Au cours de l'endocytose, les cargos de membrane plasmique (PM) sont internalisés puis dirigés vers l'endosome précoce (EE), les corps multivésiculaires (MVBs), puis le lysosome/vacuole pour dégradation. Le ciblage des protéines vers les zones invaginées des MVBs requiert l'action des complexes ESCRTs. Chez la levure comme chez les mammifères, les mutants déficients pour ces complexes présentent un compartiment endosomal anormal (Cl E) et une accumulation à la PM de diverses protéines. Nous avons montré que chez S. cerevisiae la stabilisation de la perméase à uracile (Fur4p) à la PM dans les mutants ESCRTs résulte de son recyclage vers la PM après internalisation. Fur4p ne traverse pas les compartiments Golgiens lors de son recyclage depuis le compartiment Cl E. Cette voie de recyclage est distincte de celle empruntée par la v-SNARE Snc1p. Fur4p est également capable de recycler depuis l'EE et suit alors la même voie de recyclage que Snc1p. Ceci suggère une complexité inattendue des voies de recyclage chez la levure.<br />Nous nous sommes aussi intéressés à Irs4p et Tax4p, 2 protéines à domaine EH, un domaine trouvé jusqu'alors dans des protéines impliquées dans l'endocytose ou le recyclage. Irs4p et Tax4p ne sont pas impliquées dans ces processus mais interviennent de façon redondante au cours de l'autophagie, un transport catabolique vésiculaire de fractions de cytoplasme ou d'organelles vers le lysosome/vacuole. Irs4p et Tax4p interagissent physiquement avec la machinerie d'autophagie et sont partiellement localisées à la structure Pré-autophagosomale, d'où émanent les vésicules d'autophagie. Ces résultats étendent donc la panoplie des fonctions des protéines à domaine EH.

Le fer est un élément essentiel pour les plantes, mais toxique lorsqu'il est accumulé en excès. Chez Arabidopsis thaliana, le transporteur IRT1 joue un rôle essentiel dans l'acquisition du Fe depuis la solution du sol, en conditions limitantes en cet élément. Le gène IRT1 est régulé transcriptionnellement par le fer conduisant à une accumulation des transcrits IRT1 dans l'épiderme des racines carencées en fer. Par homologie avec les mécanismes décrits pour le transporteur de zinc ZRT1 de levure, une régulation post-traductionnelle d'IRT1, contrôlant la stabilité de celui-ci en présence de fer a été envisagée. IRT1 a donc été utilisé comme modèle pour caractériser le système endocytique des plantes. Nos travaux révèlent que la protéine IRT1 est localisée au niveau des endosomes précoces (TGN/EE) des cellules de poils racinaires. Des approches pharmacologiques ont permis de révéler un cyclage d'IRT1 entre la membrane plasmique et le TGN/EE ainsi qu'une dégradation vacuolaire. Nous avons également pu montrer que l'internalisation et la dégradation d'IRT1 ne sont pas affectées par la disponibilité en fer et sont sous le contrôle de la monoubiquitination de résidus lysines présents dans les parties cytosoliques de la protéine IRT1. Nos travaux suggèrent un modèle où l'internalisation d'IRT1 depuis la membrane plasmique, contrôlée par monoubiquitination, permet aux plantes de se prémunir contre la toxicité des métaux transportés par IRT1. Enfin, nous avons réalisé un crible double hybride en utilisant la boucle cytosolique d'IRT1 afin d'identifier des protéines contrôlant son trafic et/ou sa dégradation. Ce crible a permis notamment l'identification d'une protéine à domaine FYVE, localisée aux endosomes et dont la caractérisation fonctionnelle a été initiée / Iron is an essential element for plants but toxic when present in excess. IRT1 is the major root iron transporter responsible for iron uptake from the soil under iron limitation in Arabidopsis thaliana. IRT1 is transcriptionally regulated by iron, resulting in a high IRT1 expression in iron-starved root epidermal cells. In addition, IRT1 was suggested to be controlled at the post-translational level, with iron affecting IRT1 protein stability, in a similar fashion with the yeast ZRT1 zinc transporter. To shed light on two poorly-understood phenomena in plants, endocytosis and degradation of plasma membrane proteins, we studied the proposed post-translational regulation of IRT1 in Arabidopsis thaliana. Interestingly IRT1 protein is found in early endosomes of root hair cells. Pharmacological approaches reveal that IRT1 cycles back and forth with the plasma membrane to perform iron uptake, and is sent to the vacuole for proper turnover. We also demonstrate that iron nutrition have no effect on the levels and the subcellular localization of IRT1 protein. The internalization of IRT1 is dependent on the monoubiquitination of several cytosol-exposed lysine residues. Together, these data suggest a model where monoubiquitin-dependent endocytosis/recycling of IRT1 keeps the plasma membrane pool of IRT1 low, to better deal with metal uptake. Finally, in order to indentify genes involves in IRT1 endocytosis/recycling and turnover, we perform a yeast two-hybrid screen with IRT1 cytosolic loop. This screen allows the identification of a FYVE domain-containing protein localized in endocytic compartment which functional characterization was initiated.