L'utilisation des composés furaniques comme matières premières est largement justifiée par la disponibilité et l'aspect renouvelable de ces sources (biomasse végétale). Dans ce projet, nous nous sommes intéressés au caractère photosensible des composés furaniques pour l'élaboration de nouveaux polymères photo-réticulables en vue de leur application sur plaques d'impression Offset. Des structures photosensibles simples ont été synthétisées et caractérisées afin d'étudier la synthèse et le comportement photochimique du photopolymère final. Lors de l'irradiation dans un milieu concentré, ces composés subissent une [pi2+pi2] cycloaddition entre un chromophore à l'état excité et un chromophore à l'état stable formant des motifs cyclobutanes. Les composés les plus prometteurs ont été utilisés comme monomères pour la préparation des photopolymères, basés sur une structure polyester, contenant le groupement chromophore dans la chaîne principale. Après une étude structurelle et thermique, ces polymères photosensibles ont été étudié photochimiquement et ont montré une bonne aptitude à induire la réticulation des matériaux initiaux.

Les molécules classiques du CMH de classe II sont responsables de la présentation de peptides exogènes par les cellules présentatrices d’antigène aux lymphocytes T CD4+. Cette présentation antigénique est essentielle à l’établissement d’une réponse immunitaire adaptative. Cependant, la reconnaissance d’auto-antigènes ainsi que l’élimination des cellules du Soi sont des problèmes à l’origine de nombreuses maladies auto-immunes. Notamment, le diabète et la sclérose en plaque. D’éventuels traitements de ces maladies pourraient impliquer la manipulation de la présentation antigénique chez les cellules dont la reconnaissance et l’élimination engendrent ces maladies. Il est donc primordial d’approfondir nos connaissances en ce qui concerne les mécanismes de régulation de la présentation antigénique. La présentation antigénique est régulée tant au niveau transcriptionnel que post-traductionnel. Au niveau post-traductionnel, diverses cytokines affectent le processus. Parmi celles-ci, l’IL-10, une cytokine anti-inflammatoire, cause une rétention intracellulaire des molécules du CMH II. Son mécanisme d’action consiste en l’ubiquitination de la queue cytoplasmique de la chaîne bêta des molécules de CMH II. Cette modification protéique est effectuée par MARCH1, une E3 ubiquitine ligase dont l’expression est restreinte aux organes lymphoïdes secondaires. Jusqu’à tout récemment, il y avait très peu de connaissance concernant la structure et les cibles de MARCH1. Considérant son impact majeur sur la présentation antigénique, nous nous sommes intéressé à la structure-fonction de cette molécule afin de mieux caractériser sa régulation ainsi que les diverses conditions nécessaires à son fonctionnement. Dans un premier article, nous avons étudié la régulation de l’expression de MARCH1 au niveau protéique. Nos résultats ont révélé l’autorégulation de la molécule par formation de dimères et son autoubiquitination. Nous avons également démontré l’importance des domaines transmembranaires de MARCH1 dans la formation de dimères et l’interaction avec le CMH II. Dans un second article, nous avons investigué l’importance de la localisation de MARCH1 pour sa fonction. Les résultats obtenus montrent la fonctionnalité des motifs de localisation de la portion C-terminale de MARCH1 ainsi que la présence d’autres éléments de localisation dans la portion N-terminale de la protéine. Les nombreux mutants utilisés pour ce projet nous ont permis d’identifier un motif ‘‘VQNC’’, situé dans la portion cytoplasmique C-terminale de MARCH1, dont la valine est requise au fonctionnement optimal de la molécule. En effet, la mutation de la valine engendre une diminution de la fonction de la molécule et des expériences de BRET ont démontré une modification de l’orientation spatiale des queues cytoplasmiques. De plus, une recherche d’homologie de séquence a révélé la présence de ce même motif dans d’autres ubiquitines ligases, dont Parkin. Parkin