During zebrafish gastrulation, highly coordinated cellular rearrangements lead to the formation of the three germ layers, ectoderm, mesoderm and endoderm. Recent studies have identified silberblick (slb/wnt11) as a key molecule that regulates gastrulation movement through a conserved pathway, which shares significant similarity with a signalling pathway that establishes epithelial planar cell polarity (PCP) in Drosophila (Heisenberg et al., 2000; Veeman et al., 2003), suggesting a role for cell polarity in regulating gastrulation movements. However, the cellular and molecular mechanisms by which slb/wnt11 functions during zebrafish gastrulation are still not fully understood. In the first part of the thesis, the three-dimensional movement and morphology of individual cells in living embryos during the course of gastrulation were recorded and analysed using high resolution confocal microscopy. It was shown that in slb/wnt11 mutant embryos, hypoblast cells within the forming germ ring display slower, less directed migratory movements at the onset of gastrulation, which are accompanied by defects in the orientation of cellular processes along the individual movement directions of these cells. The net movement direction of the cells is not changed, suggesting that slb/wnt11-mediated orientation of cellular processes serves to facilitate and stabilize cell movements during gastrulation. By using an in vitro reaggregation assay on mesendodermal cells, combined with an analysis of the endogenous expression levels and distribution of E-cadherin in zebrafish embryos at the onset of gastrulation, E-cadherin mediated adhesion was found to be a downstream mechanism regulating slb/wnt11 function during gastrulation. Interestingly, the effects of slb/wnt11 on cell adhesion appear to be dependent on Rab5-mediated endocytosis, suggesting endocytic turnover of cell-cell contacts as one possible mechanism through which slb/wnt11 mediates its effects on gastrulation movements. - Die Druckexemplare enthalten jeweils eine CD-ROM als Anlagenteil: QuickTimeMovies (ca. 23 MB)- Übersicht über Inhalte siehe Dissertation S. 92 - 93"

Endocytose joue un rôle dans l'activation du récepteur Notch. Des mutations dans le gène drosophilien lethal giant discs (lgd), provoque une prolifération cellulaire en perturbant l'endocytose de Notch. Les orthologues murins mlgd1 et 2 peuvent sauver ce phénotype, démontrant une fonction conservée. Cependant, des publications récentes suggèrent que les orthologs humains de lgd (hgd1/2) sont nucléaires. Dans cette étude, il est démontré que chez la Drosophile, le mutant dlgd(08) provoque l'accumulation de Notch dans des vésicules et une surprolifération de neuroblastes . Ceci suggère que Notch est activé a l'intérieur des endosomes dans les neuroblastes. L'immunohistochimie de cellules Hela indique que hlgd1 et 2 ne sont pas nucléaires, mais associés à des strctures endosomales. Enfin, la baisse d'expression par shRNA des gènes murins mlgd1 et mlgd2 provoque une différenciation accélérée des cellules souches hématopoïétiques dans la lignée lymphopoïèse T et bloque la transition DN3 / CD4+CD8+, suggérant une suractivation de Notch. / Endocytosis plays a role in the activation of the Notch receptor. Mutations in the Drosophila gene lethal giant discs (lgd), causes cellular overgrowth by perturbing Notch endocytosis. This Drosophila phenotype is rescued by the murine orthologs mlgd1 and 2, indicating conserved function. However, recent publications suggest that the human orthologs (hlgd1/2) are nuclear. This study demonstrates that the dlgd(08) mutant in Drosophila causes accumulation of Notch in vesicles and the overproliferation of neuroblasts. This suggests Notch is activated from within endosomes in neuroblasts. Immunohistochemistry of Hela cells indicates that hlgd1 is associated with early endosome while, hlgd2 with later endosome and lysosome, and not with the nucleus. Finally, down regulation of murine mlgd1 and mlgd2 by shRNA caused an accelerated differentiation of hematopoietic stem cell into the T lymphopoiesis lineage and blocked the DN3 to CD4+CD8+ transition, suggesting that Notch is overactivated in these cells.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'infection par le virus de l'hépatite C (HCV) reste aujourd'hui une cause majeure d'hépatite chronique, de cirrhose du foie et de carcinome hépatocellulaire. L'attachement cellulaire et l'entrée de HCV sont médiés par les protéines d'enveloppe E1 et E2. De nouveaux récepteurs ont été récemment identifiés mais l'entrée du virus dans les hépatocytes reste énigmatique et n'a jamais été visualisée. Nous avons tout d'abord caractérisé le modèle des pseudo-particules HCV (HCVpp) encryomicroscopie électronique en transmission (cryo-MET). Ce sont des particules sphériques de 100 nm de diamètre portant à leur surface E1 et E2. Nous avons ensuite visualisé l'entrée des HCVpp dans les hépatocytes en MET conventionnelle en utilisant des lignées d'hépatome et des hépatocytes primaires humains(PHH). Ces derniers maintiennent leur polarité en culture comme en témoigne la persistance de canalicules biliaires, tels que dans les hépatocytes natifs. Après synchronisation à 4°C avec les cellules, les HCVpp sont retrouvées liées aux prolongements cellulaires