In this work organic molecules, namely derivatives of BODIPY and poly-para-phenyls are investigated on different metal surfaces by means of LT-STM. These molecule are important for the development of molecular electronics and spintronics. I show that aza-BODIPY molecules form a weak chemical bond with the Au(111) substrate and the molecular structure significantly changes upon adsorption. Due to the low corrugation of the Au(111) surface, diffusion of the molecule is observed for applied bias in excess of ±1 V. The temperature dependent formation of different molecular nanostructures formed by polyparaphenyls and Au adatoms is discussed. The diffusing Au adatoms act as coordination centers for the cyano groups present on one end of the molecules. The structure of the super molecular assemblies completely changes in a temperature range of only 60 K. Furthermore, I investigate in this work the hybridization of atomic orbitals within the molecular ligand. The Kondo resonance of a Co atom incorporated into an other aza-BODIPY derivative is investigated in detail on Ag(100). The hybridization of the atomic Co orbital with the organic ligands molecular orbitals is shown by spectroscopy measurements with submolecular resolution. The changing line shape of the Kondo resonance for the molecule-substrate system is discussed. This data is compared to measurements of Co incorporated in another molecular binding motive and on different metal samples to show the importance of the local environment for molecular materials. / In dieser Arbeit werden organische Moleküle, Derivate von BODIPY und poly-para-Phenyl, auf verschiedenen Metalloberflächen mittels Tief-Temperatur Rastertunnelmikroskopie (LT-STM) untersucht. Diese Moleküle sind wichtig für die Entwicklung von molekularer Elektronik und Spintronik. Ich zeige, dass aza-BODIPY-Moleküle eine schwache chemische Bindung mit dem Au(111)- Substrat eingehen und die molekulare Struktur bei der Adsorption deutlich verändert wird. Wegen der geringen Rauigkeit der Au(111)-Oberfläche wird bereits bei einer angelegten Spannungen über ±1 V die Diffusion der Moleküle beobachtet. Die temperaturabhängige Bildung verschiedener molekularer Nanostrukturen aus poly-para-Phenyl und frei beweglichen Goldatomen wird diskutiert. Die diffundierenden Goldatome agieren hierbei als Koordinationszentren für die Cyanogruppen am einen Ende der Moleküle. Die Struktur der supramolekularen Anordnungen verändert sich dabei in einem Temperaturbereich von nur 60 K vollkommen. Außerdem beschäftige ich mich in dieser Arbeit mit der Hybridisierung atomare Orbitale im molekularen Verbund. Die Kondo-Resonanz eine Co-Atoms, welches in einem anderen aza-BODIPY-Derivat gebunden ist, wird detailliert auf der Ag(100)-Oberfläche untersucht. Die Hybridisierung des atomaren Co-Orbitals mit den molekularen Orbitalen des organischen Liganden wird an Hand von Spektroskopiemessungen mit submolekularer Auflösung gezeigt. Die veränderte Form der Kondo-Resonanz für dieses Molekül-Substrat-System wird diskutiert. Diese Daten werden mit Messungen an Co-Atomen in anderen molekularen Bindungsschemen und auf anderen Substraten verglichen um dieWichtigkeit der lokalen Umgebung für molekulare Materialien zu verdeutlichen.