est fortement exprimée dans le cerveau et agirait, entre autre, sur la dégradation des agrégats protéiques. La dysfonction de Parkin cause l’accumulation de ces agrégats, nommés corps de Lewy, qui entraînent des déficiences au niveau du fonctionnement neural observé chez les patients atteints de la maladie de Parkinson. La valine comprise dans le motif ‘’VQNC’’ a d’ailleurs été identifiée comme étant mutée au sein d’une famille où cette maladie est génétiquement transmise. Nous croyons que l’importance de ce motif ne se restreint pas à MARCH1, mais serait généralisée à d’autres E3 ligases. Ce projet de recherche a permis de caractériser des mécanismes de régulation de MARCH1 ainsi que de découvrir divers éléments structuraux requis à sa fonction. Nos travaux ont permis de mieux comprendre les mécanismes de contrôle de la présentation antigénique par les molécules de CMH II. / Classical MHC class II molecules are responsible for the presentation of exogenous peptides to CD4+ T cells, which is essential for the establishment of the adaptive immune response. However, problems with recognition of auto-antigens and the subsequent cell elimination are at the root of numerous autoimmune diseases. Manipulation of the antigen presentation pathway in order to eliminate cells that present self-antigens could serve as potential treatments of many autoimmune disorders. It is therefore essential to deepen our knowledge regarding the mechanisms regulating antigen presentation. Antigen presentation is regulated both transcriptionally and post-translationally. Whereas many cytokines affect the latter, IL-10, an anti-inflammatory cytokine, causes the intracellular retention of MHC II molecules. This phenotype is the result of the ubiquitination of MHC II -chain cytoplasmic tail by MARCH1. MARCH1 is an E3 ubiquitin ligase expressed in secondary lymphoid organs. Until recently, little was known about the structure-function and the targets of MARCH1. Considering its major impact on antigen presentation, we were interested to study this E3 ligase in order to reveal how it is regulated and what are the required conditions for its function. In a first report, we have investigated the regulation of MARCH1’s protein expression. Our results revealed its autoregulation via dimer formation and autoubiquitination. In addition, we have demonstrated the involvement of MARCH1’s transmembrane domains for dimerization and MHC II interaction. In a second article, we highlighted the importance of MARCH1 localization for its function. Our results indicated that localization motifs in the C-terminal portion of MARCH1 were functional and revealed the presence of some sorting elements in the N-terminal portion of the molecule. A panel of mutant were used and allowed us to identify a ‘’VQNC’’ motif, located in the C-terminal cytoplasmic portion of MARCH1, in which the valine is central for the molecule’s function. Indeed, point-mutation of the valine led to a decrease in MARCH1 ability to relocate MHC II whereas BRET experiments revealed a modification in the spatial organization of the cytoplasmic tails. Moreover, a blast of sequence homology showed the presence or that same motif in others ubiquitine ligases, one of which is Parkin. Parkin is highly expressed in the brain and seems to be implicated in protein aggregates’ degradation. It was reported that malfunction of Parkin leads to the accumulation of aggregates, called Lewy bodies, responsible for the neural functions deficiencies observed in patients with Parkinson disease. Interestingly, a family for which the sickness was genetically transmitted has a mutated valine in the VQNC motif. We believe that the importance of this motif is not restricted to MARCH1 and could be generalized to others E3 ubiquitin ligases. This project enabled us to characterize the regulation mechanisms of MARCH1. In addition, we discovered various structural elements required for its function. Altogether, our data allows for a better understanding of the mechanisms controlling MHC II molecules antigen presentation.

