Experiment s were conducted to see if Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. overwinters inside living host tissue in Utah. Bacteria, collected from apple, pear, mountain ash, chokecherry and Pyracantha, were used in the experiment. Isolates taken from buds and inner bark plated on nutrient yeast dextrose agar, we re tested by serological and bacteriophage techniques. Those showing positive tests were then inoculated into Bartlett pear seedlings to test virulence. Both virulent and avirulent isolates were isolated from each species of plant in the experiment. Pathogenic bacteria were isolated from diseased tissue near cankers, as well as from apparently healthy inner bark as far as six inches below the cankers. Pathogenic bacteria were also isolated from healthy appearing buds in the vicinity of cankers. Nearly 15 percent of isolates from hosts other than apple and pear were pathogenic to Bartlett pear seedlings. A good deal of variation existed among the bacterial isolates. Antisera developed from four isolates of Erwinia amylovora proved to be a good means of identification for the pathogen.

According to CDC, every year at least 2 million people are affected and 23,000 dies as a result of antibiotic resistance in U.S. It is considered one of the biggest threats to global health. More and more bacterial infections are becoming harder to treat. One such infection is fire blight, one of the most destructive disease of apple and pear trees. It is caused by bacteria Erwinia amylovora and its outbreaks have been known to destroy entire orchards in a single season. The conventional method of treatments includes use of antibiotics like streptomycin and oxytetracycline but the incidences like presence of multi-drug resistant bacteria in the mammals grazing in the fields have raised concerns. Phage therapy is considered one of the few ways available to combat bacterial resistance and prevent fire blight. In this method, a cocktail of highly lytic bacteriophages is prepared and sprayed on the trees at different time intervals. Bacteriophages are an “intelligent” drug. They multiply at the site of the infection until there are no more bacteria and then they are excreted back into the nature. These phenomena make them more efficient than an antibiotic, which kills all kind of bacteria including good bacteria and can be maintained in the environment for long periods of time. These qualities of bacteriophage have resulted in many commercially available phage therapies. The initial part of this research focuses on isolation, characterization and genomic comparison of bacteriophages that infect a plant pathogen E.amylovora of Erwiniaceae family of Enterobacteriales order. In this study, 28 novel bacteriophages were isolated, fully sequenced, characterized and grouped into seven families based on phage homology. To take this further, we characterized a novel jumbo family of bacteriophages that has a small burst size of 4.6-4.9 and are most similar to bacteriophages that infect Pseudomonas and Ralstonia rather than Enterobacteriales bacteria by protein similarity. These bacteriophages are shown to infect Erwinia and Pantoea bacterial strains, but no infection of 9 other bacterial strains tested, was seen, under laboratory conditions. The results of this work provide an insight on special characteristics that makes bacteriophage so unique and adaptable. The final part of this research explores the enormous diversity of bacteriophages. In 2014 Grose and Casjens grouped 337 fully sequenced tailed phages into 56 diverse clusters (32 lytic and 24 temperate). We further expanded our current understanding of these clusters by performing the comprehensive analysis of genomes and proteomes of 1037 tailed bacteriophages, posted on GenBank. The results of this work provide insights into diversity and relatedness of bacteriophages and the data is posted on GenBank.

El fuego bacteriano de las rosáceos es una enfermedad de fácil diseminación dificil control que afecta a los frutales de pepita, principalmente peral y manzano, y a plantas ornamentales. El agente etiológico de esta enfermedad es Erwinia amylovora, una enterobacteria considerada como organismo de cuarenta en la Unión Europea.Esta bacteria ha sido identificada en la mayoría de los paises del centro y norte de Europa, y en los últimos veinte años también se ha extendido por los países del Mediterráneo. en España, se han detectado diversos focos desde 1995, en distintos hospedadores procedentes de varias Comunidades Autonómas, habiéndose aplicado programas intensivos de erradicación en casi todas ellas. En esta investigación se ha llevado a cabo una caracterización fenotípica y genotípica de una amplia colección de aislados españoles de E. Amylovora de diversos orígenes geográficos, hospedadores y años de aislamiento. La evaluación de los datos obtenidos, tras la realización de análisis fisiológicos, bioquímicos y moleculares de las cepas españolas, ha mostrado su escasa diversidad fenotípica y genotípica. No obstante, los resultados de la cracterización molecular mediante electroforesis en campo pulsante y otras técnicas, apoyan dos hipotesis sobre el origen y la diseminación del fuego bacteriano en nuestro país; en primer lugar, la introducción de material vegetal infectado procedente de otros países de Europa como posible responsable de varios de los focos de infección de esta enfermedad en España, y en segundo lugar, la existencia de, al menos, tres fuentes de inóculo distintas. Por otro lado, la primera descripción de una cepa de E. amylovora que carece del plásmido PEA29 de forma natural, representa una novedad con implicaciones importantes para el diagnóstico molecular de la enfermedad, asi como para la hipótesis acerca del papel de este plásmido en la virulencia del patógeno del fuego bacteriano. / Donat Luis, MV. (2004). Caracterización fenotípica y genotípica de aislados españoles de Erwinia amylovora [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/1859