via des 'piliers', et sont ensuite internalisées à 37°C par endocytose dépendante de la clathrine. Ces 'piliers', actuellement en cours d'identification par immunomarquages, sont internalisés avec les HCVpp dans les hépatocytes au sein de vésicules de clathrine ; ce suivi est effectué par des approches de congélation haute pression et de tomographie électronique. Enfin, les évènements d'endocytose des HCVpp dans les PHH se sont avérés rares, avec une cinétique ralentie comparée aux lignées cellulaires. Ces études en MET soulignent l'importance d'utiliser un modèle cellulaire physiologique polarisé pour l'étude du mécanisme d'entrée de HCV. / Hepatitis C virus (HCV) infection is a major cause of chronic hepatitis, liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Receptor recognition, cell binding and membrane fusion rely on HCV envelope proteins E1 and E2. New receptors were recently discovered; however HCV entry into hepatocytes remains largely unknown and has not yet been visualized. At first, we characterized HCV pseudoparticles (HCVpp) by cryo-transmission electron microscopy (cryo-TEM). They appeared as regular spherical structures of ca. 100-nm, with E1 and E2 at their surface. By conventional TEM, we then visualized HCVpp entry into hepatocytes, using hepatoma cells and primary human hepatocytes (PHH) as a more physiological cell model.PHH maintain their polarity in culture as attested by TEM observation of persistent bile canaliculi. At 4°C, viral particles were primarily found attached to microvilli at the cell surface via molecular bridges and, after warming to 37°C, they were internalized by endocytosis in clathrin-coated pits and vesicles. Using freeze substitution and electron tomographyapproaches, these bridges were found intimately surrounding HCVpp inside the clathrincoated vesicles, suggesting a concomitant internalization. The nature of these bridges is currently under investigation by immunogoldlabeling approaches. Finally, we reproducibly observed less HCVpp internalization events in PHH compared to hepatoma cells, and the kinetics of these events seemed delayed, probably due to PHH polarity. To conclude, ourTEM approach proved powerful to visualize HCV entry, and highlights the importance of studying a physiological cell model to understand HCV entry mechanism.

Les contacts cellulaires sont formés par l'association et la clusterisation des molécules d'adhésion, qui agissent comme des unités d'organisation et de signalisation, garantissant la cohérence et la plasticité des tissus. Bien que les détails moléculaires des complexes d'adhésion soient bien caractérisés, la façon dont ces unités d'adhérence supramoléculaires sont organisés et régulées dans les conditions physiologiques est méconnue. Nous avons développé et appliqué la microscopie super-résolue et une analyse quantitative pour caractériser l'organisation nanométrique de la E-cadhérine dans le tissu épithélial de l'embryon de drosophile. Les molécules individuelles de la E-cadhérine sont localisées en 3D avec une précision de 30 et 100 nm dans des directions latérale et axiale, respectivement. Nous avons constaté que la E-cadhérine existe soit sous forme de monomères ou d'oligomères, contenant jusqu'à une centaine de molécules. La distribution de taille des clusters suit une loi de puissance (sans taille caractéristique). L'analyse de la répartition de clusters à différentes étapes de la morphogénèse indique que l'état d'agrégation est dicté par la concentration de la E-cadhérine aux jonctions. Pour tenter de déterminer comment la clusterisation de la E-cadhérine est régulée, nous avons perturbé l'endocytose et l'ancrage de la E-cadhérine à l'actine, et analysé l'état de clusterisation. / Cell-cell contacts form through binding and clustering of adhesion molecules, which act as organizational and signaling units and ensure coherence and plasticity of tissues. While the molecular details of adhesion complexes are well characterized, little is known about how these supramolecular adhesion units are organized and regulated in physiological conditions. We developed and applied superresolution microscopy and quantitative analysis to characterize the nanoscale organization of E-cadherin clusters in the early epithelial tissue of Drosophilaembryos. E-cadherin molecules at adherens junctions were localized in 3D with precision of 30 and 100 nm in lateral and axial directions, respectively. We found that E-cadherin exists either as monomers or oligomeric clusters, containing up to one hundred molecules. The cluster size distribution follows a power law - referred as scale free with no characteristic size. Analysis of clustering distribution at different stages of tissue morphogenesis indicates that the state of aggregation is dictated by the junctional concentration of E-cadherin. In an attempt to determine how E-cadherin clustering might be regulated, we perturbed endocytosis and anchoring of E-cadherin to actin, and analyzed the state of E-cadherin clustering. While blocking dynamin-dependent endocytic pathways yields increases of junctional E-cadherin concentration and promotes macroscopic aggregates, RNAi knockdown of α-catenin and Par-3 reduces E-cadherin concentration and changes significantly the organization of E-cadherin.

