La trans-différenciation des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) vers un phénotype migratoire, prolifératif et sécrétoire joue un rôle clé dans la progression des lésions athéromateuses et l’hyperplasie intimale qui sous-tend la resténose post-angioplastie. Nos travaux suggèrent que la transition phénotypique des CMLV implique, chez le rat, la souris et l’Homme, l’expression de novo de l’Adénylyl Cyclase 8 (AC8), une enzyme catalysant la synthèse de l’AMP cyclique (AMPc) (Clément et al., 2006; Gueguen et al., 2010; Keuylian et al., 2012; résultats non publiés). Ce travail de thèse avait pour objectif d’appréhender le rôle de l’AC8 dans la trans-différenciation des CMLV en évaluant son impact sur la signalisation AMPc. L’étude des dynamiques de production du second messager avec le biosenseur T-Epac-VV montre que l’AC8 inhibe les hausses d’AMPc dans les CMLV trans-différenciées à l’Interleukine-1β. Cette fonction non canonique est assurée par de nouvelles isoformes d’AC8 que nous avons identifiées et clonées, les AC8E1 à 4, qui partagent une délétion des cinq premiers domaines transmembranaires. Des dosages de l’accumulation d’AMPc couplés à des expériences de co-immunoprécipitation et d’immunocytochimie révèlent que les AC8E exprimées de façon hétérologue dans des cellules HEK s’hétéro-dimérisent avec les AC en transit dans le réticulum, suppriment leur activité enzymatique et préviennent leur adressage à la membrane plasmique. L’induction des AC8E dans les CMLV trans-différenciées pourrait prévenir les effets vasculoprotecteurs de l’AMPc (Douglas et al., 2005; Katakami et al., 2010), favorisant ainsi l’acquisition et/ou le maintien du phénotype synthétique. / The phenotypic switch of vascular smooth muscle cells (VSMC) towards a migratory, proliferative and secretory state plays a key role in atherosclerotic plaque expansion and intimal hyperplasia leading to post-angioplasty restenosis. Our previous results suggest that the trans-differentiation of rat, mouse and human VSMC involves the de novo expression of the Adenylyl Cyclase 8 (AC8), an enzyme that catalyzes the synthesis of cyclic AMP (cAMP) (Clement et al., 2006; Gueguen et al., 2010; Keuylian et al., 2012; unpublished results). The main goal of my PhD was to decipher the impact of AC8 expression on cAMP signaling in trans-differentiated VSMC. Using the FRET-based biosensor T-Epac-VV, we showed that the de novo expression of AC8 limits increases in cellular cAMP. This non-canonical function relies on a new family of AC8 isoforms that we have identified and cloned: the AC8E1 to 4. They share a common deletion of the first five transmembrane domains. The biochemical characterization of AC8E over-expressed in HEK cells allowed us to elucidate their functioning. cAMP accumulation assays, co-immunoprecipitation experiments and immunocytochemistry revealed that AC8E hetero-dimerize with functional AC during their maturation in the reticulum, suppress their enzymatic activity and prevent their traffic to the plasma membrane. Numerous studies have shown that increases in cAMP concentration within trans-differentiated VSMC antagonize pathological vascular remodeling (Douglas et al., 2005; Katakami et al., 2010). Thus, the induction of AC8E in trans-differentiated VSMC could prevent the vasculoprotective effects of cAMP and promote the acquisition of a synthetic phenotype.

Le récepteur A des peptides natriurétiques (NPRA) fait partie de la famille des guanylates cyclases membranaires. L’activation du NPRA par ses agonistes naturels, ANP et BNP, induit une production de GMPc qui est responsable de leur rôle dans l’homéostasie cardiovasculaire, l’inhibition de l’hypertrophie et de la fibrose cardiaques et la régulation de la lipolyse. Le NPRA est un homodimère non covalent composé d’un domaine extracellulaire de liaison du ligand (ECD), d’un unique domaine transmembranaire (TM), d’un domaine d’homologie aux kinases et d’un domaine guanylate cyclase. Bien que le NPRA ait un rôle physiologique important, les mécanismes moléculaires régissant son processus d’activation restent inconnus. Nous avons donc analysé les premières étapes du processus d’activation du NPRA. Nous avons d'abord étudié le rôle de la dimérisation des ECD dans l’activation du récepteur. Nous avons utilisé les techniques de liaison de radioligand, de FRET et de modélisation moléculaire, pour caractériser la liaison à l’ECD des agonistes naturels, d’un superagoniste et d’un antagoniste. L’ANP se lie à un dimère d’ECD préformé et la dimérisation spontanée est l’étape limitante du processus de liaison. De plus, comme le démontrent nos études de FRET, tous les peptides, incluant l’antagoniste, stabilisent le récepteur sous sa forme dimérique. Cependant, l’antagoniste A71915 stabilise le dimère d’ECD dans une conformation différente de celle induite par l’ANP. La dimérisation du NPRA semble donc nécessaire, mais non suffisante à l’activation du récepteur. L’état d’activation du NPRA dépend plutôt de l’orientation des sous unités dans le