Conventional kinesin (kinesin-1) transports membrane-bounded cargos such as mitochondria and vesicles along microtubules. In vivo it is likely that several kinesins move a single organelle and it is important that they operate in a coordinated fashion so that they do not interfere with each other. Evidence for coordination comes from in vitro assays, which show that the gliding speed of a microtubule driven by many kinesins is as high as one driven by just a single kinesin molecule. Coordination is thought to be facilitated by flexible domains so that when one motor is bound another can work irrespectively of their orientations. The tail of kinesin-1 is predicted to be composed of a coiled-coil with two main breaks, the “swivel” (380-442 Dm numbering) and the hinge (560-624). The rotational Brownian motion of microtubules attached to a glass surface by single kinesin molecules was analyzed and measured the torsion elasticity constant. The deletion of the hinge and subsequent tail domains increase the stiffness of the motor (8±1 kBT/rad) compared to the full length (0.06±0.01 kBT/rad measured previously), but does not impair motor cooperation (700±16nm/s vs. full length 756±55nm/s - speed in high motor density motility assays). Removal of the swivel domain generates a stiff construct (7±1 kBT/rad), which is fully functional at single molecule (657±63nm/s), but it cannot work in large numbers (151±46nm/s). Due to the similar value of flexibility for both short construct (8±11 kBT/rad vs 7±1 1 kBT/rad) and their different behavior at high density (700±16 nm/s vs. 151±46 nm/s) a new hypothesis is presented, the swivel might have a strain dependent conformation. Using Circular Dichroism and Fluorescence the secondary structure of this tail region was studied. The central part of the swivel is dimeric α-helical and it is surrounded by random coils, thereby named helix-coil (HC) region. Furthermore, an experimental set-up is developed to exert a torque on individual kinesin molecules using hydrodynamic flow. The results obtained suggest for the first time the possibility that a structural element within the kinesin tail (HC region) has a force-dependent conformation and that this allows motor cooperation.

At present chemistry is undergoing an interesting change from the traditional preparation and investigation of single molecules to the construction and use of more complex functionalized architectures. Especially the better understanding of biological processes and the demand to create new materials with specific properties lead to a development of novel nanostructured assemblies that are held together by reversible weak interactions, that include coordination and hydrogen bonds, van der Waals forces as well as p-p and electrostatic interactions. Based on the smart use of Nature’s principles of molecular recognition and self-assembly, the supramolecular chemistry is now one of the pillars within the framework of nanotechnology. This contribution gives an overview on the basic concepts of supramolecular chemistry, the latter’s connections with biological systems and foreseeable applications. / Die Chemie erfährt gegenwärtig einen interessanten Übergang von der traditionellen Betrachtung der Einzelmoleküle hin zu großen komplexen Funktionseinheiten. Besonders das wachsende Verständnis biologischer Prozesse als auch die steigenden Forderungen nach neuen Werkstoffen mit einem spezifischen Eigenschaftsprofil führten zur gezielten Konstruktion definierter Baueinheiten auf der Nanometerskala. Dabei werden in intelligenter Weise reversible Bindungsprozesse auf Basis schwacher nichtkovalenter Wechselwirkungen, wie koordinative und Wasserstoffbrückenbindungen, Van-der-Waals- Kräfte sowie p−p- und elektrostatische Wechselwirkungen, genutzt. Aufbauend auf den natürlichen Prinzipien der molekularen Erkennung und Selbstorganisation ist die supramolekulare Chemie heute eine der Säulen in der Entwicklung der Nanotechnologie. Im Beitrag wird ein Überblick über wesentliche Aspekte der supramolekularen Chemie, ihre Anknüpfung an biologische Prinzipien und ausgewählte Nutzungsmöglichkeiten gegeben.