Erwinia amylovora, a quarantine organism of the European Union (EU), is the causal agent of fire blight. This disease causes substantial economic losses in all countries where it is present and its control turns out difficult, due to the absence of effective chemical and biological treatments and the ability of persistence and dissemination of E. amylovora. Cupric treatments constitute the base of the integrated management of fire blight in the European Union countries, because the antibiotics, although have been proved useful against this disease, are forbidden in the EU for plant treatments. This thesis, mostly performed in a P2 security lab, is aimed to dilucidate molecular mechanisms implicated in the response of E. amylovora to copper sulfate as a stress factor, considering that copper is a well known toxic element for bacterial cells over a certain threshold concentration. The global objective was first addressed with the study of a selection of genes that have been related in other bacterial models with copper stress or with stress in general. The quantification of the rpoS gene expression in presence of copper showed that, at least in long-term survival, this gene may be involved in the E. amylovora response to copper stress. Second, a transcriptomic study was performed by microarray after subdue the bacteria to a copper shock treatment. The analysis of the microarray results showed that 44 genes were differentially expressed in presence of this metal. Each one of these genes was studied by gene ontology and, after comparing them with databases published in NCBI, they were classified in functional categories. The gene expression of twenty-five out of fourty-four differentially expressed genes was validated by real-time PCR. In the validation, copA gene was expressed more than 19-fold in presence than in absence of copper and, because of that, it was selected together with other seven genes (soxS, yjcE, ygcF, yhhQ, galF, arcB, EAM_3469), which also showed an increased expression, to generate mutants of E. amylovora. The responses of mutants to copper, and the fact that the wild phenotype was restored in the complemented mutants, has shown the role of copA, soxS, yjcE, ygcF, arcB and yhhQ genes in the E. amylovora in vitro survival against copper stress. Besides, the implication of copA gene has also been proved in planta, in copper treated shoots from pear trees. Finally, all the results obtained along this thesis have allowed to elaborate a putative model of the different genetic mechanisms that seem are involved in the interaction between E. amylovora and copper. The most important mechanism seems to be to face up reactive oxygen species (ROS) by the activation of the soxS and yjcE genes. The activity of these genes is supported by CopA protein, which pumps copper from inside the cell out to the periplasmic space. The activation of arcB gene, which allows the change from aerobic metabolism to anaerobic metabolism, would also help E. amylovora to reduce ROS. Taking together, the results of this thesis have allowed an approximation to the genetic basis of E. amylovora response to copper stress and they constitute a start point to move forward in the knowledge of the molecular mechanisms underlying that response. / Erwinia amylovora, organismo de cuarentena en la Unión Europea (UE), es el agente causal del fuego bacteriano. Esta enfermedad produce grandes pérdidas económicas en todos los países en los que está presente y su control resulta muy difícil, debido a la carencia de tratamientos químicos y biológicos eficaces y a la persistencia y facilidad de diseminación de E. amylovora. Los tratamientos con compuestos cúpricos constituyen la base de la gestión integrada del fuego bacteriano en los países de la UE, puesto que el uso de antibióticos, aunque se ha demostrado útil contra esta enfermedad, está prohibido en la UE para el tratamiento de bacteriosis en plantas. Esta tesis, realizada en su mayoría en un laboratorio de seguridad biológica P2, pretende dilucidar mecanismos moleculares implicados en la respuesta de E. amylovora al sulfato de cobre como factor de estrés, ya que este metal es un elemento tóxico para las células bacterianas por encima de una determinada concentración umbral. El objetivo global se abordó, en primer lugar, con el estudio de una selección de genes que se han relacionado en otros modelos bacterianos con el estrés que produce el cobre o con el estrés en general. La cuantificación de la expresión del gen rpoS en presencia de cobre mostró que este gen puede estar implicado en la supervivencia a largo plazo de E. amylovora para combatir