We use time-lapse AFM to visualize collagen fibrils self-assembly. A solution of acid-solubilized collagen was injected into the AFM fluid cell and fibril formation was observed in vitro. Single fibrils continuously grew and fused with each other until the supporting surface was completely covered by a nanoscopically well-defined collagen matrix. Laterally, the fibrils grew in steps of ~4 nm suggesting a two-step mechanism. In a first step, collagen molecules associated together. In the second step, these molecules rearranged into a structure called a microfibril. High-resolution AFM topographs revealed substructural details of the D-band architecture. These substructures correlated well with those revealed from positively stained collagen fibers imaged by transmission electron microscopy. Secondly, a covalent assembly approach to prepare membrane protein for AFM imaging that avoids crystallization was proposed. High-resolution AFM topographs can reveal structural details of single membrane proteins but, as a prerequisite, the proteins must be adsorbed to atomically flat mica and densely packed in a membrane to restrict their lateral mobility. Atomically flat gold, engineered proteins, and chemically modified lipids were combined to rapidly assemble immobile and fully oriented samples. The resulting AFM topographs of single membrane proteins were used to create averaged structures with a resolution approaching that of 2D crystals. Finally, the contribution of specific amino acid residues to the stability of membrane proteins was studied. Two structurally similar proteins sharing only 30% sequence identity were compared. Single-molecule atomic force microscopy and spectroscopy was used to detect molecular interactions stabilizing halorhodopsin (HR) and bacteriorhodopsin (BR). Their unfolding pathways and polypeptide regions that established stable segments were compared. Both proteins unfolded exactly via the same intermediates. This 3 Molecular Assemblies observed by AFM observation implies that these stabilizing regions result from comprehensive contacts of all amino acids within them and that different amino acid compositions can establish structurally indistinguishable energetic barriers. However, one additional unfolding barrier located in a short segment of helix E was detected for HR. This barrier correlated with a Pi-bulk interaction, which locally disrupts helix E and divides into two stable segments.

Conventional kinesin (kinesin-1) transports membrane-bounded cargos such as mitochondria and vesicles along microtubules. In vivo it is likely that several kinesins move a single organelle and it is important that they operate in a coordinated fashion so that they do not interfere with each other. Evidence for coordination comes from in vitro assays, which show that the gliding speed of a microtubule driven by many kinesins is as high as one driven by just a single kinesin molecule. Coordination is thought to be facilitated by flexible domains so that when one motor is bound another can work irrespectively of their orientations. The tail of kinesin-1 is predicted to be composed of a coiled-coil with two main breaks, the “swivel” (380-442 Dm numbering) and the hinge (560-624). The rotational Brownian motion of microtubules attached to a glass surface by single kinesin molecules was analyzed and measured the torsion elasticity constant. The deletion of the hinge and subsequent tail domains increase the stiffness of the motor (8±1 kBT/rad) compared to the full length (0.06±0.01 kBT/rad measured previously), but does not impair motor cooperation (700±16nm/s vs. full length 756±55nm/s - speed in high motor density motility assays). Removal of the swivel domain generates a stiff construct (7±1 kBT/rad), which is fully functional at single molecule (657±63nm/s), but it cannot work in large numbers (151±46nm/s). Due to the similar value of flexibility for both short construct (8±11 kBT/rad vs 7±1 1 kBT/rad) and their different behavior at high density (700±16 nm/s vs. 151±46 nm/s) a new hypothesis is presented, the swivel might have a strain dependent conformation. Using Circular Dichroism and Fluorescence the secondary structure of this tail region was studied. The central part of the swivel is dimeric α-helical and it is surrounded by random coils, thereby named helix-coil (HC) region. Furthermore, an experimental set-up is developed to exert a torque on individual kinesin molecules using hydrodynamic flow. The results obtained suggest for the first time the possibility that a structural element within the kinesin tail (HC region) has a force-dependent conformation and that this allows motor cooperation.