In dieser Dissertation werden die Bindungseigenschaften von Rezeptor-Ligand-Komplexen mit Hilfe von Optischen Pinzetten untersucht. Aufgrund ihrer außerordentlichen Orts- (2nm) und Kraftauflösung (0,2pN) ist es möglich, diese spezifischen Interaktionen anhand einzelner Bindungsereignisse zu charakterisieren. Als Modellsysteme dienen die Wechselwirkungen zwischen den phosphorylierungsspezifischen, monoklonalen Antikörpern HPT-101 und HPT-104 und dem Morbus Alzheimer relevanten Tau-Peptid. Dieses pathogen veränderte Peptid wird krankheitsspezifisch an den Aminosäuren Threonin231 und Serin235 phosphoryliert, sodass die Detektion dieses Phosphorylierungsmusters mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern eine mögliche Früherkennung der Alzheimer-Krankheit darstellt. Eine notwendige Voraussetzung dafür ist jedoch die exakte Kenntnis der Bindungsstellen des Liganden am Rezeptor. Ziel des ersten Teils dieser Arbeit ist es, das Epitop des monoklonalen Antikörpers HPT-101 zu bestimmen. Dazu werden mögliche bindungsrelevante Aminosäuren durch ein Alanin ausgetauscht (Alanin-Scan) und so insgesamt sieben neue Tau-Isoformen aus dem ursprünglichen doppelt-phosphorylierten Peptid Tau[pThr231/pSer235] hergestellt. Die jeweiligen Interaktionen zwischen den modifizierten Peptiden und dem Antikörper werden mit der dynamischen Kraftspektroskopie untersucht und mit Hilfe eines literaturbekannten Modells analysiert. Die sich daraus ergebenden Bindungsparameter (Lebensdauer der Bindung, charakteristische Bindungslänge, freie Aktivierungsenergie und Affinitätskonstante) werden zusammen mit den relativen Bindungshäufigkeiten erstmals genutzt, um Kriterien für essentielle, sekundäre und nicht-essentielle Aminosäuren im Tau-Peptid zu definieren. Bemerkenswerterweise existieren für insgesamt drei dieser Parameter (Bindungslebensdauer, Bindungslänge und Affinitätskonstante) scharfe Klassengrenzen, mit denen eine objektive Einteilung des Epitops von Antikörper HPT-101 möglich ist. Die erhaltenen Ergebnisse sind in überzeugender Weise im Einklang mit ELISA-Messungen zu diesem Antikörper-Peptid-Komplexen, sie liefern jedoch einen tieferen Einblick in die Natur einer spezifischen Bindung, da den kraftspektroskopischen Messungen auch die Bindungskinetik zugänglich ist. Das zweite Projekt der vorliegenden Dissertation etabliert eine Methodik, um die Datenvarianz in der Bestimmung der relativen Bindungshäufigkeit zu reduzieren. Anhand einer Kombination aus Fluoreszenz- und kraftspektroskopischen Messungen werden die Wechselwirkungen zwischen dem monoklonalen Antikörper HPT-104 und dem fluoreszenzmarkierten Peptid Tau[Fl-pThr231] untersucht. Es wird gezeigt, dass durch Vorsortieren der Peptid-beschichteten Kolloide, entsprechend ihrer Oberflächenbeladung, die Datenvarianz in den Bindungshäufigkeitsmessungen signifikant reduziert wird.

In this work organic molecules, namely derivatives of BODIPY and poly-para-phenyls are investigated on different metal surfaces by means of LT-STM. These molecule are important for the development of molecular electronics and spintronics. I show that aza-BODIPY molecules form a weak chemical bond with the Au(111) substrate and the molecular structure significantly changes upon adsorption. Due to the low corrugation of the Au(111) surface, diffusion of the molecule is observed for applied bias in excess of ±1 V. The temperature dependent formation of different molecular nanostructures formed by polyparaphenyls and Au adatoms is discussed. The diffusing Au adatoms act as coordination centers for the cyano groups present on one end of the molecules. The structure of the super molecular assemblies completely changes in a temperature range of only 60 K. Furthermore, I investigate in this work the hybridization of atomic orbitals within the molecular