Dentre os desafios do cultivo de trigo, encontram-se as doenças fúngicas e a presença de micotoxinas. Estima-se que as perdas anuais nesse setor sejam bilionárias. Além dos prejuízos econômicos, há preocupações quanto a segurança alimentar humana e animal. Com o objetivo de avaliar a micobiota e a ocorrência de micotoxinas em diferentes estádios de maturação do trigo foram realizados estudos morfológicos, utilizando métodos morfológicos clássicos e moleculares, identificação do perfil genotípico dos fungos produtores de tricotecenos, por PCR em tempo real e determinação de deoxinivalenol (DON) e zearalenona (ZEA), utilizando a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada à Espectrometria de Massas (LC-MS/MS). Os dados obtidos também foram correlacionados com os fatores climatológicos. Os resultados revelaram a predominância do gênero Fusarium nas amostras das duas safras, seguido de Alternaria e Epicoccum. A atividade de água média para os dois anos foram, 0,608 e 0,886, consecutivamente. Dentro do gênero Fusarium constatou-se predomínio do complexo de espécies Fusarium graminearum (CEFG), identificando F. graminearum sensu stricto, F. meridionale, F. cortaderiae e F. austroamericanum. Os genótipos dos isolados foram, na sua maioria, 15-ADON para F. graminearum s.s, seguido de NIV para as espécies F. meridionale, F. cortaderiae e F. austroamericanum e 3-ADON para as duas últimas. Por PCR em tempo real, a determinação do genótipo nos grãos de trigo nas safras 2014/15 e 2015/16 demonstraram predomínio de 100% e 93% para 15-ADON, respectivamente. A quantificação de DNA dos isolados do CEFG demostrou que o perfil 15-ADON foi responsável por mais de 95% nas duas safras, com valores irrisórios, menores que 3% para 3-ADON e NIV. Os níveis de contaminação pela micotoxina DON nas amostras foi de 100% nas duas safras, com valores variando entre 24,3 a 5530 &#956g/kg. Para ZEA os valores foram 30% e 96%, nas duas coletas consecutivas, variação entre 26,0 a 4360 &#956g/kg. Ambas as micotoxinas foram detectadas em concentrações acima do limite estabelecido pela legislação brasileira, 3000 &#956g/kg para DON e 400 &#956g/kg para ZEA. Os fatores climáticos obtiveram uma correlação positiva tanto na contaminação fúngica quanto no acúmulo de micotoxinas. Este estudo forneceu novas informações sobre a micobiota natural do trigo brasileiro, em diferentes etapas do cultivo, demonstrando a contaminação por DON e alta frequência de ZEA em amostras do provindas do Paraná. / The fungal diseases and the presence of mycotoxins in cereals cause annually, billionaire losses. In addition, there are concerns about human and animal food safety. Due to the wheat culture relevance in feed and foodstuff, the present work aimed to evaluate mycobiota and the occurrence of mycotoxins in different wheat maturation stages. In order to achieve these objectives, morphologic studies using classic and molecular methods, genotype profile and DNA quantification from trichothecene producers, by real-time PCR and determination of deoxynivalenol (DON) and zearalenone (ZEA), using High Performance Liquid Chromatography coupled to Mass Spectrometry (LC-MS/MS), were done. The obtained data were also correlated with the climatic factors. The results showed the predominance of the genus Fusarium followed by Alternaria and Epicoccum. The average water activity over two years were 0.608 and 0.886, consecutively. Within the genus Fusarium, it was identified a predominance of the Fusarium graminearum species complex (FGSC), identifying F. graminearum sensu stricto, F. meridionale, F. cortaderiae and F. austroamericanum. The genotypes of the isolates were 15-ADON for F. graminearum s.s, followed by NIV for the F. meridionale, F. cortaderiae and F. austroamericanum and 3-ADON for F. cortaderiae and F. austroamericanum. In real-time PCR, the determination of genotype in wheat grains in the 2014/15 and 2015/16 harvests showed a predominance of 100% and 93% for 15-ADON, respectively. The DNA quantification of the FGSC isolates showed that the 15-ADON profile was responsible for more than 95% in both harvests. The levels of DON mycotoxin contamination in the samples were 100%, with values ranging from 24.3 to 5530 &#956g/kg. For ZEA the values were 30% and 96%, in the two consecutive collections, ranging from 26,0 to 4360 &#956g/kg. Both mycotoxins were detected in concentrations above the limit established by Brazilian legislation, 3000 &#956g / kg for DON and 400 &#956g/kg for ZEA. The climatic factors obtained a positive correlation both in the fungal contamination and in the accumulation of mycotoxins. This study provided new information on the Brazilian native mycobiota to different stages of cultivation, demonstrating contamination by DON and high frequency of ZEA in samples from Paraná.