L’ubiquitination est une modification post-traductionnelle qui joue un rôle majeur chez les organismes vivants. Chez Arabidopsis thaliana, le transporteur de fer racinaire IRT1 est endocyté à la suite de la monoubiquitination de deux résidus lysine situés au niveau de sa grande boucle cytosolique. Cependant, les mécanismes régissant l’endocytose médiée par l’ubiquitine ainsi que son rôle biologique restent flous. Au cours de ma Thèse, j’ai mis en évidence que la dynamique d’IRT1 était contrôlée par les métaux substrats secondaires du transporteur (à savoir le zinc, le manganèse et le cobalt). En l’absence de ces métaux, IRT1 est localisé à la membrane plasmique avec une polarité latérale le positionnant sur la face externe des cellules de l’épiderme racinaire. La présence de ces mêmes métaux à un niveau physiologique entraîne la monoubiquitination d’IRT1 et son internalisation vers les endosomes précoces. J’ai démontré que lorsque les métaux substrats secondaires d’IRT1 sont présents en excès, les modifications monoubiquitine sont alors allongées en chaînes de polyubiquitines liées par le résidu lysine-63, entrainant ainsi son adressage vers la vacuole et sa dégradation. Mes travaux ont par ailleurs permis d’élucider les mécanismes moléculaires impliquées dans la réponse des plantes à l’excès de métaux substrats d’IRT1. J’ai notamment montré que l’endocytose d’IRT1 était dépendante i) d’un motif riche en résidus histidine dans la séquence d’IRT1 qui est capable de fixer ces métaux autres que le fer, ii) de la phosphorylation d’IRT1 au niveau d’un résidu thréonine par une protéine kinase en cours d’investigation, et iii) de l’E3 ligase à domaine RING IDF1. D’un point de vue physiologique, l’endocytose d’IRT1 médiée par l’ubiquitine et dépendante des métaux protège la plante d’une suraccumulation de ces métaux autres que le fer qui sont hautement réactifs. / Ubiquitination is a post-translational modification playing a major role in living organisms. In Arabidopsis thaliana, the root iron transporter IRT1 is endocytosed following the monoubiquitination of two lysine residues located in its large cytosolic loop. However, the mechanisms driving IRT1 ubiquitin-mediated endocytosis and its biological relevance remains unclear. During my PhD, I uncovered that IRT1 dynamics is controlled by its secondary metal substrates (i.e. zinc, manganese and cobalt). In the absence of these non-iron metals, IRT1 is found at the cell-surface of root epidermal cells with an outer lateral polarity, while their presence at physiological levels triggers IRT1 monoubiquitination, internalization and accumulation in early endosomes. However, upon non-iron metal excess, monoubiquitin modifications are extended into K63 polyubiquitin chains to promote the vacuolar targeting of IRT1 and its degradation. I investigated further the molecular mechanisms driving plant responses to non-iron metal excess. I notably showed that this regulation by non-iron metals is dependent on i) a histidine-rich stretch in IRT1 that is able to directly bind to non-iron metals, ii) the subsequent recruitment of a kinase currently under investigation which phosphorylates IRT1 at a threonine residue, and iii) the RING E3 ligase IDF1. Altogether, the metal-dependent ubiquitin-mediated endocytosis of IRT1 protects the plant from overaccumulation of highly reactive non-iron metals.