ligand. The Kondo resonance of a Co atom incorporated into an other aza-BODIPY derivative is investigated in detail on Ag(100). The hybridization of the atomic Co orbital with the organic ligands molecular orbitals is shown by spectroscopy measurements with submolecular resolution. The changing line shape of the Kondo resonance for the molecule-substrate system is discussed. This data is compared to measurements of Co incorporated in another molecular binding motive and on different metal samples to show the importance of the local environment for molecular materials.:Introduction 1 1 Basic Principles 5 1.1 The Scanning Tunneling Microscope 6 1.2 Theory of STM/STS 8 1.2.1 Scanning Tunneling Microscopy 8 1.2.2 Scanning Tunneling Spectroscopy 12 1.2.3 dI/dV-maps and SPECGRIDs 15 1.3 Lateral Manipulation of Adsorbates 15 1.4 The Kondo Effect 17 1.4.1 Investigation of Kondo Systems by STM 19 2 Experimental Setup 23 2.1 LT-STM and UHV System 24 2.2 Substrates 26 2.2.1 Au(111) 26 2.2.2 Ag(100) 28 2.2.3 Cu(110) 28 2.2.4 Surface Preparation 29 2.3 The Molecules 29 2.3.1 aza-BODIPY 29 2.3.2 6Ph-CN 30 2.3.3 Co-(BiPADI)2, Co-BiPADI, and BiPADI 31 2.3.4 Sample Preparation 32 2.4 Organic Photovoltaics 32 3 Aza-BODIPY on Au(111) 35 3.1 Experimental Results 36 3.1.1 STM Images 36 3.1.2 Spectroscopy 38 3.1.3 Lateral Manipulation 38 3.2 Discussion 39 4 6Ph-CN on Au(111) 43 4.1 Experimental Results 44 4.1.1 STM Images 44 4.1.2 Temperature Dependent Nanostructure Formation 44 4.1.3 Spectroscopy 46 4.2 Discussion 47 5 Co-BiPADI on Ag(100) and Cu(110) 55 5.1 Experimental Results 56 5.1.1 Co-BiPADI on Ag(100) 56 5.1.1.1 STM Images and Identification 56 5.1.1.2 Adsorption Geometry 56 5.1.1.3 Spectroscopy and Kondo Resonance 59 5.1.1.4 Temperature Dependent Measurements 63 5.1.1.5 SPECGRID Measurements and Comparison with Molecular Structure 64 5.1.1.6 Interaction of Several Co-BiPADI Molecules and Related Changes of Their Kondo Resonances 67 5.1.1.7 Determination of Adsorption Position of Molecules in SPECGRID Measurements 69 5.1.2 Co-BiPADI on Cu(110) 71 5.1.2.1 STM Images and Identification 71 5.1.2.2 STS Measurements and dI/dV Maps 72 5.2 Discussion 74 6 Co-(BiPADI)2 on Au(111) 81 6.1 Experimental Results 82 6.1.1 STM Images 82 6.1.2 Spectroscopy 82 6.2 Discussion 86 7 Conclusions and Outlook 89 Bibliography 93 List of Publications 101 Acknowledgments 103 A Appendices 105 A.1 Fitting Routine for Kondo STS 105 A.2 Background Subtraction in Kondo STS 107 A.3 MATLAB Fitting Tool fit.m 107 A.4 Import Routine and Fitting Script for SPECGRID Files 111 A.5 Calibration of Piezo Constants from Atomically Resolved Images 112 A.5.1 Au(111) 112 A.5.2 Ag(100) 112 Confirmation 113 / In dieser Arbeit werden organische Moleküle, Derivate von BODIPY und poly-para-Phenyl, auf verschiedenen Metalloberflächen mittels Tief-Temperatur Rastertunnelmikroskopie (LT-STM) untersucht. Diese Moleküle sind wichtig für die Entwicklung von molekularer Elektronik und Spintronik. Ich zeige, dass aza-BODIPY-Moleküle eine schwache chemische Bindung mit dem Au(111)- Substrat eingehen und die molekulare Struktur bei der Adsorption deutlich verändert wird. Wegen der geringen Rauigkeit der Au(111)-Oberfläche wird bereits bei einer angelegten Spannungen über ±1 V die Diffusion der Moleküle beobachtet. Die temperaturabhängige Bildung verschiedener molekularer Nanostrukturen aus poly-para-Phenyl und frei beweglichen Goldatomen wird diskutiert. Die diffundierenden Goldatome agieren hierbei als Koordinationszentren für die Cyanogruppen am einen Ende der Moleküle. Die Struktur der supramolekularen Anordnungen verändert sich dabei in einem Temperaturbereich von nur 60 K vollkommen. Außerdem beschäftige ich mich in dieser Arbeit mit der Hybridisierung atomare Orbitale im molekularen Verbund. Die Kondo-Resonanz eine Co-Atoms, welches