el estrés que produce este metal. En una segunda aproximación, se realizó un estudio transcriptómico mediante microarray tras someter a la bacteria a un breve tratamiento de cobre. El análisis de los resultados del microarray reveló que 44 genes se expresaban de forma diferencial en presencia del metal. Cada uno de ellos se estudió mediante gene ontology y por comparación con las bases de datos publicadas en el NCBI, y así se clasificaron en categorías funcionales. Las categorías de estrés y transporte fueron las más abundantes, tanto respecto a los genes que aumentaron su expresión tras la aplicación de cobre como a los que la disminuyeron. De los 44 genes que se expresaron de forma diferencial, se validó la expresión de 25 de ellos por PCR en tiempo real. En dicha validación, el gen copA se expresó 19 veces más en presencia que en ausencia de cobre, por lo que fue seleccionado, junto con siete genes más (soxS, yjcE, ygcF, yhhQ, galF, arcB, EAM_3469), en los que el incremento en la expresión fue menos pronunciado, para generar mutantes de E. amylovora. La respuesta de los mutantes a la presencia de cobre, y la restauración de fenotipos al complementar las mutaciones generadas, han revelado el papel de los genes copA, soxS, yjcE, ygcF, arcB y yhhQ en la supervivencia in vitro de E. amylovora frente al estrés por cobre. Además, la implicación del gen copA se ha demostrado también in planta en brotes de peral tratados con cobre. Finalmente, todos los resultados obtenidos han permitido elaborar un posible modelo de los diferentes mecanismos genéticos que parecen estar implicados en la interacción de E. amylovora con el cobre. El mecanismo más importante parece ser combatir las especies reactivas del oxígeno (ERO), mediante la activación de la expresión de los genes soxS e yjcE. La actividad de estos genes está apoyada, además, por la proteína CopA, que bombea cobre desde el interior celular al espacio periplásmico. La activación del gen arcB, que permite el cambio de un metabolismo aerobio a uno anaerobio, también ayudaría a la reducción de las ERO. En definitiva, los resultados han permitido una aproximación al sustrato genético de la respuesta de E. amylovora al estrés por cobre, y constituyen un punto de partida para avanzar en el conocimiento de los mecanismos moleculares implicados en dicha respuesta. / E. amylovora, organisme de quarantena a la Unió Europea (UE), és l'agent causal del foc bacterià. Aquesta malaltia produeix grans pèrdues econòmiques a tots els països on està present, i el seu control resulta molt difícil, a causa de l' absència de productes químics i biològics eficaços i també per la capacitat de persistència i disseminació d'E. amylovora. Els tractaments amb composts cúprics constitueixen la base de la gestió integrada del foc bacterià als països europeus, ja que l'ús d'antibiòtics, tot i que s'ha demostrat eficaç per a combatre aquesta malaltía, està prohibit a la UE per al tractament de bacteriosi en plantes. Aquesta tesi, realitzada majoritàriament a un laboratori de seguretat biològica P2, pretén dilucidar mecanismes moleculars implicats en la resposta d'E. amylovora davant del coure com a factor d'estrés, ja que el coure és un element tòxic per la cèl.lula per damunt d'una determinada concentració umbral. L'objectiu global es va abordar, en primer lloc, amb l'estudi d'una selecció de gens relacionats en altres models bacterians amb l'estrés que produeix el coure, o amb l'estrés en general. La quantificació de l'expressió del gen rpoS en presència de coure va mostrar que aquest gen pot estar implicat en la supervivència a llarg termini d'E. amylovora per a combatre l'estrés que produeix aquest metall. En una segona aproximació, es va realitzar un estudi transcriptòmic mitjançant microarrays després de sotmetre els bacteris a un breu tractament de coure. L'anàlisi dels resultats dels microarrays va revelar que 44 gens s'expressen de forma diferencial en presència del metall. Cadascun d'ells es va estudiar mitjançant gene ontology i, per comparació amb les bases de dades publicades al NCBI, es van classificar en categories funcionals. Les categories d'estrés i transport van ser les més enriquides, tant en els gens que augmentaren la seua expressió després de l'aplicació de coure com en aquells que la van reduir. Dels 44 gens que s'expressaren de forma diferencial, es va validar l'expressió de 25 d'ells per PCR a temps real. En la validació, el gen copA es va expressar 19 vegades més en presència que en absència de coure, per aquesta raó va ser seleccionat junt amb set gens més (soxS, yjcE, ygcF, yhhQ, galF, arcB, EAM_3469), en els que l'increment de l'expressió va ser menys pronunciada, per a generar mutants d'E. amylovora. La resposta dels mutants a la presència de coure, i la restauració dels fenotips originals al complementar les mutacions generades, han revelat el paper dels gens copA, soxS, yjcE, ygcF, arcB i yhhQ en la supervivència in vitro d'E. amylovora davant a l'estrés per coure. A més a més, la implicació del gen copA s'ha demostrat també in planta, en brots de perera tractats amb coure. Finalment, tots els resultats obtinguts han permès elaborar un possible model dels diferents mecanismes genètics que semblen estar implicats en la interacció d'E. amylovora amb el coure. El mecanisme més important sembla ser