Rab35 est une petite GTPase de la superfamille des Ras protéines. Chez l’Homme, plus de 60 Rabs jouent un rôle clef « d’interrupteur moléculaire » dans la régulation du trafic membranaire. Des progrès significatifs ont été réalisé sur le rôle de certaines Rabs, cependant il reste encore un travail important de compréhension fonctionnelle et du mécanisme d’action de celles-ci au sein de la cellule. L’actuel projet a pour but d’étudier Rab35, un régulateur essentiel d’une voie de recyclage vésiculaire vers la membrane plasmique, aussi impliqué dans la régulation de l’actine lors de la dernière étape de la division cellulaire. Rab35 agit via le recrutement et la régulation de protéines spécifiques appelées effecteurs. Chez l’humain, des mutations chez les partenaires de Rab35 entrainent de rares maladies connues sous le nom du syndrome de Birt-Hogg-Dube et syndrome de Lowe. Ce projet en étroite collaboration avec le laboratoire d’Arnaud Echard (Institut Pasteur) consiste à mieux comprendre le rôle cellulaire et fonctionnel de deux nouveaux effecteurs de Rab35 : MICAL1 et MiniBAR. Lors de la division cellulaire, MICAL1 pourrait réduire le niveau d’actine avant l’abscission car il possède un domaine catalytique monooxygénase démontré comme étant un facteur de désassemblage de l’actine. MICAL1 agit directement sur les filaments d’actine et oxyde des résidus spécifiques permettant la dépolymérisation de ces derniers. Mais il est actuellement inconnue si MICAL1 joue un rôle dans la division cellulaire. Par ailleurs, nos collaborateurs ont découvert un nouvel effecteur de Rab35 appelé MiniBAR. Ils ont récemment décrit MiniBAR comme étant un partenaire spécifique de Rab35 et contenant un domaine BAR (connue pour lier et courber les membranes). Ce domaine, adjacent au domaine d’interaction de Rab35, lie spécifiquement Rac1 une autre GTPase bien connue pour son rôle dans la régulation de l’actine. De ce fait MiniBAR pourrait être un lien entre les deux GTPases coordonnant le processus de remodelage de l’actine dans la cellule.Le laboratoire de Motilité Structurale dirigé par Anne Houdusse est spécialisé dans l’étude structurale des moteurs moléculaire et GTPases qui contribuent aux différentes fonctions dans la cellule par l’interaction avec leur différents cargos et effecteurs. L’élaboration de ce projet consiste à caractériser d’un point de vue structural et fonctionnel les complexes entre Rab35 et ses effecteurs. Laboratoire spécialisé dans la détermination de structure à haute résolution par cristallographie aux rayons X, ce travail mènera à la résolution de complexes macromoléculaires afin de désigner des mutants spécifiques pour des études fonctionnelles dans la cellule en étroite collaboration avec l’équipe d’Arnaud Echard, leader dans l’étude cellulaire de Rab35. / Rab35 is an essential regulator of a recycling pathway back to the plasma membrane, that is also required for the post-furrowing terminal steps during cytokinesis that are associated with F-actin depolymerisation [1]. Rab35 performs its role in the cell via recruitment and regulation of specific effector proteins. Recently the lab of our collaborator Arnaud Echard (Pasteur institute, Paris) has identified and is currently studying by cell biology approaches two novel Rab35 effectors - MICAL1 and MiniBAR proteins. MICAL1 may restrict actin levels before cytokinesis abscission, because it harbours a monooxygenase catalytical domain and has been shown to be an F-actin-disassembly factor [2]. But it is unknown whether MICAL1 has a function in cell division. Another effector of Rab35 currently uncharacterized was identified and named MiniBAR by our collaborators. They recently described that MiniBAR specifically binds to active Rab35, that it contains an unnoticed, putative BAR domain (known to sense membrane curvature) and that this domain, adjacent to the Rab35-binding domain, binds specifically to GTP-bound Rac1 - a well known actin remodelling regulator. So, MiniBAR may function as a linker between the two small GTPases coordinating actin-remodelling processes in the cell. The aim of the project is to perform extensive structural/functional characterization of complexes between the Rab35 GTPase and its interacting effector proteins.References:[1] - Dambournet and al, Nat Cell Biol, 2011. Rab35 GTPase and OCRL phosphatase remodel lipids and F-actin for successful cytokinesis.[2] - Giridharan SS and Caplan S, Antioxid Redox Signal, 2014. MICAL-family proteins: Complex regulators of the actin cytoskeleton.

