INTRODUÇÃO: A cicatriz em prega vocal que ocorre após injúria constitui causa importante de disfonia. A fonocirurgia ideal é aquela em que a lesão efetivamente removida com o menor dano possível ao tecido adjacente, a fim de reestabelecer a função da prega vocal ao mesmo tempo em que a sua ultraestrutura sua ultraestrutura é preservada. Tanto o bisturi frio quanto lasers em geral são aceitos como instrumentos para fonocirurgia. O laser de diodo tem sido usado no tratamento de doenças laríngeas. Entretanto, não há consenso quanto os parâmetros ideais desse aparelho para tal finalidade. Inexistem trabalhos que mostrem a forma ou a extensão da lesão provocada com laser de diodo em laringe e tampouco as reações histológicas e cicatriciais provocadas por ele. OBJETIVO: O objetivo desta pesquisa é estudar as alterações morfométricas e histopatológicas observadas nas pregas vocais de coelhos, sete dias após a lesão provocada com o laser de diodo, comparando diferentes configurações do dispositivo. MÉTODO: Vinte e um coelhos machos albinos da raça New Zealand foram distribuídos aleatoriamente em três grupos com sete animais por grupo. Foi realizada uma lesão única durante 20 segundos em cada prega vocal com a ponta da fibra em contato superficial com o tecido. Duas frequências de pulso foram comparadas no Grupo I (10Hz versus 1000Hz), diferentes potências no Grupo II (3W versus 5W) e modos de radiação distintos no Grupo III (pulsado versus contínuo). Após sete dias, as laringes foram excisadas e submetidas à coloração com hematoxilina-eosina, além de coloração histoquímica para colágeno e elastina. Foi realizada análise histológica quantitativa e subjetiva. RESULTADOS: o laser de diodo provocou: exocitose de células inflamatórias; edema de mucosa e submucosa; infiltrado celular extenso em torno da úlcera, composto por polimorfonucleares (especialmente eosinófilos), linfócitos e histiócitos; tecido de granulação com a presença de fibroblastos e vasos neoformados e áreas de necrose do tipo coagulativa. A extensão do processo inflamatório e a extensão linear da úlcera apresentaram diferença significativa entre as duas potências, e foi maior com uso do laser ajustado para 5W. A extensão do processo inflamatório, extensão linear da úlcera, profundidade da úlcera e profundidade do processo inflamatório apresentaram diferença significativa entre os dois modos de emissão do laser, isto é, maior no modo contínuo. A densidade das fibras colágenas apresentaram-se elevadas apenas ao uso do laser no modo contínuo, quando comparado ao modo pulsado. Não houve diferença estatística quanto à densidade de fibras elásticas. CONCLUSÃO: O uso do laser de diodo ajustado em potência de 5W ao invés 3W e o uso do modo contínuo ao invés do pulsado são capazes de aumentar significativamente a injúria térmica nas pregas vocais de coelhos / INTRODUCTION. Scarring of the vocal folds is a relevant cause of dysphonia after injury. The ideal phonomicrosurgery would be the one that removes the vocal fold disease in order to restore the biomechanical function, while providing minimal disruption to the surrounding vocal fold layered structure. Steel scalpel and laser systems are widely accepted tools for vocal fold surgical procedures. The diode laser technique has been used in the treatment of laryngeal diseases. However, there is great variability among surgeons with regard to the use of the diode laser for laryngeal surgery and the ideal parameters for this procedure remain unclear. No description of the lesion extent or the vocal fold healing after injury with this device have been reported to date. OBJECTIVE: The aim of this research was to study the morphometric and histopathological changes seen in the vocal fold seven days after injury with the diode laser in a rabbit model, comparing different settings of the device. METHODS: Twenty-one male New Zealand white rabbits were randomized into three groups with seven animals per group. A single spot injury during 20 seconds was performed in each vocal fold with the fiber tip in superficially contact with the tissue. Two pulse frequency were compared in group I (10Hz versus 1000Hz), different powers in group II (3W versus 5W) and distinct wave mode of radiation in group III (pulsed versus continuous). After seven days, the larynges were harvested and subjected to H&E staining, histochemical staining for collagen and elastin, with quantitative and subjective histological analysis. RESULTS: the diode laser provoked exocytosis of inflammatory cells; edema of mucosa and submucosa; extensive cell infiltrate around the ulcer with polymorphonuclear cells (especially eosinophils), lymphocytes and histiocytes; granulation tissue with the presence of fibroblasts and neoformed vessels and areas of coagulative necrosis. The extent of the inflammatory infiltrate and the extent of the ablation crater showed to be greater with the 5W power use. The analyzes of extension of the extent of the inflammatory infiltrate, the extent of the ablation crater, the depth of the ablation crater and depth of the inflammatory process presented greater measurements with the continuous mode. The density of collagen fibers was higher when the laser was used in continuous wave mode. There was no statistically significant difference in elastic fiber density. CONCLUSION: Increasing power from 3W to 5W and using continuous wave rather than pulsed wave mode of the diode laser significantly increased the extent of thermal injury in the rabbit vocal folds

