Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-08-06T17:36:07Z No. of bitstreams: 1 DissertaçãoNayaraFINALmaio2013.pdf: 3684656 bytes, checksum: 44cf55a7da171d43dbf42153f6237225 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-06T17:36:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissertaçãoNayaraFINALmaio2013.pdf: 3684656 bytes, checksum: 44cf55a7da171d43dbf42153f6237225 (MD5) Previous issue date: 2013 / Em nosso estudo caracterizamos a enzima ferro superóxido dismutase-A (FeSOD-A)e a proteína de membrana dos kinetoplastídeos-11 (KMP-11) em linhagens de Leishmania spp. do Novo Mundo selvagens e resistentes aos antimoniais. Ambas proteínas apresentam grande relevância no metabolismo do parasito, visto que a enzima FeSOD-A está envolvida na defesa antioxidante e KMP-11, presente na superfície da membrana dos kinetoplastídeos, pode estar relacionada ao fenótipo de resistência do parasito ao antimonial. Análise de Southern blot mostrou a presença de polimorfismos na sequência do gene FeSOD-A entre as linhagens de Leishmania avaliadas. A expressão de FeSOD-A foi analisada utilizando anticorpo policlonal (TcFeSOD) que reconheceu um polipeptídio de 26 kDa em todas as linhagens estudadas. Quantificação por qPCR mostrou que o mRNA do gene é 3,6X menos expresso na linhagem L. guyanensis resistente LgSbR, por outro lado a proteína está 2,0X mais expressa nessa linhagem. A FeSOD-A está 3,0X menos expressa em L. amazonensis resistente LaSbR, mas o nível de mRNA foi o mesmo entre as linhagens LaWTS e LaSbR. Ensaios de atividade enzimática mostraram que FESOD-A possui maior atividade nas linhagens resistentes de L. braziliensis e L. infantum chagasi (LbSbR e LcSbR) comparado com as linhagens selvagens. A análise funcional foi realizada para determinar se a superexpressão do gene FeSOD-A nas linhagens LbWTS/LbSbR e LcWTS/LcSbR iria alterar o fenótipo de resistência dos parasitos transfectados. Ensaios de Western blot e de atividade enzimática mostraram que o nível de expressão da proteína e atividade da FeSOD-A foram maiores nos parasitos transfectados em comparação com os não-transfectados. Análise IC50 do SbIII mostrou que a superexpressão FeSOD-A nas linhagens de LbWTS e LcWTS aumentou 1,7X e 1,6X o fenótipo de resistência ao antimônio, respectivamente. A superexpressão da enzima FeSOD-A na linhagem LbSbR reduziu o fenótipo resistência, enquanto que na linhagem LcSbR não houve alteração no fenótipo. Resultados de tolerância ao estresse oxidativo induzido por paraquat mostrou que o clone superexpressor de LbWTS apresentou maior proteção ao estresse comparado à linhagem não-transfectada. Concluindo, nossos resultados sugerem que a enzima FeSOD-A está envolvida no fenótipo de resistência de L. braziliensis e L. chagasi ao antimonial. Para o gene KMP-11 análise por Southern blot mostrou semelhante perfil de hibridização entre as diferentes espécies analisadas, com exceção da linhagem LgWTS que apresentou perfil de fragmentos diferentes. Análise de Northern blot revelou a presença de dois transcritos, 1,0 Kb e 3,0 Kb, em todas as linhagens de Leishmania spp., com exceção da linhagem LgWTS que apresentou apenas um transcrito de 1,0 Kb. Quantificação por qPCR mostrou que mRNA do gene KMP-11 está 2,9X menos expresso na linhagem de LbSbR e 1,5X mais expresso na linhagem LcSbR comparado com os respectivos pares selvagens. A expressão de KMP-11 utilizando anticorpo policlonal anti-KMP-11, mostrou que ele reconheceu um polipeptídio de 11 kDa em todas as linhagens de Leishmania spp. estudadas. Análises de densitometria mostraram que KMP-11 está 1,5X mais expressa em LcSbR comparado com o par selvagem LcWTS e 2,0X menos expressa em LbSbR comparado ao par LbWTS. Ensaios de transfecção do gene KMP-11 foram realizados nas linhagens LbWTS e LbSbR. Análise de Western blot mostrou maior expressão da proteína KMP-11 nos parasitos resistentes transfectados. Avaliação da susceptibilidade ao SbIII mostrou que a superexpressão de KMP-11 na linhagem selvagem de LbWTS não alterou o fenótipo. Por outro lado, a superexpressão dessa proteína na linhagem resistente (LbSbR) reduziu o fenótipo resistência. Ensaios in vitro e in vivo com as linhagens LbWTS não-transfectadas e os clones transfectados com KMP-11 não mostraram diferenças quanto à infectividade dos parasitos em células THP-1 e em camundongos nocaute para interferon-γ. Apenas o clone 6 apresentou menor infectividade em camundongos. Estudos adicionais são necessários para investigar melhor a possível participação da proteína KMP-11 no fenótipo de resistência ao antimonial e na infectividade dos parasitos. / In this study, we characterize the iron superoxide dismutase-A (FeSOD-A) enzyme and kinetoplastid membrane protein-11 (KMP-11) in New World Leishmania spp. lines wild and resistant to antimonials. Both proteins are very important in metabolism of the parasite, since that FeSOD-A is involved in antioxidant defense and KMP-11, present on the surface of kinetoplastids membrane, may be related to antimony-resistance phenotype. Southern blot analysis showed the presence of polymorphisms in the FeSOD-A gene sequence between the Leishmania lines evaluated. The expression level of FeSOD-A was analyzed using polyclonal antibody (anti-TcFeSOD) that recognized a polypeptide of 26 kDa in all lines studied. Quantification by qPCR showed that the FeSOD-A mRNA is 3.6-fold less expressed in SbIII-resistant L. guyanensis line (LgSbR), on the other hand the protein is 2.0-fold more expressed in this line. FeSOD-A is 3.0-fold less expressed in L. amazonensis resistant line (LaSbR), but the level of mRNA was the same between LaWTS and LaSbR lines. Enzymatic activity assays showed that SbIII-resistant L. braziliensis and L. infantum chagasi lines (LbSbR and LcSbR) present a higher FeSOD-A activity than their susceptible pairs. Functional analysis was performed to determine whether