combatre les especies reactives de l'oxigen (ERO), mitjançant l'activació de l'expressió dels gens soxS i yjcE. L'activitat d'aquestos gens és recolzada també per l'acció de la proteïna copA, que bombeja coure des de l'interior cel.lular a l'espai periplàsmic. L'activació del gen arcB, que permet el canvi d'un metabolisme aerobi a un metabolisme anaerobi, també ajudaria a reduir la producción de les ERO. En conclusió, els resultats han suposat una aproximació al substrat genètic de la resposta d'E. amylovora a l'estrés per coure, i constitueixen un punt de partida per avançar en el coneixement dels mecanismes moleculars implicats en aquesta resposta. / Águila Clares, B. (2017). Elucidating the molecular basis of copper stress in Erwinia amylovora [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/81658

Tesis por compendio / Fire blight is considered the most serious disease affecting pome fruit and ornamental and wild rosaceae. The causal agent is the bacterium Erwinia amylovora, considered a quarantine organism in the EU. This species has been extensively studied, but at the genomic level there is still much to know, as there are currently only two genomes published and another thirteen were assembled in scaffolds. Its pangenoma is considered open, although with a core with a high sequence identity. There is very little intraspecific variability, which is manifested in a low genotypic diversity, being noticed that the plasmids are the major source of genetic variability. This could explain the differences in virulence in strains, as well as their better adaptation to the different environmental conditions. The plasmid pEA29 described in the majority of the strains of E. amylovora, and with a quantitative effect in virulence, was not found in some Spanish isolates of the bacterium. The study of these strains gave way to the discovery of another plasmid, pEI70, which is present in strains of several European countries. After pEA29, pEI70 is the one with the highest presence. The function, distribution and genetic content of this plasmid, as well as the effect of pEA29 and pEI70 on the expression of the chromosomal genes in strain bearing them, have been studied. The inoculation experiments on fruit with the strains to which the plasmid pEI70 or pEA29 had been introduced compared to that same strain without plasmids showed an increase in virulence, which was manifested in a reduction in the time of the emergence of symptoms and in which they appeared more aggressively. An experiment was carried out using a microarray, in order to study if the presence of each one of these plasmids could affect the expression on certain chromosomal genes that would explain that variation in virulence of the carrier strain, using a microarray. The results demonstrated the role of both plasmids to affect gene expression, between 120 and 180 chromosomal genes according to the plasmid carrying the strain, in each case enriching different functional categories, although 28 of them were coincident in the two cases. E. piriflorinigrans is a newly described pathogenic species that produces necrosis only in pear blossoms but does not appear to affect other organs. Both species share phenotypic and molecular characteristics, making their distinction difficult. Its detection and correct identification was a challenge because the symptoms it causes are practically indistinguishable from those caused by E. amylovora. In this work new plasmid pEPIR37 found in this new species was studied also. This is present in all analyzed strains. When this plasmid was introduced into strains of the species E. amylovora cured of plasmids, they showed an increase in virulence comparable to that observed with pEA29, suggesting that pEPIR37 produces a similar effect. Two specific and sensitive real-time and conventional PCR protocols have also been developed to identify, detect and differentiate E. piriflorinigrans from E. amylovora and other species of this genus using primers designed from specific sequences, annoted in this same work, from plasmid pEPIR37. This has allowed to identify this new species in other hosts as Pyracantha sp., besides pear tree and in other regions where previously it had not been detected. Likewise, these results have allowed to know biological and epidemiological aspects of E. piriflorinigrans that contribute to have new key scientific information to establish strategies for its control in pome fruit trees. The study of the plasmids and their functions in these two phylogenetically related species and their role in the adaptation to the environment in which these species live, as well as in the virulence of the strains that carry them, could give new clues about the origin of both pathogens, their evolution, their biological cycle and interaction with the host plant / El fuego bacteriano está considerada la enfermedad más grave que afecta a frutales de pepita y rosáceas ornamentales y silvestres. El agente causal es la bacteria Erwinia amylovora, perteneciente a la familia Erwiniaceae, organismo de cuarentena en la UE. Esta especie ha sido ampliamente estudiada, pero a nivel genómico todavía queda mucho por conocer, ya que en la actualidad existen únicamente dos genomas completamente secuenciados y anotados, y otros trece en scaffolds, de cepas de E. amylovora