A fisiopatologia do edema de Reinke ainda permanece desconhecida e poucos estudos abordam sobre as alterações das proteínas fibrosas, colágeno e elastina, na matriz extracelular da prega vocal com edema de Reinke. Por isso, este estudo foi idealizado para descrever a distribuição das fibras colágenas e do sistema de fibras elásticas do espaço de Reinke com edema de Reinke comparando com a prega vocal normal e com a severidade do edema. Foram obtidas 20 amostras de pregas vocais de indivíduos com edema de Reinke, sendo nove casos com edema de Reinke grau II e 11 casos grau III. Dezessete indivíduos eram do sexo feminino e três do sexo masculino, com idade variando de 47 a 62 anos (55 ± 4,4 anos). Quinze pacientes eram tabagistas e cinco ex-tabagistas, média e desvio padrão de 22 ± 10,7 maço/ano. O tempo de disfonia apresentou média e desvio padrão de 36 ± 16,6 meses. Dez pregas vocais normais de laringes humanas excisadas foram utilizadas como controles. Os métodos da Picrossírius-polarização e da Resorcina-fucsina de Weigert com oxidação prévia pelo oxone 10% foram empregados para visualização das fibras colágenas e do sistema de fibras elásticas, respectivamente. Uma avaliação semiquantitativa foi utilizada para categorizar os resultados histológicos que foram correlacionados com a idade, consumo de cigarro, tempo de disfonia e com a severidade do edema. Evidenciou-se que o arranjo entrelaçado das fibras colágenas semelhante a uma cesta de vime observado em pregas vocais normais estava desestruturado no edema de Reinke. A desestruturação foi caracterizada por um afastamento das fibras, fragmentação, formando áreas esparsas e tomadas por um estroma mixóide de quantidade variável. Todos os casos de edema de Reinke mostraram uma maior preservação do arranjo das fibras colágenas próximo ao epitélio da prega comparada com as fibras da camada mais profunda do espaço de Reinke. O arranjo do sistema de fibras elásticas formado por fibras finas e onduladas paralelas à membrana basal do epitélio e uma rede de fibras mais finas, logo abaixo da membrana basal do epitélio observado em pregas vocais normais estava desestruturado no edema de Reinke. Na avaliação semiquantitativa observou-se que moderada e intensa desestruturação ocorreram em 90% dos casos com relação às fibras colágenas e em todos os casos para o sistema de fibras elásticas. Houve uma correlação estatisticamente significante entre a idade e o grau de desestruturação das fibras colágenas (r=0,47, p=0,037). Houve diferenças estatisticamente significantes entre os edemas grau II e III quanto à desestruturação das fibras colágenas (p=0,007) e quanto à idade (p=0,036). Observamos com este estudo que as alterações nas proteínas fibrosas presentes no edema de Reinke podem contribuir com a deformidade da prega vocal / The physiopathological mechanisms underlying Reinkes edema are still unknown and few studies addressed alterations in the fibrillar proteins, collagen and elastin, in extracellular matrix with Reinkes edema. This study was idealized to describe the distribution of collagen fibers and elastic system fibers in Reinkes space with Reinkes edema, comparing with normal vocal fold and with the severity of Reinkes edema. Twenty surgical vocal fold specimens were obtained from patients with Reinkes edema, nine cases presented grade II severity and 11 cases grade III. Seventeen subjects were females and three were males, ranging in age from 47 to 62 years (mean±SD 55 ± 4.4 years). Fifteen patients were smokers and five ex-smokers, mean±SD of 22 ± 10.7 pack-years. The duration of dysphonia ranged from 6 to 60 months (mean of 36 ± 16.6 months). Ten vocal folds from human larynges of nonsmokers cadavers were used as normal controls. The Picrosirius polarization method and the Weigerts resorcin-fuchsin stain after oxidation with 10% aqueous oxone were used for visualization of collagen fibers and the elastic system fibers, respectively. Findings were categorized semiquantitatively and correlated with age, cigarette smoking, duration of dysphonia and Reinkes edema severity. The intertwined network of collagen fibers resembling a wicker-basket found in normal vocal folds was disarranged in Reinkes edema. Disarrangement of collagen fibers was characterized by loosely arranged and fragmented fibers intermixed with varying amounts of myxoid stroma. All cases showed a better preservation of collagen fibers arrangement closer to the epithelium compared to fibers of the deeper of the Reinkes space. The elastic system fibers arrangement formed by a delicate network of thin and undulated fibers arranged in parallel to the epithelial basement membrane and a network of thinner fibers immediately below the basement membrane was disarranged. The semiquantitatively analysis showed that moderate and large areas of disarrangement of collagen fibers were found in 90% of cases and in all cases for elastic fibers. Age was significantly correlated with collagen fiber disarrangement (r=0.47, p=0.037). There was a statistical difference in collagen disarrangement (p = 0,007) and age (p=0,036) between grade II and grade III severity. In our study, the alterations in the fibrillar proteins observed in Reinkes edema may contribute to the vocal fold deformity

Orientadores: Konradin Metze, Carlos Lenz Cesar / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T10:46:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vieira-Damiani_Gislaine_D.pdf: 4044155 bytes, checksum: 7a862a3866981d1827845318ce37b121 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A hipertensão arterial sistêmica (HAS) bem como o envelhecimento provoca mudanças na estrutura dos grandes vasos sanguíneos - aorta e seus ramos - propiciando o desenvolvimento de processos degenerativos que são a causa de diversas doenças. O uso de ferramentas fotônicas na aquisição de imagens, associado a recursos matemáticos para a interpretação delas representa um avanço para as análises histopatológicas, pois permitem a visualização e compreensão de pequenas estruturas que antes eram impossíveis de serem observadas. O objetivo desse trabalho foi associar estas duas tecnologias (ferramentas fotônicas e recursos matemáticos) e com isso criar uma metodologia para a análise simultânea de fibras elásticas e colágenas na aorta. Para tanto utilizamos aorta ascendente de 72 pacientes, sendo 22 normotensos, 38 portadores de HAS e 12 aortas de dissecção. As lâminas coradas com hematoxilina eosina foram examinadas no