Les microARNs appartiennent à la famille des petits ARNs non-codants et agissent comme inhibiteurs des ARN messagers et/ou de leurs produits protéiques. Les mi- croARNs sont différents des petits ARNs interférants (siARN) car ils atténuent l’ex- pression au lieu de l’éliminer. Dans les dernières années, de nombreux microARNs et leurs cibles ont été découverts chez les mammifères et les plantes. La bioinforma- tique joue un rôle important dans ce domaine, et des programmes informatiques de découvertes de cibles ont été mis à la disposition de la communauté scientifique. Les microARNs peuvent réguler chacun des centaines de gènes, et les profils d’expression de ces derniers peuvent servir comme classificateurs de certains cancers. La modélisation des microARNs artificiels est donc justifiable, où l’un pourrait cibler des oncogènes surexprimés et promouvoir une prolifération de cellules en santé. Un outil pour créer des microARNs artificiels, nommé MultiTar V1.0, a été créé et est disponible comme application web. L’outil se base sur des propriétés structurelles et biochimiques des microARNs et utilise la recherche tabou, une métaheuristique. Il est démontré que des microARNs conçus in-silico peuvent avoir des effets lorsque testés in-vitro. Les sé- quences 3’UTR des gènes E2F1, E2F2 et E2F3 ont été soumises en entrée au programme MultiTar, et les microARNs prédits ont ensuite été testés avec des essais luciférases, des western blots et des courbes de croissance cellulaire. Au moins un microARN artificiel est capable de réguler les trois gènes par essais luciférases, et chacun des microARNs a pu réguler l’expression de E2F1 et E2F2 dans les western blots. Les courbes de crois- sance démontrent que chacun des microARNs interfère avec la croissance cellulaire. Ces résultats ouvrent de nouvelles portes vers des possibilités thérapeutiques. / MicroRNAs belong to the family of small non-coding RNAs and act as down regula- tors of messenger RNAs and/or their protein products. microRNAs differ from siRNAs by downregulating instead of shutting down. In recent years, numerous microRNAs and their targets have been found in mammals and plants. Bioinformatics plays a big role in this field, as software has emerged to find new microRNA targets. Each individual microRNA can regulate hundreds of genes, and it has been shown that microRNA expression profiles can classify human cancers. The need for artificially created mi- croRNAs is then justified, as one could target overexpressed oncogenes and promote healthy cell proliferation. MultiTar V1.0, a tool for creating artificial microRNAs, has been implemented and is available as a web application. The tool relies on structural and biological properties of microRNAs and uses a Tabusearch metaheuristic. A typical biological problem is presented and it is shown that an in-silico microRNA has in-vitro effects. The 3’UTR sequences of E2F1, E2F2 and E2F3 were given as input to the tool, and predicted microRNAs were then tested using luciferase essays, western blots and growth curves. At least one microRNA is able to regulate the three genes with luciferase essays and all of the created microRNAs were able to regulate the expres- sion of E2F1 and E2F2 with western blots. Growth curves were also studied in order to investigate overall biological effects, and reduction in growth was observed for all solutions. Results obtained with the predicted microRNAs and the target genes open a new door into therapeutic possibilities.

<p>Control of E2F transcription factor activity, regulated by the action of the retinoblastoma tumor suppressor, is critical for determining cell cycle entry and cell proliferation. However, an understanding of the precise determinants of this control, including the role of other cell cycle regulatory activities, has not been clearly defined. </p><p>Recognizing that the contributions of individual regulatory components could be masked by heterogeneity in populations of cells, we made use of an integrated system to follow E2F transcriptional dynamics at the single cell level and in real time. We measured and characterized E2F temporal dynamics in the first cell cycle where cells enter the cell cycle after a period of quiescence. Quantitative analyses revealed that crossing a threshold of amplitude of E2F transcriptional activity serves as the critical determinant of cell-cycle commitment and division. </p><p>By using a developed ordinary differential equation model for Rb/E2F network, we performed simulations and predicted that Myc and cyclin D/E activities have distinct roles in modulating E2F transcriptional dynamics. Myc is critical in modulating the amplitude whereas cyclin D/E activities have little effect on the amplitude but do contribute to the modulation of duration of E2F transcriptional activation. These predictions were validated through the analysis of E2F dynamics in single cells under the conditions that cyclin D/E or Myc activities are perturbed by small molecule inhibitors or RNA interference. </p><p>In an ongoing study, we also measured E2F dynamics in cycling cells. We provide preliminary results showing robust oscillatory E2F expression at the single-cell level that aligns with the progression of continuous cell division. The temporal characteristics of the dynamics trajectories deserve further quantitative investigations.</p><p>Taken together, our results establish a strict relationship between E2F dynamics and cell fate decision at the single-cell level, providing a refined model for understanding the control logic of cell cycle entry.</p> / Dissertation

Dissertation (Ph.D.)--University of South Florida, 2007. / Title from PDF of title page. Document formatted into pages; contains 104 pages. Includes vita. Includes bibliographical references.

