Comprendre comment les espèces s'adaptent à leur environnement est un des buts majeurs de la biologie évolutive. Il s'agit d'identifier les gènes responsables des caractères adaptatifs, mais aussi de comprendre les mécanismes généraux de l'adaptation, et des phénomènes empêchant une adaptation optimale. Les régions non-recombinantes sont particulières pour ces aspects. En effet, elles peuvent protéger de la recombinaison des combinaisons d'allèles favorables, et inversement, la suppression de recombinaison peut entraîner une dégénérescence, comme une accumulation de mutations délétères ou des pertes de gènes. Même les organismes à reproduction sexuée possèdent cependant souvent de larges régions non-recombinantes, associées à la détermination du sexe génétique ou du type sexuel. Dans cette thèse, j’ai ainsi étudié les traces d’adaptation et de dégénérescence dans des génomes de champignons pathogènes de plantes. Les champignons du complexe d'espèces Microbotryum violaceum, qui causent la maladie du charbon des anthères chez les Caryophyllacées et comptent des dizaines d'espèces spécifiques d’hôtes différents, sont d'excellents modèles pour l'étude des processus génomiques de l'adaptation. Ils possèdent de plus des chromosomes de types sexuels non-recombinants sur une partie de leur longueur. Pour étudier l'évolution des chromosomes de types sexuels, la dégénérescence et l'adaptation à l'hôte dans le complexe M. violaceum, nous avons adopté diverses approches de génomique. En utilisant la technologie PacBio, nous avons obtenu un assemblage complet des chromosomes de types sexuels pour l'espèce M. lychnidis-dioicae. Nous avons montré que la région non-recombinante s'étend sur 90 % des chromosomes de types sexuels, présente un niveau de réarrangements exceptionnel entre les deux types sexuels, et que des centaines de gènes sont présents à l'état hémizygote et ont donc probablement été perdus dans un type sexuel. De plus, la comparaison des génomes d'une douzaine d'espèces de M. violaceum a montré une accumulation de mutations non-synonymes et d'éléments transposables dans les chromosomes de types sexuels. Nous avons aussi étudié la dégénérescence dans le contexte de l'exposition aux radiations ionisantes, en analysant des populations de M. lychnidis-dioicae exposées à différents niveaux de radiation dans la région de Tchernobyl. Nous n'avons pas détecté d'augmentation du taux de mutations non-synonymes par rapport au groupe témoin, ce qui suggère que le champignon est radio-résistant ou que la sélection est plus forte dans la région de Tchernobyl. Enfin, pour étudier l'adaptation à l’hôte, nous avons reséquencé des dizaines des génomes de deux espèces sœurs de M. violaceum. L'analyse du polymorphisme a révélé des balayages sélectifs tout le long des génomes et à des localisations différentes entre les deux espèces. Nous avons identifié un certain nombre de gènes candidats pour l'adaptation à l’hôte dans ces régions de balayages sélectifs, sur la base de leur expression in planta et de leurs annotations. Les gènes sur-exprimés dans la plante montraient d’autre part un taux de substitutions non-synonymes entre les deux espèces sœurs plus élevé que les autres gènes, ce qui suggère qu’une bonne partie pourrait être impliquée dans l'adaptation à l’hôte. Ces travaux ouvrent la voie à une comparaison des génomes de différentes espèces du complexe M. violaceum, d’une part pour reconstituer l'histoire de la suppression de recombinaison dans les chromosomes de types sexuels, et d’autre part pour étudier les bases génétiques de l'adaptation à différents hôtes dans un complexe d’espèces phylogénétiquement proches. / Understanding how species adapt to their environment is a major goal in evolutionary biology. Scientists aim to identity the genes underlying key adaptive traits, but also to understand more broadly adaptive processes and phenomena that allow or prevent optimal adaptation. Non-recombining regions are particular for these aspects. They can indeed protect adaptive combinations of alleles from recombination, and conversely, suppressed recombination can lead to degeneration, such as accumulation of deleterious mutations or genes losses. Even sexually-reproducing organisms often possess large non-recombining regions associated with sex ou mating-type determination. In this thesis, I therefore studied signatures of adaptation and degeneration in genomes of plant pathogenic fungi. Fungi of the species complex Microbotryum violaceum, with dozens of host-specific sibling species causing anther-smut disease in the Caryophyllaceae family, are particularly good models for addressing the question of the genomic processes involved in host adaptation. Moreover, they possess size-dimorphic, partly non-recombining mating-type chromosomes. To study the evolution of mating-type chromosomes, degeneration and host-adaptation in the M. violaceum species complex, we used a genomic approach. Using PacBio sequencing, we obtained a complete assembly of the mating-type chromosomes of the species M. lychnidis-dioicae. We showed that the non-recombining regions span 90 % of the mating-type chromosomes, exhibit an exceptional level of rearrangements between the two mating-types, and that hundreds of genes are