microscópio multifoton, com dois fótons: laser de argônio para fluorescência da eosina, corante de fibras elásticas e Ti:safira para SHG, sinal gerado por moléculas de colágeno. A distribuição e organização das fibras elásticas e colágenas foram analisadas pelas seguintes variáveis: morfometria geométrica, derivadas da matriz de co-ocorrência de Haralick, Transformada de Fourier e fluorescência ótica integrada. Usando estes descritores da textura associados a fractais, observamos que a geração do SHG é dependente não só da presença do colágeno como também do arranjo destas fibras. Observamos ainda que em indivíduos normotensos, quando comparados aos portadores de HAS, ocorre uma diminuição na distribuição do sinal SHG ao longo da espessura da camada média partindo da íntima em sentido à adventícia. Dessa maneira concluímos que os maiores distúrbios das fibras elásticas, nos indivíduos normais ocorrem na transição do terço interno para o médio, enquanto que nos portadores de HAS eles estão distribuídos em toda a espessura da aorta. Além disso, estes estudos nos permitiram verificar que a dissecção da aorta ocorre entre dois reforços de colágeno, uma vez que este fenômeno foi constatado entre dois picos de SHG / Abstract: The arterial hypertension as well as aging induces changes in the structure of large blood vessels - aorta and its branches - leading to development of degenerative processes which are the cause of many diseases. The use of photonics tools for image acquisition, associated to mathematical resources for interpretation of them represents an advance in histopathological analysis, because it allows the visualization and understanding of small structures that were impossible to be observed before. The main objective of this study was to associate both technologies (photonics tool and mathematical resources) to create a new methodology to evaluate, simultaneously, elastic and collagen fibers in aorta. For this we've used autopsies of ascending aortas from 72 patients, being 22 samples from normotensives individuals, 38 from HAS patients and 12 aortas from dissection. HE-stained paraffin sections from ascending aortas were analyzed by multifoton microscopy, with 2 types of photons: Two-photon excited fluorescence (TPEF) for elastin and Ti:safira for SHG to analyze collagen fibers. The distribution and organization of elastic and collagen fibers were analyzed by the following variables: geometric morphometric, derived from the co-occurrence matrix of Haralick, Fourier Transform and Fluorescence optics integrated. Using these texture descriptors associated to analysis of fractals, we've observed that SHG generation is not only dependent on the presence of collagen but on the arrangement of these fibers as well. We also observed that in normotensives individuals, if compared to HAS patients, occurs a decrease in the SHG intensity along the medial thickness from intimate in direction to adventitia. Thus we conclude that the major disorders of elastic fibers in normal subjects occur in the transition from the third layer to the middle, while in HAS individuals these disorders are distributed throughout the thickness of the aorta. Furthermore, this study has allowed us to verify that the aortic dissection has occurred between two peaks of SHG, since this phenomenon was observed between two ribs collagen / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutora em Fisiopatologia Médica

Because the urinary bladder stores and releases urine, its normal function includes filling and emptying, accompanied by distension and relaxation. It is known that chronic distension compromises blood flow. Recent studies of the rabbit bladder vasculature have described specializations of that vasculature that appear to enhance blood flow in the bladder wall during distension. The present report describes the location, orientation, and structure of an elastic sheath surrounding the vesicular arteries, which may represent one of these specializations. The location, vasculature, and structure of an accessory elastic sheath surrounding the vesicular arteries of the rabbit bladder is described using light and electron microscopy, India ink injection, and vascular corrosion casting. The common iliac arteries of rabbits were cannulated to permit perfusion of the distal vasculature including the urinary bladder. After the bladder vasculature was visually cleared of blood by perfusion with buffered saline, one of the following procedures was used: 1) for light or electron microscopy, the bladder was perfuse-fixed with buffered 2% glutaraldehyde; 2) the bladder vasculature was filled with India ink for vessel tracing; or 3) corrosion casts of the bladder vasculature were prepared by infusion of a Mercox resin mixture. Casts, cleaned of tissue with KOH, and water and formic acid rinses, are dried, and mounted for routine scanning electron microscopy. The presence of an accessory sheath surrounding the main vesicular arteries and some of their branches in the basal two thirds of the urinary bladder was observed on India ink injected specimens and confirmed by micrographs and vascular corrosion casts. The sheath consists of elastic and collagenous fibers and is separated from the tunica media of the arteries by a loose connective tissue layer of variable width. The sheath is circumscribed by a layer of fine blood vessels. The vesicular arteries undulate within the sheath to an extent which is dependent upon the degree of distension of the bladder. This sheath likely represents a specialization which permits the bladder vasculature to accommodate expansion and contraction of the wall during normal filling and emptying. Undulations or coiling of the vesicular arteries within the loose connective tissue core of the sheath increase with bladder contraction, and apparently the sheath simply holds the artery in position during such coiling. The sheath, may represent a modification of the external elastic lamina found in some muscular arteries.