overexpression of the FeSOD-A gene in LbWTS/LbrSbR and LcWTS/LcSbR lines should alter the SbIII-resistance phenotype of transfected parasites. Western blot and enzymatic activity assays showed that the protein expression level and activity of FeSOD-A were higher in the transfected parasites compared to non-transfected ones. Analysis of IC50 for SbIII showed that the overexpression of FeSOD-A in the LbWTS and LcWTS lines increased 1.7- and 1.6-fold the SbIII-resistance phenotype, respectively. Overexpression of FeSOD-A enzyme in the LbSbR line reduced the SbIII-resistance phenotype, whereas in the LcSbR line no change in phenotype was observed. Results about the tolerance of parasites to oxidative stress induced by paraquat showed that the clone from LbWTS overexpressor of FeSOD-A presented higher protection to stress compared to non-transfected lines. In conclusion, our results suggest that the FeSOD-A enzyme may be involved to antimony-resistance phenotype in L. braziliensis and L. chagasi lines. Concerning KMP-11 gene, Southern blot analysis showed similar hybridization profile between different Leishmania lines analyzed, with exception of LgWTS line that presented different profile. Northern blot analysis revealed the presence of two transcripts, 1.0 kb and 3.0 kb in all lines of Leishmania analyzed, except for LgWTS line that showed only a transcript of 1.0 kb. Quantification by qPCR showed that mRNA KMP-11 is 2.9-fold less expressed in LbSbR line and 1.5-fold more expressed in LcSbR line compared with their wild pairs. The expression of KMP-11 using anti-KMP11 polyclonal antibody, showed that it recognized a polypeptide of 11 kDa in all Leishmania lines analyzed. Densitometry analysis showed that KMP-11 is 1.5-fold more expressed in the LcSbR line compared with its wild pair and 2.0-fold less expressed in the LbSbR line compared whit its resistant pair. Transfection assays of KMP-11 gene in the LbWTS and LbSbR lines were carried out. Western blot analysis revealed expression increased of KMP-11 protein in transfected resistant parasites. Evaluation of SbIII usceptibility showed that transfection of KMP-11 in the wild LbWTS line did not alter the phenotype. On the other hand, overexpression of this protein in the resistant LbrSbR line reduced the SbIII-resistance phenotype. In vitro and in vivo assays using LbWTS lines and non-transfected clones overexpressors of KMP-11 showed no difference in infectivity of the parasite in THP-1 cells and in interferon-γ knockout mice. Only the clone 6 showed lower infectivity in mice. Additional studies are needed to further investigate a possible involvement of KMP-11 protein in SbIII-resistance phenotype and in infectivity of parasites.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-07T14:28:24Z No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_CarolinaPauladeSouzaMoreira.pdf: 2546138 bytes, checksum: 434d23f2a06b0ab5b462d8c8c67dafe8 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-07T14:28:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_CarolinaPauladeSouzaMoreira.pdf: 2546138 bytes, checksum: 434d23f2a06b0ab5b462d8c8c67dafe8 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-07T18:25:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_CarolinaPauladeSouzaMoreira.pdf: 2546138 bytes, checksum: 434d23f2a06b0ab5b462d8c8c67dafe8 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-07T18:25:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_CarolinaPauladeSouzaMoreira.pdf: 2546138 bytes, checksum: 434d23f2a06b0ab5b462d8c8c67dafe8 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / Existe uma necessidade urgente de drogas leishmanicidas mais eficazes e/ou menos tóxicas para contribuir com o arsenal terapêutico atualmente disponível. O grupo de pesquisa de Química de Produtos Naturais Bioativos do Laboratório de Química de Produtos Naturais bioativos do CPqRR tem realizado projetos de bioprospecção de flora brasileira buscando por novos hits que possam ser utilzados no tratamento das leishmanioses. A espécie Baccharis platypoda (Asteraceae) foi uma espécie que mostrou atividade leishmanicida e que foi pouco investigada do ponto de vista químico e biológico. O estudo químico biomonitorado do extrato etanólico das folhas dessa espécie levou à obtenção de cinco frações com elevada toxicidade para formas amastigotas intracelulares de L. (L.) amazonensis e o fracionamento de uma dessas frações resultou no isolamento de um novo diterpeno clerodano, de baixa atividade, que após análise de RMN e ESI-TOF-MS/MS foi denominado platypodiol ou 1R,3R,4R,8aR)-3-(hidroximetil)-4-[(3E)-5-hidroxi-3-metilpent-3-en-1-il]-4,8,8a-trimetil-1,2,3,4,4a,5,6,8a-octahidronaftalen-1-ol. Em estágio sanduíche realizado na Universidade de Granada – Espanha os compostos fenólicos do extrato etanólico das folhasd de B. platypoda foram investigados por HPLC–ESI-Q-TOF-MS/MS no modo negativo e 19 ácidos fenólicos, 10 flavonas, 5 flavonóis e 6 flavanonas foram identificados. Além disso, o potencial antioxidante do extrato foi avaliado em quatro ensaios, mostrando o potencial antioxidante da espécie. Esses resultados aumentaram o conhecimento fitoquímico sobre a espécie brasileira B. platypoda, considerando que ela foi até o momento pouco investigada cientificamente / There is an urgent need for effective leishmanicida drugs to replace or supplement those in current use. Our group have been bioprospecting many Brazilian plants looking for potential new ‘hits’ to combat leishmaniasis. We found that Baccharis platypoda was one of the Asteraceae species that displayed leishmanicidal activity and it was few investigated. The bioassay-guided chemical study of the ethanolic extract of the leaves resulted in five fractions with high toxicity for intracellular amastigotes of L. (L.) amazonensis and the fractionation of one of these fractions led to a new diterpene clerodane with low activity that was named platypodiol or 1R,3R,4R,8aR)-3-(hidroxymethyl)-4-[(3E)-5-hydroxy-3-methylpent-3-en-1-yl]-4,8,8a-trimethyl-1,2,3,4,4a,5,6,8a-octahydronaftalen-1-ol upon NMR and ESI-TOF-MS/ MS analysis. We investigated in Granada University - Spain the phenolic components of the ethanolic leaf extract using HPLC–ESI-Q-TOF-MS/MS in negative mode and provided the identification of 19 phenolic acids, 10 flavones, 5 flavonols and 6 flavanones. We also determined the antioxidant capacity of the extract. Considering the few publications about this species, this result has increased the phytochemical knowledge about B. platypoda.