In dieser Arbeit wird der Aufbau eines Raumtemperatur-Nahfeldmikroskopes und die Implementation eines neuen nichtoptischen Abstandsregelmechanismus beschrieben und die Ergebnisse verschiedener Abbildungsarten dargestellt. Eine theoretische Modellierung des Scherkraft-Detektionsmechanismus erlaubt ein gezieltes Design fuer eine Nachnutzung. Der Aufbau eines Tieftemperatur-Konfokalmikroskopes, das zum Tieftemperatur-Nahfeldmikroskop erweiterbar ist, wird dargelegt. Die Abhaengigkeit des Photobleichens einzelner Terrylen-Molekuele von der Temperatur wird untersucht. Beobachtungen der spektralen Diffusion von Terrylen-Molekuelen werden dargelegt. Den Hauptteil dieser Arbeit bilden Untersuchungen am N-V Farbzentrum im Diamant. Einzelne Defektzentren wurden bei tiefen Temperaturen abgebildet und mittels Fluoreszenz-Anregungsspektroskopie untersucht, die Fluoreszenz-Emissionsdynamik wurde mit Autokorrelationsmessungen studiert. Das Temperaturverhalten der Fluoreszenzintensitaet, die Autokorrelation der Fluoreszenzintensitaet und die verzoegerte Fluoreszenz beweisen die Existenz eines metastabilen Zustandes. Durch Einstrahlen einer zweiten Wellenlaenge verkuerzt sich die Verweilzeit im metastabilen Zustand und die mittlere Fluoreszenzrate wird erhoeht (Deshelving). Die Tieftemperaturspektren widersprechen in mehreren Punkten den aus der Literatur bekannten Werten, die an hoeherkonzentrierten Proben gemessen wurden. Diese Unterschiede werden diskutiert und sind mit einer in hoeherkonzentrierten Proben verstaerkten Verspannung zu erklaeren. Ein Vergleich mit Diamant-Nanokristalliten, in denen eine erhoehte Verspannung auftritt, bestaetigt den Zusammenhang zwischen schmalen Uebergaengen und wirkender Verspannung durch das Auftreten von schmalen Emissionslinien.

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In dieser Dissertation werden die Bindungseigenschaften von Rezeptor-Ligand-Komplexen mit Hilfe von Optischen Pinzetten untersucht. Aufgrund ihrer außerordentlichen Orts- (2nm) und Kraftauflösung (0,2pN) ist es möglich, diese spezifischen Interaktionen anhand einzelner Bindungsereignisse zu charakterisieren. Als Modellsysteme dienen die Wechselwirkungen zwischen den phosphorylierungsspezifischen, monoklonalen Antikörpern HPT-101 und HPT-104 und dem Morbus Alzheimer relevanten Tau-Peptid. Dieses pathogen veränderte Peptid wird krankheitsspezifisch an den Aminosäuren Threonin231 und Serin235 phosphoryliert, sodass die Detektion dieses Phosphorylierungsmusters mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern eine mögliche Früherkennung der Alzheimer-Krankheit darstellt. Eine notwendige Voraussetzung dafür ist jedoch die exakte Kenntnis der Bindungsstellen des Liganden am Rezeptor. Ziel des ersten Teils dieser Arbeit ist es, das Epitop des monoklonalen Antikörpers HPT-101 zu bestimmen. Dazu werden mögliche bindungsrelevante Aminosäuren durch ein Alanin ausgetauscht (Alanin-Scan) und so insgesamt sieben neue Tau-Isoformen aus dem ursprünglichen doppelt-phosphorylierten Peptid Tau[pThr231/pSer235] hergestellt. Die jeweiligen Interaktionen zwischen den modifizierten Peptiden und dem Antikörper werden mit der dynamischen Kraftspektroskopie untersucht und mit Hilfe eines literaturbekannten Modells analysiert. Die sich daraus ergebenden Bindungsparameter (Lebensdauer