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Two studies were performed in order to evaluate, through meta-analysis, the relationship of mycotoxins with performance and organ weights in pigs and broilers. The databases totaled 13,196 pigs (85 articles published between 1968 and 2010) and 37,371 broilers (98 articles, between 1980 and 2009). Meta-analysis followed three sequential analyses: graphical, correlation and variance-covariance. Pigs challenged by mycotoxins reduced feed intake by 18% and weight gain by 21% in relation to the control group. Challenged broilers presented a reduction of 12% in feed intake and 14% in weight gain. Mycotoxins with the greatest impact on performance were deoxynivalenol and aflatoxins in pigs, and ochratoxins and aflatoxins in broilers. The mycotoxin concentration in diets and the animal age at challenge were the variables that more improved the coefficient of determination in equations for estimating the mycotoxin effect on weight gain. The mycotoxin effect on growth was greater in younger animals. In addition, the residual analysis demonstrated that the greater part of the variation in weight gain was explained by the variation in the feed intake (87% in pigs and 65% in broilers). The variation in weight gain in challenged animals was also influenced by nutrient ingestion, such as protein and methionine. The mycotoxin effect on growth was greater in male pigs (-19%) compared to females (-15%). Mortality rate and some hematological parameters were also influenced by mycotoxins in broilers. Relative weight of organs increased in challenged pigs (liver, kidneys and heart) and broilers (liver, kidneys, lungs and gizzard). Mycotoxins influence on performance, productive indexes and organ weight in pigs and broilers. However, the magnitude of the effects varies with the type and concentration of mycotoxin, sex and age of the animal, as well as nutritional factors. / Dois trabalhos foram desenvolvidos com o objetivo de estudar, através de meta-análise, a relação das micotoxinas com o desempenho e o peso de órgãos de suínos e frangos de corte. As bases de dados totalizaram 13.196 suínos (85 artigos publicados entre 1968 e 2010) e 37.371 frangos de corte (98 artigos, entre 1980 e 2009). A meta-análise foi realizada através de três análises sequenciais: estudos gráficos, de correlação e de variância-covariância. Suínos desafiados por micotoxinas apresentaram redução de 18% no consumo de ração e de 21% no ganho de peso. Frangos de corte desafiados apresentaram redução de 12% no consumo de ração e 14% no ganho de peso. As micotoxinas com maior impacto sobre o desempenho foram deoxinivalenol e aflatoxinas para os suínos, e ocratoxinas e aflatoxinas para as aves. A concentração de micotoxinas nas dietas e a idade dos animais ao desafio foram as variáveis que mais ajustaram o coeficiente de determinação nas equações para estimar o efeito das micotoxinas sobre o ganho de peso. O efeito das micotoxinas sobre o crescimento foi maior nos animais jovens. Além disso, a análise de resíduos mostrou que a maior parte da variação no ganho de peso foi explicada pela variação no consumo de ração (87% nos suínos e 65% nas aves). A variação no ganho de peso em animais desafiados também foi influenciada pela ingestão de nutrientes, como proteína e metionina. O efeito das micotoxinas sobre o ganho de peso foi maior nos suínos machos (-19%) que nas fêmeas (-15%). A taxa de mortalidade e alguns parâmetros hematológicos também foram influenciados pelas micotoxinas nos frangos de corte. O peso relativo dos órgãos aumentou nos suínos (fígado, rins e coração) e nas aves (fígado, rins, pulmões e moela) desafiadas. As micotoxinas influenciam o desempenho, os índices produtivos e o peso dos órgãos em suínos e frangos de corte. No entanto, a magnitude destes efeitos varia com o tipo e a concentração de micotoxinas, o sexo e a idade do animal, bem como com fatores nutricionais.