La maladie d'Alzheimer est la forme de démence la plus répandue au monde. Dans cette maladie, la toxicité est, entre autres, causée par l’interaction entre les oligomères du peptide Aß et la protéine prion cellulaire (PrP[indice supérieur C]). Étant ancrée à la membrane plasmique, PrP[indice supérieur C] doit passer dans la voie de sécrétion cellulaire où elle peut subir un clivage endoprotéolytique nommé clivage ?. Ce clivage libère dans le milieu extracellulaire un fragment N-terminal de PrP[indice supérieur C] nommé PrPN1. Un domaine hydrophobe de PrP[indice supérieur C] est indispensable au clivage ? ainsi qu’à sa dimérisation, mais l’effet de la dimérisation de PrP[indice supérieur C] sur le clivage ? n'a toujours pas été vérifié. À la membrane plasmique, PrP[indice supérieur C] peut également être relâché (shed PrP[indice supérieur C]). Une des fonctions attribuées aux formes sécrétées de PrP[indice supérieur C] (PrPN1 et shed PrP[indice supérieur C]) est d’inhiber la toxicité causée par les oligomères de Aß dans la maladie d'Alzheimer. En effet, plusieurs évidences in vitro montrent le potentiel neuroprotecteur de rPrPN1 et de rshed PrP[indice supérieur C] contre des oligomères de Aß synthétiques. Par contre, aucunes évidences physiologiques ne confirment le potentiel neuroprotecteur des formes sécrétées de PrP[indice supérieur C] contre Aß. De plus, il n'existe toujours aucunes évidences in vivo de l’interaction entre les formes sécrétées de PrP[indice supérieur C] et Aß. Ma première étude a permis de démontrer que la dimérisation de PrP[indice supérieur C] dans la voie de sécrétion cellulaire augmente son transport vers la membrane plasmique. Le transport accru de PrP[indice supérieur C] à travers la voie de sécrétion cellulaire se traduit par une augmentation de la sécrétion de PrPN1 et shed PrP[indice supérieur C]. L'augmentation des formes sécrétées de PrP[indice supérieur C] sous des conditions de dimérisation permet de réduire significativement la toxicité causée par Aß in cellulo. Ces résultats sont particulièrement intéressants puisqu’ils ouvrent la voie à une thérapie axée sur l’utilisation de protéines endogènes en l’occurrence PrPN1 et shed PrP[indice supérieur C] contre la maladie d'Alzheimer. Ma deuxième étude a permis de démontrer qu’une interaction physiologique entre Aß et les formes sécrétées de PrP[indice supérieur C] est possible in vivo. Ces interactions induisent un changement conformationnel important et rapide menant à la formation d'agrégats amorphes. In vivo, j'ai constaté que PrPN1 et A[beta] co-agrège dans une fraction soluble au chlorure de guanidinium. J'ai aussi observé que le clivage ? de PrP[indice supérieur C] est favorisé chez les patients atteints de la maladie d'Alzheimer. Ces résultats suggèrent que les formes sécrétées de PrP[indice supérieur C], et plus particulièrement PrPN1 issu du clivage ? de PrP[indice supérieur C], sont parties intégrantes d’un mécanisme de défense endogène et inductible contre les oligomères de Aß détournant ces espèces toxiques vers une voie alternative non-toxique.[symboles non conformes]

Les récepteurs aux hormones glycoprotéiques (rGpHs) rTSH, rFSH et rLH/CG appartiennent<p>à la classe A des GPCRs. Les récepteurs da la classe A des GPCRs sont caractérisés par la<p>similitude de séquence de leur domaine transmembranaire avec la rhodopsine. Outre ce<p>domaine dit « serpentin », qu’ils partagent avec tous les GPCRs, les rGpHs offrent la<p>particularité de présenter un grand domaine extracellulaire (ECD) responsable de la liaison et<p>de l’affinité de leurs ligands respectifs.<p>Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs) sont les cibles de 50% des médicaments<p>actuellement sur le marché pharmaceutique. La compréhension de leur mode de<p>fonctionnement est donc essentielle au développement de nouvelles molécules capables de<p>cibler spécifiquement ces récepteurs. Ces dernières années, il est apparu clairement que les<p>GPCRs étaient présent à la surface cellulaire sous forme d’oligomères. Le but de ce travail<p>était d’explorer de manière approfondie, le mécanisme d’activation et de dimérisation du<p>rTSH en identifiant les résidus du domaine transmembranaire des récepteurs aux hormones<p>glycoprotéiques impliqués dans le processus d’activation et de dimérisation.<p>Au cours de ce travail de thèse, nous avons dans premier temps généré une banque de mutants<p>aléatoires du rTSH. Ces mutants ont ensuite été criblés par une approche HTRF pour mettre<p>en évidence des mutants dont l’activité constitutive est augmentée ou ayant perdu la capacité<p>de dimériser.