in a hemizygous state and were therefore probably lost in one of the two mating-type chromosomes. Moreover, comparing a dozen of species of the M. violaceum complex revealed an accumulation of non-synonymous substitutions and of transposable elements in mating-type chromosomes. We also studied degeneration in the context of ionizing radiations, by analysing populations of M. lychnidis-dioicae exposed to different radiation levels in the Chernobyl area. We did not detect any increase in the rate of non-synonymous mutations compared to the control group or with radiation, which suggests that the fungi is radio-resistant or that selection is higher in the Chernobyl area. Lastly, we resequenced dozens of genomes of two sibling species of M. violaceum in order to study host adaptation. Analysing polymorphism patterns, we found several selective sweeps along the genome, at different locations in the two species. We identified candidate genes for host-adaptation in the regions of selective sweeps, based on their expression pattern and on their putative functions. In addition, genes up-regulated in planta exhibited a higher rate of non-synonymous substitutions than other genes, suggesting that many of them are likely involved in host adaptation. This work paves the way to a larger comparison of genomes of different species of the M. violaceum species complex, in order to reconstruct the history of recombination suppression on the mating-type chromosomes on the one hand, and to study the genetic bases of adaptation to different hosts in a complex of phylogenetically close species on the other hand.

Le nématode à galle, Meloidogyne incognita est un parasite extrêmement polyphage capable d'induire la redifférentiation de cellules racinaires en cellules en cellules nourricières hypertrophiées. / The root-knot nematode Meloidogyne incognita is among the most devastating plant pathogens.

La maladie de la rouille foliaire du peuplier, causée par le basidiomycète Melampsora larici-populina (Mlp) cause des dégâts importants dans les peupleraies européennes. Le séquençage du génome de la souche 98AG31 de Mlp a ouvert de nouvelles perspectives pour l'identification de déterminants géniques impliqués dans le processus infectieux du champignon et notamment ceux codant des effecteurs fongiques capables de manipuler la structure et le fonctionnement de la cellule hôte pour assurer le succès de l'infection. L'analyse du transcriptome du champignon au cours des différentes phases du processus infectieux, basée sur l'utilisation de puces à oligonucléotides NimbleGen ou le séquençage massifs d'ESTs, a permis d?identifier des gènes marqueurs de la germination, de la phase de croissance biotrophe et de la sporulation du champignon. Nous avons notamment pu montrer l'induction importante de nombreux gènes codant des petites protéines sécrétées (SSPs) au cours de la phase biotrophe à 96 hpi heures post-inoculation (hpi) ainsi qu'au sein du parenchyme lacuneux à 168 hpi par microdissection à capture laser. L?analyse fine du sécrétome de Mlp, basée sur l'annotation, l'évolution et l'expression des gènes codant des SSPs a permis de mettre à jour des effecteurs candidats. Certains, spécifiquement exprimés in planta ou présentant des homologies de séquence avec des effecteurs de rouilles ont été localisés au niveau de l'haustorium. De manière intéressante, d'autre gènes candidats appartenant à des familles multigéniques sous pression de sélection positive, sont riches en cystéines, spécifiquement exprimés in planta et possèdent un motif de translocation potentiellement impliqué dans l'export de l'effecteur dans la cellule hôte. Ce travail d'analyse fine des effecteurs potentiels d'un agent de rouille à l'échelle génomique va contribuer à l'amélioration des connaissances sur la biologie de ces champignons biotrophes et contribuera à faciliter la recherche de nouvelles méthodes de lutte contre la maladie / The leaf rust disease caused by Melampsora larici-populina (Mlp) is the main disease affecting poplar plantations in Europe with severe economic losses. The recent sequencing of the genome of Mlp (strain 98AG31) opens new perspectives to identify key genes involved in the fungal infection process and particularly those encoding fungal effectors that could manipulate host cell structure and function to facilitate host colonization. Analysis of the rust transcriptome during time course infection of poplar leaves, based on NimbleGen oligoarrays and massive EST sequencing led to the identification of genes related to fungal germination, biotrophy and sporulation. A consistant induction of genes encoding small-secreted proteins (SSPs) was observed during the biotrophic growth at 96 hours post-inoculation (hpi) but also at 168 hpi in the palisade mesophyll using laser capture microdissection. Mlp Secretome analysis, based on annotation, evolution and expression of genes encoding SSPs helped in identifying candidate poplar rust effectors. Some, specifically expressed in planta or showing homologies with known rust effectors were localized around the haustorium. Interestingly, other candidate genes, belonging to multigenic families under diversifying selection are cystein-rich, specifically expressed in planta and harbour a translocation signal potentially involved in effector export inside host cell. This genome-wide analysis of putative fungal effectors will contribute to the general knowledge of rust biology and will help to set new approaches to prevent and control the disease

