Solos com horizonte superficial antrópico, conhecidos como Terra Preta Antropogênica (TPA), Terra Preta de Índio (TPI) ou simplesmente Terra Preta, representam um dos mais marcantes registros da antiga ocupação humana na região amazônica, sendo comumente localizados ao longo de rios e interflúvios, ocupando várzeas, elevações marginais adjacentes e terra firme. Um dos principais fatores responsáveis pelo comportamento diferenciado dos solos TPI é a maior quantidade e a diferença qualitativa da sua matéria orgânica, que consiste em, aproximadamente, 35% de carvão pirogênico. A presença de material orgânico estável e a atividade biológica indicam que as TPI podem ser sítios de alta diversidade microbiana. O manejo da matéria orgânica visando à conservação e melhoria da qualidade do solo é fundamental na ciclagem de nutrientes e na manutenção da sustentabilidade dos agroecossistemas tropicais. Nesse contexto, os processos de biodegradação regem grande parte do ciclo do carbono, cuja fração biológica é dependente de enzimas microbianas como as dioxigenases, que utilizam compostos orgânicos presentes no solo como fonte de carbono e energia. A caracterização e o isolamento de bactérias potencialmente degradadoras de resíduos orgânicos em solos TPI pode gerar dados indicativos da qualidade biológica desse solo, além de prover informações sobre a diversidade genética destes micro-organismos. Da mesma forma, o estudo da diversidade de genes catabólicos pode facilitar a compreensão das bases adaptativas de micro-organismos funcionais do carvão pirogênico e seu papel no equilíbrio da fertilidade das TPI, além de determinar sua influência nas comunidades biológicas destes solos. Este estudo analisou a diversidade de comunidades bacterianas associadas a processos de degradação de compostos aromáticos em amostras de solo TPI e carvão pirogênico na Amazônia Central, coletadas nos sítios do Caldeirão sob capoeira e sob cultivo agrícola, Costa do Açutuba, Hatahara e Balbina, por meio de técnicas de cultivo e técnicas moleculares. Estes sítios são caracterizados por diferentes épocas de ocupação pelas populações indígenas, que variam desde 1200 anos atrás (Caldeirão) até mais de 2000 anos, como o Costa do Açutuba. Os isolados obtidos a partir do enriquecimento apresentaram grande diversidade de gêneros e espécies, extensamente descritas como degradadores de vários substratos aromáticos, tanto naturais quanto xenobióticos. As bibliotecas de clones contendo genes funcionais mostraram que a diversidade microbiana no carvão pirogênico foi frequentemente maior em relação aos solos TPI. A grande maioria dos clusters gerados no pirosequenciamento (98%) reuniu sequências de dioxigenases obtidas unicamente neste estudo. A abundância de genes catabólicos foi determinada por PCR quantitativo. Os resultados deste estudo apresentaram uma diversidade de genes associados à ciclagem de C ainda não descrita em solos antrópicos da Amazônia, demonstrando o papel fundamental das comunidades microbianas funcionais na manutenção da fertilidade dos solos TPI / Antropogenic Dark Earth or Amazonian Dark Earth soils (ADE) represents one of the most important records of pre-Colombian settlements in Brazilian Amazon region, commonly located along rivers and interfluves. One of the main factors responsible for the singular features of these soils is the presence of high amounts of pirogenic black carbon or biochar, consisting of approximately 35% along anthropogenic surface. The presence of stable organic matter and biological activity are indicative that ADE soils may be hotspots of microbial diversity. The management of organic matter with the aim of conserving and improving soil quality is critical to nutrient cycling and maintenance of sustainable tropical agroecosystems. In this context, the biodegradation processes govern most of the carbon biogeochemical cycle, which quite depends on microbial enzymes such as dioxygenases, which use organic compounds in soil as carbon source and energy. The characterization and isolation of potentially degrader bacteria from ADE soils can generate indicative data of the biological quality of these soils, as well as provide information of the genetic diversity of these microorganisms. Likewise, studies involving diversity of catabolic genes may facilitate the understanding of the role of functional microorganisms present in black carbon in the balance of the fertility of ADE soils, besides the evaluation of their influence on biological communities in these soils. This study assessed the diversity of bacterial communities associated with degradation processes of aromatic compounds in ADE soils and black carbon in Central Amazon through cultivation and molecular techniques. The samples were collected in Caldeirão Experimental Station (Embrapa-CPAA) under secondary forest and manioc culture, along with Costa do Açutuba, Hatahara and Balbina sites. These TPI sites are characterized by distinct ages of occupation by pre-Colombian populations, ranging from 1,200 years ago (Caldeirão sites) to more than 2,000 years, such Costa do Açutuba site. The isolates obtained from enrichment showed great diversity of species and genera, widely described as potentially degraders of a wide range of aromatic substrates, both natural and xenobiotic. The clone libraries containing functional genes showed that the microbial diversity in black carbon was often greater in relation to soil ADE. The vast majority of clusters generated by pyrosequencing (98%) grouped dioxygenases sequences obtained solely in this study. The abundance of catabolic genes was determined by quantitative PCR. The results of this study showed great diversity of genes associated with C cycling, not previously reported in Amazonian anthropogenic soils, proving the essential role of functional microbial communities supporting the fertility of ADE soils