in einem anderen aza-BODIPY-Derivat gebunden ist, wird detailliert auf der Ag(100)-Oberfläche untersucht. Die Hybridisierung des atomaren Co-Orbitals mit den molekularen Orbitalen des organischen Liganden wird an Hand von Spektroskopiemessungen mit submolekularer Auflösung gezeigt. Die veränderte Form der Kondo-Resonanz für dieses Molekül-Substrat-System wird diskutiert. Diese Daten werden mit Messungen an Co-Atomen in anderen molekularen Bindungsschemen und auf anderen Substraten verglichen um dieWichtigkeit der lokalen Umgebung für molekulare Materialien zu verdeutlichen.:Introduction 1 1 Basic Principles 5 1.1 The Scanning Tunneling Microscope 6 1.2 Theory of STM/STS 8 1.2.1 Scanning Tunneling Microscopy 8 1.2.2 Scanning Tunneling Spectroscopy 12 1.2.3 dI/dV-maps and SPECGRIDs 15 1.3 Lateral Manipulation of Adsorbates 15 1.4 The Kondo Effect 17 1.4.1 Investigation of Kondo Systems by STM 19 2 Experimental Setup 23 2.1 LT-STM and UHV System 24 2.2 Substrates 26 2.2.1 Au(111) 26 2.2.2 Ag(100) 28 2.2.3 Cu(110) 28 2.2.4 Surface Preparation 29 2.3 The Molecules 29 2.3.1 aza-BODIPY 29 2.3.2 6Ph-CN 30 2.3.3 Co-(BiPADI)2, Co-BiPADI, and BiPADI 31 2.3.4 Sample Preparation 32 2.4 Organic Photovoltaics 32 3 Aza-BODIPY on Au(111) 35 3.1 Experimental Results 36 3.1.1 STM Images 36 3.1.2 Spectroscopy 38 3.1.3 Lateral Manipulation 38 3.2 Discussion 39 4 6Ph-CN on Au(111) 43 4.1 Experimental Results 44 4.1.1 STM Images 44 4.1.2 Temperature Dependent Nanostructure Formation 44 4.1.3 Spectroscopy 46 4.2 Discussion 47 5 Co-BiPADI on Ag(100) and Cu(110) 55 5.1 Experimental Results 56 5.1.1 Co-BiPADI on Ag(100) 56 5.1.1.1 STM Images and Identification 56 5.1.1.2 Adsorption Geometry 56 5.1.1.3 Spectroscopy and Kondo Resonance 59 5.1.1.4 Temperature Dependent Measurements 63 5.1.1.5 SPECGRID Measurements and Comparison with Molecular Structure 64 5.1.1.6 Interaction of Several Co-BiPADI Molecules and Related Changes of Their Kondo Resonances 67 5.1.1.7 Determination of Adsorption Position of Molecules in SPECGRID Measurements 69 5.1.2 Co-BiPADI on Cu(110) 71 5.1.2.1 STM Images and Identification 71 5.1.2.2 STS Measurements and dI/dV Maps 72 5.2 Discussion 74 6 Co-(BiPADI)2 on Au(111) 81 6.1 Experimental Results 82 6.1.1 STM Images 82 6.1.2 Spectroscopy 82 6.2 Discussion 86 7 Conclusions and Outlook 89 Bibliography 93 List of Publications 101 Acknowledgments 103 A Appendices 105 A.1 Fitting Routine for Kondo STS 105 A.2 Background Subtraction in Kondo STS 107 A.3 MATLAB Fitting Tool fit.m 107 A.4 Import Routine and Fitting Script for SPECGRID Files 111 A.5 Calibration of Piezo Constants from Atomically Resolved Images 112 A.5.1 Au(111) 112 A.5.2 Ag(100) 112 Confirmation 113

At present chemistry is undergoing an interesting change from the traditional preparation and investigation of single molecules to the construction and use of more complex functionalized architectures. Especially the better understanding of biological processes and the demand to create new materials with specific properties lead to a development of novel nanostructured assemblies that are held together by reversible weak interactions, that include coordination and hydrogen bonds, van der Waals forces as well as p-p and electrostatic interactions. Based on the smart use of Nature’s principles of molecular recognition and self-assembly, the supramolecular chemistry is now one of the pillars within the framework of nanotechnology. This contribution gives an overview on the basic concepts of supramolecular chemistry, the latter’s connections with biological systems and foreseeable applications. / Die Chemie erfährt gegenwärtig einen interessanten Übergang von der traditionellen Betrachtung der Einzelmoleküle hin zu großen komplexen Funktionseinheiten. Besonders das wachsende Verständnis biologischer