L'ICAP-1 est impliqué dans la dynamique de l'intégrine et la génération de force en contrôlant l'endocytose de l'intégrine grâce à la scission dépendant de nm23 des puits endocycliques recouverts de chlatrine.L'ICAP-1 a été identifié comme un partenaire spécifique de l'intégrine b1 (Degani et al., 2002, Zhang et Hemler, 1999). Nous avons déjà montré que l'ICAP-1 est impliqué dans la réponse mécanisée aux cellules et la différenciation cellulaire d'une manière dépendante de l'intégrine b1 (Bouvard et al., 2007; Brunner et al., 2011; Faurobert et al., 2013; Millon-Frémillon et al. , 2008; Renz et al., 2015). Cependant, comme ICAP-1 est également capable d'adapter la migration cellulaire en réponse à la rigidité du substrat d'une manière indépendante de la β1-intégrine (Bouin et al., 2017), nous avons spéculé sur un rôle plus général de l'ICAP-1 dans l'adhésion cellulaire et dynamique d'adhérence focale. Pour cela, nous avons créé un environnement cellulaire où l'intégrine b1 et / ou l'ICAP-1 étaient absentes en utilisant quatre lignées cellulaires: les ostéoblastes WT, les cellules ostéoblastes KO de l'intégrine b1, les cellules ostéoblastes KAP ICAP-1 et les cellules ostéoblastes double KO b1 / ICAP-1 afin de surveiller le comportement de l'intégrine b3. Comme prévu, l'épuisement de l'intégrine b1 est associé à la perte d'étalement cellulaire et à la génération de force selon la mesure de la microscopie par force de traction. De manière surprenante, la suppression supplémentaire de ICAP-1 (b1 intégrine et ICAP-1 KO) conduit à la restauration de l'étalement cellulaire et de la génération de force qui dépend de l'intégrine b3. Ces forces médiées par l'intégrine b3 sont corrélées avec la diffusion lente de l'intégrine b3 dans les sites d'adhésion et le renouvellement lent de l'adhésion focale contenant l'intégrine b3 (FRAP / TIRF / vidéomicroscopie). Nous avons abordé la question de savoir si ICAP-1 pourrait réguler l'endocytose de l'intégrine b3 puisque ICAP-1 interagit avec nm23-H2 (Fournier et al., 2002), un nucléoside diphosphate kinases (NDPK) impliqué dans l'endocytose à médiation par dynamine en produisant du GTP à travers l'adénosine triphosphate (ATP) de conversion du diphosphate de guanosine (PIB) (Boissan et al., 2014). Nous montrons que la suppression de nm23 ou de dynamine ou de chlatrine dans les cellules épuisées dans l'intégrine b1 est capable d'imiter la perte combinée de l'intégrine b1 et de l'ICAP-1 en rétablissant l'étalement cellulaire, la génération de force et la dynamique de l'intégrine b3. Pour confirmer l'implication de l'ICAP-1 dans l'endocytose de l'intégrine b3, nous montrons que l'absorption de l'anticorps de l'intégrine b3 est efficacement bloquée dans les cellules épuisées dans ICAP-1. Nos résultats suggèrent que ICAP-1 pourrait être impliqué dans la dynamique de l'intégrine et la génération de force en contrôlant l'endocytose de l'intégrine grâce à la scission dépendant de nm23 des puits endocytaires de la couche de chlatrine. / ICAP-1 is involved in integrin dynamics and force generation by controlling integrin endocytosis through nm23-dependent scission of endocytic chlatrin coated pits.ICAP-1 has been identified as a specific partner of b1 integrin (Degani et al., 2002; Zhang and Hemler, 1999). We have previously shown that ICAP-1 is involved in cell mechanoresponse and cell differentiation in a b1 integrin dependent manner (Bouvard et al., 2007; Brunner et al., 2011; Faurobert et al., 2013; Millon-Frémillon et al., 2008; Renz et al., 2015). However, as ICAP-1 is also able to adapt cell migration in response to substrate stiffness in a β1-integrin-independent manner (Bouin et al., 2017), we speculated on a more general role of ICAP-1 in cell adhesion and focal adhesion dynamics. For this purpose we have created cellular environment where b1 integrin and/or ICAP-1 were absent by using four cell lines: WT osteoblast, b1 integrin KO osteoblast cells, ICAP-1 KO osteoblast cells and double KO b1/ICAP-1 osteoblast cells in order to monitor b3 integrin behavior. As expected, depletion of b1 integrin is associated with the loss of cell spreading and force generation according traction force microscopy measurement. Surprisingly, the supplementary deletion of ICAP-1 (b1 integrin and ICAP-1 KO) leads to restoration of cell spreading and force generation which are dependent on b3 integrin. These b3 integrin-mediated forces are correlated with slow diffusion of b3 integrin within adhesion sites and slow turnover of b3 integrin containing focal adhesion (FRAP/TIRF/videomicroscopy). We addressed the question whether ICAP-1 might regulate b3 integrin endocytosis since ICAP-1 interacts with nm23-H2 (Fournier et al., 2002), a nucleoside diphosphate kinases (NDPKs) involved in dynamin-mediated endocytosis by producing GTP through adenosine triphosphate (ATP)–driven conversion of guanosine diphosphate (GDP) (Boissan et al., 2014). We show that the deletion of either nm23 or dynamin or chlatrin in cells depleted in b1 integrin is able to mimic the combined loss of b1 integrin and ICAP-1 by restoring cell spreading, force generation and b3 integrin dynamics. To confirm the involvement of ICAP-1 in b3 integrin endocytosis, we show that the b3 integrin antibody uptake is efficiently blocked in cells depleted in ICAP-1. Our results suggest that ICAP-1 might be involved in integrin dynamics and force generation by controlling integrin endocytosis through nm23-dependent scission of endocytic chlatrin coated pits.