Acredita-se que nos humanos, o ligamento vocal se desenvolva após o nascimento. No entanto, não há consenso na literatura sobre qual a faixa etária de seu aparecimento. Muitos estudos indicam que no neonato, a lâmina própria da prega vocal apresenta-se com algumas fibras esparsas sem uma organização particular. O principal objetivo deste estudo foi obter informação a respeito das fibras colagênicas e do sistema elástico (sob a luz dos conhecimentos atuais sobre a matriz extracelular), na lâmina própria de pregas vocais de fetos no período perinatal. Laringes obtidas por autópsia de fetos entre sete a nove meses foram estudadas através de microscopia de luz e eletrônica de transmissão. Fibras contendo colágeno foram identificadas através do Método da Picrossírius-polarização, fibras do sistema elástico foram descritas utilizando-se o método de Resorcina-fucsina de Weigert após oxidação com oxona. Os resultados histoquímicos coincidem com as observações da microscopia eletrônica, evidenciando populações de fibras de colágeno segregadas em diferentes compartimentos na lâmina própria. Assim, em sua região central as fibras de colágeno se mostraram finas, fracamente birrefringentes de coloração esverdeada, enquanto que as regiões superficiais e profundas apresentaram fibras grossas de colágeno com forte birrefringência de cor vermelho-amarelada, quando estudadas através do método da Picrossírius-polarização. Estas características sugerem que as fibras finas da região central são compostas principalmente por colágeno tipo III, enquanto o colágeno tipo I predomina nas regiões superficial e profunda, em concordância com as observações da literatura relacionada com o estudo da prega vocal de adultos. Assim como o componente colagênico, as fibras do sistema elástico mostraram uma distribuição diferencial ao longo da lâmina própria. Em certo sentido, esta distribuição é complementar àquela das fibras de colágeno: a região central, na qual fibras colagênicas eram escassas e finas, apresentou maior densidade de fibras do sistema elástico, em comparação às regiões superficial e profunda. Assim, a presença de um padrão de distribuição diferencial das fibras da matriz extracelular na prega vocal humana fetal equivalente à descrição clássica do ligamento vocal adulto nos permitiu concluir que o ligamento vocal já está presente ao nascimento. As implicações funcionais destes achados foram discutidas. O conceito corrente de que os estímulos externos, como a fonação, são essenciais para a determinação da estrutura em camadas da lâmina própria, faz com que nossos resultados sejam surpreendentes ao evidenciar a presença de uma distribuição complexa e organizada dos componentes do tecido conjuntivo na lâmina própria de pregas vocais de fetos no período perinatal. A idéia de que a contribuição genética poderia desempenhar um papel importante na organização destas camadas, independentemente do estímulo mecânico, poderia explicar melhor a presença das estruturas observadas já ao nascimento, uma vez que o mecanismo genético pode agir antes de qualquer estímulo mecânico externo, como a fonação. / It is currently believed that, in humans, the vocal ligament develops after birth. However, there is no consensus in the literature about the age of its surge. Most papers describe that in the newborn, the lamina propria shows the presence of some sparse fibers without any particular organization. The main purpose of this study was to obtain information regarding collagenous and elastic system fibers (in the light of the current knowledge on extracellular matrix) in the lamina propria of fetal vocal fold. Larynges obtained from autopsy of human fetuses aged seven to nine months were studied by means of light and electron microscopy. Collagen containing fibers were assessed by the Picrosirius-polarization method, elastic system fibers were described using Weigert\'s resorcin-fuchsin with previous oxidation with oxone. The histochemical results coincide with the electron microscope observations in showing collagen populations segregated into different compartments of the lamina propria. Thus, in its central region the collagen shows up as thin, weakly birefringent, greenish fibers while the superficial and deep regions consist of thick collagen fibers which display a strong birefringence of red or yellow color when studied with the aid of the Picrosirius-polarization method. These characteristics strongly suggest that the thin fibers in the central region are composed mainly of type-III collagen, whereas type-I collagen predominates in the superficial and deep regions, in agreement with the observations in the literature pertaining to studies of adult vocal folds. As well as collagen, the elastic system fibers show a differential distribution throughout the lamina propria. This distribution is complementary, in a sense, to that of the collagen fibers: the central region, with thin collagenous fibers, presents the greatest density of elastic system fibers in comparison to the superficial and deep regions. Thus, the presence of a differential distribution of the extracellular matrix fibers in the fetal vocal fold equivalent to the classical description of the adult vocal ligament allowed the conclusion that a vocal ligament is already present in the newborn. The functional implications of the foregoing findings are discussed. Current ideas sustaining that stimuli like phonation are essential to the determination of the layered structure of the lamina propria would make it surprising that a newborn baby could present a complex and organized distribution of connective tissue components as our results show to be the case. The idea that genetic contrivance instead should play a role in the organization of these layers seems to explain better the observed structures once it would act before any mechanical stimulus similar to phonation could take place.