de diferentes orígenes geográficos y huéspedes. Su pangenoma se considera abierto, aunque con un core con una alta identidad de secuencia en estas cepas. Existe muy poca variabilidad intraespecífica, lo que se manifiesta en una escasa diversidad genotípica, advirtiéndose que los plásmidos son la mayor fuente de variabilidad genética que podría explicar las diferencias en virulencia en cepas portadoras de plásmidos, así como su mejor adaptación a diferentes condiciones ambientales. El plásmido pEA29 descrito en la mayoría de las cepas de E. amylovora, y con un efecto cuantitativo en virulencia. El estudio de estas cepas sin plásmido dio paso al descubrimiento de otro plásmido que se ha denominado pEI70, presente en cepas de varios países europeos. Se ha estudiado su función, distribución y contenido genético, así como el efecto del pEA29 y del pEI70 sobre la expresión de los genes cromosómicos de la cepa que los porta, tras la infección en fruto inmaduro. Los experimentos de inoculación con las cepas a las que se les había introducido el plásmido pEI70 o el pEA29, en comparación con esa misma cepa sin plásmidos, mostraron un aumento de la virulencia. Por todo ello, con el fin de estudiar si la presencia de cada uno de estos dos plásmidos podría producir efectos sobre determinados genes cromosómicos que explicarían esa variación en virulencia, se realizó un experimento de expresión génica diferencial usando un microarray. Los resultados demostraron el papel de ambos plásmidos al afectar a la expresión de entre 120 y 180 genes cromosómicos según el plásmido que porte la cepa, enriqueciéndose en cada caso categorías funcionales diferentes. Por otro lado, E. piriflorinigrans es una especie patógena descrita recientemente que produce necrosis sólo en las flores de peral, pero no parece afectar a otros órganos. Además, ambas especies comparten características fenotípicas y moleculares. Su detección y correcta identificación era un reto debido a que los síntomas que provoca en flores son prácticamente indistinguibles a los causados por E. amylovora. Se ha estudiado el contenido genético de un plásmido de 37 Kb, pEPIR37 presente en todas las cepas analizadas de la especie. Además, se ha observado que cuando este plásmido es introducido en cepas de la especie E. amylovora curadas de plásmidos, mostraron un nivel de virulencia mayor, comparable a la observada en las cepas portadoras del plásmido pEA29, lo que parece indicar que este plásmido produce un efecto similar. En este trabajo también se han desarrollado dos protocolos específicos y sensibles de PCR en tiempo real y convencional para identificar, detectar y diferenciar E. piriflorinigrans de E. amylovora y de otras especies de este género, usando secuencias específicas del plásmido pEPIR37. Ello ha permitido identificar esta nueva especie en otros huéspedes como en otras regiones en donde no se había detectado. Asimismo, estos resultados han permitido conocer aspectos biológicos y epidemiológicos de E. piriflorinigrans que aportan nueva información científica que resultaría para establecer estrategias para su control. El estudio de los plásmidos y sus funciones en estas dos especies tan relacionadas filogenéticamente y su papel en la adaptación al medio en el que ambas habitan, así como en la virulencia de las cepas que los portan, podría dar nuevas pistas sobre el origen de estos patógenos, su evolución / El foc bacterià està considerada la malaltia més greu que afecta arbres fruiters de pinyol i rosàcies ornamentals i silvestres. L'agent causal d'aquesta malaltia és el bacteri Erwinia amylovora, organisme de quarantena a la UE. Aquesta espècie ha estat àmpliament estudiada, però a nivell genòmic encara queda molt per conèixer, ja que en l'actualitat únicament existeixen dos genomes publicats, i altres tretze assemblades scaffolds. El seu pangenoma es considera obert, tot i que aquests soques posseeixen un core amb una alta identitat de seqüència. Hi ha molt poca variabilitat intraespecífica, el que es manifesta en una escassa diversitat genotípica, advertint-se que els plasmidis són la major font de variabilitat genètica que podria explicar les diferències en virulència a les soques, així com la seua millor adaptació a les condicions ambientals. El plasmidi pEA29 descrit en la majoria de les soques d'E. amylovora, i amb un efecte quantitatiu en virulència, no es va trobar en alguns aïllats espanyols del bacteri, donant pas al descobriment d'un altre plasmidi, pEI70. Per això, després del pEA29, el plasmidi pEI70 és el de major. S'ha estudiat la funció, distribució i contingut genètic d'aquest plasmidi, així com l'efecte del pEA29 i del pEI70 sobre l'expressió dels gens cromosòmics. Els experiments d'inoculació en fruit amb les soques amb els plasmidis van mostrar un augment de la virulència, que es manifestava en una reducció en el temps de l'aparició de símptomes i en què aquests es presentaven de forma més agressiva. Per tal d'estudiar si la presència de cada plasmidi podria produir efectes sobre determinats gens cromosòmics que explicarien aquesta variació en virulència de la soca portadora, es va realitzar un experiment d'expressió genètica diferencial mitjançant un microarray. Els resultats obtinguts van demostrar el paper dels dos plasmidis en afectar l'expressió d'entre 120 i 180 gens