Le recyclage de récepteurs et de lipides vers la membrane plasmique, est un processus finement régulé, essentiel pour l’homéostasie de la membrane plasmique et pour la migration cellulaire. Il requière l’intervention des petites GTPases de la famille Rabs et leurs effecteurs. La protéine MICAL-L1, effecteur de plusieurs Rabs, comme Rab 8, 11, 13 et 35, a été impliquée dans le recyclage vers la membrane plasmique. Dans cette étude, nous avons identifié une nouvelle interaction entre MICAL-L1 et la PACSINE3, une protéine à domaine F-BAR capable de façonner les membranes intracellulaires et qui contribue à la génération d’endosomes de recyclage tubulaires. MICAL-L1 est nécessaire pour la localisation de la PACSINE3 au niveau des membranes des endosomes. La perturbation du complexe MICAL-L1/PACSINE3 affecte le recyclage du récepteur de la transferrine (TfR) vers la membrane plasmique. Le complexe MICAL-L1/PACSINE3 est associé à des longs tubules membranaires contenant la transferrine comme cargo. La dynamique de ségrégation et de détachement des cargos Tf à partir des tubules contenant MICAL-L1 et PACSINE3, suggère que ce complexe contrôle le tri/adressage des endosomes de recyclage vers la membrane plasmique. Notre travail révèle un nouveau mécanisme de régulation de la voie de recyclage vers la surface cellulaire. / The recycling to the plasma membrane of receptors and lipids is tightly regulated and is essential for PM homeostasis, adhesion and cell migration. It requires small GTPase Rab proteins and their effectors. The MICAL-L1 protein, an effector of several Rabs including Rab 8, 11, 13 and 35, has been shown to play an important role in the recycling. Here, we report a novel interaction between MICAL-L1 and the BAR domain containing protein PACSIN3/Syndapin3 that contributes to generate tubular recycling endosomes. MICAL-L1 is required for the localization of PACSIN3 to endosomal membranes. Importantly, disruption of MICAL-L1/PACSIN3 interaction promotes the transferrin receptor (TfR) delivery back to the plasma membrane. The MICAL-L1/PACSIN3 complex accumulates in elongated tubules that contain transferrin carriers. The dynamic of transferrin positive endosomes segregation from MICAL-L1/PACSIN3 tubules suggests that MICAL-L1/PACSIN3 complex controls TfR recycling endosomes delivery to the plasma membrane. Our data provide novel mechanistic insights on the dynamical regulation of the plasma membrane recycling pathway.

Les nématodes à galle du genre Meloidogyne sont des parasites telluriques provoquant de graves pertes agricoles dans presque tous les systèmes de culture des plantes, et en particulier affectent la production de riz (Oryza sativa L.) dans toutes les régions cultivées. Ces parasites biotrophes obligatoires établissent une interaction compatible avec leur hôte grâce à des effecteurs protéiques produits par leurs glandes œsophagiennes et sécrétés dans la cellule végétale à travers leur stylet. L'objectif de ce travail était d'identifier parmi les protéines sécrétées celles qui jouent un rôle dans la virulence du nématode. L'interaction compatible entre la variété de riz Nipponbare et deux espèces de RKN (Meloidogyne incognita et Meloidogyne graminicola) a été choisie comme modèle et décryptée par des approches d'histologie et de transcriptomique. Trois nouvelles protéines de M. incognita spécifiquement exprimées dans les phases précoces de l'interaction ont été identifiées. Les deux gènes Mi-SP1 (Minc17980) et Mi-SP5 (Minc14137) sont exprimés dans les glandes subventrales alors que Mi-SP4 (Minc16281) s'exprime dans la glande dorsale de la larve parasitaire dite « juvénile au stade 2 (J2) ». Mi-SP1 et Mi-SP4 sont des gènes pionniers (sans homologue dans les bases de données publiques) et Mi-SP5 code potentiellement pour une déstabilase, de la famille des lysozymes. Les deux protéines pionnières Mi-SP1 et Mi-SP4 sont adressées dans le noyau et le cytoplasme de cellules de tabac après expression hétérologue en fusion avec la protéine GFP. La protéine Mi-SP5 exprimée en fusion GFP dans les cellules épidermiques d'oignon est localisée dans la paroi cellulaire. L'atténuation de l'expression des trois gènes Mi-SPs chez les J2s, induite par l'absorption de petits ARN interférants (siRNA), entraine une baisse significative de la reproduction du nématode chez le riz. De plus, la protéine Mi-SP1 permet de réprimer les défenses basales de la plante induites par le facteur bactérien flg22, telles que la production de composés réactifs d'oxygène. L'expression dans le riz de micro-ARNs artificiels (amiRNA) définis pour spécifiquement éteindre l'expression de Mi-SP5 entraine également une baisse significative de la reproduction du nématode chez le riz. L'analyse fonctionnelle de Mi-SP1 et de Mi-SP5 a montré que ces deux protéines sont capables de jouer un rôle important dans l'interaction compatible riz-nématode. / Root-knot nematode, Meloidogyne sp., are telluric pests causing severe agricultural lost in almost all