der Bindung, charakteristische Bindungslänge, freie Aktivierungsenergie und Affinitätskonstante) werden zusammen mit den relativen Bindungshäufigkeiten erstmals genutzt, um Kriterien für essentielle, sekundäre und nicht-essentielle Aminosäuren im Tau-Peptid zu definieren. Bemerkenswerterweise existieren für insgesamt drei dieser Parameter (Bindungslebensdauer, Bindungslänge und Affinitätskonstante) scharfe Klassengrenzen, mit denen eine objektive Einteilung des Epitops von Antikörper HPT-101 möglich ist. Die erhaltenen Ergebnisse sind in überzeugender Weise im Einklang mit ELISA-Messungen zu diesem Antikörper-Peptid-Komplexen, sie liefern jedoch einen tieferen Einblick in die Natur einer spezifischen Bindung, da den kraftspektroskopischen Messungen auch die Bindungskinetik zugänglich ist. Das zweite Projekt der vorliegenden Dissertation etabliert eine Methodik, um die Datenvarianz in der Bestimmung der relativen Bindungshäufigkeit zu reduzieren. Anhand einer Kombination aus Fluoreszenz- und kraftspektroskopischen Messungen werden die Wechselwirkungen zwischen dem monoklonalen Antikörper HPT-104 und dem fluoreszenzmarkierten Peptid Tau[Fl-pThr231] untersucht. Es wird gezeigt, dass durch Vorsortieren der Peptid-beschichteten Kolloide, entsprechend ihrer Oberflächenbeladung, die Datenvarianz in den Bindungshäufigkeitsmessungen signifikant reduziert wird.

Within the last years, e.g. by investigating the fluorescence of single molecules in biological cells, remarkable progress has been made in cell biology extending conventional ensemble techniques concerning temporal / spatial resolution and the detection of particle subpopulations [82]. In addition to employing single fluorophores as "molecular beacons" to determine the position of biomolecules, single molecule fluorescence studies allow to access the photophysical dynamics of genetically encoded fluorescent proteins itself. However, in order to gain statistically consistent results, e.g. on the mobility behavior or the photophysical properties, the fluorescence image sequences have to be analyzed in a preferentially automated and calibrated (non-biased) way. In this thesis, a single molecule fluorescence optical setup was developed and calibrated and experimental biological in-vitro systems were adapted to the needs of single molecule imaging. Based on the fluorescence image sequences obtained, an automated analysis algorithm was developed, characterized and its limits for reliable quantitative data analysis were determined. For lipid marker molecules diffusing in an artifcial lipid membrane, the optimum way of the single molecule trajectory analysis of the image sequences was explored. Furthermore, effects of all relevant artifacts (specifically low signal-to-noise ratio, finite acquisition time and high spot density, in combination with photobleaching) on the recovered diffusion coefficients were carefully studied. The performance of the method was demonstrated in two series of experiments. In one series, the diffusion of a fluorescent lipid probe in artificial lipid bilayer membranes of giant unilamellar vesicles was investigated. In another series of experiments, the photoconversion and photobleaching behavior of the fluorescent protein Kaede-GFP was characterized and protein subpopulations were identified.