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-05-24T14:53:34Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Lucas Fonseca Rodrigues.pdf: 1491783 bytes, checksum: 4c381c126501225055166afa8882ba08 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-24T14:53:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Lucas Fonseca Rodrigues.pdf: 1491783 bytes, checksum: 4c381c126501225055166afa8882ba08 (MD5) Previous issue date: 2012 / Apesar da busca por tratamentos alternativos para a Leishmaniose Cutânea (LC), os antimoniais pentavalentes (SbV) ainda permanecem como os fármacos mais amplamente usados no tratamento dessa doença. Eles podem ser eficazes e relativamente bem tolerados; entretanto, reações adversas graves e falha terapêutica ocorrem frequentemente. A possibilidade de a falha terapêutica estar associada a diferenças na sensibilidade ao SbV dos parasitos foi investigada utilizando-se, principalmente, análise de sensibilidade in vitro. Os resultados, até o momento, porém, são contraditórios. Portanto, faz-se necessária a busca por novos modelos de avaliação de sensibilidade a fármacos em Leishmania e por tratamentos alternativos que sejam menos tóxicos, como por exemplo, o desenvolvimento de formulações de uso tópico. Por isso, o objetivo deste trabalho foi avaliar a sensibilidade in vivo de Leishmania (Viannia) braziliensis isoladas de pacientes portadores de LC ao antimoniato de meglumina, bem como a atividade da combinação de uma baixa dose de SbV, considerando-se o modelo de hamsters dourados (Mesocricetus auratus), com aplicação tópica de uma formulação hidrofílica de paromomicina (PA). Para a análise de sensibilidade in vivo, hamsters foram infectados com 13 diferentes isolados e tratados com 50mg SbV/Kg/dia, durante 20 dias. Em comparação à resposta observada para a cepa de referência de L. (V.) braziliensis MHOM/BR/1975/M2903, todos os isolados mostraram-se sensíveis ao antimoniato de meglumina. Para a avaliação da combinação SbV + PA, hamsters foram infectados com três dos 13 isolados utilizados na análise de sensibilidade e com a cepa M2903 e separados em grupos que receberam esquemas terapêuticos de 25mg Sb V /Kg/dia, 25mg SbV/Kg/dia + PA e apenas PA, todos por 20 dias. Para esses isolados, a dose de 25mg SbV/Kg/dia, por 20 dias, por si só, foi eficaz na cicatrização dos animais, o que prejudicou a avaliação da eficácia da associação dessa dose com a aplicação tópica de PA, considerando o parâmetro tamanho de lesão. Porém, por outro lado, também evidenciou maior sensibilidade dos isolados ao antimoniato de meglumina. Considerando-se o parâmetro carga parasitária, a combinação dos fármacos foi eficiente para redução do parasitismo no sítio de lesão apenas em um dos isolados, quando comparada à ação dos fármacos isoladamente. Para a cepa M2903, a combinação SbV + PA mostrou-se eficaz na a redução do tamanho da lesão nos animais, mas não na redução da carga parasitária. / Despite the search for alternative treatments for cutaneous leishmaniasis (CL), the pentavalent antimonials (SbV) still remain the most widely used drugs in the treatment of this disease. They can be effective and well tolerated, but serious adverse reactions and therapeutic failure occur frequently. The relation between therapeutic failure and differences in sensitivity to SbV of parasites was investigated using in vitro sensitivity analysis mainly. The results until now, however, are inconclusive. Therefore, it is necessary to search for new models for evaluating drug susceptibility in Leishmania and for alternative treatments which are less toxic, such as the development of formulations for topical use. Therefore, the objective of this study was to evaluate the in vivo sensitivity of Leishmania (Viannia) braziliensis isolated from patients with CL to meglumine antimoniate, as well as the activity of the combination of low doses of SbV, considering the model of gold hamsters (Mesocricetus auratus), with a topical paromomycin (PA) hydrophilic formulation. For in vivo sensitivity analysis, 13 hamsters were infected with different isolates and treated with 50mg SbV /kg/day for 20 days. In comparison to response observed for the reference strain of L. (V.) braziliensis MHOM/BR/1975/M2903, all isolates were susceptible to meglumine antimoniate. To evaluate the combination SbV + PA, hamsters were infected with three of the 13 isolates used in the sensitivity analysis and the strain M2903 and separated into groups that received 25 mg SbV/kg/day, 25 mg/kg/day + PA and only PA, all for 20 days. For these isolates, the dose of 25 mg SbV /kg/day for 20 days, by itself, was effective for the lesion healing, which hampered the evaluation of the efficacy of this dose associated with the topical application of PA, considering the lesion size parameter. How ever, on the other hand, this result also showed increased sensitivity of the isolates to meglumine antimoniate. Considering the parasitic load parameter, the combination of the drugs was effective in reducing the parasitism at lesion site in only one of the isolates compared to the action of the drugs alone. For M2903 strain, the PA + SbV combination was effective in reducing lesion size but not in the reducing the local parasitic burden.