Les épithéliums jouent le rôle fondamental de barrière physique et chimique chez les Métazoaires. Les jonctions adhérentes, par le biais de la protéine transmembranaire E-cadhérine (E-cad), assurent une grande partie de l’adhésion intercellulaire. Malgré cette robustesse, les épithéliums peuvent subir des remodelages considérables pendant l’embryogenèse ou la cicatrisation. Lors de la gastrulation de l’embryon de Drosophile, l’épithélium ventro-latéral (la bandelette germinale) subit une élongation le long de l’axe antéropostérieur induite par l’intercalation cellulaire. Le remodelage polarisé des jonctions cellulaires est à la base de ce phénomène: les jonctions parallèles à l’axe dorsoventral (DV) rétrécissent et forment de manière irréversible de nouvelles jonctions parallèles à l’axe antéropostérieur (AP). Ce remodelage dépend de l’enrichissement du moteur moléculaire Myosine II (MyoII) dans les jonctions DV, qui induit une anisotropie de tension. Les protéines des jonctions adhérentes (E-cad, β-catenin) sont, elles aussi, polarisées : elles sont enrichies dans les jonctions AP. Néanmoins, nous ne savions pas si cette polarité de l’adhésion avait un rôle dans le remodelage des jonctions, et nous ne connaissions pas les mécanismes contrôlant cette localisation asymétrique. L’un des mécanismes les mieux connus de la modulation de l’adhésion cellulaire est l’endocytose des protéines d’adhésion. A ce titre, je me suis intéressé au rôle de l’endocytose Clathrine dépendante (ECD) pendant l’intercalation cellulaire. J’ai ainsi pu montrer que l’ECD de E-cad est régulée à la hausse dans la bandelette germinale au niveau jonctionnelle, plus particulièrement au niveau des jonctions DV (qui rétrécissent). L’ECD d’E-cad est nécessaire à l’intercalation et à la distribution polarisée d’E-cad. Elle est régulée par l’organisation de l’actine: la formine Diaphanous ainsi que le moteur moléculaire Myosine II accélèrent le recrutement de la machinerie d’endocytose (AP2 et Clathrine) et régulent la polarité de l’ECD dans l’embryon. Elles sont contrôlées par RhoGEF2, qui est enrichie dans les jonctions DV, et induisent l’endocytose par un mécanisme de clustering latéral d’E-cad. Dans la seconde partie de ma thèse, je me suis intéressé au couplage entre E-cad et la dynamique de MyoII. En effet, l’intercalation dépend aussi de flux contractiles de MyoII qui ont lieu préférentiellement en direction des jonctions DV. J’ai ainsi pu montrer que la direction des flux est induite par les anisotropies de forces d’ancrage de MyoII. Les faibles niveaux d’E-cad et le fort taux d’endocytose dans les jonctions DV augmentent la probabilité de générer une anisotropie d’ancrage et induisent davantage de flux de MyoII vers les jonctions DV. Ce projet met en lumière le rôle fondamental du couplage entre E-cad et MyoII dans la régulation de la morphogenèse. / Epithelia build up strong mechanical and chemichal barriers in Metazoans. Adherens junctions, through the adhesion provided by the transmembrane protein E-cadherin (E-cad), are essential for the mechanical integrity of the tissue. Yet, epithelia can be dramatically remodeled during embryogenesis or wound healing. During gastrulation of Drosophila embryo, the ventrolateral epithelium (the germ band) undergoes a massive elongation along the anteroposterior (AP) axis, driven by cell-cell intercalation. This is based on the polarized remodeling of intercellular junctions whereby junctions parallel to the dorsoventral axis (DV) shrink and form new junctions along AP axis. This remodeling is mediated by the planar polarized enrichment of Myosin II (MyoII) in DV junctions, which generates high tension. Adhesion proteins are also planar polarized, E-cad is enriched in AP junctions, but