Devido aos altos teores de húmus e matéria orgânica pirolisada, os solos de Terra Preta de Índio da Amazônia (TPA) apresentam uma dinâmica diferente de outros, com hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos em grandes quantidades. Os alcanos são os maiores constituintes da matéria orgânica do solo, pouco reativos, insolúveis e recalcitrantes, promovendo menor rendimento à produção de combustíveis fósseis e renováveis. Os hidrocarbonetos aromáticos, assim como alcanos, são encontrados no ambiente de forma natural ou introduzidos e podem ser tóxicos, mutagênicos ou carcinogênicos. O estudo das comunidades bacterianas desses locais é de interesse no entendimento da alta fertilidade destes solos e da ação do carvão na relação planta-solo-microrganismo, além de bioprospecções de novas vias metabólicas. Diversos estudos já avaliaram genes de interesse para biodegradação destes compostos na TPA, como bph (Brossi, 2014) em solo e ?-ARHDs (Germano, 2011) em solo e carvão, ambos para degradação de hidrocarbonetos aromáticos. Porém o gene alk, para degradação de alcanos, ainda não fora estudado em carvão de TPA e nenhum isolamento bacteriano deste carvão foi feito e o presente trabalho teve esta abordagem inovadora para os solos de TPA, aliando cultivo, biologia molecular e bioensaios. O carvão foi separado, diluído e plaqueado em cinco meios de cultivo, com posterior incubação microaerofílica. Ao final da obtenção dos isolados, uma seleção de singularidade de morfologia foi feita a fim de se trabalhar com riqueza de tipos bacterianos, resultando em 86 isolados. Na identificação molecular pelo gene 16S ribossomal bacteriano identificamos 24 gêneros: Burkholderia, Ralstonia, Pseudomonas, Achromobacter, Pantoea, Leclercia, Acinetobacter, Cupriavidus, Enterobacter, Variovorax, Leifsonia, Leclercia, Pantoea, Parapusiliimonas, Bordetella; Bacillus, Paenibacillus, Lysinibacillus, Brevibacillus, Rummeliibacillus; Arthrobacter, Streptomyces, Rhodoccocus; e Fibrobacterium, além de bactérias não cultivadas. Os meios GA e ES comprovaram ser um método com boa eficiência para isolamento de quantidade e variedade de bactérias do carvão, tanto aeróbias quanto anaeróbias facultativas, sendo pertencentes aos filos Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria e Bacteroidetes. Apenas 11 isolados possuem o gene alk. Observamos que 53,49% de isolados foram positivos para a degradação de 0,05% de fenantreno; 70,93% foram positivos para a degradação de 8% de óleo diesel; e 88,37% foram positivos para degradação de 0,05% de bifenil. Houve isolados com capacidade de degradar mais de um substrato, e até mesmo os 3 substratos. Este estudo demonstra que os biocarvões de TPA são um microhabitat para microrganismos com capacidade comprovada em metabolizar hidrocarbonetos aromáticos complexos e diversos como fonte de carbono e energia. Os isolados apresentam um grande potencial biotecnológico para a geração de moléculas ligadas aos processos metabólicos da biodegradação, principalmente os não-cultivados, podendo auxiliar processos de biorremediação de áreas contaminadas e, possivelmente, produção de biocombustíveis de segunda geração. Além disso, os dados gerados por este estudo fornecem informações sobre o papel dessas bactérias na ciclagem de nutrientes, que influenciam diretamente na resiliência e fertilidade dos solos de Terra Preta de Índio da Amazônia por serem capazes de degradar compostos recalcitrantes de carbono dos fragmentos de biocarvão, ácidos húmicos e, talvez, grupos funcionais aderidos, além de outras frações da matéria orgânica humificada / Due to high humus content and pyrolyzed organic matter, Amazonian Dark Earth Soils (ADE) show different dynamic than other soils, presenting high contents of aliphatic and aromatic hydrocarbons. Alkanes are the major constituents of soil organic matter, low reactive, insoluble and recalcitrant, promoting lesser yield on fossil and renovable fuels production, as well as pollute the environment when in high concentrations. Aromatic hydrocarbons, as well as alkanes, are found in environment due to natural e industrial processes, are insoluble and recalcitrants, and can be toxic, mutagenic and carcinogenic. The study of bacterial communities from these areas is of major interest to reveal the high fertility of these soils, and understand the biochar influences on the plant-soil-microrganism relation, besides discover novel bacteria, genes and proteins. Diverse studies had already evaluated genes of interest for the biodegradation of hydrocarbons on ADEs, like bph gene (Brossi, 2014) from soils and ?-ARHDs (Germano, 2011) from soils and biochar. However, the alk gene for the biodegradation of alkanes was never studied in biochar. Neither any bacterial isolation from the ADEs biochar was done until now, so this work has this innovative approach to the ADEs. Biochar was separated, dilluted and plated on five culture media, and microarophilic incubation. The isolates were selected by their morphology and 86 isolates were obtained. We identified 24 bacterial genera throught the 16S rRNA gene sequencing: Burkholderia, Ralstonia, Pseudomonas, Achromobacter, Pantoea, Leclercia, Acinetobacter, Cupriavidus, Enterobacter, Variovorax, Leifsonia, Leclercia, Pantoea, Parapusiliimonas, Bordetella; Bacillus, Paenibacillus, Lysinibacillus, Brevibacillus, Rummeliibacillus; Arthrobacter, Streptomyces, Rhodoccocus; and Fibrobacterium, in addition to uncultured-bacteria. GA and ES media were the best on variety and number of bacteria from biochar, such aerobic as well as facultative anaerobic bacteria, being from the phyla Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria and Bacteroidetes. The alk gene was found in 11 isolates. We observed 53,49% of isolates were positive for 0,05% phenanthrene degradation; 70,93% of isolates were positive for 8% diesel oil degradation; and88,37% of isolates were positive for 0,05% biphenyl degradation. There were isolates capable to degrade more than one substratum, even the three substrata. This study demonstrates that ADE biochars are a microhabitat for bacteria with proved capacity to metabolize complex aromatic hydrocarbons as carbon and energy sources. The isolates have great biotehcnological potential to generate molecules associated to metabolic process of biodegradation, mainly the uncultured ones, being helpfull for polluted areas bioremediation and, possibly, to the production of second generation biofuels. Furthermore, the generated data supplies the role of bacteria from ADE biochar on the nutrient cycle, wich directly influences the resiliance and fertility of ADEs, for microbiota being capable to degrade recalcitrant carbon fragments of biochar, humic acids and, possibly, adhered functional groups, besides other organic matter fractions, as well