plants growing system including cereals. These obligate biotrophic parasites affect the rice production in all cultivated countries. Meloidogyne incognita establishes a compatible interaction with the plant host thanks to effectors produced by esophageal glands and secreted in the plant cell through the stylet. The objective of this work was to identify secreted proteins involved in the virulence of the nematode. The compatible interaction between rice variety Nipponbare and two species of RKN (Meloidogyne incognita and Meloidogyne graminicola) was chosen as a model and decrypted by histology and transcriptomic approaches. Three new proteins of M. incognita which were specifically expressed during early stages of interaction have been identified. Two genes Mi-SP1 (Minc17980) and Mi-SP4 (Minc16281) were pioneers with no homolog in databanks and Mi-SP5 (Minc14137) encodes for a putative destabilase, belongs to lysozyme family. Mi-SP1 and Mi-SP5 were expressed in the subventral glands whereas Mi-SP4 was expressed in the dorsal gland of the parasitic larva called “juvenile stage 2 (J2)". The two pioneer proteins Mi-SP1 and Mi-SP4 were localized in both the nucleus and the cytoplasm of tobacco cell after heterologous expression whereas Mi-SP5 was located in the onion epidermal cell wall. The silencing of three effectors by soaking approach using siRNAs leads to a significant reduction in nematode reproduction in rice. In addition, Mi-SP1 can suppress the plant defences PTI triggered by the PAMP flg22. Knock-down Mi-SP5 by host-delivered RNAi also causes a significant reduction in nematode reproduction in rice. The functional analysis of Mi-SP1 and Mi-SP5 showed that these two effectors are able to play important roles in rice-nematode interaction.

Le système de sécrétion de type III est un des déterminants majeurs de la pathogénicité de Ralstonia pseudosolanacearum qui lui permet d’injecter des effecteurs de type III (les « Rip », « Ralstonia Injected Protein ») directement dans les cellules des plantes hôtes. Les effecteurs RipH1, RipH2 et RipH3 sont des effecteurs de type III conservés dans la plupart des souches séquencées. Au cours de ma thèse, le rôle de ces effecteurs RipH lors de l’infection de différentes plantes a été étudié en prenant comme point d’entrée les protéines de tomates avec lesquelles ces effecteurs interagissent. Un criblage par double hybride dans la levure a permis d’identifier 19 de ces protéines « cibles » de tomate. Des méthodes de génétique inverse ont ensuite été utilisées pour chercher le rôle des orthologues de ces protéines dans différentes plantes modèles lors de l’infection par Ralstonia pseudosolanacearum. Du VIGS chez Nicotiana benthamiana a permis de mettre en évidence l’implication des orthologues de la protéine TOM3 : la multiplication bactérienne est moins importante dans les feuilles lorsque l’expression de ces gènes est diminuée. Dans Arabidopsis thaliana, des mutants d’un gène orthologue de la cible TOM9, décrit comme jouant entre autres un rôle dans la remodélisation de la chromatine, est plus résistant à l’infection par R. pseudosolanacearum. Dans un deuxième chapitre correspondant à un article publié, le rôle de l’effecteur RipAX2 a été étudié dans la résistance des aubergines AG91-25. La présence de cet effecteur dans la souche GMI1000 est nécessaire à l’établissement de la résistance de cette variété dans laquelle le locus de résistance EBWR9 a été mis en évidence. L’ajout de RipAX2 dans la souche PSS4, une souche pathogène de AG91-25 qui ne possède pas cet effecteur naturellement, la rend non pathogène. De plus, le motif protéique putatif « zincbinding » qui est décrit comme nécessaire pour l’induction de réponses de défense chez l’espèce proche de l’aubergine Solanum torvum n’est pas nécessaire pour la résistance de AG91-25. Enfin, la conservation de l’effecteur RipAX2 dans les différentes souches du complexe d’espèces de Ralstonia solanacearum a été étudiée pour évaluer l’efficacité potentielle de cette source de résistance contre différentes souches. / One of the major virulence determinants of plant pathogenic Ralstonia species is the type III secretion system that enables it to inject proteins (also called “Ralstonia Injected Proteins” or Rip) into the host cells. The RipH1,2,3 type III effectors are conserved in different strains of the Ralstonia solanacearum species complex. The role of these effectors during infection has been studied, taking as an entry point the tomato proteins they interact with. Using yeast-two-hybrid screenings we have identified 19 tomato targets of these three RipH. Reverse genetics methods have then been used to study the role of orthologous genes of these targets in other model plants. Virus induced gene silencing in Nicotiana benthamiana showed that the orthologous genes of TOM3 were involved in plant response to Ralstonia pseudosolanacearum, as the bacterial multiplication was diminished in plants silenced for these genes. In Arabidopsis thaliana, mutants of the TOM9 orthologous gene which is described as involved in chromatin remodelisation were more tolerant to infection. In a second chapter corresponding to a published article, the role of RipAX2 has been studied. This effector triggers specific resistance in AG9125 eggplant which carry the major resistance locus EBWR9. This eggplant accession AG9125 is resistant to the wild type R. pseudosolanacearum strain GMI1000, while a ripAX2 defective mutant of this strain can cause wilt. The addition of ripAX2 from GMI1000 to the naturally pathogenic strain PSS4 suppresses its pathogenicity, demonstrating that RipAX2 causes AG9125 resistance. Moreover, a zinc binding motif described as necessary to induce defenses on the eggplant wild relative Solanum torvum upon RipAX2 recognition is not necessary for AG91-25 resistance. The conservation of RipAX2 has been studied in the different strains of the bacteria in order to determine the potential of this resistance source against various strains for breeding