dimère. Nous avons ensuite étudié le mécanisme moléculaire de transduction du signal à travers la membrane. Plusieurs études ont suggéré que l’activation du NPRA implique un changement de conformation du domaine juxtamembranaire (JM). Cependant, les études de cristallographie de l’ECD soluble de NPRA n’ont pas permis de documenter la structure du JM et le changement de conformation impliqué dans la transduction du signal reste inconnu. Pour analyser ce changement de conformation, nous avons d’abord séquentiellement substitué les neuf acides aminés du JM par une cystéine. En étudiant la capacité des mutants à former des dimères covalents de façon constitutive ou induite par l’ANP, nous avons pu évaluer la proximité relative des résidus du JM, avant et après activation du NPRA. Ces résultats ont démontré la proximité élevée de certains résidus spécifiques et sont en contradiction avec les données cristallographiques. Nous avons également démontré que le domaine intracellulaire impose une contrainte conformationnelle au JM à l’état de base, qui est levée après liaison de l’ANP. En introduisant de 1 à 5 alanines dans l’hélice-α transmembranaire, nous avons montré qu’une rotation des TM de 40° induit une activation constitutive du NPRA. Le signal d’activation pourrait donc être transmis à travers la membrane par un mécanisme de rotation des TM. En utilisant nos données expérimentales, nous avons généré le premier modèle moléculaire illustrant la conformation active du NPRA, où les domaines JM et TM sont représentés. Dans son ensemble, cette étude apporte une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires régissant les premières étapes du processus complexe d’activation du NPRA. / Natriuretic peptide receptor-A (NPRA) is a member of the particulate guanylate cyclase family. NPRA activation by natural agonists, ANP and BNP, leads to cGMP production, which is responsible for their role in cardiovascular homeostasis, cardiac hypertrophy and fibrosis inhibition and lipolysis regulation. NPRA is a non covalent dimer composed of an extracellular domain (ECD) with a ligand binding site, a single transmembrane region (TM), a kinase homology domain, and a guanylyl cyclase domain. Although NPRA plays an important physiologic role, molecular mecanisms driving its activation process are yet unknown. We thus analysed the first steps of NPRA’s activation process. First, we studied the role of ECD dimerization in receptor activation and determined the sequential steps of this dimerization process. We used radioligand binding, FRET and molecular modeling to characterize the interaction of ECD with natural agonists, a superagonist and an antagonist. ANP binds to preformed ECD dimers and spontaneous dimerization is the rate-limiting step of the ligand binding process. Furthermore, like demonstrated with fluorescence homoquenching, all the studied peptides, including A71915 antagonist, stabilize a dimeric form of the receptor. However, A71915 stabilizes the ECD dimer in a conformation distinct from those induced by ANP. Thus, ECD dimerization is necessary but not sufficient for NPRA activation. The activation state of NPRA seems to depend on the orientation of the receptor subunits within the dimer. Then, we tried to identify the molecular mechanism of signal transduction through the plasma membrane. Previous studies have shown that activation of NPRA involves a conformational change of the juxtamembrane domain (JM). However, crystallographic study of the soluble ECD of NPRA has failed to document JM structure, and the conformational change involved in transmembrane signal transduction is still unknown. To analyse this conformational change, we first sequentially substituted nine amino acids of JM by a cysteine residue. By studying the mutant’s capacity to form ANP-induced or constitutive covalent disulfide dimers, we evaluated the relative proximity of JM residues, before and after NPRA activation. These results demonstrate a high proximity of specific JM residues and are in disagreement with crystallography data. We also demonstrated that intracellular domain imposes a conformational constraint on JM at basal state, which becomes relaxed upon ANP binding. We finally confirmed, with a full-length receptor, that A71915 stabilizes NPRA in a dimeric form where JM are in a conformation distinct from the basal state. By introducing 1 to 5 alanine residues in the transmembrane α-helix, we showed that a TM rotation of 40° leads to constitutive NPRA activation. Activation signal could thus be transmitted through the membrane by a TM rotation mechanism. We finally studied the role of the TM in NPRA dimerization. By using the ToxR system, we demonstrated that the last JM residues are required to stabilize the TM dimer. Using these experimental data, we generated the first molecular model illustrating the active conformation of NPRA, where JM and TM are depicted. In summary, this study allows a better understanding of molecular mecanisms driving the first steps of NPRA’s complex activation process.