Parasitoides interferem no sistema imunológico de seus hospedeiros, influenciando a expressão de genes relacionados à resposta celular e humoral, podendo interferir na relação hospedeiro - microbiota intestinal. Além disso, parasitoides induzem alterações fisiológicas no hospedeiro que alteram o consumo e a utilização de alimento, e que podem influenciar a microbiata intestinal do mesmo. Alterações nessa microbiota poderiam afetar as relações e contribuições ao hospedeiro e, consequentemente, influenciar o desenvolvimento do próprio parasitoide. O objetivo deste trabalho foi o de verificar o efeito do parasitismo por Cotesia flavipes (Cameron) (Hymenoptera: Braconidae) na estrutura e no potencial funcional de contribuição da microbiota intestinal de Diatraea saccharalis (F.) (Lepidoptera: Crambidae), hospedeiro permissivo, e de Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae), hospedeiro não-permissivo. Além disso, buscou-se verificar se as secreções utilizadas pelo parasitoide (veneno, fluidos do cálice e virus simbionte) na regulação hospedeira estariam associadas à manipulação da microbiota intestinal do hospedeiro. O efeito do parasitismo na microbiota intestinal associada às porções antero-mediana e posterior do intestino dos hospedeiros estudados foi avaliado na fase inicial (1 DAP - dia após o parasitismo), intermediária (5 DAP) e final (9 DAP) do desenvolvimento larval do parasitoide. A avaliação foi feita por meio da comparação da diversidade e abundância de bactérias associadas ao trato intestinal de D. saccharalis e S. frugiperda parasitadas ou não por C. flavipes. A caracterização das bactérias foi feita via análise metagenômica em plataforma Illumina MiSeq utilizando a região V4 do gene ribossomal 16S. O pacote de softwares QIIME foi utilizado para a atribuição taxonômica das mesmas e o potencial funcional foi inferido por meio do software PICRUSt. O parasitismo afetou a abundância e diversidade de unidades taxonômicas operacionais (UTOs) da microbiota intestinal da porção antero-mediana e posterior de ambos hospedeiros. As alterações observadas para as duas regiões intestinais investigadas não seguiram o mesmo padrão ao longo do desenvolvimento do parasitoide. As análises realizadas também demonstraram que as alterações da microbiota induzidas pelo parasitismo refletiram em alterações significativas no potencial funcional de contribuição da microbiota associada ao trato digestivo de D. saccharalis e S. frugiperda. As análises da microbiota de lagartas pseudo-parasitadas demonstraram que as secreções maternas injetadas pela fêmea do parasitoide no momento do parasitismo estão envolvidas, pelo menos parcialmente, com os processos que levam às modificações na diversidade e abundância da microbita intestinal hospedeira, assim como de seu potencial de contribuição funcional. Esses resultados indicam que outros fatores/alterações produzidos em condições normais de parasitismo, seja pela influência de secreções de teratócitos e das próprias larvas do parasitoide em desenvolvimento também estão envolvidos na manipulação da microbiota hospedeira. Várias das alterações observadas no potencial de contribuição da microbiota intestinal do hospedeiro podem refletir sua qualidade nutricional e, consequentemente, favorecer sua exploração pelo parasitoide. Assim, o processo de regulação hospedeira por parasitoides se estende ao conjunto de organismos associados que compõem o holobionte representado pela lagarta hospedeira. / Parasitoids interfere with the immune system of their hosts by influencing the expression of genes related to cellular and humoral responses, which may interfere with the host - gut microbiota relationship. Furthermore, parasitoids induce physiological changes in the host, modifying food consumption and utilization, influencing then the host gut microbiota. These changes can affect the relationship and contributions of the gut microbiota to the host and therefore influence parasitoid development. This study aimed to evaluate the effect of parasitism by Cotesia flavipes (Cameron) (Hymenoptera: Braconidae) in the structure and potential functional contribution of the gut microbiota of the permissive host Diatraea saccharalis (F.) (Lepidoptera: Crambidae) and the non-permissive host Spodoptera frugiperda (JE Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) . In addition, the participation of the secretions female parasitoids (venon, calyx fluid and symbiotic virus) use in host regulation in the manipulation of the host gut microbiota was also investigated. The effects of host parasitization on the microbiota associated with the anterior (foregut-midgut) and posterior (hindgut) portions of host gut were evaluated at the early (1 DAP - day after parasitism), intermediate (5 DAP) and final (9 DAP) stages of parasitoid larval development. The diversity and abundance of the gut microbiota of D. saccharalis and S. frugiperda was compared in between parasitized and non-parasitized larvae by C. flavipes. The gut microbiota was characterized by sequencing the V4 region of the 16S ribosomal gene using the Illumina MiSeq platform. The software package QIIME was used for taxonomic attribution and the PICRUSt software was used to infer the potential funcional contribution of the gut microbiota. Host parasitization affected the abundance and diversity of operational taxonomic units (OTUs) of the two gut regions investigated (foregut-midgut and hindgut) in both hosts. The changes observed for both gut regions did not follow the same pattern throughout parasitoid development. Changes in the gut microbiota induced by parasitization reflected in significant changes in the potential of the functional contribution of the gut microbiota associated with D. saccharalis and S. frugiperda. Analyses of pseudo-parasitized larvae demonstrated that the maternal secretions female parasitoids inject when ovipositing are involved, at least partially, with the processes that lead to changes in the abundance, diversity and potential functional contribution of the host gut microbita. These results indicate that other factors / changes produced during normal parasitization, such as secretions from teratocytes and/or the developing parasitoid larvae can also be involved in the manipulation of host gut microbiota. Several of the changes observed in the potential contribution of the host gut microbiota may reflect its nutritional quality and therefore favor host exploitation by parasitoids. Thus, the process of host regulation by parasitoids also involves the regulation of the gut-associated bacteria, which altogether comprise the holobionte represented by the host larvae.