Au cours de la gastrulation de l’embryon de Drosophile, l’activation apicale du cytosquelette d’acto-myosine orchestre la constriction apicale dans le mésoderme en invagination ainsi que l’intercalation cellulaire dans l’ectoderme en extension. Un contrôle quantitatif de l’activité des GPCRs et, par conséquent, de l’activation de Rho1 est à l’origine des différences de déformation des cellules du mésoderme et de l’ectoderme mais ces mécanismes demeurent incompris. L’activité du GPCR Smog se concentre respectivement en deux compartiments distincts à la surface de la membrane plasmique (PM) et dans ses invaginations (PMI). Au moyen de la FCS, nous avons étudié la surface de la PM et pu montrer que Smog oligomérise en homo-clusters en réponse à son activation par le ligand Fog. L’endocytose de Smog est facilitée par la kinase Gprk2 et sa protéine adaptatrice la β-Arrestine-2 qui retire Smog actif de la PM. Lorsque que la concentration de Fog est élevée ou que l’endocytose est réduite, Smog s’organise en homo-clusters et s’accumule au niveau des PMI qui agissent comme des centres d’activation de Rho1. Une concentration plus importante d’homo-clusters de Smog et un nombre plus important PMI dans le mésoderme par comparaison avec l’ectoderme. Répartition dynamique de Smog actif à la surface de la PM ou dans ses invaginations impacte directement sur la signalisation Rho1. Les PMI accumulent de hauts niveaux de Rho1-GTP suggérant qu’elles forment des centres de signalisation. La concentration de Fog et l’endocytose de Smog sont des processus régulateurs couplés qui contrôlent la différence quantitative d’activation de Rho1 dans le mésoderme et l’ectoderme de la Drosophile. / During Drosophila gastrulation, apical activation of the actomyosin networks drives apical constriction in the invaginating mesoderm and cell-cell intercalation in the extending ectoderm. Here, we show that cell-surface G-protein coupled receptor, Smog activates G-proteins, Rho1 and Rho-kinase that is required for apical constriction and cell-cell intercalation. Quantitative control over GPCR activity and thereby Rho1 activation underlies differences in deformation of the mesoderm and ectoderm cells but the mechanisms remain elusive. We show that GPCR-Smog activity is concentrated on two different apical plasma membrane compartments i.e. the surface and the plasma membrane invaginations. Using FCS, we probe the surface of the plasma membrane (PM) and show that Smog homo-clusters in response to its activating ligand Fog. Endocytosis of Smog is facilitated by the kinase Gprk2 and the adaptor protein β-Arrestin-2 that clears active Smog from the surface of PM. When Fog concentration is high or endocytosis is low, Smog arranges in homo-clusters and accumulates in plasma membrane invaginations (PMI), that are hubs for Rho1 activation. Lastly, we find high Smog homo-cluster concentrations and numerous apical PMIs in the mesoderm compared to the ectoderm. We identify that dynamic partitioning of active Smog on the surface of the PM or PMI directly impact on Rho1 signaling. PMIs accumulate high Rho1-GTP suggesting they form signaling centers. Fog concentration and Smog endocytosis form coupled regulatory processes that regulate quantitative differential Rho1/MyoII activation in the Drosophila mesoderm and ectoderm.