O músculo cricofaríngeo desempenha um importante papel na deglutição. Acredita-se que seu comportamento elástico seja dependente não apenas do componente muscular, mas também do tecido conectivo intramuscular. O objetivo desse estudo foi analisar a presença e a distribuição do colágeno total, colágenos tipo I e III, fibras elásticas, fibronectina e versican no endomísio do músculo cricofaríngeo em cadáveres de diferentes idades. Vinte e sete músculos foram obtidos mediante autópsia de indivíduos de ambos os sexos com idades entre 28 e 92 anos. Foram realizadas colorações histoquímicas, Método Picrossírius e Método Resorcina-fuccina com oxidação prévia pela oxona, e imunoistoquímicas, para colágeno tipo I, tipo III, fibronectina e versican. A medida dos elementos estudados foi feita por meio de um sistema de análise de imagens que incluía um microscópio, conectado a um computador por meio de uma câmera de vídeo. Foi utilizado o software Image pro Plus, versão 4.1. Para cada caso, quinze imagens não sobrepostas de cada coloração no aumento de 400x foram analisadas. A área de marcação positiva dentro do endomísio do músculo cricofaríngeo foi determinada por um padrão de cor específico para cada coloração. A área de cada elemento da matriz extracelular foi expressa como porcentagem da área total do estudada. Os dados foram expressos em medianas e intervalos interquartílicos. A correlação entre idade e os diferentes elementos da matriz extracelular foi realizada por meio da correlação de Spearman. O teste de Mann-Whitney para distribuição não paramétrica foi utilizado para comparar as áreas porcentuais e os indivíduos de diferente sexo. Todos os testes foram realizados pelo software SPPS versão 13.0 e foi admitido um calor de significância com p < 0,05. O colágeno foi o elemento mais abundante dentre os estudados. Encontrou-se fibras elásticas longitudinais à fibra muscular, finas fibras transversais entre as fibras musculares e espessamento as fibras elásticas nos pólos da fibra muscular. Foi encontrada uma grande variação no conteúdo de fibronectina e versican entre os casos. Não foi evidenciada diferença estatisticamente significativa entre os elementos estudados, o sexo e a idade. Os resultados sugerem que a presença e distribuição desses elementos são importantes para a função do músculo cricofaríngeo e para a manutenção da homeostase. A porcentagem de colágeno encontrada é condizente com a característica esfinctérica do músculo e o arranjo de fibras elásticas contribui para o comportamento elástico e a capacidade de rapidamente reassumir a posição tônica após a abertura durante as deglutições. As variações da quantidade de fibronectina e versican, podem ser resultante da susceptibilidade a fatores agressores. A ausência de alterações com a idade pode significar que o músculo não esteja sujeito às mesmas alterações decorrentes da idade que outros músculos esqueléticos / The cricopharyngeus muscle is thought to play an important role in swallowing and related activities. Its elastic behavior is likely to depend not only on its muscular components, but also on the intramuscular connective tissue. Our objective is to analyze the presence and distribution of total collagen, type I and III collagen, elastic fibers, fibronectin and versican in cricopharyngeus muscle endomysium in adults of a wide age range. Twenty-seven cricopharyngeus muscles obtained from male and female cadavers (age range, 28-92 years-old) were analyzed with the Picrosirius method, oxidized Weigert resorcin-fuchisin, immunohistochemistry. Quantification of stained areas in the cricopharyngeus endomysium with different techniques was performed by an image analysis system connected to a light microscope. The correlation between age and the density of different extracellular matrix proteins was tested using Spearman test. T-tests for independent samples were used to analyze the influence of gender and smoking habit on the fractional areas of extracellular matrix. Collagens had the highest density among the analyzed components. Elastic fibers surrounded each muscle cell, longitudinal to their long axis, associated to traversing fibers, forming a fiber network embedding muscle cells. There was a wide variation on fibronectin and versican content among cases. There were no statistical significance for analysis made between those components of extracellular matrix and age andgender. Our findings suggest that presence and distribution of these extracellular matrix components are important to cricopharyngeus muscle homeostasis. The elastic fibers arrangement can contribute for the cricopharyngeus muscle elastic behavior and ability to rapidly reassume its tonic position after opening during swallows. Variations in the expression of fibronectin and versican can beresultant of its injury susceptibility. The absence of changes on extracellular components during aging could mean that cricopharyngeus muscle is not susceptible to similar age changes as other skeletal muscles

La peau et son vieillissement sont un enjeu de santé publique. Les modèles expérimentaux disponibles pour l'étude du vieillissement cutané restent perfectibles. Dans ce contexte, nos objectifs étaient simultanément d'utiliser les modèles de peaux reconstruites (PR) développés dans notre laboratoire afin i) de mieux comprendre les mécanismes du vieillissement cutané, ii) de démontrer l'efficacité et le mécanisme d'action du sélénium comme « anti âge » et enfin iii) de les faire évoluer en utilisant le support poreux ou auto-assemblé avec des fibroblastes du même donneur prélevés à des âges différents. Ainsi, le modèle de PR cultivé sur une longue période a montré une surexpression du microARN miR30-a par RT qPCR dans les PR « âgées » avec une altération de la fonction barrière mesurée par la perte insensible en eau et une perturbation de la différenciation terminale (baisse d'expression de la loricrine et de l'involucrine). Avec le même modèle in vitro, nos résultats démontrent que la supplementation en sélénium retarde la sénescence des kératinocytes souches. Cette efficacité passe non pas par un effet antioxydant comme attendu mais par l'activation de leur adhésion à la lame basale, qui participe à les conserver souche et donc à préserver le renouvellement épidermique. Enfin, nous avons eu la chance exceptionnelle de préparer des PR avec des fibroblastes provenant d'un donneur unique prélevé à 36 et 72 ans. Les résultats immunohistologiques montrent que l'âge induit une augmentation