Apicomplexan parasites are leading causes of human and livestock diseases such as toxoplasmosis and malaria caused by Toxoplasma gondii and Plasmodium falciparum respectively. These organisms are varied in their morphologies and astoundingly complex on their life cycles that include infections of more than one host organism, differentiation through several morphologically distinct forms, and both sexual and asexual replication. What we and others have initially proposed was that the control of gene expression and cellular differentiation are particularly interesting in these organisms, as the apparent lack of large families of recognizable transcription factors typically found in other eukaryotic organisms suggests that they may be unusually reliant on epigenetic mechanisms. The initial hypothesis had to be re-assessed in light of the discovery in Apicomplexa of an expanded family of plant-like transcription factors (TFs) harbouring APETALA2 (AP2)-like domains. Yet, a growing body of evidence tends to favor epigenetic as one of the main contributor to parasite developmental programs and adjustments to fluctuant environment. One way to examine dynamic changes in post-translations modifications (PTMs) patterns is to alter the histone code writing. We therefore took advantage of HDAC inhibitors and showed that specific inhibition of TgHDAC3 by the cyclopeptide FR235222 disrupts the genome wide steady-state level of histone H4 acetylation inducing derepression of stage-specific genes. Yet, many questions about TgHDAC3 modus operandi remain unanswered. During my thesis, I uncovered the TgHDAC3-regulated proteome-wide acetylome typified by the presence of non-histone proteins including AP2 TFs and novel PTMs, e.g. the acetylation at Lys31 within the globular domain of histone H4. H4K31ac promotes a relaxed chromatin state at the promoter of active genes through nucleosome disassembly in both parasites. We identified TgGCN5B and TgHDAC3 as two antagonist enzymes regulating H4K31 acetylation in T. gondii. In contrast, H4K31monomethylation is enriched throughout the gene body of T. gondii active genes and contributes to transcription, whereas it is enriched at transcriptionally inactive pericentromeric heterochromatin regions in P. falciparum, a region that is lacking H3K9me3 and heterochromatin protein 1 in this parasite. We also showed that treating T. gondii cystogenic strains with a low dose of FR235222 induces the levels of proteins known to be expressed exclusively in cat (sporozoite and merozoite) or in murine chronic stage (bradyzoite). Lastly, we determined the specific interactome of TgHDAC3 and found as partners a MORC protein (CR230), several AP2 TFs, and ELM2 domain-containing scaffolding proteins. Collectively, these data established TgHDAC3 family as a central regulator of gene expression and stage conversion in T. gondii and, likely, other Apicomplexa. / Apicomplexan genome architecture is typified by a binary chromatin structure, with a major fraction of the bulk genome packaged as transcriptionally permissive euchromatin while few loci are embedded in silenced heterochromatin. There is evidence that histone modifications occurring at the lateral surface of the nucleosome play a substantial role in shaping chromatin structure, yet our understanding of the exact mechanism of action is poor. Here, we address how versatile modifications at Lys31 within the globular domain of histone H4 contribute to genome organization and expression in Apicomplexa. H4K31 acetylation was found at the promoter of active genes. The residue lies where the DNA wraps around the histone and its acetylation may enhance nucleosome disassembly, thereby favoring a more relaxed, open chromatin state. This residue tends also to be monomethylated and depending of the parasite examined different patterns were found. H4K31me1 was enriched in the core body of Toxoplasma active genes, yet its occupancy was inversely correlated with transcripts levels likely because the mark by reducing histone turnover impedes RNA polymerase progression across transcribed units. In contrast to the methylation of H3, it is the first time that a methylated residue of H4 has been clearly associated with transcriptional regulation. In Plasmodium, H4K31me1 was exclusively enriched at transcriptionally inactive genomic regions and peculiarly at pericentromeric heterochromatin, likely to replace the missing H3K9me3 that commonly decorated pericentric nucleosomes in other species.