Le fer est essentiel à la croissance et au développement des plantes. Chez Arabidopsis thaliana, le transporteur IRT1 permet l’absorption du fer par les cellules épidermiques de la racine et est, par conséquent, un des acteurs majeurs de la nutrition en fer. IRT1 est cependant un transporteur peu spécifique qui transporte également des métaux non ferreux que sont le zinc (Zn), le manganèse (Mn) et le cobalt, qui constituent les substrats secondaires d’IRT1 et qui ont été récemment démontrés dans notre laboratoire comme régulant l’endocytose d’IRT1. Afin d’identifier des protéines potentiellement impliquées dans le trafic ou dans la régulation de l’activité d’IRT1, nous avons isolé des interactants de ce transporteur via des immunopurifications d’IRT1 combinées à des analyses de spectrométrie de masse. Cette approche nous a permis d’établir le premier intéractome d’IRT1. Parmi les protéines interagissant avec IRT1, nous avons isolé AHA2 et FRO2 qui participent toutes les deux au processus d’absorption du fer chez Arabidopsis, ainsi que la protéine à domaine SPFH appelée HIR2. HIR2 est localisée dans des microdomaines membranaires chez Arabidopsis mais sa fonction reste jusqu’à présent assez énigmatique. Cependant, chez les animaux, les protéines à domaine SPFH ont été proposées comme étant impliquées dans la formation des microdomaines membranaires; de plus certaines protéines à domaines SPFH appelées Flotillines interviennent dans des mécanismes d’endocytose chez les animaux et les plantes. Après avoir validé les interactions entre les protéines IRT1 et FRO2/AHA2/HIR2 par des approches complémentaires, nous avons analysé la dynamique intracellulaire de ces protéines par microscopie. Nos résultats suggèrent l’existence d’un complexe protéique regroupant les trois acteurs majeurs de l’homéostasie du fer chez Arabidopsis : IRT1, FRO2 et AHA2, dont la fonction pourrait être d’optimiser l’absorption du fer dans la racine. Contrairement à ce qui est observé pour IRT1, les protéines FRO2 et AHA2 ne sont pas massivement endocytées en réponse à un excès de métaux (Zn,Mn, Co) et ceci bien qu’elles puissent être présentes au sein d’un complexe contenant IRT1. Nous avons en outre montré que FRO2 et AHA2 étaient ubiquitinées, mais contrairement à IRT1, de façon indépendante de la concentration en métaux non ferreux. En utilisant des approches de génétique inverse, nous avons mis en évidence que HIR2 était impliquée dans le maintien de l’homéostasie du fer, les mutants hir2 étant extrêmement sensibles à la carence en fer. D’autre part nous avons montré que l’accumulation de la protéine IRT1 était dérégulée chez le mutant hir2 et ceci de façon post-transcriptionnelle. Nous cherchons actuellement à déterminer comment HIR2 régule la dynamique et/ou la stabilité d’IRT1 dans la cellule. HIR2 pourrait assurer le recrutement d’IRT1 et plus généralement du complexe d’acquisition du fer décrit ci-dessus dans des microdomaines membranaires spécifiques. D’autre part, nous avons également émis l’hypothèse que HIR2 pourrait être impliquée dans une voie d’endocytose d’IRT1 indépendante de la clathrine. / Iron is an essential nutrient for plant growth and development. In Arabidopsis thaliana, the transporter IRT1, which allows iron absorption through the epidermic cells of the root, is a major actor in iron nutrition. Despite of it, IRT1 also transports the non-iron metals zinc (Zn), manganese (Mn) and cobalt (Co). These metals are considered as the secondary substrates of IRT1, and therefore this transporter is considered as poorly specific. Our laboratory has recently uncover that these secondary substrates regulate IRT1 endocytosis. In order to uncover the different proteins that can be implicated in the traffic or in the regulation of IRT1 activity, we have proceeded to perform IRT1 immnopurifications, followed by mass spectrometry analyses. This approach has allowed us to produce a first interactome list of IRT1. Among the proteins that interact with IRT1, we have isolated AHA2 and FRO2, both well known in the process of iron acquisition in Arabidopsis, and also a SPFH domain containing protein known as HIR2. Although it is known that HIR2 is contained in membrane microdomains in Arabidopsis, its function is still to be determined. Nevertheless, in the animal kingdom, SPFH domain containing proteins have been proposed as implicated in the formation of membrane microdomains. This is specially the case of the specific SPFH domain containing proteins known as Flotillins, which have the ability to