HIV-1 is a dangerous retrovirus which represents one of the world's leading health problems. HIV-1 infection is incurable and without proper treatment by antiretroviral therapy it leads to death within several years. Despite intensive research, no HIV vaccine is currently available. This thesis presents a new and unique approach which has not been used for vaccine development yet. The promising strategy is based on small binding proteins that can elicit broadly neutralizing HIV-1 antibodies by mimicking their epitopes. The aim of this project was to select and characterize small binding proteins that can successfully mimic the surface of viral envelope glycoproteins that is recognized by the broadly neutralizing HIV-1 antibodies PGT121 and PGT126. Proteins were selected from a highly complex combinatorial protein library derived from a new type of scaffold called Myomedin. Firstly, the extent of the protein library was narrowed down using the ribosome display. Then the direct sandwich ELISA screening was applied to select scaffold variants that interact with the target antibodies. In total over 200 variants were tested and several promising candidates were found. These Myomedin variants were purified, biochemically and biophysically characterised and the best ones were used to immunize mice....

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Post-translational modifications (PTMs) of proteins can be a sign and/or cause of disease. These modified proteins have the potential to be used as biomarkers for diagnostic purposes. However, research in the field is limited. The challenge of having an accessible way of diagnosing patients in time and at a low cost is crucial to improve public health. Blood samples or other non-invasive methods to detect diseases such as Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease, Amyotrophic lateral sclerosis and cancers are of urgent need. This report investigates PTMs as possible biomarkers measurable in biofluids, such as blood, for diagnosis and prognosis. Biomarkers like phospho-tau and amyloid-beta are examined in the context of neurodegenerative diseases, as well as phosphorylations on neurofilaments, TAR DNA-binding protein 43 and α-synuclein. All of these are detectable in blood. Several PTMs with connection to different types of cancers are also investigated, such as F3-phosphopeptide and AFP-L3. It was found that many biomarkers for the detection of cancers can potentially be found in extracellular vesicles in blood. Methods such as ELISA, PEA, SomaScan, xMAP, SIMOA and mass spectrometry (MS) are all now available on the market to quantify these PTMs. MS has revolutionized the fields of protein detection in the past and has further evolved to being capable of protein quantification. ELISA has been prevalent for decades and laid the groundwork for improved methods such as xMAP and SIMOA that are easy to use and provide adequate sensitivity. SomaScan and PEA lead the way in dynamic range and multiplexing capacity with around 7000 and 3000 protein assays. The soon-to-be-released technology NULISA, with promising values in sensitivity and dynamic range, is also investigated here. Additionally, a written ethical analysis regarding the process and consequences of biomarker quantification through these technologies was performed. Although the investigated biomarkers are detectable in biofluids, using them as clinical diagnostic markers still poses a challenge, which is why further research in the field is needed. Through an increased knowledge of PTMs of proteins and the right use of platforms, clinical diagnostics and population screenings can be done more efficiently improving public health around the world.