we did not know if this polarity contributed to cell-cell intercalation and the mechanism driving this polarity. As such, I have studied the role of Clathrin mediated endocytosis (CME) during germ band extension. I have shown that E-cad CME is specifically upregulated at the junction plane in the germ band, and planar polarized (enriched in DV shrinking junctions). It is required for cell-cell intercalation and the planar polarized distribution of E-cad. E-cad CME is regulated by the concerted action of the Formin Diaphanous and Myosin-II, which accelerates CME through the lateral clustering of E-cad. They are controlled by RhoGEF2, which is also enriched in DV junctions. In the second part of my PhD, I have studied the coupling between E-cad and MyoII dynamics. Indeed, planar polarized contractile flows of MyoII are required for DV junction shrinkage, but we did not know the mechanism driving the polarity of these flows. I have shown that the transient anisotropy of anchoring forces between two facing junctions triggers flow. As such, the low steady state amount of E-cad and the high rate of CME in DV junctions trigger more anisotropy and polarize the flow. These results outline the strong crossregulation between E-cad and MyoII and their concerted action in morphogenesis.

Le recyclage de récepteurs et de lipides vers la membrane plasmique, est un processus finement régulé, essentiel pour l’homéostasie de la membrane plasmique et pour la migration cellulaire. Il requière l’intervention des petites GTPases de la famille Rabs et leurs effecteurs. La protéine MICAL-L1, effecteur de plusieurs Rabs, comme Rab 8, 11, 13 et 35, a été impliquée dans le recyclage vers la membrane plasmique. Dans cette étude, nous avons identifié une nouvelle interaction entre MICAL-L1 et la PACSINE3, une protéine à domaine F-BAR capable de façonner les membranes intracellulaires et qui contribue à la génération d’endosomes de recyclage tubulaires. MICAL-L1 est nécessaire pour la localisation de la PACSINE3 au niveau des membranes des endosomes. La perturbation du complexe MICAL-L1/PACSINE3 affecte le recyclage du récepteur de la transferrine (TfR) vers la membrane plasmique. Le complexe MICAL-L1/PACSINE3 est associé à des longs tubules membranaires contenant la transferrine comme cargo. La dynamique de ségrégation et de détachement des cargos Tf à partir des tubules contenant MICAL-L1 et PACSINE3, suggère que ce complexe contrôle le tri/adressage des endosomes de recyclage vers la membrane plasmique. Notre travail révèle un nouveau mécanisme de régulation de la voie de recyclage vers la surface cellulaire. / The recycling to the plasma membrane of receptors and lipids is tightly regulated and is essential for PM homeostasis, adhesion and cell migration. It requires small GTPase Rab proteins and their effectors. The MICAL-L1 protein, an effector of several Rabs including Rab 8, 11, 13 and 35, has been shown to play an important role in the recycling. Here, we report a novel interaction between MICAL-L1 and the BAR domain containing protein PACSIN3/Syndapin3 that contributes to generate tubular recycling endosomes. MICAL-L1 is required for the localization of PACSIN3 to endosomal membranes. Importantly, disruption of MICAL-L1/PACSIN3 interaction promotes the transferrin receptor (TfR) delivery back to the plasma membrane. The MICAL-L1/PACSIN3 complex accumulates in elongated tubules that contain transferrin carriers. The dynamic of transferrin positive endosomes segregation from MICAL-L1/PACSIN3 tubules suggests that MICAL-L1/PACSIN3 complex controls TfR recycling endosomes delivery to the plasma membrane. Our data provide novel mechanistic insights on the dynamical regulation of the plasma membrane recycling pathway.