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les récepteurs ionotropiques AMPA (AMPAR) activés par le glutamate sont les principaux acteurs de la transmission synaptique excitatrice rapide du cerveau. Ils jouent également un rôle crucial dans les processus de plasticité synaptique, reconnus pour être à la base des fonctions cognitives. Les récepteurs canaux P2X sont activés par l'adénosine-5'-triphosphate (ATP) extracellulaire libéré par les neurones ou les cellules gliales. Ils sont exprimés dans le cerveau en périphérie des synapses glutamatergiques, où ils participent à l’excitabilité neuronale et modulent la transmission synaptique ainsi que la plasticité synaptique. Bien que la signalisation purinergique ait de multiples effets sur la transmission et la plasticité synaptique, la fonction des récepteurs P2X au niveau des synapses du cerveau reste à établir. Ici, nous montrons dans les neurones d'hippocampe en culture que l'activation des récepteurs P2X postsynaptiques par l'ATP exogène ou via la libération d'ATP endogène par les cellules gliales diminue l'amplitude des courants miniatures et évoqués des AMPAR postsynaptiques. En utilisant des approches d’électrophysiologie, de biochimie et d'imagerie en temps réel, nous démontrons que l'afflux de calcium passant par les canaux P2X déclenche l’internalisation des AMPAR par un mécanisme d’endocytose clathrine et dynamine dépendante. Cette diminution de surface altère par conséquent la transmission synaptique médiée par les AMPAR. Nous avons aussi démontré par des approches moléculaires et pharmacologiques la cascade de signalisation engagée dans l’altération du trafic des AMPAR de surface après activation des récepteurs P2X. Cette inhibition par les récepteurs P2X, serait dépendante de l’activation de kinases et des phosphatases qui régulent le niveau de phosphorylation des AMPAR. Nos travaux de recherche suggèrent ainsi, que les récepteurs postsynaptiques P2X jouent un rôle essentiel dans la régulation de l'expression de surface des AMPAR et régulent ainsi la force et la plasticité synaptique. / Ionotropic AMPA receptors (AMPAR) activated by glutamate are the main actors of the fast excitatory synaptic transmission in the brain. They also play a crucial role in the process of synaptic plasticity that are widely recognized to be the basis cognitive functions. P2X receptors are ATP-gated cation channels widely expressed in the brain where they mediate action of extracellular adenosine-5’-triphosphate (ATP) released by neurons or glia. P2X receptors are located et the periphery of glutamatergic synapses and although purinergic signaling has multiple effects on synaptic transmission and plasticity, the function of P2X receptors at brain synapses remains to be established.Here, we show in cultured hippocampal neurons that activation of postsynaptic P2X receptors by exogenous ATP or glial release of endogenous ATP decreases the amplitude of miniature excitatory postsynaptic currents and AMPA-evoked currents. Using a combination of electrophysiology, surface or internalization assays and real time imaging, we demonstrate that the calcium influx through the ATP-gated channels triggers AMPA receptor internalization through clathrin-mediated dynamin-dependent endocytosis leading to reduced surface AMPA receptors and therefore, altered AMPA-mediated current. We also identified by molecular and pharmacological approaches the signaling cascade involved in the P2X-mediated alteration of surface AMPAR trafficking. P2X-mediated AMPAR internalization is dependent on the activation of kinases CamKII and phosphatases which regulate the phosphorylation level of AMPARs. Our finding indicates that postsynaptic P2X receptors play a critical role in regulating the surface expression of AMPAR and thereby regulate the synaptic strength.