de l'expression de l'élastine et de la fibrilline ainsi que leur co-expression. L'augmentation de LTBP1 et aSMA suggère que cette augmentation inattendue est due à une dérégulation de la voie TGF-ß et une différenciation des fibroblastes en myofibroblastes. En conclusion l'utilisation de différents modèles de PR a permis d'explorer les mécanismes conduisant au vieillissement cutané et de démontrer l'efficacité du sélénium comme anti âge / Skin and its aging is a public health issue. In vitro skin models available for the study aging remain perfectible. In this context, our objectives were simultaneously to use skin equivalent (SE) developed in our laboratory i) to better understand mechanisms of skin aging, ii) to demonstrate the effectiveness of selenium as “anti-aging” and finally iii) to improve SE using the porous or scaffold free model with fibroblasts from the same donor at different ages. Thus, the model of SE mimicking senescence showed an overexpression of microRNA miR30-a by RT qPCR in old SE with an alteration of the barrier function measured by the transepidermal water loss and a deficiency of epidermal terminal differentiation (decreased expression of loricrin and involucrin). With the same SE model, our results demonstrate that selenium supplementation delays the senescence of keratinocytes stem cells. This effectiveness does not involve antioxidant effect as expected but the activation of their adhesion to the basement membrane, which participates in preserving stemness and epidermal renewal. Finally, we had the opportunity to prepare SE with fibroblasts from a single donor at 36 and 72 years old. The histological results show that age induces an increase in the expression of elastin and fibrillin as well as their co-expression. The increase of LTBP1 and aSMA suggests that this unexpected increase is due to deregulation of the TGF-ß pathway and fibroblasts differentiation into myofibroblasts. In conclusion, the use of different models of SE helps us to explore some mechanisms leading to skin aging and to demonstrate the efficacy of selenium as “anti-aging”

O músculo cricofaríngeo desempenha um importante papel na deglutição. Acredita-se que seu comportamento elástico seja dependente não apenas do componente muscular, mas também do tecido conectivo intramuscular. O objetivo desse estudo foi analisar a presença e a distribuição do colágeno total, colágenos tipo I e III, fibras elásticas, fibronectina e versican no endomísio do músculo cricofaríngeo em cadáveres de diferentes idades. Vinte e sete músculos foram obtidos mediante autópsia de indivíduos de ambos os sexos com idades entre 28 e 92 anos. Foram realizadas colorações histoquímicas, Método Picrossírius e Método Resorcina-fuccina com oxidação prévia pela oxona, e imunoistoquímicas, para colágeno tipo I, tipo III, fibronectina e versican. A medida dos elementos estudados foi feita por meio de um sistema de análise de imagens que incluía um microscópio, conectado a um computador por meio de uma câmera de vídeo. Foi utilizado o software Image pro Plus, versão 4.1. Para cada caso, quinze imagens não sobrepostas de cada coloração no aumento de 400x foram analisadas. A área de marcação positiva dentro do endomísio do músculo cricofaríngeo foi determinada por um padrão de cor específico para cada coloração. A área de cada elemento da matriz extracelular foi expressa como porcentagem da área total do estudada. Os dados foram expressos em medianas e intervalos interquartílicos. A correlação entre idade e os diferentes elementos da matriz extracelular foi realizada por meio da correlação de Spearman. O teste de Mann-Whitney para distribuição não paramétrica foi utilizado para comparar as áreas porcentuais e os indivíduos de diferente sexo. Todos os testes foram realizados pelo software SPPS versão 13.0 e foi admitido um calor de significância com p < 0,05. O colágeno foi o elemento mais abundante dentre os estudados. Encontrou-se fibras elásticas longitudinais à fibra muscular, finas fibras transversais entre as fibras musculares e espessamento as fibras elásticas nos pólos da fibra muscular. Foi encontrada uma grande variação no conteúdo de fibronectina e versican entre os casos. Não foi evidenciada diferença estatisticamente significativa entre os elementos estudados, o sexo e a idade. Os resultados sugerem que a presença e distribuição desses elementos são importantes para a função do músculo cricofaríngeo e para a manutenção da homeostase. A porcentagem de colágeno encontrada é condizente com a característica esfinctérica do músculo e o arranjo de fibras elásticas contribui para o comportamento elástico e a capacidade de rapidamente reassumir a posição tônica após a abertura durante as deglutições. As variações da quantidade de fibronectina e versican, podem ser resultante da susceptibilidade a fatores agressores. A ausência de alterações com a idade pode significar que o músculo não esteja sujeito às mesmas alterações decorrentes da idade que outros músculos esqueléticos / The cricopharyngeus muscle is thought to play an important role in swallowing and related activities. Its elastic behavior is likely to depend not only on its muscular components, but also on the intramuscular connective tissue. Our objective is to analyze the presence and distribution of total collagen, type I and III collagen, elastic fibers, fibronectin and versican in cricopharyngeus muscle endomysium in adults of a wide age range. Twenty-seven cricopharyngeus muscles obtained from male and female cadavers (age range, 28-92 years-old) were analyzed with the Picrosirius method, oxidized Weigert resorcin-fuchisin, immunohistochemistry. Quantification of stained areas in the cricopharyngeus endomysium with different techniques was performed by an image analysis system connected to a light microscope. The correlation between age and the density of different extracellular matrix proteins was tested using Spearman test. T-tests for independent samples were used to analyze the influence of gender and smoking habit on the fractional areas of extracellular matrix. Collagens had the highest density among the analyzed components. Elastic fibers surrounded each muscle cell, longitudinal to their long axis, associated to traversing fibers, forming a fiber network embedding muscle cells. There was a wide variation on fibronectin and versican content among cases. There were no statistical significance for analysis made between those components of extracellular matrix and age andgender. Our findings suggest that presence and distribution of these extracellular matrix components are important to cricopharyngeus muscle homeostasis. The elastic fibers arrangement can contribute for the cricopharyngeus muscle elastic behavior and ability to rapidly reassume its tonic position after opening during swallows. Variations in the expression of fibronectin and versican can beresultant of its injury susceptibility. The absence of changes on extracellular components during aging could mean that cricopharyngeus muscle is not susceptible to similar age changes as other skeletal muscles