<p>Nous avons ainsi déterminé de nouveaux résidus importants pour le mécanisme d’activation<p>du rTSH. Les résultats que nous avons obtenus permettent d’apporter des éléments de réponse<p>et une base de travail sur le mécanisme d’activation. Cependant une description détaillée de<p>l’activation reste toutefois indéterminée. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’élastine est la protéine de la matrice extracellulaire (MEC) responsable des propriétés de résilience et d'élasticité des tissus élastiques. Durant le vieillissement, les protéines de la MEC vasculaire sont exposées à des réactions délétères qui altèrent leurs propriétés structurales et fonctionnelles. Une des caractéristiques principales des protéines de la MEC est leur longue demi-vie, associée à un renouvellement très lent, comme pour l'élastine. Ainsi, tout dommage survenant sur l'élastine est essentiellement irréparable. La fragmentation des fibres élastiques génère des peptides d’élastine (EDP) bioactifs capables de modifier le comportement des cellules environnantes en se liant au complexe récepteur de l’élastine (CRE), composé de trois sous-unités dont la neuraminidase-1 (Neu-1), sous-unité catalytique du CRE. Cette thèse a consisté en l'étude, chez la souris, du rôle des EDP dans le développement du diabète de type 2 et dans la thrombose, deux pathologies vasculaires liées à l'âge, et s'est également focalisée sur la sous-unité Neu-1 du CRE. Dans un premier temps, nous avons montré que les EDP favorisent le développement d’une insulinorésistance et d’un diabète de type 2. Cet effet implique l'interaction de Neu-1 avec la sous-unité β du récepteur à l'insuline qui diminue son niveau de sialylation altérant ses voies de signalisation. Dans un second temps, nous avons identifié un mécanisme d'action des EDP à deux niveaux (matriciel et plaquettaire) et mis en évidence la présence d'un CRE fonctionnel dans les plaquettes régulant la thrombose. Enfin, nous avons étudié la topologie membranaire de Neu-1 par différentes approches technologiques et identifié un domaine transmembranaire potentiel jouant un rôle important pour sa dimérisation et son activité sialidase. En conclusion, les EDP sont des acteurs clefs du remodelage vasculaire physiopathologique et des pathologies vasculaires associées et de contribuer à faire avancer nos connaissances sur l'organisation de Neu-1 à la membrane plasmique. / Elastin is the extracellular matrix (ECM) protein responsible for resilience and elasticity of tissues such as arteries. During ageing, vascular ECM proteins are subjected to deleterious reactions that alter their structural and functional properties (addition reactions, proteolysis). One of the main features of ECM proteins is their long half-life, associated with a low, or even, inexistent turnover. This is the case for elastin with an estimated half-life at 70 years. Therefore, any damage occurring on elastin will be mostly irreparable. Fragmentation of elastic fibers produces bioactive elastin-derived peptides (EDP) able to modify the behavior of surrounding cells by binding to the elastin receptor complex (ERC). This receptor is composed of three subunits, among which neuraminidase-1 (Neu-1) is the catalytic subunit. The aim of this thesis was to study, in mice, the role of EDP in the development of type 2 diabetes and in thrombosis, two age-related vascular diseases, and to focus on the Neu-1 subunit of the ERC. In a first time, we have shown that EDP promote the development of insulin resistance and type 2 diabetes. This effect involves Neu-1 interaction with the β subunit of the insulin receptor and leads to its reduced sialylation level and signaling. In a second time, we have demonstrated that EDP are regulators of thrombosis. We identified a two-level mechanism (matrix and platelet) and the presence of a functional ERC in platelets. Finally, we have studied the membrane topology of Neu-1 by different biophysical, biochemical and molecular biology approaches, and identified a potential transmembrane domain involved in the dimerization and sialidase activity of Neu-1. In conclusion, this thesis consolidates the concept that EDP are crucial actors of pathophysiological vascular remodeling and related vascular diseases, and expands our knowledge on the plasma membrane organization of Neu-1.