cromosòmics segons el plasmidi que porta la soca, enriquint-se en cada cas categories funcinals diferents, tot i que 28 d'ells van ser coincidents en els dos casos. E. piriflorinigrans és una espècie patògena descrita recentment que produeix necrosi només en les flors de perera. Les dues espècies comparteixen característiques fenotípiques i moleculars, fent difícil la seua distinció. La seua detecció i correcta identificació era un repte. En aquest treball també s'ha avaluat el contingut genètic d'un plasmidi de 37 Kb, anomenat pEPIR37, present en totes les soques analitzades de l'espècie E. piriflorinigrans, i a més s'ha observat que quan aquest plasmidi era introduït en soques de l'espècie E. amylovora curades de plasmidis, que per això tenen una virulència reduïda, van mostrar una virulència major, comparable amb l'observada en les soques portadores del plasmidi pEA29, el que indicaria que aquest plasmidi produeix un efecte similar.Per tot això en aquest treball també s'han desenvolupat dos protocols específics i sensibles de PCR en temps real i convencional per identificar, detectar i diferenciar E. piriflorinigrans d'E. amylovora i d'altres espècies d'aquest gènere, usant iniciadors dissenyats a partir de seqüències específiques, anotades en aquest mateix treball, del plasmidi pEPIR37. Això ha permès identificar aquesta nova espècie a altres hostes com Pyracantha sp., a més de perera i en altres regions on anteriorment no s'havia detectat. Així mateix, aquests resultats han permès conèixer aspectes biològics i epidemiològics d'E. piriflorinigrans que aporten nova informació científica clau per establir estratègies per al seu control en arbres fruiters de pinyol. L'estudi dels plasmidis i les seues funcions en aquestes dues espècies tan relacionades filogenèticament i el seu paper en l'adaptació al medi on habiten, així com en la virulència de les soques que els porten, podria donar noves pistes sobre l'origen dels dos patògens, la seua evolu / Barbé Martínez, S. (2017). Función y origen de los plásmidos en especies de Erwinia patógenas y epífitas de frutales de pepita [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/86146 / Compendio

Le feu bactérien et le psylle causent d’importantes pertes économiques dans les zones de production du poirier dans le monde entier. Le développement de nouvelles variétés de poirier résistantes à ces bio-agresseurs constitue un enjeu majeur dans le cadre d’un programme de lutte intégrée. L’objectif de ce projet de thèse est l'étude du déterminisme génétique de la résistance vis-à-vis de ces deux bio-agresseurs. La thèse a été réalisée dans le cadre d’une collaboration internationale entre Fondazione Edmund Mach (Italie), Institut de Recherches en Horticulture et Semences (France) et Plant & Food Research (Nouvelle-Zélande). Une descendance interspécifique de poirier T003 x ‘Moonglow’ a été développée avec pour objectif de cumuler les résistances au feu bactérien et au psylle provenant de variétés asiatiques et européennes de Pyrus. Deux cartes génétiques ont été élaborées pour T003 et ‘Moonglow’ sur la base de marqueurs SNP (Single Nucleotide Polymorphism) et SSR (microsatellite), et la cartographie de QTLs (Quantitative Trait Loci) a permis de démontrer le déterminisme polygénique de la résistance à ces bio-agresseurs. Une sélection assistée par marqueurs (MAS) peut donc être engagée pour ces deux caractères. Des incompatibilités génétiques ont aussi été observées dans une partie de la descendance, ce qui a permis de cartographier pour la première fois chez le poirier les zones du génome liées au phénomène de « nécrose hybride ». Le développement de marqueurs liés aux gènes létaux devrait permettre aux sélectionneurs d’éviter les combinaisons incompatibles en croisement qui peuvent impacter certains caractères agronomiques co-ségrégant avec ces gènes létaux. / The goal of this PhD project was to study the genetic architecture of pear resistance to two of its most significant diseases and pests, fire blight and psylla, which cause severe yield losses in all the main pear production regions worldwide. The development of new pear varieties with resistance against these two biotic stresses is of major interest for Integrated Pest Management. This project was designed in a joint collaboration among Fondazione Edmund Mach (Italy), Institut de Recherches en Horticulture et Semences (France) and Plant & Food Research (New-Zealand). The interspecific pear F1 progeny T003 x ‘Moonglow’ was developed with the purpose of cumulating resistances to fire blight and psylla deriving from Asian and European pear cultivars. Single nucleotide polymorphism (SNP) and simple sequence repeat (SSR)-based genetic maps were built for T003 and ‘Moonglow’. Quantitative Trait Loci (QTLs) were detected for the resistances, demonstrating their polygenic nature. Marker-assisted selection (MAS) can now be applied for these two traits. Furthermore, the segregating population exhibited genetic incompatibilities, and the genomic regions associated with hybrid necrosis were mapped for the first time in pear. Development of molecular markers linked to the lethal genes should allow breeders to avoid crosses leading to incompatible combinations that could affect the expression of important agronomic traits co-segregating with these genes.