La sélection de l’ARNg des rétrovirus repose sur des interactions entre le domaine nucléocapside (NC) du précurseur Gag et des régions de l’ARN viral appelées ψ (ou Psi) localisées dans la région 5’ non traduite (5’-UTR) de l’ARNg et/ou dans le début du gène gag.Malgré des nombreuses études, les mécanismes moléculaires gouvernant l’incorporation de l’ARNg dans les particules virales en cours d’assemblage sont encore mal compris. La protéine Gag est notoirement sensible à la protéolyse et la plupart des études ont été menées avec une Gag dépourvue du domaine p6 (GagΔp6) qui ne reflètepas correctement les propriétés de fixation de la protéine Gag entière à l’ARNg. Les travaux réalisés aux cours de cette thèse nous ont permis de montrer que Pr55Gag et ses produits de maturation NCp15 et NCp7 sont capables de distinguer l’ARNg du VIH-1 des ARN viraux épissés. La stabilisation des formes dimériques ou la perturbation des interactions à longue distance n’ont aucune influence sur la reconnaissance spécifique de Gag pour l’ARNg. Par des expériences de mutagénèse dirigée et de compétition, nous avons montré non seulement que la dimérisation de l’ARNg et le motif SL1 (surtout sa boucle interne) joue un rôle crucial pour la fixation de Gag mais aussi que l’intégrité de la région Psi est indispensable pour une fixation optimale. Ces résultats nous ont amené à déterminer plus précisément l’empreinte de Gag sur l’ARNg et les résidus requis pour la fixation de Gag qui on confirmé le rôle crucial de SL1 comme le siganl major pour la reconnaissance spécifique de l’ARNg par le pr55Gag. / Packaging of HIV-1 genomic RNA (gRNA) is a highly regulated and selective process that leads to prefrential selection and packaging of dimeric gRNA from a cellular medium containing a large excess of cellular and spliced viral mRNAs. This event underlies interaction between the nucleocapsid domain in the context of the uncleaved Gag precursor and a Packaging signal located in the 5’ untranslated region (5’ UTR) of the gRNA and/or the beginning of gag gene. Despite a considerable effort, the molecular mechanisms beyond the selective encapsidation of HIV-1 gRNA is still unknown. To address this, we first characterized the relative affinities of Pr55gag to various HIV-1 RNA fragments (spliced and unspliced) by biochemical and spectroscopic approaches which all revealed that Pr55gag exhibits a higher binding affinity for viral gRNA than for viral spliced species. Interestingly, we noticed that Pr55Gag, through its nucleic acid chaperone activity, was able to stabilize the dimeric form of almost all viral RNA species (spliced and unspliced) suggesting that RNA dimermaturation does not allow the gRNA discrimination. Further characterization of specific Gag binding sites to short RNA fragments corresponding to the minimal packaging signal by competition experiments, inhibition of Gag/RNA interaction by antisense oligo-deoxynucleotides, as well as the detection of Pr55Gag RNA binding sites on gRNA by enzymatic and chemical footprinting confirmed the crucial role of SL1 (or DIS) as a specific binding site for Pr55Gag. Taken together, our results strongly suggest that SL1 and/or RNA dimerization is a specific recognition signal for Pr55Gag to specifically select and probably induce HIV-1 gRNA packaging.

La dimérisation des récepteurs couplés aux protéines G est un nouveau concept apparu dans la littérature au cours des quelques années qui ont précédé le début de notre travail. Bien qu’il soit clairement établi que les récepteurs sont capables de former des homo et des hétérodimères, les conséquences fonctionnelles de telles interactions demeurent souvent peu claires. Dans une étude précédente, le laboratoire d’accueil a montré que les récepteurs aux chimiokines CCR2 et CCR5 forment des homo et des hétérodimères de manière constitutive et identifié une coopérativité négative de liaison de nature allostérique entre les deux sites de liaison de CCR2 et CCR5 dans des cellules co-exprimant les deux récepteurs. Dans ce travail, nous avons étendu cette étude au récepteur CXCR4, structurellement plus éloigné que CCR2 et CCR5 entre eux. Nous montrons par une méthode biophysique se basant sur le transfert d’énergie de bioluminescence (le BRET) que CCR2, CCR5 et CXCR4 forment des homodimères et des hétérodimères de manière constitutive. De plus nous démontrons une coopérativité négative de liaison de nature allostérique des deux sites de liaisons pour les hétérodimères CCR2/CXCR4 et CCR5/CXCR4. lorsque CXCR4 est co-exprimé avec CCR2 ou CCR5, la chimiokine spécifique de CXCR4 (SDF-1α) inhibe la liaison du traceur spécifique de CCR2 (MCP-1) ou du traceur spécifique de CCR5 (MIP-1β), et vice-versa. La nature allostérique de ces interactions est démontrée par des expériences mesurant la dissociation de traceurs en présence ou non de compétiteurs. La coopérativité négative de liaison de nature allostérique des deux sites de liaisons est montrée également dans des cellules primaires, excluant tout effet indésirable dû à la surexpression de récepteurs. Nous montrons également que l’antagoniste spécifique de CXCR4 (AMD3100) inhibe la liaison du traceur spécifique de CCR2 (MCP-1) ou du traceur spécifique de CCR5 (MIP-1β), et vice-versa (TAK-779 vs SDF-1α), uniquement quand CXCR4 est co-exprimé respectivement avec CCR2 ou CCR5. Il s’agit là de la première preuve montrant que les interactions allostériques au sein d’hétérodimères de récepteurs aux chimiokines impliquent aussi des antagonistes, et qu’un antagoniste de récepteur aux chimiokines influence la réponse fonctionnelle d’un autre récepteur aux chimiokines auquel il ne se lie pas. De tels effets fonctionnels ont été montré dans des expériences de mobilisation de Ca++, de chimiotactisme sur lymphoblastes et dans des expériences d’air pouch in vivo. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le cancer est l'une des principales causes de décès dans le monde. D'après la société américaine contre le cancer; en 2015, un quart des décès aux Etats-Unis est du au cancer du poumon avant même les maladies cardiaques. Cette situation nous incite et bien d'autres scientifiques dans le monde à développer des moyens plus efficaces de traitement, le diagnostic et le dépistage de la maladie. Parce que près de 90% des décès par cancer sont dus à des métastases, de nombreuses études se sont concentrées sur le mécanisme de métastases et sur son impact clinique. Les cellules tumorales circulantes (CTC) sont les cellules s’échappent de tumeurs primaires ou métastatiques pour rejoindre le flux sanguin périphérique, ces cellules sont un élément de transition dans le processus métastatique et portent ainsi des informations cruciales sur ce mécanisme encore mal compris. Les CTCs ont déjà montré leur potentiel comme biomarqueur de pronostic de la progression de la maladie et de l'indicateur de l'efficacité du traitement en fonction l’augmentation ou de la diminution de leur nombre. Leur caractérisation moléculaire peut également donner des informations vis à vis de cibles thérapeutiques possibles et des mécanismes de progression de la maladie ou de la résistance aux médicaments. Leur comptage au cours du traitement combiné avec leur caractérisation moléculaire devrait améliorer la prise en charge des patients dans le cadre de la médecine personnalisée. Cependant CTCs sont extrêmement rares, 1 à 10 cellules / ml de sang parmi les 106 globules blancs et 109 globules rouges, leur capture à partir du sang reste donc un challenge analytique. Dans les dernières décennies, Une grande variété de techniques d'enrichissement et de capture a été mise au point et l'approche microfluidique est l'une des méthodes efficaces, flexibles et à haut débit. Au sein de notre équipe, un dispositif microfluidique (système Ephesia) puissant pour la capture et l'analyse des cellules tumorales circulantes a déjà été mis au point précédemment. Le principe de capture est basé sur l'auto-assemblage de billes magnétiques greffées par des anticorps, grâce aux quelles les cellules sont enrichies via l’interaction Ab- l'antigène de surface EpCAM que l'on trouve communément dans les cellules cancéreuses d'origine épithéliale. Ce système a déjà été validé avec des lignées cellulaires et des échantillons de patients. Cependant, le système n'a pas permis l'isolement / détection des sous-populations de CTCs ou d'effectuer une caractérisation moléculaire très poussée. Par conséquent, mon projet de thèse vise à améliorer encore les capacités du système sur les deux principaux aspects: le ciblage sous-populations de CTC et à l'étude des interactions des protéines à la surface des CTCs dans le Système Ephesia... / Metastasis is the advanced stage of cancer progression and is the cause of 90% of deaths in cancer disease. During metastatic cascade, it is suggested that the successful metastatic initiation depends on the survival of circulating tumor cells (CTCs). CTCs are the cells that shed from the primary or secondary tumor sites into the blood circulation. it is now widely recognized as potential biomarker for companion diagnostics in which high number of CTCs in blood can indicate association with poor survival or high risk of disease progression. Besides, following the number of CTCs during the course of treatment can help to adapt the selected therapy and predict the treatment efficacy. On the other hand molecular characterization can provide patient stratification and identifying the therapeutic targets. However they are extremely rare in the bloodstream, estimated between 1-10 CTC among 6×106 leukocytes, 2×108 platelets and 4×109 erythrocytes per one mL of blood which makes their isolation very challenging. A very attractive way of isolation of CTCs is to integrate microfluidics. Microfluidics offers great advantages such as low volume of reagent consumption and short analysis times with automation as well as isolation and detection analysis can be integrated resulting in highly efficient biomedical devices for diagnostics. As parallel to state of the art, a powerful microfluidic device for circulating tumor cells capture and analysis had already been developed previously in our laboratory. The principle of capture is based on self-assembly of antibody-coated (EpCAM) magnetic beads in which the cells are enriched by EpCAM surface antigen which is found commonly in epithelial origin cancer cells. This system was already validated with cell lines and patients samples. However, the system did not allow isolation/detection of subpopulations of CTCs or performing high content molecular characterization. Therefore, my PhD project aimed at further improving the capabilities of the system on the main two aspects: targeting subpopulations of CTC and studying of protein interactions of CTCs in Ephesia System...