L'intégrase (IN) est une enzyme essentielle du cycle réplicatif des rétrovirus, qui catalyse l'intégration de l'ADN viral rétrotranscrit dans le génome de la cellule cible. Des données structurales, précédemment obtenues par notre équipe, ont conduit à la conception rationnelle de molécules susceptibles de bloquer l'IN sous une forme oligomérique inactive. Des tests d'intégration concertée in vitro ont permis d'étudier leur effet sur l'activité enzymatique de l'IN.Le porc est porteur d'un Gammaretrovirus endogène appelé Porcine Endogenous RetroVirus (PERV), susceptible d'être transmis à l'homme lors d'une xénotransplantation. L'étude structurale de l'IN du virus recombinant PERV-A/C a pour but de mieux comprendre son fonctionnement et de guider le développement rationnel d'inhibiteurs limitant le risque de xénozoonose. J'ai modélisé l'intasome de l'IN de PERV-A/C en complexe avec le raltégravir, un médicament utilisé comme traitement anti-VIH. J'ai ensuite mis au point des protocoles de purification permettant d'étudier le domaine carboxy-terminal (Carboxy Terminal Domain ou CTD) de l'IN de PERV-A/C isolé et en complexe avec le CTD du cofacteur cellulaire humain Brd2. L'enveloppe SAXS de ce complexe a été déterminée. En parallèle, une étude par histone array, réalisée avec le CTD seul de l'IN de PERV-A/C, a révélé un profil de spécificité pour des queues d'histones H2B et H3 portant des modifications post-traductionnelles / Integrase (IN) is an essential enzyme in retroviral replicative cycle, which catalyzes the integration of the viral DNA into the target cell genome. Structural data previously obtained by our team led to rational design of molecules likely to block IN in an inactive oligomeric form. In vitro concerted integration assays made it possible to study their effect on IN enzymatic activity. Pig has an endogenous gammaretrovirus called Porcine Endogenous RetroVirus (PERV) which can be transmitted to humans during xenotransplantation. The aim of the structural study of the recombinant virus PERV-A/C IN is to better understand its mechanism and thus guide the rational design of inhibitors limiting xenozoonosis risk. I modeled the PERV-A/C IN intasome in complex with raltegravir, a drug used for HIV treatment. Then I developed purification protocols to study the isolated and complexed PERV-A/C IN Carboxy-Terminal Domain (CTD) with the human cellular cofactor Brd2. The SAXS envelope of the complex was determined. In parallel, a histone array study, performed with the PERV-A/C IN CTD alone, revealed a specificity profile for modified H2B and H3 histone tails

L’objectif de cette thèse de doctorat vise à développer des monocouches organiques auto-assemblées (SAMs) destinées à mieux comprendre la transposition depropriétés macroscopiques observées en solution vers le milieu confiné. Dans le cadre de notre étude, nous avons synthétisé des précurseurs électroactifs (i.e. dérivés du thiophène, du pérylènediimide et du tétrathiafulvalène) comportant des mécanismes électrochimiques (i.e. schéma carré, EDimE) et des propriétés optiques (absorption et/ou émission de fluorescence) spécifiques. L’immobilisation des précurseurs sur substrats d’or à l’aide de fonctions disulfures a permis d’élaborer des SAMs. L’étude des électrodes modifiées par des méthodes électrochimiques (voltammétrie cyclique) et spectroélectrochimiques a permis d’établir des relations de type structure/propriétés et structure/réactivité. / This thesis is devoted to the elaboration of new organic self-assembled monolayers (SAMs) for a better understanding of the transposition of macroscopic properties that are well-known in solution onto metallic surface. In our study we have synthesised electroactive precursors (i.e. thiophene, perylene diimide and tetrathiafulvalene derivatives) with electrochemical mechanisms (i.e. squared scheme, EDimE) and specific optical properties (absorption and/or emission of fluorescence). The immobilization of the precursors on gold substrates was achieved using disulphide moieties to form SAMs. The study of the modified electrodes by electrochemical techniques (cyclic voltammetry) and spectroelectrochemistry helped to establish detailed structure-properties and structure-reactivity relationships, especially on mixed SAMs.