Die Toxoplasmose, nach ihrem Verursacher, dem Parasiten Toxoplasma gondii (T. gondii) benannt, ist eine weltweit häufig auftretende Zoonose. Einen wichtigen Infektionsweg stellt der Verzehr von nicht ausreichend erhitztem oder rohem Fleisch, welches Gewebezysten enthält, dar. In Deutschland hat der Konsum von Wildbret in den letzten 10 Jahren zugenommen. Schwarzwild (Sus scrofa), Rehwild (Capreolus capreolus), Damwild (Dama dama) und Rotwild (Cervus elaphus) sind das am häufigsten gejagte Schalenwild in Deutschland. Dennoch gibt es nur wenige Informationen über das Vorkommen von T. gondii in Wildtieren in Deutschland, so dass die Bedeutung von Wild als Quelle für eine Infektion des Menschen mit T. gondii weitgehend unbekannt ist. Ziel dieser Studie war es, die Datenlage zum Vorkommen von T. gondii in Schwarzwild, Rehwild, Damwild und Rotwild in Deutschland zu verbessern und eine fundierte Bewertung des von dem Verzehr von Wildtieren ausgehenden potenziellen Risikos zu ermöglichen. Neben dem indirekten serologischen Nachweis soll der Nachweis mittels direkter Nachweisverfahren einen Einblick in die tatsächliche Anwesenheit von T. gondii im Muskelgewebe und einen potenziellen Zusammenhang von Seropositivität und der Anwesenheit von T. gondii im Gewebe geben. In den Jahren 2017-2020 wurden in Brandenburg 306 Stück Schwarzwild, 184 Stück Rehwild, 80 Stück Damwild und 65 Stück Rotwild beprobt. Den 635 Wildtieren wurden Blutproben und Proben von Herz- und Vorderlaufmuskulatur entnommen. Das aus den Blutproben gewonnene Serum wurde mittels eines kommerziell erhältlichen ELISA untersucht. Zum direkten Nachweis von T. gondii wurde zur Analyse der aus den Muskelproben gewonnenen DNA eine real-time PCR (qPCR) eingesetzt, die auf das 529-bp-repetitive Element abzielt. Die DNA wurde auf drei unterschiedliche Arten gewonnen: direkt aus 5 g Muskelgewebe extrahiert, aus einem Pellet nach saurem Pepsinverdau von 50 g Muskelgewebe extrahiert, und die Ziel-DNA durch Magnetic Capture aus weiteren 50 g Muskelgewebe angereichert. Die Übereinstimmung der Ergebnisse des molekularen Nachweises und ihre Übereinstimmung mit den ELISA-Ergebnissen wurde ermittelt. Der molekulare Nachweis wurde bei 23 Proben von einem Maus-Bioassay begleitet. Zusätzlich wurde eine PCR-RFLP zur Genotypisierung bei qPCR-positiven Proben durchgeführt. Fisher’s exact Test, Cohen’s kappa (κ) und Odds Ratio wurden für die statistische Analyse genutzt. T. gondii-spezifische Antikörper wurden in 20,3 % der Schwarzwildproben, 10,9 % der Rehwildproben und 6,2 % der Rotwildproben nachgewiesen. Bei allen untersuchten Wildarten wurde ein Anstieg der Seroprävalenz mit zunehmendem Alter festgestellt, welcher bei Schwarzwild und Rehwild statistisch signifikant war (p = 0,004 und < 0,001). Bei der Untersuchung von Herzmuskulatur wurde T. gondii-DNA mit mindestens einer direkten Nachweismethode in 11,8 % der Schwarzwildproben, 5,5 % der Rehwildproben, 2 % der Damwildproben und 1,9 % der Rotwildproben nachgewiesen. Der höchste Anteil an Tieren, die positiv auf T. gondii-DNA getestet wurden, wurde durch die qPCR-Analyse von DNA aus 50 g Herzmuskulatur nach Magnetic Capture nachgewiesen (10 %). Die Ergebnisse der Methoden zeigten insgesamt eine mäßige Übereinstimmung (κ = 0,47-0,59). Die höchste Übereinstimmung zeigten die Ergebnisse von DNA aus 50 g Herzmuskulatur nach Pepsin-Verdau und DNA aus 50 g Herzmuskulatur nach Magnetic Capture (κ = 0,59). Insgesamt ergab die Untersuchung von 50 g Herzmuskulatur einen signifikant höheren Anteil an positiven qPCR-Ergebnissen als die Analyse von 5 g Herzmuskulatur (p = 0,048). Die qPCR-Ergebnisse von Herz- und Vorderlaufmuskelgewebe zeigten beim Schwarzwild eine beachtliche und bei der gemeinsamen Betrachtung aller untersuchten Wildarten eine mäßige Übereinstimmung (κ = 0,62 bzw. 0,46). Ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen Seropositivität und direktem Nachweis war bei Schwarzwild und Rehwild erkennbar (p < 0,001). In allen T. gondii-DNA-positiven Proben, bei denen zusätzlich ein Bioassay durchgeführt wurde, konnte Infektiosität bestätigt werden (4/4). Sowohl in den T. gondii-DNA-positiven Schwarzwildproben als auch in den positiven Rehwildproben waren die spezifischen Allele von T. gondii-Typ II am weitesten verbreitet. Die durch diese Arbeit generierten Daten zeigen, dass T. gondii in Schwarzwild, Rehwild, Damwild und Rotwild in Brandenburg vorkommt und Wild eine relevante Quelle für T. gondii-Infektionen beim Menschen darstellen könnte.