Made available in DSpace on 2011-05-04T12:36:30Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010 / Embora os antimoniais pentavalentes (antimoniato de meglumina, AM, e estiboglucanato de sódio) tenham sido introduzidos no mercado em meados dos anos 1940, eles ainda são medicamentos de primeira linha no tratamento das leishmanioses. Sendo um fármaco antigo para uma das doenças mais negligenciadas, há importantes lacunas na base de dados não clínicos de segurança disponível para o AM (e.g. estudos de toxicidade reprodutiva). Neste estudo investigamos se o tratamento com AM durante a gestação e lactação prejudicaria o crescimento pós-natal, a maturação neurocomportamental e a fertilidade da prole na vida adulta. Ratos Wistar foram tratados com AM (0, 75, 150 and 300 mg Sb+5/kg peso corporal/dia, via sc) durante a gravidez (dia 1 de gravidez em diante), parto e lactação até o desmame (dia 21 pós-natal, 21PN). A prole das mães tratadas foi avaliada quanto ao crescimento pós-natal, maturação somática e neurocomportamental (dias nos quais marcos do desenvolvimento apareceram, e teste do campo aberto nos dias 25 e 60 PN). O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética de Pesquisas do Uso de Animais da FIOCRUZ (CEUA, L0016/08). As ratas tratadas com AM não exibiram deficits de ganho de peso ou outros sinais de toxicidade materna. A duração da gravidez, o tamanho da ninhada, e o peso dos filhotes ao nascimento não foram alterados pelo tratamento com AM. O peso da prole nos grupos tratados com as duas maiores doses foi reduzido nas dias 50 e 60 PN. Os marcos do desenvolvimento físico e reflexos, a maturação sexual e a fertilidade na vida adulta não foram afetados. A prole feminina das mães tratadas com as duas maiores doses apresentou uma exploração vertical (frequência de levantar) reduzida no teste do campo aberto realizado no dia 60 PN. O peso do fígado discretamente menor foi achado em machos e fêmeas mortos na idade adulta. Considerados em conjunto, os resultados desse estudo sugeriram que, exceto por alguns poucos efeitos de menor monta em relação ao peso corporal e desempenho no teste do campo aberto no dia 60 PN, notados apenas na prole feminina, o tratamento materno com AM, no intervalo de doses testado, durante toda a gestação e lactação, não afetou o desenvolvimento, maturação e fertilidade da prole exposta. / Although having been introduced in the market in mid 1940s, pentavalent antimony drugs (meglumine antimoniate, MA, and sodium stibogluconate) are still first choice drugs for treatment of leishmaniasis. Being a rather old drug for one of the most neglected diseases, important gaps are found in the non-clinical safety data base available for MA (e.g., reproductive toxicity studies). In this study we investigated whether maternal treatment with MA during gestation and lactation impaired the postnatal growth, neurobehavioral maturation and fertility of the offspring in the adulthood. Wistar rats were treated with MA (0, 75, 150 and 300 mg Sb+5/kg body wt/day by sc route) during pregnancy (from gestation day 1 onwards), parturition and lactation until weaning (postnatal day 21, 21PN). The offspring of treated dams was evaluated regarding postnatal growth, somatic and neurobehavioral maturation (day on which developmental landmarks appeared and open field test on 25 and 60 PN). The study protocol was approved by the Ethical Committee on the Use of Animals of FIOCRUZ (CEUA, L0016/08). Dams treated with MA did not show body weight gain deficits or other signs of maternal toxicity. Duration of pregnancy, litter size and pup body weight at birth were not altered by maternal treatment with MA. Pup body weight in groups exposed to the two highest doses was reduced on 50 e 60PN. The milestones of physical and reflexes development, sexual maturation, and fertility in adulthood were not affected. Female offspring from mothers treated with the two highest doses showed a decreased vertical exploration (rearing up frequency) in the open field test on 60 PN. A slightly lower liver weight was found in males and females euthanized in adulthood. Taken together, results from this study suggested that, except for a few minor effects in female body weight and open field behavior on 60 PN, maternal treatment with MA, in the dose range tested, during the whole pregnancy and suckling periods, did not affect the development, maturation and fertility of the exposed offspring.