Prozesse als auch die steigenden Forderungen nach neuen Werkstoffen mit einem spezifischen Eigenschaftsprofil führten zur gezielten Konstruktion definierter Baueinheiten auf der Nanometerskala. Dabei werden in intelligenter Weise reversible Bindungsprozesse auf Basis schwacher nichtkovalenter Wechselwirkungen, wie koordinative und Wasserstoffbrückenbindungen, Van-der-Waals- Kräfte sowie p−p- und elektrostatische Wechselwirkungen, genutzt. Aufbauend auf den natürlichen Prinzipien der molekularen Erkennung und Selbstorganisation ist die supramolekulare Chemie heute eine der Säulen in der Entwicklung der Nanotechnologie. Im Beitrag wird ein Überblick über wesentliche Aspekte der supramolekularen Chemie, ihre Anknüpfung an biologische Prinzipien und ausgewählte Nutzungsmöglichkeiten gegeben.

In dieser Arbeit wurden auf Substratoberflächen adsorbierte Polymermoleküle mit Rasterkraftmikroskopie (RKM) untersucht. Dabei war die Form der Moleküle (Konformation) von besonderem Interesse. Sie ist von zentralerer Bedeutung in der Polymerphysik und wird üblicherweise in Lösung und mit Streumethoden untersucht. Polymerkonformationen auf Oberflächen sind heutzutage noch wenig untersucht. Üblicherweise wird das Verhalten nach dem so genannten Wormlike-Chain Modell angenommen. Es basiert auf der Annahme, dass die Kettenbiegung nur aus thermischen Fluktuationen resultiert, so dass sich die Kettenform durch statistische Mechanik beschreiben lässt. Es wurden für verschiedene Modellsystem einzelne Moleküle hochaufgelöst abgebildet und die Konformation aus den Bildern bestimmt. Es hat sich gezeigt, dass die idealisierte Vorstellung des Wormlike-Chain Modells tatsächlich nur für wenige der untersuchten Systeme erfüllt ist. Abweichende Konformationen sind oft auffallend regelmäßig: entweder sinusartig mäandrierte oder spiralförmig gedrehte. Beide Charakteristika lassen sich aus dem Prozess der Adsorption erklären, was zeigt, dass die Moleküle auf dem Substrat immobil sind, so dass eine thermische Relaxation der Konformation verhindert ist. Konformtionen lassen sich mit RKM nicht nur beobachten, sondern auch gezielt verändern (Nanomanipulation). Für dendronisierte Polymere konnte so gezeigt werden, dass es einen glasartigen Zustand für das einzelne Molekül gibt. In diesem Zustand verhält sich das Molekül nicht mehr wie eine bewegliche Kette, sondern formstabil, ähnlich einem makroskopischen festen Körper. / In this work single polymer molecules adsorbed onto substrate surfaces were investigated by scanning force microscopy (SFM). The focus was on the shape (conformation) of the molecules, which is of central importance in polymer physics. It is commonly investigated in solutions and with scattering methods. Conformations on surfaces are only little investigated thus far. Often a behavior according to the so-called worm-like chain model is assumed. It is based on the assumption that chain bending results entirely from thermal fluctuations so that the overall chain shape can be described by statistical mechanics. For several model systems single molecules were imaged and the conformation was determined from the images. It was found that the idealistic wormlike chain behavior is only valid for a few systems. Deviations are often remarkable regular: either sine-like undulated or spiral wound. Both characteristics can be explained from the process of adsorption, indicating that molecules are immobile on the substrate so that thermal relaxation is inhibited. Conformations can not only be imaged using the SFM, but also changed in a defined way (nanomanipulation). Manipulation experiments with dendronized polymers the existence of a glassy state for the single polymer. In this state the molecule no longer behaves as a flexible chain but remains its shape, similar to a macroscopic solid body.