L'état circulaire du chromosome bactérien pose un problème particulier lors de la réplication. Un nombre impair d'événements de recombinaison homologue donne des chromosomes dimères concaténés qui ne peuvent pas être divisés en cellules filles. Pour résoudre ce problème, les bactéries ont mis au point un mécanisme de résolution des dimères basé sur un système de recombinaison spécifique au site. Ceci est effectué par le système Xer/dif. Dans ce système, les protéines Xer effectuent une réaction de recombinaison dans le site dif au niveau du septum cellulaire immédiatement avant la division cellulaire. Dans la plupart des bactéries, cette réaction est effectuée par deux recombinases, XerC et XerD. Cependant, Streptococcus suis, un agent pathogène zoonotique important utilise un système de recombinaison différent, constitué d'une seule enzyme recombinase appelée XerS, qui catalyse la réaction de recombinaison dans un site dif non conventionnel. Pour caractériser le mode de clivage de XerS, des expériences EMSA ont été réalisées en utilisant des fragments de PCR marqués par HEX et des "suicide substrates". Nos données suggèrent que 1.) XerS est capable de lier la séquence entière de difSL; 2.) XerS lie plus efficacement le côté gauche des mutants difSL incomplets que le côté droit; 3.) XerS coupe les brins supérieur et inférieur du site difSL, avec une réaction plus efficace au bas. 4.) Modifications des nucléotides de la région la plus externe ou de la région centrale changent les préférences de clivage. 5.) XerS n'a montré aucune activité spécifique sur un autre site dif non conventionnel des Firmicutes, 6.) XerS interagit avec la sous-unité FtsK-y. L'ensemble des résultats présentés permet de mieux comprendre le fonctionnement de la recombinaison XerS dans le système de recombinase unique de Streptococcus et comment cette recombinaison est régulée par des facteurs de l'hôte. / The circular state of the bacterial chromosome presents a specific problem during replication. An odd number of homologous recombination events results in concatenated dimer chromosomes that cannot be partitioned into daughter cells. To solve this problem, bacteria have developed a mechanism of dimer resolution based on site-specific recombination system. This is performed by the Xer/dif system. In this system, the Xer proteins perform a recombination reaction in the dif site at the cell septum immediately prior to cell division. In most bacteria this reaction is performed by two recombinases, XerC and XerD. However, an important zoonotic pathogen; Streptococcus suis harbors a different recombination system, composed by a single recombinase enzyme called XerS, that catalyzes the recombination reaction in an unconventional dif site; difSL. A region characterized by two imperfect inverted repeat regions that flank a central region of 11 bp.To characterize the mode of cleavage of XerS, EMSA experiments were performed by using HEX-labelled PCR fragments and “nicked suicide substrates”. Our data suggests that; 1.) XerS is able to bind the entire difSL sequence; 2.) XerS binds more efficiently the left half side on incomplete difSL mutants than the right half side; 3.) XerS cleaves both the top and bottom strands of the difSL site, with a more efficient reaction at the bottom strand; 4.) Nucleotides at the outermost region of a T rich region seem to be determinant for binding selectivity and modifications of the extra spacing between the inverted repeat arms as well as length modifications of the central region change cleavage preference. 5.) XerS did not show any specific activity on another unconventional dif site in Firmicutes, as tested on difH. 6.) XerS interacts with FtsK-y subunit. This research aims to understand how XerS recombination works in the single recombinase system of Streptococcus and how this recombination is regulated by host factors. Exploration of these recombinases will provide a better understanding of the mechanisms of DNA exchange and genome stability in bacteria. It can also increase our knowledge of the evolution and speciation of recombinogenic bacteria.

Le système endothéline (ET) est activé en condition d’hypertension pulmonaire (HTP). L’efficacité des antagonistes des récepteurs à l’ET a clairement été démontrée et a menée à l’approbation clinique de tels antagonistes dans le traitement de l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP). Toutefois, il existe présentement un important débat opposant l’utilisation d’un antagoniste sélectif des récepteur ETA à l’utilisation d’un antagoniste double ETA/ETB dans le traitement de cette pathologie. Bien que nous sachions que le système ET est activé et contribue à l’HTAP, les modifications locales de ce système induites par la pathologie, particulièrement au niveau des artères de résistance pulmonaires, demeurent inconnues. De plus, l’impact de ces modifications sur la réponse pharmacologique aux divers antagonistes des récepteurs à l’ET (sélectifs versus double) est d’une importance capitale. Ainsi, le but de la première étude de cette thèse était d’évaluer les modifications potentielles de la pharmacologie du système ET au niveau des artères de résistance pulmonaires induites par l’HTAP. Dans cette étude, nous avons démontré qu’en condition contrôle l’antagoniste sélectif ETA et l’antagoniste double n’ont eu aucun effet sur la réponse vasoconstrictrice à l’ET-1. Toutefois, en condition d’HTAP, les antagonistes sélectif et double ont tous deux été en mesure de réduire la vasoconstriction pulmonaire induite par l’ET-1. Une diminution importante de l’expression génique du récepteur ETB pourrait être à l’origine de cette modification du profil pharmacologique des antagonistes. Une meilleure compréhension des rôles joués par les récepteurs ETA et ETB au niveau des artères de résistance pulmonaires pourrait permettre l’optimisation des traitements de l’HTAP. Ainsi, le but de la deuxième étude était d’évaluer les effets d’un traitement antisens ex vivo dirigé contre l’ARNm des récepteurs ETA et ETB dans la vasoconstriction des artères de résistance pulmonaires induite par l’ET-1. Dans cette étude, nous avons démontré dans un premier temps que les récepteurs ETA et ETB pouvaient former des dimères au niveau des artères de résistance pulmonaires. De plus, nous avons observé qu’une réduction de l’expression protéique du R-ETA entraînait une potentialisation de la vasoconstriction ETB dépendante suggérant ainsi qu’en condition contrôle, le récepteur ETA aurait un effet inhibiteur sur la vasoconstriction pulmonaire induite par la stimulation du récepteur ETB. Les effets délétères de l’ET-1 sur la circulation pulmonaire sont bien connus, toutefois seules quelques études ont porté leur attention sur l’implication de l’ET-3 dans l’HTAP. Ainsi, le but de la troisième étude était d’évaluer l’implication potentielle de l’ET-3 dans l’HTAP. Dans cette étude, nous avons démontré qu’il était nécessaire en condition contrôle de bloquer simultanément les récepteurs ETA et ETB afin de réduire la réponse vasoconstrictrice pulmonaire à l’ET-3. En condition d’HTAP, nous avons observé une augmentation non-significative des concentrations plasmatiques d’ET-3 ainsi qu’une modification du profil pharmacologique des antagonistes des récepteurs à l’ET. En effet, l’utilisation de l’antagoniste sélectif ETA ou de l’antagoniste double était dans