Multivalente Wechselwirkungen sind in diversen biomolekularen und supramolekularen Systemen anzutreffen. Gewöhnlich werden sie durch ihre thermische Stabilität charakterisiert. Doch auch das mechanische Reißverhalten ist relevant: Ein System mit großer Reißlänge (Verformbarkeit) weist zwar eine geringere Reißkraft auf, kann aber besser auf äußere Einflüsse ohne Bindungsbruch reagieren. Daher besteht ein zunehmendes Interesse an Modellen zur Vorhersage der mechanischen Stabilität multivalenter Wechselwirkungen. Einzelmolekül-Kraftspektroskopie (SMFS) ist eine nützliche Methode, um den Reißprozess nichtkovalenter Wechselwirkungen zu studieren. Im Rahmen dieser Dissertation wurden mono- und bivalenten Pyridine, komplexiert und verbunden durch Cu(II) und Zn(II), entworfen und untersucht. Die drei bivalenten Pyridine wiesen unterschiedlich flexible Rückgratstrukturen auf (flexibel, teilflexibel, steif). Überraschenderweise wurde ein anderer Trend für die Verformbarkeiten gemessen (flexibel > steif > teilflexibel). Durch Vergleich von experimentellen Daten mit ab-initio Berechnungen konnten komplexe Reißmechanismen vorgeschlagen werden: Das Lösungsmittel war entscheidend und führte zu wasserverbrückten Zwischenprodukten, was die Verformbarkeit aller Systeme stark erhöhte. Im bivalente System mit teilflexiblem Rückgrat, koordiniert durch Cu(II), rissen beide Bindungen gleichzeitig bei vergleichsweise großen Kräften. Die beiden anderen Systeme mit Cu(II) wurden in zweistufigen Prozessen voneinander getrennt, was kleinere Reißkräfte zur Folge hatte. Insbesondere das flexible System war zwar thermisch stabiler, brach aber leichter als das monovalente System. Damit wurde zum ersten Mal der große Einfluss des Rückgrats, bei sonst gleicher Art von Wechselwirkung, auf die mechanische Stabilität bivalenter Wechselwirkungen gezeigt. Außerdem ist das entwickelte Modellsystem sehr nützlich für weiterführende Untersuchungen in biologisch relevanten wässrigen Lösungsmitteln. / Multivalent interactions are ubiquitous in biomolecular and supramolecular systems. They are commonly characterized by their thermal stability in terms of average bond lifetime or equilibration constant. However, also mechanical stabilities are relevant: A system with high rupture length (malleability) has a lower rupture force, but can more easily adopt to external constraints without rupture. Thus it is of ever-increasing interest to find appropriate models that allow predictions on the mechanical stability of multivalent interactions. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) is a powerful tool to study the rupture process of non-covalent interactions. In the present thesis, a comprehensive study on the mechanical stability of bivalent pyridine coordination compounds with the metal ions Cu(II) and Zn(II) was performed. Surprisingly, three different backbone flexibilities (high, intermediate, low) did not correlate with the measured malleabilities (high > low > intermediate). Instead, comparison between experimental results and ab-initio calculations revealed more complex underlying rupture mechanisms: Due to the aqueous environment, hydrogen bound complexes were formed and important intermediate structures that strongly increased malleabilities. Both interactions of the intermediately flexible bivalent system with Cu(II) broke simultaneous, yielding comparatively large rupture forces. The bivalent interactions of high and low backbone flexibility with Cu(II) broke stepwise at smaller forces. Although being thermally more stable, the highly flexible system even broke at lower forces than the monovalent system. Thereby it was shown for the first time, that rupture forces of similar systems can be tuned over a broad range, just by changing the connecting backbone structure. Furthermore, the developed approach is a rich toolkit to study further the balanced interplay between rupture force and malleability in biologically relevant aqueous solvents.

Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with atomic force microscope (AFM) has advanced our knowledge of the mechanical aspects of biological processes, and helped us take big strides in the hitherto unexplored areas of protein (un)folding. One such virgin land is that of membrane proteins, where the advent of AFM has not only helped to visualize the difficult to crystallize membrane proteins at the single-molecule level, but also given a new perspective in the understanding of the interplay of molecular interactions involved in the construction of these molecules. My PhD work was tightly focused on exploiting this sensitive technique to decipher the intra- and intermolecular interactions in membrane proteins, using bacteriorhodopsin and bovine rhodopsin as model systems. Using single-molecule unfolding measurements on different bacteriorhodopsin oligomeric assemblies - trimeric, dimeric and monomeric - it was possible to elucidate the contribution of intra- and interhelical interactions in single bacteriorhodopsin molecules. Besides, intriguing insights were obtained into the organization of bacteriorhodopsin as trimers, as deduced from the unfolding pathways of the proteins from different assemblies. Though the unfolding pathways of bacteriorhodopsin from all the assemblies remained the same, the different occurrence probability of these pathways suggested a kinetic stabilization of bacteriorhodopsin from a trimer compared to that existing as a monomer. Unraveling the knot of a complex G-protein coupled receptor, rhodopsin, showed the existence of two structural states, a native, functional state, and a non-native, non-functional state, corresponding to the presence or absence of a highly conserved disulfide bridge, respectively. The molecular interactions in absence of the native disulfide bridge mapped onto the three-dimensional structure of native rhodopsin gave insights into the molecular origin of the neurodegenerative disease retinitis pigmentosa. This presents a novel technique to decipher molecular interactions of a different conformational state of the same molecule in the absence of a high-resolution X-ray crystal structure. Interestingly, the presence of ZnCl2 maintained the integrity of the disulfide bridge and the nature of unfolding intermediates. Moreover, the increased mechanical and thermodynamic stability of rhodopsin with bound zinc ions suggested a plausible role for the bivalent ion in rhodopsin dimerization and consequently signal transduction. Last but not the least, I decided to dig into the mysteries of the real mechanisms of mechanical unfolding with the help of well-chosen single point mutations in bacteriorhodopsin. The monumental work has helped me to solve some key questions regarding the nature of mechanical barriers that constitute the intermediates in the unfolding process. Of particular interest is the determination of altered occurrence probabilities of unfolding pathways in an energy landscape and their correlation to the intramolecular interactions with the help of bioinformatics tools. The kind of work presented here, in my opinion, will not only help us to understand the basic principles of membrane protein (un)folding, but also to manipulate and tune energy landscapes with the help of small molecules, proteins, or mutations, thus opening up new vistas in medicine and pharmacology. It is just a matter of a lot of hard work, some time, and a little bit of luck till we understand the key elements of membrane protein (un)folding and use it to our advantage.

Die vorliegende Promotionsarbeit “Density functional study of the electronic and magnetic properties of selected transition metal complexes” beschäftigt sich mit dem Zusammenhang zwischen strukturellen Merkmalen sowie elektronischen und magnetischen Eigenschaften von Einzelmolekül-Magneten. Im Wesentlichen konnte dabei gezeigt werden, dass die magnetischen Eigenschaften sowohl von strukturellen Merkmalen als auch von den elektronischen Eigenschaften bestimmt werden. Des Weiteren ergab sich, dass verschiedene Kenngrößen der magnetischen Eigenschaften (im speziellen der magnetische Grundzustand S sowie die magnetische Anisotropie D) miteinander korreliert sind. Dies ist im Besonderen für eine mögliche Anwendung von Einzelmolekül-Magneten im Bereich der Datenspeicherung von Bedeutung.