O Brasil é um dos países com a maior biodiversidade do mundo, embora existam ainda poucos estudos sobre a biodiversidade microbiana dulcícola, assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a diversidade e estrutura das comunidades bacterianas presentes no corpo e afluentes do Rio Tietê e relacioná-las às variáveis ambientais. Foram obtidos 385 fragmentos terminais de restrição representando a temporada de estiagem em 2013 e 217 TRFs representando a temporada de cheias em 2014. As análises de Redundância (RDA) apresentaram separação entre as amostras de acordo com o período de coleta seguida da qualidade da água de origem e a temporada 2013 apresentou maior riqueza e diversidade com relação à 2014. Já a técnica de sequenciamento por MiSeq Illumina, apresentou 2.130.122 sequências com boa qualidade e o parâmetro temperatura representou a principal variável ambiental agindo sobre a riqueza das comunidades avaliadas, além disso, a localização geográfica dos rios e suas conexões representaram fatores importantes para a distribuição dos gêneros observados. / Brazil is considered one of the countries with the highest biodiversity; however, there are few studies on microbial diversity in freshwaters. Thereby, the aim of present work was to evaluate the diversity and structure of bacterial community present in Tietê river and its tributaries, for that, 28 points along Tietê River Basin were evaluated by T-RFLP and 14 points were chosen based on these results for partial sequencing of rRNA 16S gene by MiSeq Illumina. 385 Terminal Restriction Fragments were obtained for season 2013 and 217 for 2014 and Redundancy Analysis presented separation between samples according to seasons followed by water quality group separation. Season 2013 presented higher richness and diversity compared to season 2014 and high throughput sequencing presented 2.130.122 sequences with good quality. Temperature parameter represented the main environmental variable acting on the richness of assessed communities, in addition, the geographic location of the rivers and their connections were important factors for the distribution of observed genera.

Estudos sobre a diversidade de Bacteria em solos de mangue (Brasil) e marisma (Espanha) são escassos. A vegetação de mangue, composta por espécies como Spartina alterniflora, Rhizophora mangle, Avicennia schaueriana e Laguncularia racemosa, pode ser um dos fatores que determinam a estruturação das comunidades de procariotos. Determinações das estruturas das comunidades e de diversidade de Bacteria podem ocorrer em função das diferentes condições físico-químicas dos solos, refletindo na configuração dos processos biogeoquímicos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a variação das estruturas das comunidades de Bacteria e Archaea, bem como a diversidade, em solos de mangue e marisma utilizando DGGE e sequenciamento parcial do rDNA 16S. As estruturas das comunidades de procariotos apresentaram variações em função de condições de vegetação. Proteobacteria e Bacteroidetes estão presentes em todos os solos estudados. A comunidade de Bacteria destes ambientes é dominada por Proteobacteria. Vários dos táxons detectados estão relacionados com ciclos biogeoquímicos importantes para os ambientes estudados. As estimativas não-paramétricas de riqueza de espécies (ACE e Chao1) mostram que solos de mangue e marisma podem conter milhares de espécies de bactérias. As comunidades de Bacteria dos solos de mangue e marisma são significativamene diferentes. Na camada mais superficial do sedimento de mangue predomina Euryarchaeota metanogênicas enquanto que na camada mais profunda predomina Crenarchaeota. Bactérias das ordens Desulfobacterales, Desulfovibrionales e Desulfuromonales podem estar relacionadas com a atividade de sulfato-redução e formação de pirita na camada anaeróbia do perfil de solo de marisma. De uma maneira geral, pode-se concluir que a diversidade e estrutura das comunidades de procariotos de ambientes estuarinos pode variar em função da vegetação estabelecida e do tipo de ambiente. Adicionalmente, solos de mangue e marisma possuem grande diversidade de procariotos, grande parte da qual é desconhecida, podendo representar elevado potencial genético para utilização biotecnológica. / The bacterial diversity in mangrove (Brazil) and marisma (Espanha) soils are largely unknown. Bacterial communities participate in biogeochemicals processes that occurs in soils of estuarine ecosystems. Determinations of the bacterial communities structures and diversity can occur in function of different physico-chemical conditions, reflecting in the biogeochemical processes. The aim of this work was to evaluate the variation of bacterial an archaeal communities structures utilizing DGGE and partial sequencing of 16S rDNA. Bacterial community structures showed more similarity between repetitions samples than the areas under different vegetation. Phylogenetic afiliation shows that several sequences were not clamped into known phyla. Proteobacteria prevails in bacterial communities of mangrove and marisma soils. Several taxa detected are associated to important biogeochemical cycles that occur in estuarine ecosystems. Analysis of species richness showed that mangrove and marisma soils can contain 200 to 6000 species of bacteria. Methanogenic Euryarchaeota was found specially in the upper sample of mangrove sediment analysed whereas the Crenarchaeota was found specially in the lower. Based on the data obtained, it can be concluded that the vegetation is one of the factors affecting the structure of bacterial and archaeal communities in mangrove soils. Additionaly, the effects of edafic factors and seasonal variations have to be considered as determining the prokaryotic community sctuctures, and bacterial and archaeal communities can respond independently to the factors that determine their community structures. Bacterial diversity can vary with the studied estuarine ecosystem. Studies are necessary concerning to diversity of Bacteria, it variation and correlation with biogeochemical process in the mangrove and marisma soils. These soils show a great diversity of bacteria, much of than unknown, which represent a great genetic potential to the biotechnology.