De récentes études ont montré dans les cellules chromaffines que la libération des granules de sécrétion est temporellement et spatialement couplée au processus d’endocytose. Nous avons proposé l’hypothèse que la membrane du granule préserve son intégrité au sein de la membrane plasmique durant l’exocytose avant d’être internalisée ainsi avec ses composants. Cependant, les mécanismes moléculaires de ce processus d’endocytose compensatrice sont encore inconnus. Ainsi, mon projet de thèse vise a répondre à la question suivante : Quels sont les différents mécanismes déclenchant et régulant l’exocytose et l’endocytose compensatrice? Les propriétés physiques des lipides jouent des rôles fondamentaux dans le trafic membranaire. Ils servent de système d’échafaudage pour maintenir la machinerie spécifique à des endroits précis de la membrane plasmique. Par exemple, la formation de microdomaines de gangliosides et de PIP2 au niveau des sites d’exocytose ou encore le mélange de lipides au sein de la bicouche lipidique représentent des processus attractifs pour permettre cette fonction au cours des événements d’exo-endocytose dans les cellules neuroendocrines. De plus, en raison de leur implication importante dans les processus d’exo-endocytose ou dans le remodelage des lipides, l’annexine A2, la synaptotagmine 1, l’oligophrénine1 et la scramblase 1 doivent être considérées comme des signaux potentiels pour le déclenchement de l’endocytose de la membrane granulaire. Au cours de mon doctorat, je me suis intéressée à étudier comment l’exocytose et l’endocytose compensatrice sont régulées par la scramblase1 et l’oligophrénine1 dans les cellules chromaffines de la glande surrénale. / Recent studies in neuroendocrine chromaffin cells have suggested that the secretory granule release is temporally and spatially coupled to a compensatory endocytic process. Hence, we hypothesized that the secretory granule membrane would preserve its integrity within the plasma membrane after exocytosis before being retrieved as such along with its components. However, the underlying molecular mechanisms of this compensatory endocytic process are largely unknown today. Therefore my thesis project is aiming to address the following specific question: What are the different mechanisms triggering and regulating exocytosis and the compensatory endocytosis? Physical properties of lipids play fundamental roles in membrane trafficking. They act as a scaffolding system to maintain specific machinery at restricted site of the plasma membrane. For example, the formation of ganglioside- and PIP2-enriched microdomains at the exocytic sites or the phospholipid scrambling across the bilayer plasma membrane, represent attractive processes to fulfill this function during exo- endocytosis events in neuroendocrine cells. Moreover, in view to their important implication in exo-endocytotic processes or lipid remodeling, annexin-A2, synaptotagmin- 1, oligophrenin-1 and phospholipid scramblase-1 have to be considered as potential signal-triggers of the granule endocytosis. During my PhD, I focused in investigating how exocytosis and compensatory endocytosis are regulated by PLSCR-1 and OPHN1 in adrenal chrommaffin cells.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'endocytose dépendante de la clathrine (EDC), c’est-à-dire la formation de vésicules recouvertes de clathrine (VRC) à partir de la membrane plasmique, est un processus essentiel dans les cellules eucaryotes. Au cours de l’EDC, la GTPase dynamine est recrutée au cou de la VRC naissante où elle s'oligomérise en hélice. Les changements de conformation induits par l'hydrolyse du GTP catalysent la scission du cou vésiculaire. Ce processus a été étudié en détail par reconstitution in vitro sur des tubules membranaires, mais il doit être établi dans des cellules vivantes, où les interactions de la dynamine avec d'autres protéines comme l'amphiphysine sont critiques. L'imagerie TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) avec le protocole pH pulsé (ppH) sur cellules vivantes permet la détection de la formation de VRC avec une résolution spatiale (~100 nm) et temporelle (2 s) élevée. Ce protocole a révélé que la dynamine présente un recrutement biphasique aux puits recouverts de clathrine (PRC) en maturation avec un pic au moment de la scission mais les paramètres de son recrutement dans les cellules vivantes restent peu clairs. Pour déterminer ces paramètres, j’ai utilisé des techniques d’imagerie sur cellules vivantes pour étudier le recrutement de la dynamine à l’échelle globale et à l’échelle de la molécule unique lors de perturbations aiguës de sa fonction. Mes résultats de thèse ont montré que la dynamine est recrutée à la membrane plasmique, diffuse à l'extérieur des PRC et y est transitoirement piégée. De plus, j’ai déterminé avec des dynamines mutées (1) que le domaine PRD de la dynamine est crucial pour son recrutement aux PRC ; (2) que le domaine PH est important pour la scission vésiculaire mais par pour son recrutement aux PRC ou à la membrane plasmique. Enfin, j’ai observé que la dynamine s'échange en permanence avec un pool extra-PRC, ce qui permettrait son recrutement ultérieur par l'ajout de nouveaux sites de liaison et sa capacité à rétrécir le cou des vésicules suite à l’hydrolyse du GTP. En conclusion, ces données suggèrent qu’aux PRC, les molécules de dynamine (1) sont constamment échangées ; (2) diffusent à des taux