Durante a gestação, observamos um influxo de linfócitos para a região mesometrial de camundongos denominados de células Natural Killer Uterinas (uNK). Estas células desempenham funções importantes no início da gestação, como a manutenção da tolerância materna ao feto, angiogênese e remodelação das artérias espiraladas. Sua capacidade citolítica é reduzida podendo ser ativada caso haja algum desequilíbrio entre citocinas pró e anti-inflamatórias durante a gestação. A ciclofosfamida é um medicamento usado no tratamento de doenças autoimunes e câncer. Trata-se de um teratógeno, sendo que seu uso pode levar a alterações macroscópicas e microscópicas, bem como, a redução da viabilidade gestacional em camundongos. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da ciclofosfamida no útero e nas células uNK de camundongos no 10° ddg, por meio da análise morfológica, citoquímica e estereológica concomitantemente a análise da viabilidade gestacional e no comportamento destes animais nos parâmetros de depressão e ansiedade. Nossos resultados mostraram que a ciclofosfamida provoca rapidamente o aumento de células uNK no útero, bem como, diminuição na expressão de N-acetil-D-galactosamina em seus grânulos e superfície, atingindo primeiramente células uNK menos diferenciadas próximas ao mesométrio, e posteriormente células mais diferenciadas em regiões mais próximas ao embrião. Seu efeito drástico na gestação provocou ainda diminuição no número de células uNK após 48h de sua administração, concomitante ao aparecimento de muitos sítios em reabsorção, diminuindo a viabilidade gestacional, bem como, estabelecimento de comportamento semelhante ao doentio nesses animais, causando 100% de perda embrionária diagnosticada em nosso estudo da prenhez a termo / During pregnancy, we observed an influx of lymphocytes into the region of mice mesometrial decidua. These cells are natural killer cells (NK), presenting different behavior and phenotype of circulating NK cells. Uterine Natural Killer Cells (uNK) play important roles in early pregnancy, such as maintaining maternal tolerance to the fetus, angiogenesis and remodeling of the spiral arteries. Their cytolytic capacity is reduced during pregnancy and can be activated if there is an imbalance between pro and anti-inflammatory cytokines. Cyclophosphamide is a drug used in treating autoimmune diseases and cancer. It is known that it is a teratogen, and its use can lead to macroscopic and microscopic changes, as well as the reduction of viability pregnancy in mice. The objective of this study was to evaluate the effects of cyclophosphamide in the uterus and in cells uNK (morphological analysis, cytochemistry and stereological) on the 10th ddg, as well as its effects on behavior related to depression and anxiety. Our results showed that cyclophosphamide rapidly increased uNK cells number in the uterus as well as decreased expression of N-acetyl-D-galactosamine in their granules and surface, early reaching less differentiated uNK cells near the mesometrium, and latter more differentiated uNK cells closer to the embryo. His dramatic effect on pregnancy still caused a decreasing in the number of uNK cells 48 after the drug administration, concomitant with the appearance of many resorption implantation sites, decreasing of gestational viability, as well as, establishment of sickness-like behavior, causing 100% of embryo loss diagnosed in the pregnancy to term. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Base Teórica. Embora vários relatos de casos tenham sugerido uma associação entre a ingesta de vitamina K e a instabilidade da anticoagulação oral, o impacto clínico de diferentes quantidades de vitamina K dietética na anticoagulação oral crônica nunca foi prospectivamente estabelecido. Métodos. Características clínicas e estimativas semi-quantitativas sobre a ingesta de vitamina K foram avaliadas, prospectivamente, em 230 visitas ambulatoriais de pacientes anticoagulados em um hospital público universitário (protocolo observacional). Treze pacientes ambulatoriais anticoagulados cronicamente e estáveis foram arrolados em um ensaio clínico randomizado cruzado de intervenção dietética de 4 dias com aumento e diminuição de 5 vezes da sua ingesta habitual de vitamina K (protocolo experimental randomizado). Resultados. Protocolo observacional: Na análise univariada, identificamos uma associação estatisticamente significativa, progressiva e inversa entre um escore global de ingesta de vitamina K e diferentes níveis de anticoagulação. Na análise multivariada, a ingesta de vitamina K dietética foi independentemente associada com níveis subterapêuticos e anticoagulação excessiva (ambos valores de p =0,04), após ajuste para escolaridade, renda, uso de novos fármacos, aderência à anticoagulação oral e intercorrências clínicas. Protocolo randomizado: Após a dieta restrita em vitamina K, observamos um aumento significativo nos valores do INR (de 2,6 ± 0,5 para 3,3 ± 1,0, p=0,03; do início para o dia 7) enquanto, após a dieta enriquecida, identificamos uma diminuição significativa e mais precoce no INR (de 3,2 ± 0,9 para 2,8 ± 0,7, p=0,005; do início para o dia 4). O efeito da ingesta de vitamina K sobre a variação do INR foi particularmente influenciada pela ingesta média habitual da vitamina. Conclusões. Nossos dados prospectivos reforçam o conceito de que a interação vitamina K e fármacos cumarínicos é de fato real e clinicamente relevante, devendo ser reconhecida como um fator importante e independente que interfere com a estabilidade da anticoagulação oral crônica. / Background. Although several case reports suggest a potential association between vitamin K intake and coagulation instability, the clinical impact of different amounts of vitamin K intake on chronic oral anticoagulation has never been prospectively established. Methods. Clinical characteristics and semi-quantitative queries on vitamin K intake were prospectively evaluated in 230 outpatients’ visits in an anticoagulation clinic (observational protocol). Twelve stable chronically anticoagulated outpatients underwent a randomized crossover trial of 4-day in-hospital dietary intervention of 5-fold increase and 5-fold decrease of baseline vitamin K intake (randomized protocol). Results. Observational protocol: In univariate analysis, we identified a progressive and inverse statistically significant association between an aggregated score of vitamin K intake and different levels of anticoagulation. In multivariate logistic regression, dietary vitamin K intake was independently associated with both overcoagulation and undercoagulation, after adjustment for educational level, income, drug compliance, concurrent illness and clinical comorbidities. Randomized protocol: After the vitamin K depleted diet we observed a significant increase in INR values (from 2.6 ± 0.5 to 3.3 ± 0.9, p =0.005; from baseline to day 7), while after the 4-day enriched diet we identified a significant and earlier decrease in INRs (from 3.1 ± 0.8 to 2.8 ± 0.6, p =0.035; from baseline to day 4). The effect of vitamin K intake on INR variation was particularly influenced by the average baseline intake. Conclusions. Our prospective data strengthen the concept that the vitamin K-coumarin interaction is in fact operative and clinically relevant, and must be acknowledged as a major independent factor that interferes with anticoagulation stability.