Acredita-se que nos humanos, o ligamento vocal se desenvolva após o nascimento. No entanto, não há consenso na literatura sobre qual a faixa etária de seu aparecimento. Muitos estudos indicam que no neonato, a lâmina própria da prega vocal apresenta-se com algumas fibras esparsas sem uma organização particular. O principal objetivo deste estudo foi obter informação a respeito das fibras colagênicas e do sistema elástico (sob a luz dos conhecimentos atuais sobre a matriz extracelular), na lâmina própria de pregas vocais de fetos no período perinatal. Laringes obtidas por autópsia de fetos entre sete a nove meses foram estudadas através de microscopia de luz e eletrônica de transmissão. Fibras contendo colágeno foram identificadas através do Método da Picrossírius-polarização, fibras do sistema elástico foram descritas utilizando-se o método de Resorcina-fucsina de Weigert após oxidação com oxona. Os resultados histoquímicos coincidem com as observações da microscopia eletrônica, evidenciando populações de fibras de colágeno segregadas em diferentes compartimentos na lâmina própria. Assim, em sua região central as fibras de colágeno se mostraram finas, fracamente birrefringentes de coloração esverdeada, enquanto que as regiões superficiais e profundas apresentaram fibras grossas de colágeno com forte birrefringência de cor vermelho-amarelada, quando estudadas através do método da Picrossírius-polarização. Estas características sugerem que as fibras finas da região central são compostas principalmente por colágeno tipo III, enquanto o colágeno tipo I predomina nas regiões superficial e profunda, em concordância com as observações da literatura relacionada com o estudo da prega vocal de adultos. Assim como o componente colagênico, as fibras do sistema elástico mostraram uma distribuição diferencial ao longo da lâmina própria. Em certo sentido, esta distribuição é complementar àquela das fibras de colágeno: a região central, na qual fibras colagênicas eram escassas e finas, apresentou maior densidade de fibras do sistema elástico, em comparação às regiões superficial e profunda. Assim, a presença de um padrão de distribuição diferencial das fibras da matriz extracelular na prega vocal humana fetal equivalente à descrição clássica do ligamento vocal adulto nos permitiu concluir que o ligamento vocal já está presente ao nascimento. As implicações funcionais destes achados foram discutidas. O conceito corrente de que os estímulos externos, como a fonação, são essenciais para a determinação da estrutura em camadas da lâmina própria, faz com que nossos resultados sejam surpreendentes ao evidenciar a presença de uma distribuição complexa e organizada dos componentes do tecido conjuntivo na lâmina própria de pregas vocais de fetos no período perinatal. A idéia de que a contribuição genética poderia desempenhar um papel importante na organização destas camadas, independentemente do estímulo mecânico, poderia explicar melhor a presença das estruturas observadas já ao nascimento, uma vez que o mecanismo genético pode agir antes de qualquer estímulo mecânico externo, como a fonação. / It is currently believed that, in humans, the vocal ligament develops after birth. However, there is no consensus in the literature about the age of its surge. Most papers describe that in the newborn, the lamina propria shows the presence of some sparse fibers without any particular organization. The main purpose of this study was to obtain information regarding collagenous and elastic system fibers (in the light of the current knowledge on extracellular matrix) in the lamina propria of fetal vocal fold. Larynges obtained from autopsy of human fetuses aged seven to nine months were studied by means of light and electron microscopy. Collagen containing fibers were assessed by the Picrosirius-polarization method, elastic system fibers were described using Weigert\'s resorcin-fuchsin with previous oxidation with oxone. The histochemical results coincide with the electron microscope observations in showing collagen populations segregated into different compartments of the lamina propria. Thus, in its central region the collagen shows up as thin, weakly birefringent, greenish fibers while the superficial and deep regions consist of thick collagen fibers which display a strong birefringence of red or yellow color when studied with the aid of the Picrosirius-polarization method. These characteristics strongly suggest that the thin fibers in the central region are composed mainly of type-III collagen, whereas type-I collagen predominates in the superficial and deep regions, in agreement with the observations in the literature pertaining to studies of adult vocal folds. As well as collagen, the elastic system fibers show a differential distribution throughout the lamina propria. This distribution is complementary, in a sense, to that of the collagen fibers: the central region, with thin collagenous fibers, presents the greatest density of elastic system fibers in comparison to the superficial and deep regions. Thus, the presence of a differential distribution of the extracellular matrix fibers in the fetal vocal fold equivalent to the classical description of the adult vocal ligament allowed the conclusion that a vocal ligament is already present in the newborn. The functional implications of the foregoing findings are discussed. Current ideas sustaining that stimuli like phonation are essential to the determination of the layered structure of the lamina propria would make it surprising that a newborn baby could present a complex and organized distribution of connective tissue components as our results show to be the case. The idea that genetic contrivance instead should play a role in the organization of these layers seems to explain better the observed structures once it would act before any mechanical stimulus similar to phonation could take place.