Orientador: Laura Maria Mariscal Ottoboni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T16:24:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carlos_Camila_D.pdf: 3834562 bytes, checksum: ae067ac8bf3731e5d1ab6af674e63c67 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Os recifes de corais são ecossistemas sensíveis que estão ameaçados pelas mudanças climáticas. Estudos têm demonstrado a importância da microbiota associada aos corais na resistência às doenças e aos estresses. Neste trabalho, a caracterização taxonômica e funcional da microbiota associada a corais encontrados no litoral de São Paulo permitiu a identificação de associações espécie-específicas entre corais e bactérias e a identificação de funções bacterianas responsáveis pelo estabelecimento de associações coral-bactéria. A composição taxonômica associada a ambientes coralíneos (muco, água e sedimento do entorno) de quatro espécies de corais encontradas no litoral de São Paulo foi avaliada por pirosequenciamento do gene de rRNA 16S. Os resultados indicam que a comunidade microbiana do muco não é apenas distinta do ambiente do entorno, todavia é, também, mais estável ao longo das estações do ano. A composição taxonômica da microbiota do coral mole Palythoa caribaeorum foi bastante distinta das demais espécies, pertencentes estas à ordem Scleractinia, indicando a influência das relações filogenéticas na moldagem das comunidades microbianas associadas aos corais. O metagenoma de Madracis decactis e da espécie brasileira endêmica Mussismilia hispida foi sequenciado por pirosequenciamento. A maior parte das sequências obtidas não pôde ser anotada, o que pode indicar a abundância de micro-organismos, especialmente vírus, ainda não estudados. Entre as sequências anotadas, foi observada uma grande abundância de sequências de origem viral em ambas as bibliotecas. Os metagenomas de M. hispida e M. decactis foram comparados a outros metagenomas disponíveis no banco de dados do MG-RAST e foi possível identificar genes ou funções mais abundantes nessas bibliotecas, como genes de resistência a antibióticos da classe dos aminoglicosídeos, que podem estar sujeitos à transferência horizontal nesse ambiente. Por último, foi sequenciado o genoma de uma bactéria isolada de muco de M. hispida, Paracoccus sp. SM22M-07. A análise comparativa desse genoma com outros genomas do gênero Paracoccus revelou funções únicas do isolado de muco de coral, por exemplo, genes do sistema de secreção do tipo IV podem exercer a função de contribuir com o estabelecimento de interações bactéria-coral. Todos os resultados aqui apresentados e analisados apontam para uma grande diversidade tanto taxonômica quanto funcional da comunidade bacteriana associada aos corais brasileiros. A estabilidade sazonal dessas comunidades é uma propriedade importante que contribui para a prevenção da colonização de bactérias patogênicas. Os resultados aqui apresentados representam um extenso inventário da diversidade microbiana em um ecossistema ameaçado pelas mudanças climáticas globais e permitirão futuros estudos comparativos e a criação de modelos e estimativas das taxas de redução da diversidade microbiana em ambientes marinhos / Abstract: Coral reefs are one of the ecosystems most threatened by global climate changes. Studies have shown the importance of the coral microbiota in stress and disease resistance. In this work, the taxonomic and functional characterization of the bacterial communities associated with corals from the coast of São Paulo State, Brazil, allowed the identification of species-specific interactions between corals and bacteria and the identification of the bacterial functions responsible for the establishment of these interactions. The taxonomic composition of mucus, water and surrounding sediment of four coral species found in the coast of Sao Paulo State was assessed by 16S rDNA pyrosequencing of metagenomic DNA. The microbial communities found in samples of mucus, water, and sediment differed according to the taxonomic composition, and the coral mucus community seemed to be more stable to seasonal changes. The taxonomic composition of the microbiota of the soft coral Palythoa caribaeorum was distinct from the other species belonging to the order Scleractinia, indicating the influence of phylogenetic relationships in shaping the microbial communities associated with the coral. The metagenome of Madracis decactis and the Brazilian endemic species Mussismilia hispida was sequenced by pyrosequencing. Most of the sequences obtained could not be annotated, which might indicate an abundance of unknown microorganisms, especially viruses. Among the annotated sequences, an abundance of viral sequences in both libraries was observed. The metagenomas M. decactis and M. hispida were compared with metagenomes datasets available in the MG-RAST database and through these comparisons, the most abundant genes or functions of the corals¿ metagenomes were identified, for example, genes for resistance to antibiotics of the aminoglycoside class. Finally, the genome of an isolate of mucus of M. hispida, Paracoccus sp . SM22M - 07 was sequenced. The comparative analysis of this genome with other genomes of the genus Paracoccus revealed unique functions of the bacteria isolated from coral mucus, such as genes of the type IV secretion system, which may contribute to the establishment of coral-bacteria interactions. All results presented and analyzed in this work show a great diversity, both taxonomic and functional, of the bacterial community associated with Brazilian corals. The seasonal stability of these communities is an important property that contributes to preventing the colonization by pathogenic bacteria. The results presented here represent an extensive inventory of microbial diversity in an ecosystem threatened by global climate change and will allow future comparisons, modeling and estimates of the rates of reduction of microbial diversity in marine environments / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Valéria Maia Merzel / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T14:04:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Verde_LeandroCostaLima_D.pdf: 7821596 bytes, checksum: b0f165c3b35ff62438f4e8f59035eb82 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O processo de biodegradação do petróleo em reservatórios pode resultar em mudanças na composição e propriedades físico-químicas de óleos brutos e gases naturais, as quais levam à diminuição do teor de hidrocarbonetos saturados, produzindo óleos mais pesados e com baixo valor econômico. O uso combinado de técnicas dependentes e independentes de cultivo pode nos permitir um melhor entendimento acerca