similaires tout au long du processus de formation, maturation et scission des vésicules; et (3) l'activité GTPase de la dynamine contribue à la maturation et à la scission des VRC. / Clathrin-mediated endocytosis (CME), the formation of clathrin-coated vesicles (CCV) from the plasma membrane, is an essential process in eukaryotic cells. During CME, the GTPase dynamin is recruited to the neck of nascent CCV where it oligomerizes into helical filaments. Conformational changes induced by the hydrolysis of GTP catalyze the scission of the vesicle neck. This process has been studied in detail with in vitro reconstitution on membrane tubules but it needs to be established in living cells, where interactions between dynamin and other proteins such as amphiphysin are critical. Live cell total internal reflection fluorescence (TIRF) imaging with the pulsed pH (ppH) assay allows the detection of CCV formation with high spatial (~100 nm) and temporal (2 s) resolutions. It has revealed that dynamin is recruited to maturing clathrin-coated pits (CCP) in two phases with a peak at the time of scission but the parameters of its recruitment in living cells remain unclear. To determine these parameters, we have performed live cell imaging of dynamin recruitment at collective and single molecule levels during acute perturbations of its function. My PhD results showed that dynamin is recruited to the plasma membrane, diffuses outside of CCP and is trapped at CCP. Furthermore, we determined with mutated dynamins that (1) the PRD domain of dynamin is crucial for its recruitment at CCP; (2) the PH domain is important for vesicular scission but not for recruitment to CCP or to the plasma membrane. Finally, I observed that dynamin exchanges with an extra-CCP pool at all times: this would allow for its further recruitment by addition of new binding sites and its ability to narrow the vesicle neck after GTP hydrolysis. Altogether, these data suggest that in CCP dynamin molecules (1) are constantly exchanged; (2) diffuse at similar rates throughout the entire process of vesicle formation, from maturation until scission; and (3) that dynamin’s GTPase activity contributes to CCP maturation and scission.

L'utilisation récente des nanoparticules (NPs) comme vecteurs pour l'imagerie et l'adressage d'agents thérapeutiques en nano-médecine nécessite la compréhension de leurs mécanismes d'internalisation et de transport au niveau des barrières biologiques. Dans ce contexte, l'objectif de cette étude est de caractériser l'interaction et la transcytose de NPs de silice fluorescentes en fonction de leur taille (15, 50 et 100 nm) dans un modèle in-vitro de barrière endothéliale pulmonaire humaine. L'internalisation et le transport trans-endothélial des NPs a été analysé quantitativement à l'échelle nanométrique par microscopie électronique à transmission (MET) combinée à de la stéréologie. Un transport trans-endothélial a été observé pour toutes les tailles de NPs. Néanmoins, l'analyse de la distribution intracellulaire révèle une tendance à l'accumulation dans les voies de dégradation cellulaires pour les NPs de 50 et 100 nm. Cette accumulation est moindre pour les NPs de 15 nm. L'internalisation des NPs a également été analysée par cytométrie en flux et MET en présence de différents inhibiteurs de l'endocytose dans le but d'identifier leurs voies d'internalisation. En fonction de la taille des NPs, les mécanismes d'endocytose varient, suggérant une dépendance du transport trans-cellulaire à certains mécanismes d'endocytose. L'internalisation des NPs de 15 nm par la voie d'endocytose cavéole dépendante pourrait ainsi expliquer l'efficacité de leur transport du côté basal. Les méthodologies développées pour l'étude du transport trans-cellulaire des NPs de silice peuvent être appliquées à l'étude de NPs synthétiques plus complexes ou de NPs biologiques, telles que les lipoprotéines de basse-densité, et ce dans un contexte pathologique. / The recent use of nanoparticles (NPs) as carriers for imaging and delivery of therapeutics agents in nanomedecine involves understanding their endocytosis and transcytosis mechanisms at biological barriers. In this context, the aim of this study was to characterize the interaction and transcytosis of fluorescent silica NPs in function of their size (15, 50, and 100 nm) in an in-vitro model of human pulmonary endothelial barrier. NPs internalization and trans-endothelial transport has been quantitatively analyzed at nanometer resolution using transmission electron microscopy (TEM) combined with stereology. Trans-endothelial transport has been observed for each size of NPs. However cellular distribution analysis shows an accumulation in the cellular degradation pathways for 50 nm and 100 nm NPs. Whereas 15 nm NPs are less accumulated. NPs uptake was also analyzed by flow cytometry and TEM in the presence of different inhibitors to decipher NPs internalization pathways. Depending on NPs size, the involved endocytosis pathways were different, suggesting a dependency of trans-cellular transport toward endocytic mechanisms. The specific internalization of 15 nm NPs by the caveolin dependant pathway could explain the efficacy of their release at the basal side. Techniques developed for the study of the trans-cellular transport of silica NPs can also be applied to more complex synthetic NPs or biological NPs, such as low-density lipoproteins, in a pathological context.