Ce mémoire présente une nouvelle méthode pour la synthèse de 1,3-énynes par dimérisation d’alcynes terminaux. La méthode de synthèse utilisée est la métallaphotorédox, une technologie qui s’est largement développée au cours des dernières années. Celle-ci nécessite l’utilisation de la lumière visible comme source d’énergie, un photocatalyseur qui peut absorber la lumière ainsi qu’un catalyseur métallique qui peut interagir avec le photocatalyseur. La dimérisation d’alcyne peut être achevée en soumettant un alcyne terminal face à de la lumière bleue en présence du photocatalyseur 4CzIPN, du catalyseur Co(BF4)2·6H2O, du ligand DPPP et de la base DIPEA qui fait office d’anode sacrificielle, dans l’acétonitrile. Les réactions d’homo-dimérisation (un alcyne avec un autre alcyne identique) fournissent des rendements de 48 à 90 % avec un rapport E:Z de >99:1 pour l’ényne formé. Des réactions d’hétéro-dimérisation (un alcyne avec un alcyne différent) peuvent également être effectuées entre un alcyne aliphatique ou aromatique et un alcyne de silyle (TMS ou TIPS) et les rendements varient de 47 à 99 % avec un rapport E:Z de >99:1 pour l’ényne formé. Cette méthodologie a ensuite été appliquée pour des réactions de macrocyclisation. Trois macrocycles à 17, 18 et 19 chaînons ont pu être synthétisés de cette manière avec des rendements respectifs de 25, 91 et 37 %. / This thesis presents a new methodology for the synthesis of 1,3-enynes by dimerization of terminal alkynes. The synthetic method used is based on metallaphotoredox, a technology that was largely developed during the last few years. The latter uses visible light as an energy source, a photocatalyst that can absorb the light and a metal-based catalyst that interacts with the photocatalyst. The dimerization of alkyne can be achieved by submitting a terminal alkyne under blue light irradiation in the presence of the photocatalyst 4CzIPN, the catalyst Co(BF4)2·6H2O, the ligand DPPP and the base DIPEA which is used as a sacrificial anode, in acetonitrile. The reactions of homo-dimerization (one alkyne with an identical alkyne) provides yields ranging from 48 to 90 % and a E:Z ratio of >99:1 for the resulting enyne. Reactions of hetero-dimerization (one alkyne with a different alkyne) can also be achieve with an aliphatic or aromatic alkyne and a silyl alkyne (TMS or TIPS) with yields ranging from 47 to 99 % and a E:Z ratio of >99:1 for the resulting enyne. This methodology was then applied for macrocyclization reactions. Macrocycles with 17-, 18- and 19- members ring were synthesized that way, with yield of 25, 91 and 37 % respectively.

La voie de signalisation RAS-ERK régule la prolifération et la différenciation cellulaire par la propagation séquentielle d’un signal jusqu’au noyau, aboutissant à la régulation des gènes cibles. Après réception d’un stimulus extracellulaire conduisant à l’activation de la petite GTPase RAS (Rat Sarcoma), la transduction du signal s’effectue par les phosphorylations successives de RAF (Rapid Accelerated Fibrosarcoma), MEK (MAPK/ERK Kinase 1/2) et ERK (Extracellular signal-Regulated Kinase 1/2). Chez les mammifères, la famille élargie des protéines RAF comprend les trois kinases ARAF, BRAF, CRAF et les pseudokinases KSR1, KSR2 pour Kinase Suppressor of Ras 1/2. En l’absence de stimuli, les kinases RAF adoptent une forme auto-inhibée où leur région régulatrice N-terminale (N-terminal Region ou NTR) inhibe l’activité catalytique de leur domaine kinase (Kinase Domain ou KD). L’activation des GTPases RAS ancre les kinases RAF à la membrane plasmique via le domaine RBD (Ras Binding Domain) de leur NTR. Ce phénomène favorise la dérépression des KD et dévoile leur interface de dimérisation. L’association de deux protéines RAF l’une avec l’autre induit l’activation des kinases RAF et la phosphorylation de leur substrat MEK. Bien que dénuées d’activité kinase intrinsèque, les pseudokinases KSR sont néanmoins capables de dimériser avec les kinases RAF et de les activer. Des mutations des protéines clés de la voie RAS-ERK conduisent à son activation anormale et sont directement responsables du développement et de la progression tumorale. Notamment, la kinase BRAF est altérée dans 7 % des cancers. L’échec des stratégies thérapeutiques permettant d’inhiber les kinases RAF a mis en lumière l’importance de la dimérisation dans la régulation de leur activité. Ainsi, les processus favorisant la formation d’hétérodimères RAF/KSR ne sont, à ce jour, pas bien compris. La problématique de la thèse a été d’identifier les mécanismes moléculaires régissant la formation spécifique du dimère BRAF/KSR1 aboutissant à la phosphorylation du substrat MEK1. Les objectifs de la thèse ont donc été 1) de déterminer ce qui permet au substrat MEK1 de se lier aux différentes protéines de la famille RAF, 2) d’identifier les domaines nécessaires à l’interaction spécifique de BRAF et KSR1, 3) de développer des stratégies de purification