da comunidade de micro-organismos que habita os reservatórios de petróleo, incluindo aqueles responsáveis por esta biodegradação. O conhecimento sobre a composição microbiana, suas funções e interações com outros micro-organismos e com o ambiente pode levar à definição de estratégias de monitoramento e/ou controle da biodegradação em reservatórios. Este estudo teve como finalidade avaliar a diversidade de micro-organismos e genes envolvidos na degradação de hidrocarbonetos presentes em amostras de petróleo provenientes de dois poços terrestres da Bacia Potiguar (RN), identificados como GMR75 (poço biodegradado) e PTS1 (poço não-biodegradado), através da construção de bibliotecas de genes catabólicos (alcano monooxigenases - alk, dioxigenases que hidroxilam anéis aromáticos ¿ ARHDs e 6-oxocyclohex-1-ene-1-carbonyl-CoA hidroxilase - bamA) e sequenciamento em larga escala de metagenoma e metatranscriptoma de enriquecimentos microbianos aeróbios. Os resultados obervados mostraram uma distribuição diferencial dos genes catabólicos entre os reservatórios, sendo o óleo biodegradado mais diverso para os genes alk e bamA. As sequências foram semelhantes aos genes alkB dos gêneros Geobacillus, Acinetobacter e Streptomyces, aos genes ARHD dos gêneros Pseudomonas e Burkholderia, e aos genes bamA do gênero Syntrophus. A análise quantitativa dos genes catabólicos de degradação de hidrocarbonetos presentes e expressos nos enriquecimentos microbianos em diferentes etapas da biodegradação do óleo, através de PCR Tempo Real, demonstrou maior atividade do gene que codifica a enzima dioxigenase nas comunidades microbianas enriquecidas, e os resultados obtidos pela técnica de microarray sugeriram a existência de novas sequências dos genes alk e ARHD provindas do reservatório de petróleo. As análises das sequências obtidas a partir do metagenoma e metatranscriptoma mostraram que a comunidade bacteriana recuperada no enriquecimento aeróbio é bastante diversa, com predominância do Filo Actinobacteria, seguido de Proteobacteria. As sequências com maior abundância e níveis de expressão foram relacionadas aos genes que codificam as proteínas ligase CoA de ácido graxo de cadeia longa, envolvida na degradação de compostos aromáticos; descarboxilase, envolvida com o ciclo do glioxilato, e o fator sigma da RNA polimerase, envolvida com a regulação da resposta ao estresse oxidativo, sugerindo uma adaptação da comunidade microbiana às condições do enriquecimento e um processo inicial de biodegradação dos hidrocarbonetos. Os resultados obtidos neste trabalho fornecem dados inéditos sobre a diversidade de genes catabólicos e de membros da comunidade microbiana potencialmente envolvidos com a degradação do óleo em reservatórios de petróleo / Abstract: The process of oil biodegradation in reservoirs may result in changes in the composition and physico-chemical properties of crude oils and natural gases, which lead to the decrease of the content of saturated hydrocarbons, producing heavy oils and with low economic value. The combined use of both dependent and independet cultivation techniques may allow us to better understand the microbial community inhabiting oil reservoirs, including those microorganisms responsible for oil degradation. The knowledge about the microorganisms, ther functions and interactions with other microorganisms and the environment may lead to the definition of monitoring and/or control strategies of biodegradation in oil reservoirs. This study aimed at evaluating the diversity of microorganisms and genes involved in the degradation of hydrocarbons present in oil samples from two onshore reservoirs at Potiguar Basin (RN), identified as GMR75 (biodegraded) and PTS1 (non- biodegraded), through the construction of catabolic gene libraries (alkane monooxygenases - alk, aromatic ring hydroxylating dioxygenases ¿ ARHD and 6-oxocyclohex-1-ene-1-carbonyl-CoA hydroxylase - bamA) and highthroughput sequencing of metagenome and metatranscriptome from aerobic microbial enrichments. Results observed showed a differential distribution of catabolic genes between the reservoirs, being the biodegraded oil more diverse for the alk and bamA genes. The sequences were similar to alkB genes from Geobacillus, Acinetobacter and Streptomyces genera, to the ARHD genes from Pseudomonas and Burkholderia genera, and to the bamA genes from Syntrophus genus. Quantitative analysis of the hydrocarbon degradation genes present and expressed in the microbial enrichments during the different phases of oil biodegradation by Real-Time PCR showed that there was a higher activity of dioxygenase enzymes in the enriched microbial communities and results from microarray assays suggested the existence of new alk and ARHD gene sequences originated from the oil reservoir. Metagenomic and metatranscriptomic analyses showed a highly diverse bacterial community, dominated by the Phylum Actinobacteria, followed by Proteobacteria. The most abundant and active sequences were affiliated to the Long-chain-fatty-acid-CoA ligase protein, involved in the degradation of aromatic compounds; decarboxylase, which is involved with the glyoxylate cycle, and RNA polymerase sigma factor, which is involved in regulating the oxidative stress response, suggesting an adaptation of the microbial community to the enrichment conditions and an initial process of biodegradation of hydrocarbon compounds. The results obtained in this work bring innovative data on the diversity of catabolic genes and microbial community members potentially involved with oil degradation in petroleum reservoirs / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Este estudo teve por objetivos avaliar diferentes níveis de suplementação de ?-ácidos do lúpulo como aditivos de rações para frangos de corte sobre o desempenho e a manutenção do equilíbrio da microbiota intestinal após desafio com Eimeria. No experimento 1, foram alojados 1440 pintos de corte da linhagem Cobb 500, no período de 1 a 42 dias de idade, com 6 tratamentos e 6 repetições. Os tratamentos utilizados foram: controle negativo, ração sem antimicrobiano; controle positivo, ração com 30 mg/kg de bacitracina de zinco e rações com 30, 60, 120 ou 240 mg/kg de ?-ácidos do lúpulo, compondo 4 tratamentos adicionais. Os ?-ácidos foram microencapsulados com 30%de extrato. As rações foram formuladas à base de milho e farelo de soja, com inclusão de 5% de farelo de trigo e 5% de farinha de penas e vísceras. Aos 7 dias de idade todas as aves foram vacinadas contra coccidiose. As aves e as rações foram pesadas semanalmente para cálculo de desempenho. No experimento 2, foram alojados 1440 pintos de corte da linhagem Ross 308, no período de 1 a 42 dias de idade, com 6 tratamentos e 6 repetições. Os tratamentos foram: controle negativo, dieta basal; controle positivo, ração com 30 mg/kg de bacitracina de zinco; controle negativo mais desafio; controle positivo mais desafio; controle negativo suplementado com 30 mg/kg de ?