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-08-06T19:23:03Z No. of bitstreams: 1 SARAH_RESENDE_MBCM_Final.pdf: 6553798 bytes, checksum: cb7ea34b3f0a947f3d81c20d5448938f (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-06T19:23:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SARAH_RESENDE_MBCM_Final.pdf: 6553798 bytes, checksum: cb7ea34b3f0a947f3d81c20d5448938f (MD5) Previous issue date: 2013 / Cepas de Plasmodiumresistentes a diferentes drogas têm sido descritasao redor do mundo. Embora os mecanismos de desenvolvimento de resistência não sejam bem conhecidos, sabe-se que defeitos nos sistemas de reparo do DNA podem estar envolvidos. Esses defeitos estão relacionados principalmente a mutações nas enzimas do sistema de reparo de mal pareamento do DNA ou mismatch repair (MMR) e já foram descritos em populações naturais de diversos organismos. Devido ao conhecimento limitado sobre o sistema MMR de Plasmodium, faz-se necessário um amplo estudo sobre os genes que codificam as proteínas envolvidas nesse sistema. Neste trabalho, foi realizado um estudo sobre as enzimas envolvidas no sistema de reparo do mal pareamento do DNA em Plasmodium: variabilidade intra e interespecífica em Plasmodium, principalmente nos domínios funcionais, e comparação entre níveis de expressão entre cepas/isolados de P. falciparum.Os parasitos foram também avaliados quanto ao número de cópias e expressão dos genes gch-1emdr1. Foram identificadas proteínas pertencentes às classes MSH2, MSH6, MLH1 e PMS1. As sequências de proteínas mostraram-se muito conservadas, tanto entre o gênero Plasmodium, quanto em relação a outros organismos distantes evolutivamente. Foi encontradaum proteína homóloga a MutS que possui os domínios I e V, mas ainda não identificada quanto à sua classificação. O gene codificador desta proteína teve sua expressão confirmada neste e em outros trabalhos. Alguns SNPs foram encontrados em cepas/isolados depositados no PlasmoDB, no entanto, o sequenciamento da região que compreende os principais domínios funcionais apontou apenas 1 SNP na proteína PMS1. Os genes estudados, em sua maioria, apresentaram-se mais expressos entre 10 e 30 horas após a sincronização. W2 e 3D7 apresentam 2 cópias do genes gch-1e mdr1. BHZ apresentou apenas 1 cópia do mdr1. Os resultados da análise de expressão desses genes ligados à resistência concordam com os resultados encontrados para o número de cópias gênicas. Este estudo fornece uma análise ampla das principais enzimas do MMR e será importante para estudos futuros do papel funcional destas enzimas e seu envolvimento no desenvolvimento de resistência às drogas. / Drug-resistant Plasmodiumstrains have been reported world wide. The mechanisms underlying resistance development are not well understood, but failure in DNA repair could be involved in this process. This failure is mainly related to mutations in the enzymes of the DNA mismatch repair (MMR). Because of the limited knowledge about the PlasmodiumMMR system, it is necessary a comprehensive study about the genes encoding proteins involved in this system. In this work, we studied the enzymes involved in the PlasmodiumMMR, considering the intraspecific and interspecific variability in Plasmodium, especially within the functional domains and comparing the expression levels between strains/isolates of P. falciparum.Parasites were also assessed for copy number and expression of the genes pfgch-1and pfmdr1. We identified proteins related to MSH2, MSH6, MLH1 and PMS1. The protein sequences were very conserved among the genus Plasmodium, as well in relation to other evolutionarily unrelated organisms. We found a putative protein homologous to MutS showing the domains I and V, butnot classified yet. The gene encoding this protein has its expression confirmed here and in other previous studies. SNPs were found in some strains/isolates deposited in PlasmoDB, however, the sequencing of the region comprising the main functional domains showed only one SNP in PMS1. The genes studied, mostly, were more expressed between 10 and 30 hours after synchronization. W2 and 3D7 showed 2 copies of the gene gch-1 and mdr1. In BHZ, only one copy of the mdr1 were founded. The results of expression of these genes related to the resistanceagree with the findings for the gene copy number. This study provides a comprehensive analysis of the major enzymes of the MMR and will be important to further functional studies of this enzymes and their role in drug resistance development.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-12-13T18:17:24Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Douglas de Souza Moreira.pdf: 7794967 bytes, checksum: 2d88472031668d7a41792b1f3ad4546e (MD5) / Made available in DSpace on 2013-12-13T18:17:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Douglas de Souza Moreira.pdf: 7794967 bytes, checksum: 2d88472031668d7a41792b1f3ad4546e (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou / Transportadores ABC (ATP-binding cassette) abrangem proteínas transmembrana, que utilizam a energia resultante da hidrólise de ATP, para transportar uma variedade de moléculas através de membranas biológicas, incluindo drogas quimioterapêuticas. Alguns membros dessa superfamília ABC estão associados com quimioresistência através da superexpressão de proteínas de resistência a múltiplas drogas (multidrug resistance associated protein – MRP). Uma dessas proteínas é a Pgp (P-glicoproteína), que está relacionada à resistência através da extrusão de compostos tóxicos da célula. O gene MRPA, um transportador da subfamília ABCC, está envolvido na resistência pelo sequestro do conjugado metal-tiol em vesículas próximas da bolsa flagelar da Leishmania. Neste estudo, formas promastigotas de populações sensíveis e resistentes ao antimonial trivalente (SbIII) de quatro espécies de Leishmania, L. (V.) guyanensis, L. (L.) amazonensis, L. (V.) braziliensise L. (L.) infantum chagasi, foram analisadas quanto: a localização cromossômica, presença