mediate endocytosis in animals as in plants. After validation of the interaction between IRT1 and FRO2/AHA2/HIR2 by different complementary approaches, we have microscopically analyzed the intracellular dynamics of these proteins. Our results suggest the existence of a protein complex that reunites the three major actors of iron homeostasis in Arabidopsis: IRT1, FRO2 and AHA2. We suspect that the main function of this complex is to optimize the process of iron absorption in the root. In spite of what is known for IRT1 and despite being part of a same complex, FRO2 and AHA2 are not massively endocytosed in response to a non-iron metal excess (Zn, Mn, Co). Furthermore, we have shown that FRO2 and AHA2 are ubiquitinated, although their ubiquitination is also independent of the concentration of the non-iron metals, unlike the ubiquitination of IRT1. Finally, using reverse genetic approaches, we have been able to show that HIR2 is implicated in the maintenance of the iron homeostasis. Indeed, hir2 mutants are extremely sensitive to lack of Fe, even though they present posttranslational deregulations that result in the an overaccumulation of the protein IRT1. We are currently trying to determine how HIR2 regulates the dynamics and/or the stability of IRT1 inside the cell. HIR2 could be assuring the recruiting of IRT1 (or the recruitment of the whole iron acquisition complex) into specific membrane microdomains. On the other hand, HIR2 could be implicated in a new pathway of internalization of IRT1, independent of clathrin.

L’endocytose dépendante de la clathrine (EDC) est la principale voie d’internalisation des récepteurs de surface et de leurs ligands. L’internalisation se fait suite à l’invagination de la membrane plasmique vers l’intérieur de la cellule suite à la formation, dans un premier temps, de puits recouverts de clathrine (PRCs) qui bourgeonnent ensuite en vésicules recouvertes de clathrine dans le cytosol. L’EDC est un processus très dynamique qui a lieu en l’espace de 30 sec-1mn. Elle est impliquée dans de multiples fonctions et permet ainsi à la cellule de réguler l’expression de ses protéines en surface, de répondre aux signaux de prolifération ou migration envoyés par l’environnement immédiat via l’activation de voies de signalisation spécifiques ou encore de réguler le renouvellement des composants de la membrane plasmique. De par son importance, des dérégulations de l’endocytose dépendante de la clathrine ont déjà été observées dans les cancers. Ces modifications peuvent impliquer directement l’EDC en modifiant ses composants ou indirectement lors d’altérations de récepteurs régulés par celle-ci. La progression tumorale est elle-même régulée par de multiples facteurs, notamment l’accumulation de mutations qui ont des conséquences sur les cellules cancéreuses elle-même ou bien sur l’environnement immédiat, formant ainsi la « niche tumorale ». Ces changements agissent réciproquement sur la progression tumorale afin de l’amplifier. Lors de la croissance tumorale, les cellules cancéreuses recrutent des fibroblastes qui vont participer au remodelage et à l’augmentation de la rigidité autour de la tumeur. La rigidité de la matrice extracellulaire est détectée par les cellules ce qui envoie des signaux déclencheurs de prolifération et de migration en conséquence. Cette détection passe essentiellement par les intégrines à la surface membranaire qui vont s’agréger et induire des cascades de signalisation impliquées dans ces réponses. Ces intégrines peuvent se regrouper dans deux types de structures, les adhésions focales et les structures recouvertes de clathrine. En ce qui concerne ces dernières, il a été démontré précédemment que la rigidité du substrat augmente sa force d’interaction avec les intégrines, et empêche ainsi l’internalisation des vésicules recouvertes de clathrine, on parle alors d’ « endocytose frustrée ». Cette rétention des structures recouvertes de clathrine à la surface provoque une signalisation soutenue à la surface au lieu de l’arrêter par dégradation ultérieure des récepteurs dans les lysosomes. Le laboratoire a démontré que les structures de clathrine frustrées capturent ainsi différent récepteurs conduisant à une signalisation accrue dans la voie de la MAP Kinase Erk. Mon projet de thèse repose sur ces observations en s’intéressant plus particulièrement au rôle d’une autre modification induite par la croissance tumorale, le confinement. En effet, en se multipliant de manière incontrôlée dans un environnement spatialement restreint, les