-ácidos mais desafio; controle negativo suplementado com 240 mg/kg de ?-ácidos mais desafio. As rações foram formuladas à base de milho e farelo de soja com inclusão de 5% de farinha de penas e vísceras. Aos 14 dias de idade, as aves dos tratamentos 3, 4, 5 e 6 foram desafiadas, via oral, com 2x105 e 5x104 oocistos de Eimeria acervulina e E. tenella, respectivamente. As aves e as rações foram pesadas semanalmente para obtenção dos dados de desempenho. Aos 21 e 35 dias de idade das aves, coletou-se o conteúdo do intestino delgado e cecos das aves para análise da microbiota intestinal, com auxílio de técnicas moleculares. No experimento 1, aos 21 dias de idade as aves os tratamentos com 30 ou 60 mg/kg de ?-ácidos apresentaram desempenho semelhante às do controle positivo. Aos 42 dias houve melhora na conversão alimentar das aves recebendo 30 e 240 mg/kg de ?-ácidos ou antimicrobiano. No segundo experimento, a coccidiose causou significativa redução no desempenho das aves e nenhum dos aditivos utilizados foi capaz de reverter esta situação. Houve aumento de bactérias do gênero Clostridium no intestino delgado aos 21 dias, em consequência do desafio, entretanto, o maior nível de ?-ácidos reduziu esta população. Aos 35 dias de idade a infecção de coccidiose não alterou a comunidade bacteriana do intestino delgado, mas nos cecos houve aumento do gênero Bacteroides.Os ?-ácidos possuem potencial para serem utilizados nas dietas de frangos de corte em situações de baixo desafio, e podem auxiliar no controle da proliferação de Clostridium, embora ineficazes contra a Eimeria. / The objective was to evaluate increasing level of hops ?-acids in the feed on performance of broiler chickens. A pen trial using 1440 one-day old chickens, from 1 to 42 days, with 6 treatments and 6 replicates was conducted (Experiment 1). The experimental treatments were: negative control, basal diet; positive control, basal diet supplemented with zinc bacitracin, 30 mg/kg; and basal diet supplemented with 30, 60, 120 or 240 mg/kg of hops ?-acids, for 4 additional treatments. The corn soybean meal basal diet was formulated with inclusion of 5% poultry by-product meal and 5% wheat bran. At 7 days of age all birds were vaccinated against coccidiosis. The chickens and the feed were weighted weekly to calculate the performance. In the second experiment, the objective was to evaluate the supplementation of hops ?-acids on performance and the balance of intestinal microbiota of broilers, following challenge with Eimeria acervulina and E. tenella. A pen trial using 1440 one-day-old chickens, from 1 to 42 days, with 6 treatments and 6 replicates was conducted. The experimental treatments were: negative control, basal diet; positive control, basal diet supplemented witn zinc bacitracin, 30 mg/kg; negative controle + challenge; Positive control + challenge; negative control supplemented with 30 mg/kg of hops ?-acids + challenge; negative control supplemented with 240 mg/kg of hops ?-acids + challenge. The corn soybean meal basal diet was formulated with inclusion of 5% poultry byproduct meal. At 14 days of age, the birds in treatments 3, 4, 5 and 6 were challenged with 2x105 and 5x104 oocists of Eimeria acervulina and E. tenella, respectively. The chickens and the feed were weighted weekly to calculate the performance. At 21 and 35 days of age, the small intestine and ceca content was collected to analyze the intestinal microbiota, using molecular techniques. In the first experiment, at 21 days of age the treatment with 30 or 60 mg/kg of ?-acids had the same performance of chickens in positive control. At 42 days, the treatments containing 30 or 240 mg/kg of ?-acids and positive control had improved feed conversion. In the second experiment, there was worse performance in broilers chickens challenged with coccidiosis and the additives were not able to oppose this situation. There was increase in the Clostridium population in the small intestine at 21 days, due to challenge, however, the highest level of ?-acids decreasead this genus. At 35 days, the coccidiosis did not alter the bacterial community in the small intestine, although the ceca had higher level of Bacteroides. The hops ?-acids have the potential to be used in the diets of broiler chickens, under low level of challenge, and to proliferation of Clostridium, although ineffective against Eimeria.

O presente trabalho busca entender a dinâmica de comunidades bacterianas cultiváveis e não cultiváveis do ecossistema do manguezal e prospectar nesse ambiente ainda inexplorado, um possível potencial biotecnológico. As amostras de sedimentos foram retiradas de duas profundidades no inverno e no verão. Bactérias caracterizadas por meio da técnica de ARDRA pertencem as ordens Vibrionales, Bacillales e Actinomycetales. As espécies bacterianas cultiváveis e as não cultiváveis foram também avaliadas por meio da técnica de PCR-DGGE, onde utilizou-se iniciadores seletivos para Actinobacterias, a e b Proteobacteria, Pseudomonas spp. e Paenibacillus spp., além do universal para bacteria. A análise multivariada de redundância (RDA) permitiu verificar a relação dos perfis obtidos das amostras com os fatores ambientais. Verificou-se uma diferente distribuição dos grupos de a e b Proteobacteria em relação à sazonalidade, enquanto que a profundidade de amostragem mostrou ser essencial no perfil das comunidades totais, a e b-Proteobacteria e Actinobacterias. / The objective of the present work is the understanding of culturable and non-culturable bacterial community dynamic present in the mangrove ecosystem also to explore the biotechnological potential of bacteria present in this environmental. Sediment samples were obtained from two depths winter and summer seasons and further analyzed. The Bacteria were characterized by ARDRA and identified the orders Vibrionales, Bacillales e Actinomycetales. Culturable and non-culturable bacteria were also assessed by PCR-DGGE using specific primers for Actinobacteria, a-Proteobacteria, b-proteobacteria, Pseudomonas spp., Paenibacillus spp. and bacteria universal primers. Multivariate redundancy analysis allowed the verification of main factors determining the bacterial communities patterns found on samples. It was verified a seasonal distribution of a and b-Proteobacteria groups, while the sampled depth was determinant for the total bacterial community composition, and also influenced the a and b-Proteobacteria and Actinobacteria profiles.