L’invasion cellulaire est un phénomène clé du développement tumoral au cours duquel les cellules réalisent une transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) caractérisée par des changements d’expression de gènes clés dans la régulation de l’adhérence et de la morphologie cellulaire. L’expression de ces gènes est sous le contrôle de voies de signalisation, qui lors du processus de tumorigenèse sont dérégulées. La dérégulation de ces voies est multifactorielle et peut-être initiée par une activation de récepteurs présents à la membrane plasmique.Dans ce contexte, nous avons mis en évidence que les flotillines sont d’importants régulateurs de l’activation de ces récepteurs et des voies de signalisation en aval qui conduisent à l’induction de la TEM. Les flotillines 1 et 2 sont des protéines ubiquitaires très conservées. Le niveau d’expression des flotillines est accru dans de nombreux cancers invasifs et ceci est un facteur de mauvais pronostic. En condition physiologique, non surexprimées, les flotillines sont majoritairement à la membrane plasmique. Surexprimées les flotillines induisent la formation d’endolysosomes ayant une faible activité de dégradation, dans lesquels elles sont retrouvées.Mes travaux montrent que l’augmentation de l’expression des flotillines dans des cellules normales mammaires est suffisante pour induire le processus de TEM, processus clé de l’invasion tumorale. De plus nous montrons que la surexpression des flotillines génère une voie de trafic vésiculaire que nous nommons UFIT (Upregulated flotillin Induced Trafficking pathway) et qui affecte le trafic de plusieurs récepteurs membranaires connus pour participer à l’activation des voies oncogéniques inductrices de la TEM. Dans le cas particulier d’un de ces récepteurs, AXL, cible thérapeutique dans les cancers du sein, nous montrons que la surexpression des flotillines régule son endocytose et l’adresse dans les endosomes de signalisation riches en flotillines tout en le protégeant de la dégradation. Ces travaux apportent donc des explications nouvelles quant au rôle des flotillines dans le processus d’invasion cellulaire conduisant à la formation des métastases. / Tumor cell invasion and consecutive metastasis formation are the main cause of death in cancer patients. One crucial process of tumor cell invasion is the epithelial to mesenchymal transition (EMT), a reversible process during which polarized epithelial cells convert into motile mesenchymal cells. This process is characterized by gene expression changes involved, in particular, in the perturbation of cell adhesion, polarity and cytoskeletal structures.Flotillin 1 and 2 are two ubiquitous and highly conserved membrane proteins that assemble in large oligomers, known to participate in membrane protein clustering and endocytosis. Flotillins are upregulated in many invasive cancers and are considered as markers of poor prognosis. At physiological expression level, flotillins are mainly located at the plasma membrane. The cellular distribution of upregulated flotillins is dramatically modified with a strong enrichment in vesicular compartments that we characterized as non-degradative-endolysosomes.During my PhD project, we identified that flotillins are key EMT inducer. We upregulated flotillins in normal mammary cells and demonstrated that it is sufficient to promote EMT. Using several global comparative analyses (transcriptomic, phosphokinase arrays), we showed that flotillin upregulation activates key oncogenic signaling pathways and plasma membrane receptors. We identified that flotillin overexpression induces a trafficking pathway that we named UFIT-pathway (Upregulated flotillin Induced Trafficking pathway), which promotes the endocytosis of several cargos, amongst them membrane receptors involved in the activation of oncogenic pathways.Our results suggest that the UFIT pathway generates flotillin-positive endolysosomes acting as as “signalosome compartments” involved in the activation of signaling pathways stimulating EMT and cellular invasion.