les deux cas en mesure de réduire la vasoconstriction pulmonaire à l’ET-3. Les résultats de ces trois études suggèrent qu’il est préférable d’utiliser un antagoniste double dans le traitement de l’HTAP. En effet, (1) en condition d’HTAP, l’utilisation d’un antagoniste double est aussi efficace que l’utilisation d’un antagoniste sélectif ETA; (2) les récepteurs ETA et ETB peuvent former des dimères au niveau des artères de résistance pulmonaires et (3) le récepteur ETB joue un rôle prédominant dans la vasoconstriction pulmonaire, il semble donc essentiel de bloquer simultanément les récepteurs ETA et ETB afin d’inhiber la réponse vasoconstrictrice induite par l’ET. Mots-clés: endothéline-1, endothéline-3, artère de résistance pulmonaire, récepteur vasculaire, antagoniste des récepteurs à l’ET, dimérisation, phosphorothioate, hypertension artérielle pulmonaire / The endothelin (ET) system is activated in pulmonary arterial hypertension (PAH); indeed, increased plasma levels of ET-1 were detected in patients with various forms of PAH and in various experimental models. The therapeutic value of pharmacological blockade of ET receptors has been demonstrated in various animal models and led to the current approval and continued development of these drugs for the therapy of human PAH. Whether the net effect of either selective ETA receptor blockade or combined ETA/ETB receptor blockade provides greater therapeutic benefit remains a subject of debate. Although the ET system contributes to PAH, we currently incompletely comprehend which local modifications of this system occur as a consequence of PAH, particularly in small resistance arteries, and how this could affect the pharmacological response to ET receptor antagonists. The purpose of the first study was therefore to evaluate potential modifications of the pharmacology of the ET system in rat pulmonary resistance arteries from monocrotaline-induced PAH. Our results reveal striking changes in pulmonary vasculature sensitivity to ET receptor antagonism in PAH that may be related to a reduction in ETB receptor expression. A better understanding of the exact role played by both ETA and ETB receptors on pulmonary resistance arteries might contribute to optimization of PAH treatments. Therefore the aim of the second study was to clarify the role played by both ETA and ETB receptors in ET-1 induced pulmonary vasoconstriction using an antisense (AS) oligonucleotide ex vivo treatment. In this study we have demonstrated that ETA and ETB receptors can form heterodimers in pulmonary resistance arteries. Furthermore, suppression of ETA receptors potentiated the response to ET-1 suggesting that in control condition the ETA receptor has an inhibitory action on the ET-1 induced pulmonary vasoconstriction induced by the stimulation of the ETB receptor. Although the deleterious effects of ET-1 on the pulmonary circulation are well established, only a few studies have focused on ET-3 in PAH. Therefore, the purpose of the last study was to evaluate the potential implication of ET-3 in MCT-induced PAH and evaluate the roles of ETA and ETB receptors on ET-3-induced pulmonary vascular reactivity. In control condition, the use of a combination of both ETA and ETB receptor antagonists is necessary to reduce the ET-3 induced pulmonary vasoconstriction. In PAH, we found an increased ET-3 plasma levels and a modification of the pharmacological profile of ET receptor antagonists. Indeed, the use of either the ETA receptor antagonist or the dual antagonist was able to reduce the ET-3 response. The results from these three studies suggest that it is preferable to use a dual antagonist in the treatment of PAH. Indeed, (1) in PAH the use of a dual antagonist is as effective as the use of a selective ETA receptor antagonist (2) ETA and ETB receptors can form heterodimers in pulmonary resistance arteries and (3) ETB receptor plays an important role in the ET-1 induced pulmonary vasoconstriction, suggesting that it is necessary to block both receptors to reduce the ET-1 induced pulmonary vasoconstriction. Keywords: endothelin-1, endothelin-3, pulmonary resistance artery, receptor, endothelin receptor antagonist, dimerisation, phosphorothioate pulmonary arterial hypertension

Les protéines membranaires représentent environ le tiers des gènes dans les différents génomes séquencés. La prépondérance de ce type de protéines en terme de cibles thérapeutiques (50 % des médicaments) ainsi que leur implication dans beaucoup de phénomènes cellulaires tel que la transduction d'énergie, le transport de nutriments et la signalisation reflètent leur importance. Les interactions entre protéines membranaires jouent un rôle primordial dans leur structure, leurs fonctions et leur assemblage en complexes. La fonction de la plupart des protéines membranaires est liée à l'assemblage de leurs segments transmembranaires TMs dans la bicouche lipidique. Les segments TMs sont des morceaux de séquences majoritairement hydrophobes d'environ 20 résidus adoptant une structure en hélice alpha. En fait, les interactions entre hélices TMs sont essentielles pour le repliement des protéines membranaires et leur organisation dans la membrane. Pour cette raison, des interactions qualitatives entre domaines TMs de différentes protéines bitopiques ont été caractérisé en utilisant le système du double hybride bactérien (BACTH) basé sur une complémentation protéique de type adénylate cyclase. Ce système a révélé des interactions homo- et hétérologues entre des domaines TMs appartenant à deux familles de récepteurs humains, la famille des récepteurs du facteur de croissance épidermique à activité tyrosine kinase (EGFRs) et les Neuropilines. / Many cellular and biochemical processes/activities are actually carried out by the complexome, which is defined as a set of protein complexes. Identification and characterization of the complexome are essential for a comprehensive understanding and global visioning of cell functions since protein-protein interactions are the core of an entire interactomics system of any living cell. Membrane proteins make up to 30% of proteomes in eukaryotes and prokaryotes. They form a major class of proteins that are essentially involved in vital processes including bioenergetics, signal transduction, cell adhesion, catalysis and so on. Thus, they also represent more than 50% of all currently available drug targets. The function of most membrane proteins is inextricably linked to the proper packing and assembly of their transmembrane (TM) segments in the lipid bilayer. So, deciphering the contribution of TM domains interaction in the assembly of protein complexes will help to understand the dynamic assembly of membrane proteins complexes which are most important in cell signaling. For this reason, qualitative interactions between the TM domains of different bitopic proteins have been characterized using the bacterial adenylate cyclase complementation assay (BACTH). This system has been successfully adapted in the lab to study the homo- and heteromeric associations of selected TM sequences, using well characterized interactions as controls. Moreover, BACTH has revealed TM interactions of two major classes of mammalian membrane receptors, the family of epidermal growth factor receptors (EGFRs) which belongs to receptor tyrosine kinases (RTKs) superfamily and the neuropilins.