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A necessidade de aumentar a segurança alimentar norteia a busca por substâncias naturais como alternativa ao uso de fungicidas químicos. Compostos fenólicos têm demonstrado propriedades antifúngicas e antimicotoxigênicas e a incorporação dessas substâncias em sistemas carreadores, tais como lipossomos, pode preservar ou mesmo potencializar este efeito. Em função disso, o objetivo do trabalho foi estudar a atividade antifúngica de compostos fenólicos extraídos de Spirulina sp. LEB-18 na forma livre e encapsulada visando aplicá-los para diminuir o impacto da contaminação micotoxicológica em grãos por espécies filogenéticas do complexo Fusarium graminearum (Fg). Primeiramente, algumas rotas metabólicas foram avaliadas através da determinação de compostos estruturais (glicosamina e ergosterol) e da atividade de enzimas do metabolismo primário de 12 isolados de Fg em presença do extrato fenólico. A concentração necessária para inibir 50% o crescimento micelial (IC50) foi obtida em valores correspondentes entre 3 a 8% (v/v) de extrato fenólico e a glicosamina foi o indicativo de inibição que melhor representou o efeito inibidor sobre o crescimento fúngico. Padrões de ácidos fenólicos foram testados e comparados ao extrato fenólico de Spirulina, sendo observado que o ácido gálico foi o que apresentou maior efeito inibidor, porém inferior ao extrato fenólico de Spirulina. A incorporação do extrato fenólico em lipossomos alterou a dinâmica das regiões polares e apolares da fosfatidilcolina da membrana lipídica, influenciando a região fosfato do lipídio e aumentando a fluidez dos metilenos presentes na cauda apolar da membrana. Este efeito está relacionado com a inibição superior a 90% no crescimento de isolados do complexo Fg em presença de lipossomos contendo 8% de extrato fenólico (v/v). A produção de glicosamina foi reduzida de 11,5 mg g-1 para 6,1 mg g-1 no meio com lipossomo puro e extrato fenólico incorporado ao lipossomo, respectivamente, e aumentou em 15 vezes e 6 vezes a inibição da produção das micotoxinas NIV e 15AcDON. Ficou demonstrado que a técnica de encapsulamento garantiu a manutenção das propriedades de compostos bioativos, com atividade antifúngica e antimicotoxigênica superior ao extrato fenólico livre. / Fusarium is a fungal strain commonly found in grains and foods from cereals and a recognized mycotoxin producer. The need to increase food safety leads the search for biologically active natural substances as an alternative to the sinthetic fungicides. Phenolic compounds have demonstrated antifungal and antimicotoxigenic properties and the incorporation of these substances in carrier systems such as liposomes, may can preserve or even enhance this effect. As a result, this work aimed to study the antifungal activity of phenolic compounds extracted from Spirulina sp. LEB-18 in free and encapsulated form in order be applied in the reduction of the impact of micotoxin contamination in grains by Fusarium graminearum (Fg). First, the possibility affected metabolic pathways potentially affected were evaluated by determining structural compounds (glucosamine and ergosterol) and the enzymatic activity corresponding to primary metabolism of Fg 12 isolates in the presence of phenolic extract. The half inhibition concentration of fungal growth (IC50) was obtained in phenolic extracts concentrations between 3-8% (v/v) and glucosamine was the inhibition indicative which best represented the inhibitory effect on fungal growth. Phenolic acids standards were tested comparatively to Spirulina phenolic extract, and among them, being gallic acid showed the greatest inhibitory effect. However, this effect was lower than the Spirulina phenolic extract. The phenolic extract incorporation in lipossomes change the dynamics of the lipid membrandes of phosphatidylcholine polar and nonpolar regions, influencing the lipid phosphate region and increasing the fluidity of methylenes present in apolar hydrophobic acyl chains. This effect is related to the Fg growth inhibition of the complex isolates, wich was greater than 90% in the presence of liposomes containing 8% phenol extract (v/v). The production of glucosamine was reduced from 11.5 mg. g-1 to 6.1 mg. g-1 in the medium with pure liposome and phenolic extract incorporated into the liposome, respectively and increased by 15 and 6 times the inhibition of the mycotoxins NIV and 15AcDON. This showed that encapsulation technique ensured the maintenance of bioactive compounds with antifungal activity and antimicotoxigenic properties above the free phenolic extract.