de amplificação extracromossomal e análise da amplificação do gene MRPA; níveis de mRNA dos genes MRPA e MRP; expressão da proteína Pgp e determinação do nível intracelular de SbIII. Ensaios de PFGE indicaram a associação de amplificação cromossomal e extracromossomal do gene MRPA com o fenótipo de resistência à droga nas espécies de Leishmania estudadas. Os resultados obtidos através dee lise alcalina dos parasitos mostraram a presença de amplificação extracromossomal apenas na amostra resistente de L. (V.) braziliensis. Análises de Southern blot com as endonucleases BamHI e HindIII indicaram a presença de polimorfismos na sequência do gene MRPA em algumas amostras de Leishmania analisadas. Adicionalmente, foi observada amplificação desse gene nas populações de Leishmania resistentes ao SbIII. Ensaios de PCR quantitativo em tempo real mostraram aumento dos níveis de mRNA do gene MRPA nas populações resistentes de L. (L.) amazonensis e L. (V.) braziliensis, comparado com seus respectivos pares sensíveis. Os níveis de mRNA do gene MRP estão aumentados em todas as populações de Leishmania resistentes ao SbIII analisadas neste estudo. Os resultados de Western blot revelaram que a proteína Pgp está mais expressa nas populações resistentes de L. (V.) guyanensis eL. (L.) amazonensis. Os dados obtidos de quantificação dos níveis intracellulares de SbIII por espectrometria de absorção atômica em forno de grafite mostraram uma redução no acúmulo de SbIII, nas populações resistentes de L. (V.) guyanensis,L. (L.) amazonensise L. (V.) braziliensis, quando comparadas às respectivas populações sensíveis. Nossos resultados indicam que os mecanismos de resistência ao antimônio são diferentes entre as espécies de Leishmania analisadas. / ATP-binding cassette (ABC) transporters comprise transmembrane proteins that use energy from ATP hydrolysis to transport a variety of molecules across biological membranes, including chemotherapeutic drugs. Some members of this ABC superfamily are associated with chemoresistance by overexpression of multidrug resistance associated proteins (MRP). One of these proteins is the Pgp (P-glycoprotein), which is associated with resistance by extruding toxic compounds outside the cell. The MRPA gene, a transporter of ABCC subfamily, is involved in the resistance by sequestering metal-thiol conjugate in vesicles close to the flagellar pocket of Leishmaniaparasite. In this study, promastigote forms of susceptible and trivalent antimony (SbIII)-resistant populations of four Leishmaniaspecies, L. (V.) guyanensis, L. (L.) amazonensis, L. (V.) braziliensis and L. (L.) infantum chagasi, were analyzed for: chromosomal location, presence of extrachromosomal amplification and analysis of amplification of the MRPA gene; the mRNA levels of MRPA and MRP genes; Pgp protein expression and determination of intracellular SbIII level. PFGE analysis indicated the association of chromosomal and extrachromosomal amplification ofMRPA gene with SbIII-resistance phenotype in Leishmania species studied. The results obtained by alkaline lysis of these Leishmanias amples showed the presence of extrachromosomal amplification only in the SbIII-resistant L. (V.) braziliensis population. Southern blot analysis with the endonucleases BamHI and HindIII indicated the presence of polymorphisms in the sequence of MRPA gene in some Leishmania samples analyzed. Additionally, we observed amplification of thisgene in all SbIII-resistant Leishmania populations analyzed. Real-time quantitative RT-PCR assays showed increased levels of mRNA MRPA gene in SbIII-resistant populations of L. (L.) amazonensis and L. (V.) braziliensis compared to their respective susceptible counterparts. The levels of mRNA MRP gene are increased in all SbIII-resistant Leishmania populations analyzed in this study. Western blot analysis revealed that Pgp protein is more expressed in SbIII-resistant L. (V.) guyanensisand L. (L.) amazonensispopulations. The intracellular level of SbIII quantified by graphite furnace atomic absorption spectrometry showed a reduction in the accumulation of Sb in SbIII-resistant L. (V.) guyanensis, L. (L.) amazonensisand L. (V.) braziliensis populations when compared to their respective susceptible populations. Our results indicate that the mechanisms of antimony-resistance are different between species of Leishmania analyzed.

Made available in DSpace on 2015-05-19T13:30:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 401.pdf: 9920494 bytes, checksum: 8583b102e7c583547584adc8d2fe879e (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / O tratamento utilizado para a leishmaniose apresenta efeitos colaterais graves, exige acompanhamento médico e prolongado tempo de terapia. Assim, a prospecção de novos compostos contra esta doença ainda se faz necessária. As macroalgas possuem grande variedade de moléculas bioativas. No presente trabalho foi avaliada a atividade leishmanicida, a citotoxicidade, a produção de óxido nítrico (NO) e os possíveis alvos dos extratos de macroalgas. Foi avaliado o efeito de 10 extratos sobre o crescimento de formas promastigotas de L. amazonensis. A citotoxicidade em células de mamíferos foi avaliada através do método do MTT e o índice de seletividade foi determinado. A produção de NO por macrófagos foi avaliada pelo reagente de Griess. A análise ultraestrutural foi realizada por microscopia eletrônica. Para análise dos efeitos dos extratos sobre a membrana e o potencial de membrana mitocondrial células tratadas e controles foram submetidas à marcação com iodeto de propídio (IP) e rodamina 123. Os dados mostraram que todos os extratos inibiram o crescimento de formas promastigotas e apresentaram baixa toxidade para células de mamífero. Canistrocarpus cervicornis (CC), Dictyota mertensii (DM) e Laurencia dendroidea (LD) foram as mais efetivas e mais seletivas contra formas promastigotas entre todas as algas testadas. Estes extratos também inibiram a infecção e índice de sobrevivência de formas amastigotas no interior de macrófagos. Esses extratos aumentaram a produção de NO em relação às células controles. Alterações compatíveis com a perda de viabilidade e morte celular foram observadas por microscopia eletrônica. Células tratadas apresentaram discreto aumento no número de células IP+. Os extratos induziram alterações significativas no potencial de membrana mitocondrial. A baixa toxicidade às células de mamíferos e a atividade leishmanicida apresentadas apontam para a utilização dos extratos de CC, DM e LD como agentes promissores para o tratamento da leishmaniose cutânea