Le gossypol, pigment principal des semences de coton, représente une cible de choix pour les chimistes organiciens du fait de ses multiples applications pharmacologiques : contraceptif oral chez l'homme, remède naturel pour le traitement de la bronchite, inhibiteur total de la réplication du virus HIV 1, agent antiviral in vitro contre le virus de l'herpès simple type 2, le virus de l'influenza, propriétés anticancéreuses. Ce sont ses propriétés anticancéreuses qui suscitent à l'heure actuelle le plus d'intérêt. Des travaux récents (≥ 2000) montrent que le gossypol est un très bon ligand des protéines de la famille Bcl-2 qui constituent un point de contrôle majeur pour la régulation de l'apoptose (mort naturelle cellulaire dont le processus est perturbé dans les situations de cancers). Le présent travail fournit des nouvelles substances analogues du gossypol. Les voies chimiques originales mises au point permettent de remplacer les groupes isopropyle et méthyle du gossypol par des groupes structurellement proches (éthyle, n-propyle, n-butyle, etc.).<br />La première méthode générale de préparation de dérivés de l'acide vératrique substitués en position C2 par ortho-lithiation a été développée. L'acide vératrique commercial est métallé efficacement en position C2 par le LTMP. L'acide 3,4-diméthoxy-2-méthylbenzoïque ainsi obtenu est à son tour métallable latéralement par le LDA. Il a d'autre part été montré que la position C3 de l'acide 8-isopropyl-4,6,7-triméthoxynaphtalène-2-carboxylique est métallable par LTMP. Lorsque la position C8 est occupé par un méthyle, la métallation se fait exclusivement dans cette position avec LTMP. Les acides 2,3-diméthoxybenzoïques substitués en position C2 par des groupements divers conduisent après condensation de Stobbe à des composés naphtaléniques eux-mêmes précurseurs — par dimérisation oxydante — du squelette binaphtalène présent dans gossypol et l'apogossypol. Le 5,5'-didésisopropyl-5,5'-diméthylgossypol racémique et le 5-désisopropyl-5-méthylhémigossypol ont été préparés selon ces méthodes.

Le système endothéline (ET) est activé en condition d’hypertension pulmonaire (HTP). L’efficacité des antagonistes des récepteurs à l’ET a clairement été démontrée et a menée à l’approbation clinique de tels antagonistes dans le traitement de l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP). Toutefois, il existe présentement un important débat opposant l’utilisation d’un antagoniste sélectif des récepteur ETA à l’utilisation d’un antagoniste double ETA/ETB dans le traitement de cette pathologie. Bien que nous sachions que le système ET est activé et contribue à l’HTAP, les modifications locales de ce système induites par la pathologie, particulièrement au niveau des artères de résistance pulmonaires, demeurent inconnues. De plus, l’impact de ces modifications sur la réponse pharmacologique aux divers antagonistes des récepteurs à l’ET (sélectifs versus double) est d’une importance capitale. Ainsi, le but de la première étude de cette thèse était d’évaluer les modifications potentielles de la pharmacologie du système ET au niveau des artères de résistance pulmonaires induites par l’HTAP. Dans cette étude, nous avons démontré qu’en condition contrôle l’antagoniste sélectif ETA et l’antagoniste double n’ont eu aucun effet sur la réponse vasoconstrictrice à l’ET-1. Toutefois, en condition d’HTAP, les antagonistes sélectif et double ont tous deux été en mesure de réduire la vasoconstriction pulmonaire induite par l’ET-1. Une diminution importante de l’expression génique du récepteur ETB pourrait être à l’origine de cette modification du profil pharmacologique des antagonistes. Une meilleure compréhension des rôles joués par les récepteurs ETA et ETB au niveau des artères de résistance pulmonaires pourrait permettre l’optimisation des traitements de l’HTAP. Ainsi, le but de la deuxième étude était d’évaluer les effets d’un traitement antisens ex vivo dirigé contre l’ARNm des récepteurs ETA et ETB dans la vasoconstriction des artères de résistance pulmonaires induite par l’ET-1. Dans cette étude, nous avons démontré dans un premier temps que les récepteurs ETA et ETB pouvaient former des dimères au niveau des artères de résistance pulmonaires. De plus, nous avons observé qu’une réduction de l’expression protéique du R-ETA entraînait une potentialisation de la vasoconstriction ETB dépendante suggérant ainsi qu’en condition contrôle, le récepteur ETA aurait un effet inhibiteur sur la vasoconstriction pulmonaire induite par la stimulation du récepteur ETB. Les effets délétères de l’ET-1 sur la circulation pulmonaire sont bien connus, toutefois seules quelques études ont porté leur attention sur l’implication de l’ET-3 dans l’HTAP. Ainsi, le but de la troisième étude était d’évaluer