J’ai effectué ma thèse dans le groupe du Dr. Marie-Odile Fauvarque qui met en œuvre des stratégies de génétique moléculaire sur des modèles de cellules humaines et chez la mouche drosophile pour l'étude de la fonction des protéines dans la signalisation intracellulaire. Dans ce contexte, mes travaux visaient à produire des connaissances fondamentales sur le système ubiquitine dans le contrôle du trafic endocytaire, en particulier de récepteurs membranaires impliqués dans la réponse inflammatoire (TNFR, ILR) ou la différenciation et la croissance cellulaire (EGFR). Je me suis notamment intéressée au rôle du complexe formé par l’interaction entre une protéine de la voie endocytaire, CHMP1B, et la protéase d’ubiquitine UBPY (synonyme USP8). CHMP1B est un membre de la famille ESCRT-III qui, via des processus de changements de conformation et de polymérisation à la membrane, contrôle la biogenèse des vésicules intraluménales (ILVs) au niveau des endosomes tardifs pour former les corps multivésiculaires (MVBs). Ces derniers fusionnent avec les lysosomes, assurant ainsi la protéolyse des récepteurs internalisés et l‘arrêt de la signalisation intracellulaire. Alternativement, les récepteurs peuvent être renvoyés à la membrane plasmique à partir des endosomes précoces ou tardifs via des vésicules de recyclage. Le trafic intracellulaire et le tri des récepteurs dans ces différents compartiments subcellulaires jouent un rôle majeur dans l’activation, la durée et la terminaison des signaux intracellulaires. Or, la liaison covalente d’une ou plusieurs ubiquitine (un polypeptide très conservé de 76 aminoacides) au niveau des récepteurs est un signal majeur déclenchant leur internalisation. En hydrolysant cette ubiquitine, UBPY peut stopper l’internalisation des récepteurs au niveau de la membrane plasmique, ou bien, favoriser leur entrée dans le MVB. UBPY jouerait ainsi deux rôles opposés sur la stabilité des récepteurs selon son niveau d’action dans la cellule. L’interaction entre CHMP1B et UBPY avait été décrite dans la littérature chez la levure ou par co-immunoprécipitation à partir de lysat cellulaires. Cependant, les travaux de l’équipe montraient l’absence d’interaction forte entre les domaines d’interaction de ces deux protéines in vitro et par ailleurs, la fonction de cette interaction dans le processus d’endocytose n’avait été que partiellement élucidée. J’ai confirmé l’existence du complexe CHMP1B-UBPY in cellulo qui se localise essentiellement au niveau des endosomes tardifs. J’ai déterminé la région impliquée dans cette interaction et prouvé que l’existence de ce complexe permet de stabiliser les deux protéines dans les cellules. J’ai ensuite démontré l’existence de formes ubiquitinées monomériques et dimériques de CHMP1B dans lesquelles la liaison d’une molécule d’ubiquitine sur une des deux lysines d’une boucle flexible de la protéine induit un probable changement de conformation. De plus, UBPY hydrolyse cette ubiquitine et favorise l’accumulation d’oligomères de CHMP1B qui sont dépourvues d’ubiquitine. Finalement, le traitement des cellules par l’EGF, qui se lie à l’EGFR et provoque son internalisation, induit le recrutement transitoire des dimères ubiquitinés de CHMP1B aux membranes. L’analyse du trafic intracellulaire de l’EGFR et de la morphogenèse de l’aile de drosophile dans différents contextes génétiques a également prouvé que la forme ubiquitinée de CHMP1B est essentielle à sa fonction. L’ensemble de mes travaux m’autorisent à formuler une hypothèse complètement nouvelle dans laquelle l’ubiquitination de CHMP1B induit une conformation ouverte de la protéine incapable de polymériser qui est recrutée sous forme de dimères à la membrane des endosomes où la présence d’UBPY induit la deubiquitination et la polymérisation concomitante de CHMP1B, très probablement en hétéro-complexes avec d’autres membres de la famille ESCRT-III agissant de concert pour la déformation et la scission des membranes. / I did my thesis in the group of Dr. Marie-Odile Fauvarque who implements strategies of molecular genetics on human cell culture models and in the Drosophila fly for the identification and study of the function of proteins in intracellular signaling. In this context, my work aimed to produce fundamental knowledge about the ubiquitin system in the control of the endocytic trafficking, in particular of membrane receptors involved in the inflammatory response (TNFR, ILR) or cell differentiation and growth (EGFR). I was particularly interested in the role of the complex formed by the interaction between an endocytic protein, CHMP1B, and the ubiquitin protease UBPY (synonym USP8). CHMP1B is a member of the ESCRT-III family that controls the biogenesis of intraluminal vesicles (ILVs) at the late endosomes to form multivesicular bodies (MVBs) Conformational change and polymerization at lipidic membrane processes are needed for CHMP1B function. MVBs fuse with the lysosomes, thus ensuring the proteolysis of the internalized receptors and the stoppage of the intracellular signaling. Alternatively, the receptors may be returned to the plasma membrane from early or late endosomes via recycling vesicles. Intracellular trafficking and receptor sorting in these different subcellular