CARACTERIZACIÓN DE CEPAS TOXIGÉNICAS DEL GÉNERO Fusarium MEDIANTE TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR. Las micotoxinas son metabolitos producidos por un amplio grupo de hongos, entre los que se encuentran los pertenecientes al género Fusarium. Se han detectado como contaminantes naturales en mayor o en menor grado en un gran número de productos agrícolas y manufacturados y, si llegan a ser consumidas, pueden causar una gran variedad de efectos tóxicos en humanos y animales. Dentro de los cereales, el maíz es uno de los más vulnerables a la colonización por especies del género Fusarium y, por consiguiente, a la contaminación por las micotoxinas que produce dicho género. Es por ello que en este trabajo se aislaron estos hongos a partir de granos de maíz destinados al consumo humano y animal. Estos análisis, además de aportarnos los aislados necesarios para la identificación y detección de la producción de micotoxinas, sirvieron para el estudio comparativo entre los medios de cultivo Patata Dextrosa Agar (PDA) y Agar Verde Malaquita, destacándose este último por su selectividad para el aislamiento de hongos del género Fusarium frente otros géneros. Una vez obtenidos los aislados, nos centramos en la identificación por PCR de especies del género Fusarium procedentes de grano de maíz y la detección de especies productoras de tricotecenos (deoxinivalenol (DON) y nivalenol (NIV)). Como controles se utilizaron cepas de referencia: suministradas por la Colección Española de Cultivos Tipo. De los hongos obtenidos en la primera parte de este trabajo se seleccionaron 377 pertenecientes al género Fusarium. Estos aislados fueron analizados mediante PCR utilizando diferentes iniciadores específicos. Con este método se obtuvo la identificación de las especies F. graminearum, F. proliferatum, F. oxysporum y F. verticillioides. La técnica PCR también permitió la detección de cepas productoras de tricotecenos, así como la de aislados productores de DON. Para comprobar la especificidad / Gómez López, ED. (2008). Caracterización de cepas toxigénicas del género fusarium mediante técnicas de biología molecular [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/3346 / Palancia

O presente estudo objetivou avaliar a microbiota fúngica e a ocorrência de micotoxinas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada à Espectrometria de Massas em amostras de grãos de trigo recém-colhidas e armazenadas. Os resultados revelaram a predominância do gênero Alternaria nas amostras de todas as coletas, seguido de Epicoccum (12,6%), Fusarium (8,3%) e mais 16 outros gêneros de fungos filamentosos. As espécies de Fusarium e Alternaria foram identificadas utilizando métodos moleculares, sendo F. graminearum e A. alternata as espécies mais frequentes. De 70 amostras, 69 (98,6%) estavam contaminadas com a toxina DON (210-2910 ppb) e 3 (4,3%) amostras contaminadas com a toxina ZEA (20-30,1 ppb). O nível de contaminação por DON é inferior aos limites estabelecidos recentemente pela legislação brasileira (3000 ppb), porém superam os limites da Comunidade Européia (1750 ppb). É prudente que se realize um monitoramento contínuo de grãos de trigo a fim de avaliar a exposição dos consumidores às contaminações e estabelecer diretrizes de segurança alimentar. / The present study aimed to evaluated the mycoflora and occurrence of mycotoxins by high performance liquid chromatography coupled to tandem mass in freshly harvested and stored wheat samples. The results showed the predominance of genus Alternaria in all samples, followed by Epicoccum (12.6%), Fusarium (8.3%) and over 16 other genera of filamentous fungi. The species of Fusarium and Alternaria were identified using molecular methods, and F. graminearum and A. alternata were the most frequent species. Of 70 samples, 69 (98.6%) were contaminated with toxin DON (210-2910 ppb), and 3 (4.3%) samples contaminated with the toxin ZEA (20-30.1 ppb). The level of DON contamination is below of the limits recently established by Brazilian legislation (3000 ppb), but exceed the limits of the European Community (1750 ppb). It is prudent to perform a continuous monitoring of wheat to assess consumer exposure to contaminants and establish guidelines for food safety.

O presente estudo objetivou avaliar a microbiota fúngica e a ocorrência de micotoxinas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada à Espectrometria de Massas em amostras de grãos de trigo recém-colhidas e armazenadas. Os resultados revelaram a predominância do gênero Alternaria nas amostras de todas as coletas, seguido de Epicoccum (12,6%), Fusarium (8,3%) e mais 16 outros gêneros de fungos filamentosos. As espécies de Fusarium e Alternaria foram identificadas utilizando métodos moleculares, sendo F. graminearum e A. alternata as espécies mais frequentes. De 70 amostras, 69 (98,6%) estavam contaminadas com a toxina DON (210-2910 ppb) e 3 (4,3%) amostras contaminadas com a toxina ZEA (20-30,1 ppb). O nível de contaminação por DON é inferior aos limites estabelecidos recentemente pela legislação brasileira (3000 ppb), porém superam os limites da Comunidade Européia (1750 ppb). É prudente que se realize um monitoramento contínuo de grãos de trigo a fim de avaliar a exposição dos consumidores às contaminações e estabelecer diretrizes de segurança alimentar. / The present study aimed to evaluated the mycoflora and occurrence of mycotoxins by high performance liquid chromatography coupled to tandem mass in freshly harvested and stored wheat samples. The results showed the predominance of genus Alternaria in all samples, followed by Epicoccum (12.6%), Fusarium (8.3%) and over 16 other genera of filamentous fungi. The species of Fusarium and Alternaria were identified using molecular methods, and F. graminearum and A. alternata were the most frequent species. Of 70 samples, 69 (98.6%) were contaminated with toxin DON (210-2910 ppb), and 3 (4.3%) samples contaminated with the toxin ZEA (20-30.1 ppb). The level of DON contamination is below of the limits recently established by Brazilian legislation (3000 ppb), but exceed the limits of the European Community (1750 ppb). It is prudent to perform a continuous monitoring of wheat to assess consumer exposure to contaminants and establish guidelines for food safety.