Depuis la domestication du pommier, l’homme a progressivement sélectionné des variétés plus performantes, notamment pour la qualité du fruit, la productivité ou la résistance aux pathogènes. Les bases génétiques de ces caractères ont été explorées par cartographie en descendances F1 ne permettant d’explorer qu’une infime partie de la diversité génétique disponible.L’objectif de la thèse portait sur l’analyse des bases génétiques de caractères de qualité du fruit et de résistance du pommier à la tavelure et au feu bactérien dans des collections représentant une diversité plus large. Le génotypage de core collections de variétés anciennes s’est fait à l’aide de deux puces 8k et 480kSNPs ou grâce à du ré-séquençage de gènes. Des traces de différenciation génétique entre pommes à cidre et à couteau ont été identifiées et partiellement reliées à la voie des polyphénols. Après analyse de l’étendue du déséquilibre de liaison à large et fine échelle, une approche de génétique d’association a permis l’identification de régions génomiques associées à la variation de plusieurs caractères de qualité du fruit, dont le haut du groupe de liaison 16 rassemblant l’acidité (locus Ma), la fermeté, la jutosité et l’amertume (gène LAR). Pour la résistance au feu bactérien, une région contenant un homologue du gèneNPR1 (activateur de défenses) a été identifiée.Cette thèse a ainsi permis de préciser la localisation potentielle de QTLs identifiés préalablement par cartographie génétique et d’identifier de nouvelles ressources utiles dans de futurs programmes de sélection assistée par marqueurs. / Since apple domestication, humans have progressively selected improved varieties, especially for traits linked with fruit quality, productivity or resistance to pathogens. The genetic bases underlying these traits have been explored thanks to genetic mapping in F1 segregating populations that only allows the study of a small part of the available genetic diversity. The aim of this work was to analyze the genetic bases of fruit quality and disease resistance against apple scab and fire blight, in collections of old apple varieties representing a much larger diversity. Genotyping of core collections was performed either with arrays of 8k and 480k SNPs or by resequencing of chosen genes. Signs of genetic differentiation were identified between cider and dessert apples and were partially linked to the polyphenols pathway. After studying linkage disequilibrium, both on a large and a small scale, an association genetics approach allowed the identification of genomic regions associated with the variation of several fruit quality traits. Especially, the top of linkage group 16 was found to be linked with acidity (locus Ma), firmness, juiciness and bitterness (LAR gene). Concerning the resistance of apple to fire blight, a region containing a homolog of the NPR1 gene (defense activator) was identified. This thesis allowed the refining of the putative localization of previously identified QTLs and the identification of new genetic resources that could be useful in future selection programs using marker assisted selection.

Le feu bactérien des Maloideae est provoqué par Erwinia amylovora, gamma-protéobactérie dont le pouvoir pathogène repose un système de sécrétion de type trois (T3SS). Des travaux antérieurs ont révélés que des mutants hrp de régulation de ce système (hrpL, hrpS), avirulents, sont capables de protéger la plante d'une infection par la souche sauvage. Nous avons d'abord voulu savoir si la protection est due à une induction de défenses chez la plante. L'étude de l'expression de gènes de défense dépendants des voies de l'acide salicylique, de l'acide jasmonique, de l'éthylène et des phénylpropanoïdes montre qu'aucune de ces voies n'est particulièrement induite par les mutants de régulation. Puis après avoir écarté l'hypothèse d'un effet direct des mutants sur la souche sauvage, nous avons recherché des différences au niveau protéique et surtout transcriptomique entre ces bactéries par des démarches avec et sans a priori (gènes-cibles vs cDNAAFLP). Les résultats montrent que HrpS et HrpL sont capables de réguler différentiellement d'autres gènes que les gènes hrp : HrpL régule négativement les gènes flagellaires, le chimiotactisme et un gène du GSP, et positivement un gène du T1SS et une OMP ; HrpS régule négativement le quorum sensing et positivement un gène potentiellement impliqué dans la synthèse de l'éthylène. Nous avons particulièrement approfondi le système flagellaire d'E. amylovora. Une analyse bioinformatique a révélé que cette bactérie possède deux systèmes flagellaires, secrétant deux flagellines distinctes (32 vs 50 KDa). La flagelline de 32 KDa, réprimée par HrpL, ne joue pas de rôle majeur dans la protection et ne possède pas l'épitope flg22 impliqué dans l'immunité des plantes. Si notre travail n'élucide pas complètement l'origine de la protection conférée par les mutants de régulation, il apporte des informations nouvelles sur E. amylovora et sur la régulation de certains de ses gènes au cours de l'interaction avec son hôte.