cellules tumorales se retrouvent soumises à des forces de compression. Les résultats mis en évidence au cours de ma thèse ont montré que le confinement provoque, comme la rigidité, une frustration des structures de clathrine qui ne sont donc plus capables de soutenir l’endocytose des récepteurs. De plus, la compression cellulaire induit le clivage d’un pro-ligand de l’EGFR, le HB-EGF, ce qui conduit à l’activation paracrine de l’EGFR et à l’activation de la voie Erk. En effet, l’absence de facteurs de croissance dans le milieu ainsi que l’inhibition de ce clivage démontrent la nécessité de la mise en place de ce mécanisme. En résumé, le confinement induit le clivage du pro-ligand HB-EGF, qui à son tour va activer le récepteur à l’EGF. En parallèle, l’endocytose est ralentie et provoque une signalisation accrue à la membrane. Ces deux évènements coopèrent pour mener à une très forte activation de la voie Erk. / Clathrin-mediated endocytosis (CME) is the major route of endocytosis for many cargos in eukaryotic cells. Endocytosis takes place at clathrin-coated pits (CCPs), small assemblies of clathrin and clathrin adaptors randomly distributed at the plasma membrane. Clathrin polymerization induces the progressive bending of the plasma membrane resulting in the formation of a vesicle budding off into the cytosol. CME is a highly dynamic process with an average lifetime of CCPs in the order of 30 seconds. In this manner, CME fulfills a range of different functions and enables cells to regulate the surface expression of proteins, to sample the cell’s environment for growth and guidance cues, to control the activation of signaling pathways and to turn over membrane components by sending these components for degradation in the endo-lysosomal pathway. A deregulation of the endocytic pathways was previously shown to be involve in cancer. These modifications can affect CME directly by modifying its actors, or indirectly with mutations on receptors or cargoes undertaken by CME. Tumor progression is dependent of several factors, the first one involving the accumulation of mutations which results in modifications in the cells themselves or on their surrounding environment by changing its biochemical and physical properties, leading to the formation of the tumor niche. These changes reciprocally foster cancer progression. During tumor growth, fibroblasts will be recruited around tumor cells, leading to the remodeling of the microenvironment and to an increase of rigidity nearby the tumor. This stiffness is sensed by the cells and send signals for proliferation and migration as a result. Stiffness sensing engages mainly integrins at the cell surface which will aggregate and initiate signaling cascades accountable for these responses. Integrins are capable of clustering into two types of structures: focal adhesions and clathrin-coated structures (CCSs). Regarding CCSs, it was shown previously that high stiffness strengthen the interaction between integrins and the substrate, hence preventing the budding off of the vesicle, and this is referred to as “frustrated endocytosis”. This holding of CCSs at the cell surface promotes a sustained signaling at the plasma membrane instead of a signal termination after internalization and further degradation in lysosomes. My PhD project relied on these previous findings, with a particular focus on another mechanical alteration observed in tumors, the confinement. Indeed, during the uncontrolled proliferation of cancer cells in a spatially restricted area, cells become subjected to compressive forces. The results I obtained indicate that confinement leads to frustrated endocytosis and hence to sustained signaling from the plasma membrane. In addition, compression also leads to HB-EGF shedding at the cell surface, and the resulting EGF product activate the EGFR in a paracrine manner, thus leading to the activation of the MAP kinase Erk signaling pathway. Indeed, both the absence of EGFR ligands in the medium and the inhibition of the shedding demonstrate the necessity of this mechanism in EGFR activation. To sum up, confinement induces the shedding of the EGFR pro-ligand HB-EGF necessary to EGFR activation in these conditions. Simultaneously, endocytosis is delayed and frustrated endocytosis leads to sustained signaling at the cell surface. Together, these events cooperate to strongly activate the Erk pathway. These findings highlight the interplay between the physical feature of the tumor environment and signaling pathways known to govern tumor growth.