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La sénescence est un mécanisme de défense antiprolifératif dont la cellule est munie afin de prévenir l’accumulation de mutations pouvant mener à sa transformation et l’éventuel développement d’une tumeur. Ce programme consiste en un arrêt permanent du cycle cellulaire. Il peut être activé par de nombreux stimuli tels que le raccourcissement des télomères, le stress oxydatif, ou l’expression d’un oncogène constitutivement actif. Sa régulation requiert l’activation de protéines appelées des suppresseurs de tumeur dont les plus importants sont p53 et RB. De manière plus spécifique, les sénescences induites par l’expression des oncogène RASV12 ou STAT5A(1*6) sont respectivement caractérisées par l’augmentation de l’expression des protéines PML et CHES1/FOXN3. Le but de cette thèse est, dans un premier temps, de mettre en évidence le mécanisme de régulation de la sénescence par PML. PML est un suppresseur de tumeur dont l’expression dans des cellules diploïdes normales est suffisante pour induire la sénescence. Cette protéine forme des corps nucléaires sphériques au sein desquels est recruté, parmi d’autres molécules, la protéine du rétinoblastome RB. RB est un régulateur négatif du cycle cellulaire capable de lier et inhiber les facteurs de transcription E2F dont les gènes cibles sont nécessaires à la prolifération. Nos travaux démontrent que le mécanisme d’induction de la sénescence par PML implique le recrutement du complexe RB/E2F aux corps de PML afin de renforcer l’inhibition de l’activité des E2F par RB. Également, les E2F sont recrutés aux corps de PML en compagnie de leurs promoteurs ce qui favorise la formation d’hétérochromatine au niveau de ces gènes, aidant à leur répression et donc à l’établissement de la sénescence. D’autre part, cette thèse a pour but de caractériser le rôle de CHES1/FOXN3 dans la régulation du cycle cellulaire. CHES1 est un facteur de transcription de la famille des Forkheads. Son expression dans des cellules cancéreuses provoque un ralentissement de leur prolifération. Afin de comprendre son mécanisme de fonctionnement, une analyse sur micropuce d’ADN de l’expression des gènes de cellules cancéreuses exprimant CHES1 a été réalisée. Cette analyse a montré que, dans la cellule, CHES1 joue un rôle de répresseur transcriptionnel. Plus précisément, CHES1 réprime, entre autres, l’expression de gènes nécessaires à la synthèse des protéines tels que PIM2 et DYRK3. De manière intéressante, la réexpression de PIM2 dans des cellules cancéreuses exprimant CHES1 permet de rétablir partiellement la prolifération cellulaire. Également, l’analyse sur micropuce a révélé que CHES1 régule l’expression de nombreux gènes impliqués dans la formation des cilia dont l’une des fonctions semble être de moduler la synthèse protéique. Pris ensemble, ces résultats suggèrent que le mécanisme antitumoral de CHES1 consiste en une inhibition de la synthèse de protéines. / Senescence is an antiproliferative defense mechanism that protects the cell against the accumulation of mutations and, eventually, her transformation and the development of a tumor. This program consists of a permanent cell cycle arrest. It can be activated by many stimuli, such as telomere shortening, oxidative stress, or the expression of a constitutively active oncogene. Senescence regulation requires activation of proteins called tumor suppressors which the most important are p53 and RB. More specifically, senescences induced by the expression of oncogenic RASV12 or STAT5A (1 * 6) are respectively characterized by increased expression of the proteins PML and CHES1/FOXN3. The purpose of this thesis is, firstly, to identify the mechanism of regulation of senescence by PML. PML is a tumor suppressor whose expression in normal diploid cells is sufficient to induce senescence. This protein forms spherical nuclear bodies in which is recruited, among other molecules, the retinoblastoma protein RB. RB is a negative regulator of the cell cycle due to its capacity to bind and inhibit the E2F transcription factors whose target genes are necessary for proliferation. Our work demonstrates that the mechanism of induction of senescence by PML involves the recruitment of the complex RB/E2F to the PML body to enhance the inhibition of E2F activity by RB. Also, the E2Fs are recruited to PML bodies together with their promoters which promotes the formation of heterochromatin in these genes, helping their repression and thus the establishment of senescence. On the other hand, this thesis aims to characterize the role of CHES1/FOXN3 in regulating the cell cycle. CHES1 is a transcription factor of the Forkheads family which expression in cancer cells causes a growth reduction. To understand the antitumoral mechanism of CHES1, a microarray analysis of cancer cells expressing CHES1 was performed. This analysis shows that CHES1 is a transcriptional repressor. Specifically, CHES1 represses, among others, the expression of genes required for the synthesis of proteins such as PIM 2 and DYRK3. Interestingly, re-expression of PIM 2 in cancer cells expressing CHES1 partially restores cell proliferation. Also, microarray analysis revealed that CHES1 regulates the expression of many genes involved in the formation of cilia which one of the functions seems to be to modulate protein synthesis. Taken together, these results suggest that the antitumor mechanism of CHES1 involves inhibition of protein synthesis.