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Le narval (Monodon monoceros) est une espèce emblématique de l'Arctique. Les narvals sont de plus en plus exposés à des perturbations anthropiques, pouvant augmenter leur niveau de stress et, par conséquent, avoir des impacts inconnus sur la dynamique de la population. La validation et l’étude de biomarqueurs de stress chronique pourraient donc améliorer les efforts de conservation chez cette espèce. La déhydroépiandrostérone (DHEA) et son métabolite sulfaté, la DHEA-S, sont collectivement appelés DHEA(S). Lorsque combinés sous forme de ratios avec le cortisol (cortisol/DHEA(S)), ils se sont révélés prometteurs dans l'évaluation du stress chronique chez les humains et certaines espèces animales domestiques ou sauvages. Au cours de projets de pose d’émetteurs en 2017 et 2018 dans la baie de Baffin, Nunavut, Canada, des narvals (n = 14) ont été échantillonnés au début et à la fin des manipulations. La DHEA(S) sérique a ensuite été mesurée à l’aide de deux techniques immuno-enzymatiques (ELISAs) développées pour les humains et disponibles commercialement. Une validation partielle des deux ELISAs a pu être réalisée par détermination du coefficient de variation intra-essai, confirmation de la linéarité de dilution de la DHEA(S) et calcul du pourcentage de récupération. La DHEA était également bien conservée dans le sérum de narvals suite à un stockage prolongé de 12 et 24 mois à -80°C, soulignant le potentiel d'analyse d'échantillons archivés. Les valeurs sériques moyennes (ng/ml ± SEM) de cortisol, de DHEA(S) et des ratios cortisol/DHEA(S) au début et à la fin des manipulations respectivement étaient les suivantes : cortisol = 30,74 ± 4,87 et 41,83 ± 4,83; DHEA = 1,01 ± 0,52 et 0,99 ± 0,50; DHEA-S = 8,72 ± 1,68 et 7,70 ± 1,02; cortisol/DHEA = 75,43 ± 24,35 et 84,41 ± 11,76; cortisol/DHEA-S = 4,16 ± 1,07 et 6,14 ± 1,00). Le cortisol sérique et le ratio cortisol/DHEA-S étaient statistiquement plus élevés à la fin des manipulations (P = 0,024 et P = 0,035 respectivement). De plus, le cortisol sérique à la fin des manipulations était positivement corrélé à la longueur totale du corps de l’animal (P = 0,042) et avait tendance à être plus élevé chez les mâles (P = 0,086). Cette étude confirme que ces ELISAs sont une méthode d’analyse facile à réaliser, rapide et appropriée pour mesurer la DHEA(S) sérique chez le narval. La DHEA(S) sérique et les ratios cortisol/DHEA(S) représentent des biomarqueurs potentiels pour évaluer le stress chronique chez les narvals et possiblement chez d'autres espèces de cétacés. / Narwhals (Monodon monoceros) are an iconic Arctic species and are increasingly being exposed to anthropogenic disturbances that may increase their stress levels with unknown consequences for the overall population dynamics. The validation and measurement of chronic stress biomarkers could contribute towards an improved understanding and conservation efforts for this species. Dehydroepiandrosterone (DHEA), and its sulfated metabolite DHEA-S, are collectively referred to as DHEA(S). When serum DHEA(S) concentrations are combined in a ratio with cortisol (cortisol/DHEA(S)), it has shown promise for evaluating chronic stress in humans, domestic animals, and wildlife. During field tagging in 2017 and 2018 on Baffin Bay, Nunavut, Canada, wild narwhals (n = 14) were sampled at the beginning and end of capture-tagging procedures (acute stressor). Serum DHEA(S) were measured with commercially available competitive enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) developed for humans. A partial validation of the assays was performed by determination of the intra-assay coefficient of variation, confirmation of the DHEA(S) dilutional linearity, and the calculation of the percentage of recovery. In addition, DHEA was conserved following extended storage at -80°C, highlighting the potential to analyze archival samples. Mean values (ng/mL ± SEM) of narwhal serum