Mon travail a porté sur la caractérisation des effecteurs toxiques et protéines d’immunité du T6SS Sci-1 d’Escherichia coli Entero-agrégatif, éléments de la lutte inter-bactérienne. Nous avons identifié en outre Tle1, un effecteur de toxine codé par ce groupe et montré que Tle1 possède des activités de phospholipase A1 et A2 requises pour détruire la cellule proie dans la compétition interbactérienne. L'auto-protection de la cellule attaquante est assurée par une lipoprotéine de membrane externe, Tli1, qui lie Tle1 dans un rapport stoechiométrique 1: 1 avec une affinité nanomolaire et inhibe son activité phospholipase. Il a été prédit que la protéine 435 provenant à partir d'un groupe de gènes T6SS1 de l'agent pathogène AIEC LF82 est une phospholipase de la famille d'effecteurs Tle3 avec une activité PLA1. Sa toxicité peut être neutralisée par la protéine d'immunité cognate 434 qui est un Tli3 putatif, en formant le complexe de protéine Tle3 - Tli3. Les deux protéines séparées et leur complexe ont ensuite été appelées protéines complexes Tle3AIEC, Tli3AIEC et Tle3AIEC - Tli3AIEC, respectivement. Afin d'étudier plus en détail le mécanisme de Tle3-AIEC et de Tli3-AIEC, nous avons réalisé l'expression, la purification, la caractérisation, la cristallisation des deux protéines et des études cristallographiques de rayons X préliminaires du complexe Tle3-AIEC/Tli3-AIEC afin de comprendre comment la protéine Tle3-AIEC reconnaît et se lie à son effecteur apparenté Tli3-AIEC et inhibe son activité. Les données préliminaires de diffraction des rayons X ont été recueillies à partir de cristaux Tle3AIEC-SeMet/Tli3AIEC à une résolution de 3,8 Å. / Here, we analyzed the Entero-aggregative Escherichia coli Sci-1 T6SS toxin effectors. We identified Tle1, a toxin effector encoded by this cluster and show that Tle1 possesses phospholipase A1 and A2 activities required for the inter-bacterial competition. Self-protection of the attacker cell is secured by an outer membrane lipoprotein, Tli1, which binds Tle1 in a 1:1 stoichiometric ratio with nanomolar affinity, and inhibits its phospholipase activity.The protein 435 from the pathogen AIEC LF82 has been predicted to be a phospholipase of the Tle3 effector family with PLA1 activity from a T6SS1 gene cluster. Its toxicity can be neutralized by the cognate immunity protein 434 that is a putative Tli3, by forming Tle3 - Tli3 protein complex. The two separated proteins and their complex were then called Tle3AIEC, Tli3AIEC and Tle3AIEC - Tli3AIEC complex proteins, respectively. In order to further investigate the related mechanism of Tle3AIEC and Tli3AIEC, we performed expression, purification, characterization, crystallization of the two proteins and preliminary X-ray crystallographic studies of the Tle3AIEC - Tli3AIEC complex in order to understand how Tle3AIEC protein recognizes and binds to its cognate Tli3AIEC effector and inhibits its activity. X-ray diffraction data were collected from selenomethionine-derivatize Tle3AIEC SeMet - Tli3AIEC crystals to a resolution of 3.8 Å.