compartments play a major role in the activation, duration and termination of intracellular signals. The covalent bond of one or more ubiquitin (a highly conserved polypeptide of 76 amino acids) at the receptors is a major signal triggering their internalization. By hydrolyzing this ubiquitin, UBPY can stop the internalization of receptors at the plasma membrane, or promote their entry into the MVB. UBPY would thus play two opposing roles on the stability of the receptors depending on its level of action in the cell. The interaction between the two proteins CHMP1B and UBPY had been described in the literature in the two-hybrid system in yeast or by co-immunoprecipitation from cell lysates. However, the team's work showed no strong interaction between the domains of interaction of these two proteins in vitro and the function of this interaction in the endocytosis process had only been partially elucidated.During my thesis, I confirmed the existence of the CHMP1B-UBPY in cellulo complex, which is located mainly at the level of late endosomes. I determined the region involved in this interaction and proved that the existence of this complex makes possible the stabilization of both proteins into the cells. I then demonstrated the existence of monomeric and dimeric ubiquitinated forms of CHMP1B in which the binding of a molecule of ubiquitin to one of the two lysines of a flexible loop of the protein likely induces and/or stabilize a conformational conformation. In addition, UBPY hydrolyses this ubiquitin and promotes the accumulation of CHMP1B oligomers which are devoid of ubiquitin. Finally, the treatment of cells by EGF, which binds to EGFR and causes its internalization, induces transient recruitment of ubiquitinated CHMP1B dimers to the membranes. Analysis of the intracellular trafficking of EGFR and the morphogenesis of Drosophila wing in different genetic contexts has also shown that the ubiquitination of CHMP1B is essential to its function. My work has allowed me to formulate a completely new hypothesis in which the ubiquitination of CHMP1B induces an open conformation of the protein incapable of polymerizing in this state which is recruited in the form of dimers to the membrane of the endosomes and there the presence of UBPY induces the deubiquitination and the concomitant polymerization of CHMP1B, most probably in hetero-complexes with other members of the ESCRT-III family acting in concert for deformation and scission of the membranes.

Les voies d'endocytose chez l'amibe Dictyostelium discoideum ont été explorées en étudiant l'acidification des compartiments endocytaires et en caractérisant l'action de la caféine et de la cycloheximide, deux inhibiteurs qui ne modifient pas le métabolisme énergétique de la cellule.<br />Le dextran marqué par l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC dextran) a été employé comme sonde de phase fluide. Dictyostelium montre une internalisation de fluide plus active dans un milieu nutritif que dans un milieu non nutritif. Dans les deux cas, une cinétique biphasique est observée avec une première phase linéaire en fonction du temps, suivie d'un plateau qui correspond à l'équilibre dynamique entre l'entrée et la sortie de fluide. Les cinétiques sont modélisables sur la base d'un compartiment endocytaire unique. L'activité pinocytaire diminue avec la température avec une énergie d'activation de 27 kcal/mol.<br />Le FITC dextran a été utilisé comme sonde de pH. Au plateau de pinocytose, le compartiment endosomal est à une valeur moyenne de pH 5,8 (+/- 0,2) qui est indépendante du pH extracellulaire. Les bases faibles et d'autres agents comme la monensine ou le carbonyl cyanide m-chloro phenylhydrazone, diminuent l'acidité du compartiment endosomal. La détermination du pH endosomal pendant les phases initiales (t<15 min) met en évidence un compartiment plus acide que le compartiment endosomal majeur. Le pH endosomal reste constant pendant l'engagement de la différenciation induite par une carence nutritionnelle. <br />La caféine inhibe de façon immédiate toutes les activités endocytaires chez l'amibe Dictyostelium : la pinocytose de phase fluide, la phagocytose et la sécrétion des enzymes lysosomales. La caféine est aussi un inhibiteur de la croissance axénique dans la même gamme de concentrations que celles qui inhibent l'endocytose. D'autres méthylxanthines, comme la théobromine, la théophylline ou la paraxanthine sont sans effet sur l'endocytose ou la croissance de Dictyostelium. L'hypothèse pour expliquer l'effet inhibiteur de la caféine est une perturbation de l'homéostasie du Ca2+ intracellulaire.<br />La cycloheximide est un inhibiteur de la synthèse protéique chez les eucaryotes. Après une phase de latence d'environ 10 minutes, la cycloheximide bloque toutes les activités endocytaires chez l'amibe Dictyostelium. D'autres inhibiteurs de la synthèse protéique des cellules eucaryotes qui possèdent des modes d'action et des structures différents, tels que l'anisomycine, l'émétine, la pactamycine et la puromycine inhibent aussi l'endocytose. L'hypothèse envisagée pour rendre compte de l'inhibition de l'endocytose par les inhibiteurs de la synthèse protéique fait intervenir des mécanismes de réponse au stress.