La biologie moléculaire et, plus spécifiquement, la régulation de l’expression génique ont été révolutionnées par la découverte des microARN (miARN). Ces petits ARN d’une vingtaine de nucléotides sont impliqués dans la majorité des processus cellulaires et leur expression est dérégulée dans plusieurs maladies, comme le cancer. Un miARN reconnaît ses cibles principalement par son noyau, ce qui lui permet de réguler simultanément la traduction de centaines d’ARN messagers. Nos travaux ont montré l’existence d’une boucle de rétro-activation négative, entre deux miARN du polycistron miR-17-92 et trois facteurs de transcription de la famille E2F. E2F1, 2 et 3 induisent la transcription de miR-20 et miR-17 qui par la suite inhibent leur traduction. Nos résultats suggèrent l’implication de cette boucle dans la résistance à l’apoptose induite par E2F1 dans les cellules du cancer de la prostate, ce qui expliquerait en partie le potentiel oncogénique du polycistron miR-17-92. L’étude de ce motif de régulation nous a donc permis de réaliser le potentiel incroyable qu’ont les miARN à inhiber la traduction de plusieurs gènes. Basé sur les règles de reconnaissance des miARN, nous avons développé et validé MultiTar. Cet outil bioinformatique permet de trouver la séquence d’un miARN artificiel ayant le potentiel d’inhiber la traduction de gènes d’intérêts choisis par l’utilisateur. Afin de valider MultiTar, nous avons généré des multitargets pouvant inhiber l’expression des trois E2F, ce qui nous a permis de comparer leur efficacité à celle de miR-20. Nos miARN artificiels ont la capacité d’inhiber la traduction des E2F et de neutraliser leur fonction redondante de la progression du cycle cellulaire de façon similaire ou supérieur à miR-20. La fonctionnalité de notre programme, ouvre la voie à une stratégie flexible pouvant cibler le caractère multigénique de différents processus cellulaires ou maladies complexes, tel que le cancer. L’utilisation de miARN artificiels pourrait donc représenter une alternative intéressante aux stratégies déjà existantes, qui sont limitées à inhiber des cibles uniques. En plus d’élucider un réseau de régulation complexe impliquant les miARN, nous avons pu tirer profit de leur potentiel d’inhibition par la conception de miARN artificiels. / miRNAs are powerful regulators of gene expression in mammals. These small RNAs of around 20 nucleotides are involved in several cellular processes and diseases. MiRNAs recognize their targets mainly by a region comprising nucleotides 2-8, known as the seed. This characteristic gives them the potential to inhibit hundreds of messenger RNAs. Our first goal was to better characterize the complex network involving miRNAs in the regulation of gene expression. To achieve this, we studied the relation between a family of transcription factors, the E2Fs, and a family of miRNAs, the miR-17-92 cluster. Our results suggest a negative feedback loop involving miR-17, miR-20a, E2F1, E2F2 and E2F3. In this loop E2F1, 2 and 3 activate the transcription of the two miRNAs that inhibit their translation in return. The inhibition of the antiapoptotic function of E2F1 by miR-17 and miR-20 in a prostate cancer context, could explain the oncogenic potential of the miR-17-92 cluster that was previously reported. Studying the miR-20/E2F feedback loop made us realize how powerful was the ability of miRNAs to inhibit several targets. To overcome the lack of efficient tools able to inhibit simultaneously the expression of multiple genes, our second goal was to develop MultiTar, an algorithm able to design artificial miRNAs that target a set of predetermined genes. MultiTar was validated in silico, using known targets of endogenous miRNAs and in vivo, taking advantage of our experience with the E2F context. We designed artificial miRNAs against E2F1-3 and expressed them both in normal human fibroblasts and prostate cancer cells where they inhibited cell proliferation and induced cellular senescence. The observed phenotypes were precisely those known for inhibiting E2F activities. Hence, MultiTar can efficiently design artificial micro RNAs able to target multiple genes and is thus a flexible tool that can address the issue of multigenic diseases and complex cellular processes. The use of multitargets could be an alternative to overcome the limits of drugs or siRNAs that are designed generally to regulate only one target.