Na natureza, as orquídeas são totalmente dependentes de fungos micorrízicos para germinar. Estes fungos podem penetrar nas células das raízes e formar pélotons, os quais, quando digeridos pela planta, providenciam açúcares simples para o embrião. Durante a fase aclorofilada de desenvolvimento da plântula, orquídeas são obrigatoriamente dependentes dos fungos; algumas continuam assim por toda vida enquanto outras se tornam facultativamente responsivas à colonização. O objetivo deste trabalho foi identificar quantos clados de fungos podem estabelecer associação micorrízica com Coppensia doniana (sin. Oncidium donianum), uma orquídea amplamente distribuída nos arredores de Campos do Jordão e, demonstrar como as características morfológicas dos isolados, quando analisadas com ferramentas de estatística multivariada, podem ser úteis para a taxonomia destes fungos. Dez plantas foram amostradas em um sítio com vegetação típica de campos de altitude, junto ao Parque Estadual de Campos do Jordão. Fungos foram isolados pela transferência asséptica de cortes de raízes contendo pélotons para meios de cultura BDA modificados. Três clados de fungos foram formados, tanto analisando as características qualitativas das culturas quanto as quantitativas. Os clados foram identificados como dois morfotipos do gênero Ceratorhiza (fase anamórfica de Ceratobasidium) e uma Rhizoctonia-uninucleada. O sequenciamento da região ITS produziu resultados idênticos a estes, mostrando os mesmos três clados. Todas as sequências tiveram alta correlação com sequências de Ceratobasidium depositadas no Genbank, o que sugere uma alta afinidade de Coppensia doniana com este gênero. Também ficou demonstrado que os dados morfológicos, quando associados à estatística multivariada são uma ferramenta útil na taxonomia polifásica de Rhizoctonia spp. As sequências dos isolados de Coppensia doniana também foram comparadas com as de isolados de outras orquídeas, dentro da subtribo Oncidiinae, incluindo: Ionopsis utricularioides e Psygmorchis pussila, coletadas na região do Valle del Cauca Colômbia e isolados de 10 Ionopsis utricularioides, Oncidium altissimum e Tolumnia variegata, estudados por Otero (2002, 2004, 2007), em diferentes regiões de Porto Rico, Costa Rica, Cuba e Panamá. Esta última análise veio a comprovar a preferência de orquídeas da subtribo Oncidiinae por fungos do gênero Ceratobasidium, apesar de que os clados obtidos no Brasil e na Colômbia foram distantes filogeneticamente dos clados previamente estudados na América Central. Representantes dos três clados obtidos de C. doniana em Campos do Jordão foram também testados quanto à capacidade de induzir germinação em suas sementes. Todos isolados testados tiveram sucesso na germinação das sementes, levando as plântulas a estádios avançados de desenvolvimento após 30 dias, o que indica um alto potencial para utilização biotecnológica destes isolados para a germinação das sementes destas orquídeas, tanto para a floricultura comercial quanto para programas de reintrodução de espécies de orquídeas ameaçadas de extinção. / In nature, orchids are fully dependent on mycorrhizal fungi for germination. These fungi can penetrate root cells and form pelotons, whose digestion provides simple sugars for the embryo. During the achlorophyllous seedling stage, orchids are obligatory dependent on the fungi, and some species remain so through life, while others become facultatively responsive to fungal infection. The aim of this study was to identify how many fungal clades can establish mycorrhizal associations with Coppensia doniana, a widespread orchid from Campos do JordãoBrazil, and to demonstrate how their morphological features, analyzed with multivariate statistics, can be useful for classification. Ten plants were sampled in an Araucaria forest near Campos do Jordão. Fungi were isolated by transferring surface disinfected root segments containing pelotons to PDA culture medium. Three main fungal clades were formed by qualitative and quantitative morphological data. They were identified as two morphotypes of Ceratorhiza (anamorphic stage of Ceratobasidium) and one uninucleated Rhizoctonia. The ITS sequencing corroborates this identification, since the same three clades were found. All sequences were highly correlated to Ceratobasidium ITS data deposited at the Genebank, suggesting a high affinity between this species of Oncidiinae and Ceratobasidium. It also could be shown that morphological data associated with multivariate statistics can be a useful tool in fungal multi-level taxonomy. C. doniana sequences were also compared to sequences obtained from isolates of other orchids, belonging to the sub-tribe Oncidiinae, including: Ionopsis utricuarioides and Psygmorchis pussila, collected in Valle del Cauca Colombia and isolated from I. utricularioides, Oncidium altissimum and Tolumnia variegata, studied by Otero (2002, 2004, 2007) in different regions of Puerto Rico, Costa Rica and other Caribbean islands. This last analysis confirmed the preference of this Oncidiinae sub-tribe for Ceratobasidium, although isolates obtained in Brazil or Colombia belong to different clades from those previously studied in Puerto Rico, Costa Rica, Panama and Cuba. 12 Fungi representing the three clades obtained from C. doniana in Campos do Jordão were also tested for their ability to induce germination of C. doniana seeds, with a positive response for all of them, being able to bring the seedlings to advanced development stages in 30 days. These results suggest a high biotechnological potential of these isolates, to be used in orchid symbiotic germination for commercial flower production or for the reintroduction of endangered Brazilian orchid species.