cortisol, DHEA(S), and cortisol/DHEA(S) ratios at the beginning and at the end of handling respectively are reported (cortisol = 30.74 ± 4.87, 41.83 ± 4.83; DHEA = 1.01 ± 0.52, 0.99 ± 0.50; DHEA-S = 8.72 ± 1.68, 7.70 ± 1.02; cortisol/DHEA = 75.43 ± 24.35, 84.41 ± 11.76, and cortisol/DHEA-S = 4.16 ± 1.07, 6.14 ± 1.00). Serum cortisol and cortisol/DHEA-S were statistically higher at the end of the capture (P = 0.024 and P = 0.035 respectively). Moreover, serum cortisol at the end of handling and prior to release was positively correlated to total body length (P = 0.042) and tended to be higher in males (P = 0.086). This study showed that these assays are easy to perform, rapid, and suitable for measuring serum DHEA(S) of narwhals and that serum DHEA(S) and calculated cortisol/DHEA(S) are potential biomarkers for chronic stress in narwhals and possibly other species of cetaceans, but this requires additional study.

The rapid development, approval, and production of vaccines against the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in less than 1 year after the first reports of a new infectious disease was a real game changer, providing 80%–90% efficacy in preventing severe etiopathologies of the coronavirus disease 2019 (COVID-19). These vaccines induce an immune response against the SARS-CoV-2 spike (S) protein located on the surface of the virus particle. Antibodies (Abs) recognizing the S-protein can inhibit binding of the virus via the S-protein to the angiotensin-converting enzyme-2 (ACE-2) receptor expressed on different human cells, especially when these Abs bind to the interaction site, the so-called receptor-binding domain (RBD). We have expressed the RBDs of wild-type SARS-CoV-2 and five variants of concern (VOCs) to test the immune response in people before vaccination with mRNA vaccines BNT162b2 and mRNA-1273 and after up to three vaccinations using in-house ELISA and inhibition assays. The methods of both assays are provided. Both vaccines initiated similarly high IgG titers after two vaccinations against the wild-type and even two VOC-RBDs (alpha and delta) and strongly inhibited the corresponding RBD-ACE-2 binding. The IgG titers and inhibition of ACE-2 binding were lower for beta and gamma RBDs and much lower for omicron RBD. The third vaccination after 6 months strongly increased both the IgG titers and the neutralizing effect against all variants, especially for omicron, leading to 63% ± 13% neutralization potential. Importantly, neutralization linearly increased with the IgG titers.

There is an ongoing need for high-precision serological assays for the quantitation of anti-SARS-CoV-2 antibodies. Here, a trimeric SARS-CoV-2 spike (S) protein was used to develop an ELISA to quantify specific IgG antibodies present in serum, plasma, and dried blood spots (DBS) collected from infected patients or vaccine recipients. The quantitative S-ELISA was calibrated with international anti-SARS-CoV-2 immunoglobulin standards to provide test results in binding antibody units per mL (BAU/mL). The assay showed excellent linearity, precision, and accuracy. A sensitivity of 100% was shown for samples collected from 54 patients with confirmed SARS-CoV-2 infection more than 14 days after symptom onset or disease confirmation by RT-PCR and 58 vaccine recipients more than 14 days after vaccination. The assay specificity was 98.3%. Furthermore, antibody responses were measured in follow-up samples from vaccine recipients and infected patients. Most mRNA vaccine recipients had a similar response, with antibody generation starting 2–3 weeks after the first vaccination and maintaining positive for at least six months after a second vaccination. For most infected patients, the antibody titers increased during the second week after PCR confirmation. This S-ELISA can be used to quantify the seroprevalence of SARS-CoV-2 in the population exposed to the virus or vaccinated.

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