L. pneumophila est une bactérie ubiquitaire des environnements aquatiques, responsable de la légionellose. Elle est principalement retrouvée au sein de protozoaires, mais aussi dans les biofilms. Il est admit que le fer est l'un des éléments indispensable à la croissance de ce pathogène. En 2008, une étude a été réalisée au sein de notre équipe montrant une modulation de l'expression des gènes entre L. pneumophila à l'état planctonique, et à l'état de biofilm. Dans cette même étude, l'ajout de forte concentration en fer (1,25 g/l), dans le milieu de culture des biofilms, a révélé une inhibition de leur développement. Le fer présente donc un rôle dans l'établissement de biofilms mono espèces de L. pneumophila. Nous avons développé un modèle de biofilms naturels, formés à partir d'eau de rivière, afin de tester l'établissement de L. pneumophila, dans des conditions où l'eau de rivière est supplémentée en fer ou au contraire appauvrit, par l'ajout de chélateurs, le deferoxamine mesylate (DFX) ou le dipyridyl (DIP). Les ajouts de fer et de DFX n'ont eu aucun impact sur l'établissement de L. pneumophila contrairement au DIP, qui a induit une augmentation de l'implantation de ces bactéries.Par ailleurs, nous avons effectué une analyse transcriptomique sur L. pneumophila cultivées en milieu liquide supplémenté en DFX. L'ajout du chélateur a entrainé une induction de l'expression de 113 gènes et la répression de 246 gènes. Parmi les gènes induits, certains sont déjà connus comme étant impliqués dans le métabolisme du fer ou contrôlés par le fer. Parmi eux, un gène a été surexprimé, il n'a jamais été associé au fer et sa fonction est encore inconnue à ce jour. Il s'agit du gène lpp2867. Des investigations ont été réalisées afin de caractériser et de comprendre le rôle de la protéine pour laquelle il code. Elle est notamment impliquée dans l'infection des amibes et des macrophages. Son rôle dans le transport du fer ferreux a également été mis en avant. Cette protéine a été nommée IroT pour « iron transporter ». / L. pneumophila is a ubiquitous bacterium found in aquatic environments, and responsible for legionellosis. It is mainly found into both protozoa and biofilms. Iron is a key nutrient for an optimal growth of this pathogen. In 2008, a transcriptomic analysis was carried out within our team, revealing a differential expression of genes involved in iron metabolism between sessile and planktonic bacteria. Also, this study showed that, for high iron concentrations (1.25 g/l), biofilm formation by L. pneumophila was inhibited. It suggested that iron is important for biofilm formation by L. pneumophila. To extend these observations in more natural conditions, a model of biofilm formation, using natural river water, was developed. Water was spiked with L. pneumophila and supplemented with iron or iron chelator, deferoxamine mesylate (DFX) or dipyridyl (DIP). Addition of iron and DFX did not have any effect on L. pneumophila establishment unlike the DIP which induced an increase of L. pneumophila concentration into the biofilms.Otherwise, we performed transcriptomic analysis on L. pneumophila grown in liquid medium supplemented with DFX. The addition of this chelator led to the induction of 113 genes and 246 genes were repressed significantly. Among the induced genes, some are involved in iron metabolism or controlled by iron. There was an induced gene, lpp2867, never associated with iron metabolism and whose function was still unknown. Investigations were realized to characterize and understand the role of the protein encoded by this gene. It is involved in L. pneumophila virulence and in ferrous iron assimilation. This new protein was named IroT for iron transporter.

Historiquement, les LT CD8 cytotoxiques ont été considérés comme la seule composante cellulaire du système immunitaire nécessaire et suffisante pour l’élimination de cellules infectées par des virus ou transformées, les LT CD4 ne jouant qu’un rôle auxiliaire, dans le développement et le maintien de la réponse immune effectrice, ou modulateur par la fonction suppressive des T-Reg. Aux côtés, de ces fonctions auxiliaires ou suppressive, nombre de données indiquaient que les LT CD4 pouvaient également exercer une activité cytotoxique directe. Nos travaux ont permis par l’analyse chez l’Homme, de l’expression des récepteurs α à l’IL-2 (CD25) et à l’IL-7 (CD127) à la surface des LT CD4 du sang périphérique d’identifier une population singulière de LT CD4 caractérisée par l’absence de ces deux molécules. Ces LT CD4, CD25-CD127-, faiblement représentées chez les sujets sains, entre 0,2-2% des LT CD4 totaux du sang périphérique, étaient fortement augmentées, entre 2-20% dans les infections chroniques VIH et Tuberculose, et notamment dans les cancers incluant les mélanomes uvéaux métastatiques (Mum) et les cancers du sein. Puisque prédominant dans des situations de stimulation chronique, ces LT CD4 ont été définis comme des LT CD4 chroniquement stimulés : chCD4. Dans le sang périphérique de patients atteints de cancer comme chez les sujets sains, la majorité de ces chCD4 arboraient un phénotype mémoire/effecteur (CD45RO+). Cependant, dans les Mum et les cancers du sein la proportion de chCD4 effecteurs (CD45RO+CD27-) était fortement augmentée. Par ailleurs, si