El fuego bacteriano, causado por Erwinia amylovora, es una enfermedad muy importante a nivel comercial y económico porque afecta a plantas de la familia de las rosáceas y es especialmente agresiva en manzano (Pyrus malus) y peral (Pyrus communis), así como en plantas ornamentales (Crataegus, Cotoneaster o Pyracantha). Esta enfermedad está distribuida por todo el mundo en zonas climáticas templadas de Amércia del Norte, Nueva Zelanda, Japón, Israel, Turquí y Europa. En España, el fuego bacteriano fue detectado por primera vez en 1995 en el norte del País (Euskadi) y más tarde en nuevos focos aparecidos en otras áreas. La enfermedad puede ser controlada comercialmente mediante la aplicación de pesticidas quimicos (derivados de cobre, antibioticos). Sin embargo, muchos de los productos químicos presentan baja actividad o causan fitotoxicidad, y la estreptomicina, el producto más eficaz, esta prohibido en muchos países, incluyendo España. Por tanto, en ausencia de apropiados agentes químicos, el control biológico se contempla como una buena alternativa. En el presente trabajo, un agente de control biológico, Pseudomonas fluorescens EPS62e, ha sido seleccionada de entre 600 aislados de las especies P. fluorescens y Pantoea agglomerans obtenidos de flores, frutos y hojas de plantas de la familia de las rosáceas durante una prospección llevada a cabo en varias áreas geográficas de España. La cepa ha sido seleccionada por su capacidad de suprimir la infecciones producidas por E. amylovora frutos inmaduros, flores y brotes de peral en condiciones de ambiente controlado, presentando unos niveles de control similares a los obtenidos mediante el control químico usando derivados de cobre o antibióticos. La cepa además ha mostrado la capacidad de colonizar y sobrevivir en flores y heridas producidas en frutos inmaduros en condiciones de ambiento controlado pero también en flores en condiciones de campo. La exclusión de E. amylovora medinate la colonización de la superficie, el consumo de nutrientes, y la interacción entre las células del patógeno y del agente de biocontrol es la principal causa de la inhibición del fuego bacteriano por la cepa EPS62e. Estas características constituyen aspectos interesantes para un desarrollo efectivo de la cepa EPS62e como un agente de biocontrol del fuego bacteriano en condiciones comerciales. / Fire blight, caused by Erwinia amylovora is a serious disease of rosaceous plants with great commercial and economic interest that is distributed over the world. Disease may be controlled commercially by the application of chemicals (copper compounds, antibiotics). Many chemical agents have low activity or cause phytotoxicity, and streptomycin, the most effective antibiotic, is not approved for use in many countries, including Spain. Therefore, in the absence of suitable chemical control agents, biological control could provide a useful alternative. In the present work, a biological control agent, Pseudomonas fluorescens EPS62e, has been selected among 600 isolates of P. fluorescens and Pantoea agglomerans obtained from flowers, fruits and leaves of rosaceous plants in a survey performed through several geographic areas of Spain. This strain has been selected for its capacity to suppress immature fruit, blossom and shoot infections caused by E. amylovora, under controlled environment conditions, providing control levels similar to chemical control with copper or antibiotic compounds. The strain has also shown the capacity to colonize and survive well in flowers and wounds on immature fruit under controlled environment conditions but also in flowers under natural conditions. Pre-emptive exclusion of the pathogen E. amylovora by surface colonization and nutrients depletion, and cell-to-cell interaction appear to be the main mechanisms of biocontrol. These characteristics constitute interesting traits for an effective development as a fire blight biological control agent under commercial conditions.

Pseudomonas fluorescens EPS62e es va seleccionar com a agent de biocontrol del foc bacterià per la seva eficàcia en el control de Erwinia amylovora. En aquest treball es van desenvolupar mètodes de traçabilitat que van permetre la seva detecció específica i quantificació. Mitjançant les tècniques RAPD i U-PCR es van obtenir fragments d'amplificació diferencial per EPS62e que es van seqüenciar i caracteritzar com marcadors SCAR per dissenyar una PCR en temps real. La PCR a temps real es va utilitzar simultàniament amb mètodes microbiològics per estudiar l'adaptabilitat epifítica de EPS62e en pomera i perera. L'ús combinat de mètodes microbiològics i moleculars va permetre la identificació de tres estats fisiològics de EPS62e: la colonització activa, l'entrada en un estat de viable però no cultivable, i la mort cel·lular. Aquest treball mostra que EPS62e està ben adaptada a la colonització de flors a camp, encoratjant la seva utilització dins d'una estratègia de control biològic contra el foc bacterià. / Pseudomonas fluorescens EPS62e was selected as a reliable biological control agent of fire blight for its high efficacy controlling Erwinia amylovora infections. In the present work, monitoring methods which allowed EPS62e specific detection and quantification were developed. RAPD and U-PCR fingerprints were used to obtain differential amplified fragments from EPS62e that were sequence characterized as SCAR markers. A real-time PCR was developed on the basis of the strain-specific SCAR markers, and was used simultaneously with microbiological methods to study the environmental fate of EPS62e in apple and pear orchards. The combined use of both microbiological and molecular methods permitted the identification of three physiological states for EPS62e, which consisted of active colonization, survival and entry into a viable but nonculturable state, and cell death. The present work shows that EPS62e is well adapted for blossom colonisation in the field, and encourages its utilisation in a fire blight.