INTRODUÇÃO: A importância da resposta mecânica do parênquima pulmonar na fisiopatologia da asma tem sido recentemente reconhecida. O óxido nítrico é um mediador que controla o tônus muscular liso das vias aéreas, porém este efeito no parênquima pulmonar periférico ainda não foi previamente investigado. Nossa hipótese é que a inibição crônica das óxido nítrico sintases por meio do tratamento com L-NAME (falso substrato para todas as óxido nítrico sintases) pode modular a mecânica do parênquima pulmonar, o recrutamento eosinofílico e o remodelamento da matriz extracelular em modelo de inflamação alérgica crônica pulmonar em cobaias. MÉTODOS: Os animais foram expostos a sete inalações com soro fisiológico ou com ovoalbumina em doses crescentes (1~5mg/ml - 4 semanas) e tratadas ou não com L-NAME (60 mg/kg/ por dia /por animal) na água de beber. Setenta e duas horas após a sétima inalação os animais foram anestesiados, exsanguinados e a mecânica oscilatória do parênquima pulmonar foi medida na condição pré e após desafio (0.1%). Utilizando a técnica de morfometria foram avaliadas a densidade de eosinófilos, o número de células nNOS e iNOS positivas, a densidade de actina, das fibras colágenas e das fibras elásticas bem como a proporção de volume de 8-iso-PGF2 no septo alveolar. RESULTADOS: Os animais que foram expostos à ovoalbumina apresentaram um aumento da resistência e da elastância tecidual (resposta basal e após desafio antigênico), na densidade de eosinófilos, no número de células nNOS e iNOS positivas, na densidade de fibras colágenas e de fibras elásticas bem como na expressão de 8-isoPGF2 no septo alveolar comparativamente aos grupos controles (p<0,05). O tratamento com L-NAME em animais expostos à ovoalbumina atenuou todas as respostas de mecânica do tecido pulmonar periférico (p<0, 01), reduziu o número de células nNOS e iNOS positivas (p<0.01), o conteúdo de fibras elásticas (p<0,001) e de 8-iso-PGF2 no septo alveolar (p<0,001). No entanto, este tratamento não afetou o número total de eosinófilos e o conteúdo de fibras colágenas. Este trabalho sugere que o óxido nítrico contribui para a constrição do parênquima pulmonar e para a deposição de fibras elásticas neste modelo. Estes efeitos foram associados à ativação de iNOS e nNOS em células do parênquima distal e aumento na via do estresse oxidativo / The importance of lung tissue mechanical responses in asthma pathophysiology has been recently recognized. Although nitric oxide (NO) is a mediator that controls smooth muscle tonus control in the airways, its effects on lung tissue responsiveness has not been previously investigated. We hypothesized that chronic nitric oxide synthase inhibition by L-NAME (false substrate for all nitric oxide synthases) treatment may modulate lung tissue mechanics, eosinophilic recruitment and extracellular matrix remodeling in a model of chronic pulmonary allergic inflammation. Guinea pigs were submitted to seven normal saline or ovalbumin exposures with increasing doses (1~5mg/mL-4weeks) and treated or not with L-NAME in drinking water. Seventy-two hours after the seventh inhalation the animals were anesthetized, exsanguinated, and oscillatory mechanics of lung tissue strips was performed in baseline condition and after ovalbumin challenge (0.1%). Using morphometry, we assessed the density of eosinophils, the number of iNOS and nNOS-positive cells, the density of actin, the collagen and elastic fibers content and the volume proportion of 8-iso-PGF2 in the alveolar septa. Ovalbumin-exposed animals presented an increase in baseline and maximal tissue resistance and elastance responses, eosinophil density, in the number of iNOS and nNOS positive cells, in the amount of collagen and elastic fibers and in the volume proportion of 8-iso-PGF2 in the alveolar septa compared to controls (p<0.05). L-NAME treatment in ovalbumin-exposed animals attenuated all lung tissue mechanical responses (p<0.01), reduced the number of iNOS and nNOS positive cells (p<0.01), elastic fiber content (p<0.001) and 8-isoPGF2 in the alveolar septa (p<0.001). However, this treatment did not affect the total number of eosinophils and collagen deposition. These data suggest that NO contributes to distal lung parenchyma constriction and to elastic fibers deposition in this model. These effects were associated to iNOS and nNOS activation in pulmonary parenchyma and with an increase in oxidative stress pathway activation