l’implication potentielle de l’ET-3 dans l’HTAP. Dans cette étude, nous avons démontré qu’il était nécessaire en condition contrôle de bloquer simultanément les récepteurs ETA et ETB afin de réduire la réponse vasoconstrictrice pulmonaire à l’ET-3. En condition d’HTAP, nous avons observé une augmentation non-significative des concentrations plasmatiques d’ET-3 ainsi qu’une modification du profil pharmacologique des antagonistes des récepteurs à l’ET. En effet, l’utilisation de l’antagoniste sélectif ETA ou de l’antagoniste double était dans les deux cas en mesure de réduire la vasoconstriction pulmonaire à l’ET-3. Les résultats de ces trois études suggèrent qu’il est préférable d’utiliser un antagoniste double dans le traitement de l’HTAP. En effet, (1) en condition d’HTAP, l’utilisation d’un antagoniste double est aussi efficace que l’utilisation d’un antagoniste sélectif ETA; (2) les récepteurs ETA et ETB peuvent former des dimères au niveau des artères de résistance pulmonaires et (3) le récepteur ETB joue un rôle prédominant dans la vasoconstriction pulmonaire, il semble donc essentiel de bloquer simultanément les récepteurs ETA et ETB afin d’inhiber la réponse vasoconstrictrice induite par l’ET. Mots-clés: endothéline-1, endothéline-3, artère de résistance pulmonaire, récepteur vasculaire, antagoniste des récepteurs à l’ET, dimérisation, phosphorothioate, hypertension artérielle pulmonaire / The endothelin (ET) system is activated in pulmonary arterial hypertension (PAH); indeed, increased plasma levels of ET-1 were detected in patients with various forms of PAH and in various experimental models. The therapeutic value of pharmacological blockade of ET receptors has been demonstrated in various animal models and led to the current approval and continued development of these drugs for the therapy of human PAH. Whether the net effect of either selective ETA receptor blockade or combined ETA/ETB receptor blockade provides greater therapeutic benefit remains a subject of debate. Although the ET system contributes to PAH, we currently incompletely comprehend which local modifications of this system occur as a consequence of PAH, particularly in small resistance arteries, and how this could affect the pharmacological response to ET receptor antagonists. The purpose of the first study was therefore to evaluate potential modifications of the pharmacology of the ET system in rat pulmonary resistance arteries from monocrotaline-induced PAH. Our results reveal striking changes in pulmonary vasculature sensitivity to ET receptor antagonism in PAH that may be related to a reduction in ETB receptor expression. A better understanding of the exact role played by both ETA and ETB receptors on pulmonary resistance arteries might contribute to optimization of PAH treatments. Therefore the aim of the second study was to clarify the role played by both ETA and ETB receptors in ET-1 induced pulmonary vasoconstriction using an antisense (AS) oligonucleotide ex vivo treatment. In this study we have demonstrated that ETA and ETB receptors can form heterodimers in pulmonary resistance arteries. Furthermore, suppression of ETA receptors potentiated the response to ET-1 suggesting that in control condition the ETA receptor has an inhibitory action on the ET-1 induced pulmonary vasoconstriction induced by the stimulation of the ETB receptor. Although the deleterious effects of ET-1 on the pulmonary circulation are well established, only a few studies have focused on ET-3 in PAH. Therefore, the purpose of the last study was to evaluate the potential implication of ET-3 in MCT-induced PAH and evaluate the roles of ETA and ETB receptors on ET-3-induced pulmonary vascular reactivity. In control condition, the use of a combination of both ETA and ETB receptor antagonists is necessary to reduce the ET-3 induced pulmonary vasoconstriction. In PAH, we found an increased ET-3 plasma levels and a modification of the pharmacological profile of ET receptor antagonists. Indeed, the use of either the ETA receptor antagonist or the dual antagonist was able to reduce the ET-3 response. The results from these three studies suggest that it is preferable to use a dual antagonist in the treatment of PAH. Indeed, (1) in PAH the use of a dual antagonist is as effective as the use of a selective ETA receptor antagonist (2) ETA and ETB receptors can form heterodimers in pulmonary resistance arteries and (3) ETB receptor plays an important role in the ET-1 induced pulmonary vasoconstriction, suggesting that it is necessary to block both receptors to reduce the ET-1 induced pulmonary vasoconstriction. Keywords: endothelin-1, endothelin-3, pulmonary resistance artery, receptor, endothelin receptor antagonist, dimerisation, phosphorothioate pulmonary arterial hypertension