la plus part de ces cellules effectrices apparaissaient à un stade de différenciation terminale (CD57+), elles présentaient toutes les mêmes caractéristiques phénotypiques distinctes, définies par l’absence d’expression de la molécule de co-stimulation CD28 coordonnée à l’expression à leur surface de l’intégrine CD11b et du récepteur NK, 2B4. Dans les chCD4 effecteurs, nous avons également mis en évidence la présence spécifique de granules cytoplasmiques concentrant granzyme B et perforine, molécules impliquées dans la cytotoxicité directe de cellules cibles. Cette propriété fonctionnelle a été démontrée par des tests de cytotoxicité redirigée et était restreinte aux chCD4 effecteurs en comparaison aux autres sous-populations effectrices de LT CD4 conventionnels et T-Reg. L’analyse du profile de sécrétion de cytokines, révèle l’absence total de production d’IL-17 et un profile orienté Th1, soulevant la question du lignage de cette population particulière. L’absence d’expression de Ki67, marqueur des cellules en cycle, au sein de cette population de LT CD4 cytotoxiques, parallèlement à leur accumulation, suggérait qu’elles seraient capables de persister à l’état quiescent chez les patients. Par ailleurs, dans les Mum, nous avons mis en évidence que l’augmentation importante du nombre de chCD4 chez les patients, concordait avec la présence d’expansions oligoclonales au sien de cette population, et démontré une corrélation positive entre le pourcentage des cellules effectrices, chCD4 et LT CD8, LT CD8 parmi lesquels nous avons déterminé une fréquence élevée de cellules répondeuses spécifiques d’antigènes tumoraux associés à la tumeur. Nos travaux ont également permis d’évaluer l’impact de la chimiothérapie sur les populations lymphocytaires dans le sang périphérique. Chez les patientes atteintes de cancer du sein, traitées par chimiothérapie néo-adjuvante, c’est-à-dire préopératoire, nous avons constaté une augmentation du nombre de chCD4 chez 17/22 patientes. Nous avons mis en évidence que cette augmentation sous traitement était fortement corrélée au pourcentage de régression tumorale. L’ensemble de ces résultats apporte une nouvelle vision des LT CD4 dans l’immunité tumorale. (...) / Historically, CD8 positive Cytotoxic T Lymphocytes (CTL) have been associated with an effector immune response, while T cells with a CD4 phenotype where considered helper T cells. More recent data suggest that CD4 positive T cells are also capable of a direct cytotoxic activity. Through a systematic analysis of the IL-2 (CD25) as well as IL-7 (CD127) receptors α on the surface of CD4+ CTL in peripheral blood of patients before during and after treatment we were able to identify a specific CD4+ T cell population devoid of expression for these 2 molecules. These CD4+, CD25-CD127-, T cells only represent 0,2-2% of the total CD4+ pool in peripheral blood of healthy donors, while in the presence of a chronic infectious disease such as HIV or tuberculosis they were increased, representing up to 2-20% of all CD4+ T cells. Similarly, high numbers of CD4+, CD25-CD127-, T cells could be identified in the circulation in patients with metastatic uveal melanoma (muM) or with breast cancer. These chronically stimulated T cells (chCD4) demonstrate a memory effector phenotype (CD45RO+); while the majority shows a terminally differentiated phenotype (CD57+), these T cells all arbore distinct phenotypic characteristics as defined by the absence of expression of CD28 together with the presence of a surface expression of integrin CD11b and of the NK receptor, 2B4. The presence of cytoplasmic granules concentrating granzyme B and perforin, known to be responsible for T cell cytotoxicity, were identified in effector chCD4 while they were absent in conventional CD4+ T cells as well as in Tregs. This cytotoxic potential was demonstrated through redirected cytotoxicity assays that functionally confirm this feature of these chronically activated CD4+ T cells. The secretory cytokine profile showed absent IL-17 levels and a Th1 orientation, asking questions as regards to the lineage of this particular T cell population. Ki67 expression, a marker of cell proliferation, was absent, suggestive of their ability to persist quiescently in patients. However in muM patients we were able to demonstrate a vast oligoclonal increase in chCD4+ T cells, which correlated positively with CD8+ T cells. We were able to detect a high frequency of T cells responding against a specific tumor antigen among these CD8+ T cells. We furthermore studied the effects of chemotherapy on peripheral lymphocyte populations. In breast cancer patients who had been treated with preoperative (neoadjuvant) chemotherapy we detected high levels of effector chCD4 in 17/22 patients. Of particular interest was the fact that this increase through a course of chemotherapy treatment was strongly correlated to the percentage of regression of the original tumor. Together, these results cast new light on the role and function of CD4+ T cells in tumor immunity. Our observations show that CD4+ cytotoxic T lymphocytes do exist and suggest for the first time in human that they may have an important role in response to treatment and in particular in the establishment of a durable protective immune response.