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-06-19T12:51:52Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_Juvana Moreira Andrade.pdf: 5431599 bytes, checksum: 3d184133a348c819e04d8bdb3554b856 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-06-19T12:52:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_Juvana Moreira Andrade.pdf: 5431599 bytes, checksum: 3d184133a348c819e04d8bdb3554b856 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-06-19T12:52:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_Juvana Moreira Andrade.pdf: 5431599 bytes, checksum: 3d184133a348c819e04d8bdb3554b856 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-06-19T12:52:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_Juvana Moreira Andrade.pdf: 5431599 bytes, checksum: 3d184133a348c819e04d8bdb3554b856 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou / Triparedoxina peroxidase (TxP) é uma enzima que pertence à família das. peroxiredoxinas e participa da defesa antioxidante,por metabolizar peróxido de hidrogênio em moléculas de água. Dados da literatura têm mostrado que parasitos resistentes à droga podem aumentar os níveis de TxPjunto com outras enzimas, protegendo-os contra o estresse oxidativo. Inicialmente neste trabalho, avaliamos os níveis de mRNA do gene TxP e a expressão da enzima Triparedoxina peroxidase em populações de L. amazonensis, L. braziliensis,L. infantum chagasi e L. guyanensis. sensíveis e resistentes ao antimonial trivalente (SbIII). Estas populações apresentam resistência à concentração de SbIII de 4 a 20 vezes maior comparada aos seus respectivos pares sensíveis. O nível de mRNA do gene TxP, determinado por northern blot e RT-PCR quantitativo em tempo real, foi maior nas populações resistentes de L. amazonensis e L. braziliensis, enquanto que o Northern blotting mostrou maior. expressão do gene TxP na população resistente de L. guyanensis. Por outro lado, nenhuma diferença foi observada no nível do mRNA do gene TxP nas populações sensíveis e resistentes de L. infantum chagasi. Análises de southern blot mostraram que o gene cTxP não está amplificado no genoma das populações resistentes de Leishmania spp. analisadas. A expressão proteica foi determinada por ensaios de Western blotting. utilizando anticorpo policlonal contra a proteína recombinante TxP de T. cruzi. Análises do alinhamento de aminoácido da proteína TxP de T. cruzi e Leishmania spp. mostraram um alto grau de identidade entre estas sequências. O anticorpo anti-TcTxP reconheceu um polipeptídio de 25 kDa em todas as populações de Leishmania spp. analisadas.. Análises de densitometria mostraram que a proteína cTxP está 2 a 4 vezes mais expressa em todas as populações resistentes de Leishmania spp. analisadas. Na segunda parte deste estudo, ensaios funcionais da TxP foram realizados para determinar se a superexpressão da LbTxP nas populações sensíveis e resistentes de L. braziliensis. e L. infantum chagasi iria alterar o fenótipo de resistência dos parasitos transfectados ao antimonial SbIII. Análises por Western blotting mostraram que o nível de expressão da proteína TxP foi de 2 a 4 vezes maior nos parasitos transfectados quando comparado aos parasitos não-transfectados. Análises de IC50 destes parasitos mostraram que a. superexpressão do gene TxP na população de L. braziliensis sensível aumentou 2 vezes a resistência ao SbIII, quando comparado à população parental. Por outro lado, a superexpressão de TxP na população resistente de L. braziliensis reverteu o fenótipo de resistência. Os parasitos antes resistentes, após atransfecção se tornaram muito sensíveis ao SbIII. Além disto, a superexpressão daTxP em populações sensíveis e resistentes de L. infantum chagasinão alterou o fenótipo de resistência ao SbIII.. Concluindo, nossos resultados de análise funcional mostraram que a enzima triparedoxina peroxidase está envolvida no fenótipode resistência de L. braziliensis ao antimonial. / Tryparedoxin peroxidase (TxP) is an enzyme that belongs to family of peroxiredoxins and participates in the antioxidant defense by metabolizing hydrogen peroxide in water molecules. Literature data have reported that drug-resistant parasites may increase the levels of TxP along with other enzymes, protecting them against oxidative stress. Initially in this study, we analyzed the TxP mRNA levels and protein expression levels in populations of L. amazonensis, L. braziliensis, L. infantum chagasi and L. guyanensis susceptible and resistant to SbIII. These populations exhibit index of resistance to SbIII 4 to 20-fold higher compared to their respective counterparts susceptible. The level of cTxP mRNA determined by northern blot and quantitative real time RT-PCR was higher in the L. amazonensis and L. braziliensis resistant populations while that Northern blot showed increased expression this gene in the L. guyanensis resistant population. Moreover, no difference was observed in the level of cTxP mRNA between susceptible and resistant L. infantum chagasi populations. Southern blot analyzes showed that the TxP gene is not amplified in the genome of SbIII-resistant Leishmania spp. populations analyzed. Analysis of protein expression was determined by Western blotting assays using polyclonal antibody against the TxP recombinant protein from T. cruzi. Amino acid alignment of TxP sequence of T. cruzi and Leishmania spp. showed a high degree of identity among these sequences. The anti-TcTxP antibody recognized a 25 kDa polypeptide in all Leishmania spp. populations analyzed. Densitometry analysis showed that TxP protein is 2 to 4-fold more expressed in all SbIII-resistant Leishmania spp. populations analyzed. In the second part this study, functional analysis of TxP was performed to determine whether over expression of LbTxP in the susceptible and resistant L. braziliensis and L. infantum chagasi populations would change the resistance phenotype of transfected parasites to antimony SbIII. Western blotting analysis showed that the level of TxP protein expression was 2 to 4-fold higher in transfected parasites than in the non-transfected ones. IC 50 analysis showed that susceptible L. braziliensis population that overexpress of TxP protein are 2-fold more resistant to SbIII compared to its parental non-transfected population. On the other hand, overexpression of TxP in the resistant L. braziliensis population caused inversion of resistance phenotype. The resistant parasites after TxP transfection became very susceptible to SbIII. In addition, overexpression of TxP enzyme in the susceptible and resistant L. infantum chagasi populations did not alter the resistance phenotype to SbIII. In conclusion, our functional analysis results showed that the enzyme Tryparedoxin peroxidase is involved in the antimony-resistance phenotype in L. braziliensis.