du dimère BRAF/KSR1 pour en faire une analyse structurale. Ce travail a dans un premier temps montré que le substrat MEK1 est l’activateur de sa propre kinase BRAF, en favorisant sa transactivation par KSR1 via des interactions au niveau des domaines kinases. De manière inattendue, nous avons par la suite établi que ce sont les NTR des protéines BRAF et KSR1 qui guident leur hétérodimérisation. Le dimère BRAF/KSR1 repose ainsi sur l’interaction directe du domaine BRS de BRAF et du domaine CC-SAM de KSR1. Nous avons montré que le domaine CRD de BRAF exerce une influence sur l’interaction BRS/CC-SAM et par extension, sur la dimerisation de BRAF avec KSR1. Enfin, nous avons testé plusieurs stratégies de purification du dimère BRAF/KSR1 qui nous ont permis d’optimiser une technique de purification à partir de cellules de mammifères et de générer des constructions pour des cellules d’insectes. Ainsi, ce travail nous a permis d’améliorer la compréhension des mécanismes de formation de l’hétérodimère BRAF/KSR1 et son lien avec le substrat MEK1. Nous avons découvert des nouveaux moyens de régulation de la signalisation RAS-ERK. À terme, les résultats obtenus s’avèreront utiles pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques efficaces pour inhiber la voie RAS-ERK dans des contextes pathologiques. / The RAS-ERK signaling pathway regulates cell proliferation and differentiation by signal propagation from the cell surface to the nucleus, resulting in the regulation of targeted genes. After receiving an extracellular stimulus leading to the activation of the small GTPase RAS (Rat Sarcoma), signal transduction is mediated by the successive phosphorylations of RAF (Rapid Accelerated Fibrosarcoma), MEK (MAPK/ERK Kinase 1/2) and ERK (Extracellular signal-Regulated Kinase 1/2) kinases. In mammals, the extended family of RAF proteins is comprised of the three kinases ARAF, BRAF, CRAF and the two pseudokinases KSR1, KSR2 from Kinase Suppressor of Ras 1/2. In the absence of a stimulus, RAF kinases are in an auto-inhibited conformation wherein their N-terminal regulatory region (NTR) inhibits the catalytic activity of their kinase domain (KD). Activation of the RAS GTPases anchors RAF kinases to the plasma membrane through binding of the RBD (Ras Binding Domain), present in their NTR. This phenomenon induces the release of the KDs and unveils their dimerization interfaces. The association of two RAF proteins with each other stimulates the activation of RAF kinases and the phosphorylation of their substrate MEK. Although lacking an intrinsic kinase activity, KSR pseudokinases are nevertheless able to stimulate RAF kinase activity through dimerization and transactivation. Mutations of core members of the RAS-ERK pathway led to its abnormal activation and are directly responsible for tumor development and progression. In particular, the BRAF isoform is mutated in 7 % of cancers. Unsuccessful therapeutic strategies developed to inhibit RAF kinases have highlighted the importance of dimerization in the regulation of the catalytic activity of RAF kinases. Moreover, the process favoring the formation of RAF/KSR heterodimers is not fully understood. The focus of this Ph.D. was to identify the molecular mechanisms governing the specific formation of the BRAF/KSR1 dimer leading to the phosphorylation of the MEK1 substrate. Our main objectives were therefore to 1) determine what allows the substrate MEK1 to bind to the different members of the RAF family of proteins, 2) identify the domains necessary for the specific interaction of BRAF and KSR1 3) develop a new approach to purify the BRAF/KSR1 dimer for structural analysis. This work showed that the substrate MEK1 stimulates the activation of its own kinase, by promoting BRAF transactivation by KSR1 through interactions at the kinase domain level. Unexpectedly, we subsequently established that the NTRs of BRAF and KSR1 guide their heterodimerization. BRAF/KSR1 dimer formation is thus based on direct interaction of the BRS domain of BRAF and the CC-SAM domain of KSR1. We then showed that the CRD domain of BRAF has an influence on the BRS/CC-SAM interaction which overall modulates the dimerization of BRAF with KSR1. Finally, we tested several BRAF/KSR1 dimer purification strategies that allowed us to optimize a purification technique from mammalian cells. We also generated constructs enhanced for insect cells expression in the hope of successfully stabilizing BRAF/KSR1 in a signaling complex. Thus, this work allowed us to improve the understanding of the mechanisms underlying the formation of BRAF/KSR1 heterodimer and its link with its MEK1 substrate. We have discovered new ways of regulating the RAS-ERK signaling pathway. Ultimately, theses results will prove useful for the development of new effective therapeutic strategies to inhibit the RAS-ERK pathway in pathological contexts.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.