Within the last years, e.g. by investigating the fluorescence of single molecules in biological cells, remarkable progress has been made in cell biology extending conventional ensemble techniques concerning temporal / spatial resolution and the detection of particle subpopulations [82]. In addition to employing single fluorophores as "molecular beacons" to determine the position of biomolecules, single molecule fluorescence studies allow to access the photophysical dynamics of genetically encoded fluorescent proteins itself. However, in order to gain statistically consistent results, e.g. on the mobility behavior or the photophysical properties, the fluorescence image sequences have to be analyzed in a preferentially automated and calibrated (non-biased) way. In this thesis, a single molecule fluorescence optical setup was developed and calibrated and experimental biological in-vitro systems were adapted to the needs of single molecule imaging. Based on the fluorescence image sequences obtained, an automated analysis algorithm was developed, characterized and its limits for reliable quantitative data analysis were determined. For lipid marker molecules diffusing in an artifcial lipid membrane, the optimum way of the single molecule trajectory analysis of the image sequences was explored. Furthermore, effects of all relevant artifacts (specifically low signal-to-noise ratio, finite acquisition time and high spot density, in combination with photobleaching) on the recovered diffusion coefficients were carefully studied. The performance of the method was demonstrated in two series of experiments. In one series, the diffusion of a fluorescent lipid probe in artificial lipid bilayer membranes of giant unilamellar vesicles was investigated. In another series of experiments, the photoconversion and photobleaching behavior of the fluorescent protein Kaede-GFP was characterized and protein subpopulations were identified.

We use time-lapse AFM to visualize collagen fibrils self-assembly. A solution of acid-solubilized collagen was injected into the AFM fluid cell and fibril formation was observed in vitro. Single fibrils continuously grew and fused with each other until the supporting surface was completely covered by a nanoscopically well-defined collagen matrix. Laterally, the fibrils grew in steps of ~4 nm suggesting a two-step mechanism. In a first step, collagen molecules associated together. In the second step, these molecules rearranged into a structure called a microfibril. High-resolution AFM topographs revealed substructural details of the D-band architecture. These substructures correlated well with those revealed from positively stained collagen fibers imaged by transmission electron microscopy. Secondly, a covalent assembly approach to prepare membrane protein for AFM imaging that avoids crystallization was proposed. High-resolution AFM topographs can reveal structural details of single membrane proteins but, as a prerequisite, the proteins must be adsorbed to atomically flat mica and densely packed in a membrane to restrict their lateral mobility. Atomically flat gold, engineered proteins, and chemically modified lipids were combined to rapidly assemble immobile and fully oriented samples. The resulting AFM topographs of single membrane proteins were used to create averaged structures with a resolution approaching that of 2D crystals. Finally, the contribution of specific amino acid residues to the stability of membrane proteins was studied. Two structurally similar proteins sharing only 30% sequence identity were compared. Single-molecule atomic force microscopy and spectroscopy was used to detect molecular interactions stabilizing halorhodopsin (HR) and bacteriorhodopsin (BR). Their unfolding pathways and polypeptide regions that established stable segments were compared. Both proteins unfolded exactly via the same intermediates. This 3 Molecular Assemblies observed by AFM observation implies that these stabilizing regions result from comprehensive contacts of all amino acids within them and that different amino acid compositions can establish structurally indistinguishable energetic barriers. However, one additional unfolding barrier located in a short segment of helix E was detected for HR. This barrier correlated with a Pi-bulk interaction, which locally disrupts helix E and divides into two stable segments.

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