Recent advances in high throughput technology have opened the door to systematic studies of epigenetic mechanisms. One of the key components in the regulation of the cell cycle and differentiation is the retinoblastoma protein (pRB), a component of the RB/E2F tumor suppressor pathway that is frequently deregulated in cancer. The RBP2/KDM5A histone demethylase was shown to interact with pRB and regulate pRB function during differentiation. However, how precisely differentiation is coupled with halted cell cycle progression and whether an epigenetic mechanism is involved remain unknown. In the present study, I analyzed gene expression levels of human histone methyltransferases (HMT) and demethylases (HDM), as well as their targets in human cancers; and focused on RB/KDM5A connection in control of cell cycle and differentiation. In particular, I used Drosophila as a model to describe a novel mechanism where the RB/E2F pathway interacts with the Hippo tumor suppressor pathway to synergistically control cell cycle exit upon differentiation. Studying the role of miR-11, I found that the inhibition of dE2F1-induced cell death is its highly specialized function. Furthermore, I studied the induction of differentiation and apoptosis as the consequences of KDM5A deletion in cells derived from Rb knockout mice. I concluded that during differentiation, KDM5A plays a critical role at the enhancers of cell type-specific genes and at the promoters of E2F targets; in cooperation with other repressor complexes, it silences cell cycle genes. I found that KDM5A binds to transcription start sites of the majority of genes with H3K4 methylation. These are highly expressed genes, involved in certain biological processes, and occupied by KDM5A in an isoform-specific manner. KDM5A plays a unique and non-redundant role in histone demethylation and its promoter binding pattern highly overlaps with the opposing enzyme, MLL1. Finally, I found that HMT and HDM enzymes exhibit a distinct co-expression pattern in different cancer types, and this determines the level of expression of their target genes. / Los avances recientes en las tecnologías de alto flujo han abierto el camino a los estudios sistemáticos de los mecanismos epigenéticos. La proteína retinoblastoma (pRB), uno de los elementos de la ruta de supresión de tumores RB/E2F que se encuentra desregulado con frecuencia en el cáncer, es uno de los componentes esenciales de la regulación del ciclo celular y la diferenciación. Sin embargo, aún no se conoce de qué manera precisa la diferenciación se acopla a la detención del avance del ciclo celular y si hay algún mecanismo epigenético vinculado a este proceso. En este estudio, he analizado los niveles de expresión de histona metiltransferasas (HMT) y desmetilasas humanas (HDM), así como sus dianas en cánceres humanos, y me he centrado en la conexión de RB/KDM5A en el control del ciclo celular y la diferenciación. Específicamente, utilicé Drosophila como modelo para describir un mecanismo nuevo mediante el cual RB/E2F interactúa con la ruta Hippo de supresión de tumores para controlar de manera sinérgica la detención del ciclo celular relacionada con la diferenciación. Mediante la investigación del papel de miR-11, determiné que su función altamente especializada es la inhibición de la muerte celular inducida por dE2F1. Además, estudié la inducción de la diferenciación y la apoptosis como consecuencia de la pérdida de KDMA5 en células obtenidas a partir de ratones sin Rb. Extraje como conclusión que, durante la diferenciación, KDMA5 desempeña un papel esencial sobre los estimuladores de los genes específicos de los tipos celulares, así como en los promotores de las dianas de E2F; en cooperación con otros complejos represores silencia a los genes del ciclo celular. Investigué el mecanismo de reclutamiento de KDM5A y encontré que se une al sitio de inicio de la transcripción de la mayoría de los genes que poseen metilación en H3K4. Estos genes tienen elevados niveles de expresión, están involucrados en determinados procesos biológicos y están ocupados por diferentes isoformas de KDM5A. KDM5A desempeña un papel único y no redundante en la desmetilación de las histonas y que en gran medida se solapa con la enzima con la función opuesta, MLL1. Para terminar, encontré que las enzimas HMT y HDM muestran patrones de co-expresión distintos en diferentes tipos de cáncer, y que este hecho determina los niveles de expresión de sus genes diana.

Dissertation (Ph.D.)--University of South Florida, 2005. / Includes vita. Includes bibliographical references. Also available online in PDF format.

Quiescence is a non-proliferative cellular state that is critical to tissue repair and regeneration. Although often described as the G0 phase, quiescence is not a single homogeneous state. As cells remain quiescent for longer durations, they move progressively deeper and display a reduced sensitivity to growth signals. Deep quiescent cells, unlike senescent cells, can still re-enter the cell cycle under physiological conditions. Mechanisms controlling quiescence depth are poorly understood, representing a currently underappreciated layer of complexity in growth control. Here, we show that the activation threshold of a Retinoblastoma (Rb)-E2F network switch controls quiescence depth. Particularly, deeper quiescent cells feature a higher E2F-switching threshold and exhibit a delayed traverse through the restriction point (R-point). We further show that different components of the Rb-E2F network can be experimentally perturbed, following computer model predictions, to coarse-or fine-tune the E2F-switching threshold and drive cells into varying quiescence depths.