CE TRAVAIL A PORTE SUR L'ETUDE DE LA PROTEINE MULTIMODULAIRE ALIX CHEZ DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM, UN ORGANISME EUCARYOTE Où DEVELOPPEMENT MULTICELLULAIRE ET PROGRAMME DE MORT CELLULAIRE SONT ETROITEMENT LIES. L'INVALIDATION D'ALX MONTRE QUE CETTE PROTEINE EST ESSENTIELLE A LA DIFFERENCIATION CELLULAIRE ET A LA MORPHOGENESE AU COURS DU DEVELOPPEMENT MULTICELLULAIRE MAIS PAS AU PROGRAMME DE MORT. UNE APPROCHE STRUCTURE/FONCTION A REVELE QUE LE DOMAINE SUSCEPTIBLE DE PARTICIPER A DES TORSADES D'HELICES DE CETTE PROTEINE EST INDISPENSABLE A SA FONCTION DEVELOPPEMENTALE. DE PLUS, SA DISTRIBUTION CELLULAIRE INDIQUE QU'ALIX EST LOCALISE DANS LA VOIE ENDOCYTAIRE EN ASSOCIATION AVEC LA MACHINERIE ESCRT (ENDOSOMAL SORTING COMPLEX REQUIRED FOR TRANSPORT), IMPLIQUEE DANS LE TRI ET LA FORMATION DU CORPS MULTIVESICULAIRE (MVB). CEPENDANT, L'INVALIDATION DES GENES CODANTS POUR DIFFERENTS COMPOSANTS DES COMPLEXES ESCRT INDUIT DES PHENOTYPES DISSEMBLABLES. CECI SUGGERE QUE SOIT CES PROTEINES ONT DES ROLES DANS D'AUTRES PROCESSUS CELLULAIRES SOIT QUE CETTE VOIE N'EST PAS PERTURBEE DE LA MEME FAÇON DANS LES DIFFERENTS MUTANTS.

La cellule eukaryote est organisée en plusieurs compartiments, appelés organelles, délimités par des membranes. La fission des membranes est nécessaire pour le transport intracellulaire entre organelles. L'endocytose est un mécanisme de transport depuis la membrane plasmique vers les autres organelles. La Dynamine est une guanosine triphosphatase (GTPase) impliquée dans la fission des vésicules pendant l'endocytose médiée par la Clathrine. Elle polymérise en hélice au coup des bourgeons endocytiques. Après hydrolyse du GTP, la structure de l'hélice est modifiée : le rayon interne diminue de 10 à 5 nm et le pas hélical de 13 à 9 nm. Ces modifications indiquent un mécanisme de constriction. La dynamique de constriction est étudiée en suivant la rotation de microbilles attachées à des tubes lipidiques recouverts de Dynamine. La déformation des hélices de Dynamine est concertée et amortie par la friction entre membrane et Dynamine. Cependant la constriction ne suffit pas pour la fission. Pour comprendre davantage son mécanisme, la fission par la Dynamine est étudiée à l'aide de tubes lipidiques extraits de vésicules unilamellaires géantes. La fission se produit au bord de l'hélice, où la membrane est fortement courbée. D'après l'analyse statistique des temps de fission, la réaction de fission peut être modélisée par une unique barrière énergétique. La dépendance du temps de fission en rigidité de membrane, en tension de membrane et en couple est établie théoriquement et validée expérimentalement. Ce travail établit le profil énergétique de la réaction de fission membranaire et évalue à 70 kT la barrière énergétique.