Die Proteinfaltung ist ein Prozess der molekularen Selbstorganisation, bei dem sich eine lineare Kette von Aminosäuren zu einer definierten, funktionellen dreidimensionalen Struktur zusammensetzt. Der Prozess der Faltung ist ein thermisch getriebener diffusiver Prozess durch eine Gibbs-Energie-Landschaft im Konformationsraum für die Struktur der minimalen Energie. Während dieses Prozesses zeigt die freie Enthalpie des Systems nicht immer eine monotone Abnahme; stattdessen führt eine suboptimale Kompensation der Enthalpie- und der Entropieänderung während jedes Faltungsschrittes zur Bildung von Freien-Enthalpie-Faltungsbarrieren. Diese Barrieren und damit verbundenen hochenergetischen Übergangszustände, die wichtige Informationen über Mechanismen der Proteinfaltung enthalten, sind jedoch kinetisch unzugänglich. Um den Prozess der Barrierebildung und die strukturellen Merkmale von Übergangszuständen aufzudecken, werden Proteine genutzt, die über barrierefreie Pfade falten – so genannte “downhill folder“. Aufgrund der geringen Faltungsbarrieren werden wichtige Interaktionen der Faltung zugänglich und erlauben Einblicke in die ratenbegrenzenden Faltungsvorgänge. In dieser Arbeit vergleichen wir die Faltungsdynamiken von drei verschiedenen Varianten eines Lambda-Repressor-Fragments, bestehend aus den Aminosäuren 6 bis 85: ein Zwei-Zustands-Falter λWT (Y22W) und zwei downhill-folder-artige Varianten, λYA (Y22W/Q33Y/ G46,48A) und λHA (Y22W/Q33H/G46,48A). Um auf die Kinetik und die strukturelle Dynamik zu greifen zu können, werden Einzelmolekülkraftspektroskopische Experimente mit optische Pinzetten mit Submillisekunden- und Nanometer-Auflösung verwendet. Ich fand, dass die niedrige denaturierende Kraft die Mikrosekunden Faltungskinetik von downhill foldern auf eine Millisekunden-Zeitskala verlangsamt, sodass das System für Einzelmolekülstudien gut zugänglich ist. Interessanterweise zeigten sich unter Krafteinwirkung die downhill-folder-artigen Varianten des Lambda-Repressors als kooperative Zwei-Zustands-Falter mit deutlich unterschiedlicher Faltungskinetik und Kraftabhängigkeit. Drei Varianten des Proteins zeigten ein hoch konformes Verhalten unter Last. Die modellfreie Rekonstruktion von Freien-Enthalpie-Landschaften ermöglichte es uns, die feinen Details der Transformation des Zwei-Zustands-Faltungspfad direkt in einen downhill-artigen Pfad aufzulösen. Die Auswirkungen von einzelnen Mutationen auf die Proteinstabilität, Bildung der Übergangszustände und die konformationelle Heterogenität der Faltungs- und Entfaltungszustände konnten beobachtet werden. Interessanterweise zeigen unsere Ergebnisse, dass sich die untersuchten Varianten trotz der ultraschnellen Faltungszeit im Bereich von 2 μs in einem kooperativen Prozess über verbleibende Energiebarrieren falten und entfalten, was darauf hindeutet, dass wesentlich schnellere Faltungsraten notwendig sind um ein downhill Limit vollständig zu erreichen. / Protein folding is a process of molecular self-assembly in which a linear chain of amino acids assembles into a defined, functional three-dimensional structure. The process of folding is a thermally driven diffusive search on a free-energy landscape in the conformational space for the minimal-energy structure. During that process, the free energy of the system does not always show a monotonic decrease; instead, sub-optimal compensation of enthalpy and entropy change during each folding step leads to formation of folding free-energy barriers. However, these barriers, and associated high-energy transition states, that contain key information about mechanisms of protein folding, are kinetically inaccessible. To reveal the barrier-formation process and structural characteristics of transition states, proteins are employed that fold via barrierless paths – so-called downhill folders. Due to the low folding barriers, the key folding interactions become accessible, yielding insights about the rate-limiting folding events. Here, I compared the folding dynamics of three different variants of a lambda repressor fragment, containing amino acids 6 to 85: a two-state folder λWT (Y22W) and two downhill-like folding variants, λYA (Y22W/Q33Y/G46,48A) and λHA (Y22W/Q33H/G46,48A). To access the kinetics and structural dynamics, single-molecule optical tweezers with submillisecond and nanometer resolution are used. I found that force perturbation slowed down the microsecond kinetics of downhill folders to a millisecond time-scale, making it accessible to single-molecule studies. Interestingly, under load, the downhill-like variants of lambda repressor appeared as cooperative two-state folders with significantly different folding kinetics and force dependence. The three protein variants displayed a highly compliant behaviour under load. Model-free reconstruction of free-energy landscapes allowed us to directly resolve the fine details of the transformation of the two-state folding path into a downhill-like path. The effect of single mutations on protein stability, transition state formation and conformational heterogeneity of folding and unfolding states was observed. Noteworthy, our results demonstrate, that despite the ultrafast folding time in a range of 2 µs, the studied variants fold and unfold in a cooperative process via residual barriers, suggesting that much faster folding rate constants are required to reach the full-downhill limit.