Le récepteur à la transferrine (TfR1) est un récepteur très bien conservé au cours de l’évolution qui permet l’entrée du fer (Fe) lié à la transferrine (Fe-Tf) dans les cellules. Une fois internalisé, le fer se détache de la Tf et est exporté dans le cytoplasme tandis que le complexe Tf/TfR1 est recyclé à la membrane plasmique. Le TfR1 est internalisé par un mécanisme clathrine dépendant et peut être soit recyclé à la membrane plasmique par la voie rapide, soit être dirigé vers le compartiment endosomal de recyclage (ERC). Une fois dans l’ERC, le TfR1 peut être soit recyclé à la membrane plasmique par la voie lente, soit être dirigé vers les lysosomes. De nombreuses protéines régulent le routage des protéines internalisées comme les protéines Rab. Il s’agit de petites GTPases impliquées dans les échanges moléculaires entre les différents compartiments cellulaires.Etant la principale voie d’entrée du fer dans la cellule,le TfR1 est exprimé par la plupart des cellules et est surexprimé par les cellules hautement prolifératives dont certaines cellules cancéreuses. Le TfR1 est très étudié comme cible thérapeutique dans le développement de nouvelles stratégies anti-cancéreuses. A24 est un anticorps murin anti-TfR1 dont l’action anti-proliférative et pro-apoptotique ont été démontrées dans plusieurs hémopathies malignes.Nous nous sommes demandés comment la fixation de A24 sur le TfR1 peut produire des effets différents de la fixation de la Fe-Tf. En générant un fragment Fab, nous avons d’abord démontré que le routage du TfR1 dépend de la valence de son ligand. Nous avons ensuite démontré que la fixation monovalente du TfR1 par la Fe-Tf et le Fab induisent son recyclage sans passer par l’ERC. Nous avons également démontré que la fixation divalente du TfR1 par A24 induit son routage depuis l’ERC vers les lysosomes par une voie dépendante de Rab12. / The transferrin receptor (TfR1) is a highly conserved receptor that allows the entry of iron (Fe) linked to transferrin (Fe-Tf) into cells. Once internalized, Fe separates from the Tf and is exported in the cytoplasm whereas the complex Tf/TfR1 is recycled to the cell membrane. TfR1 is internalized by a clathrin mediated endocytosis and can be either recycled to the cell membrane through the rapid pathway or be routed towards the endosomal recycling compartment (ERC). Once in the ERC, the TfR1 can be either recycled to the cell membrane through the slow pathway or be routed towards lysosomes. Many proteins regulates the routing of internalized proteins such as Rab proteins. They are small GTPases involved in molecular exchanges between the different cellular compartments.Being the main mode of entry of iron into cells, TfR1is expressed by almost every cells and is overexpressed by highly proliferative cells including some cancer cells. TfR1 is extensively studied as a therapeutic target for the development of new anti-cancer strategies. A24 is a murine anti-TfR1 whose anti-proliferative and pro-apoptotic roles were demonstrated in several hematological malignancies.We wondered how A24 binding on TfR1 can produce different effects from Fe-Tf binding. By the manufacturing of a Fab fragment, we first demonstrated that TfR1 fate depends on its ligand’s valency. We then demonstrated that the monovalent binding of TfR1 with Fe-Tf or the Fab leads to its recycling without going through the ERC. We also showed that the divalent binding of the TfR1 by A24 leads to its routing from the ERC to lysosomes through a Rab12 dependent pathway.

Une multitude de voies endocytiques existent à la surface de la membrane plasmique, ce qui conduit à l'endocytose de la majeure partie des membranes ainsi que de leurs protéines associées, des molécules de signalisation, des facteurs de croissance et autres cargos (Smith et al. 2017). Pendant des décennies, la voie majeure dite clathrine dépendante a été la plus étudiée, Cette voie d’endocytose se caractérise par la polymérisation de molécules de clathrine et de protéines adaptatrices au niveau de récepteurs liés à leurs ligands, entrainant la courbure de la membrane, avant sa scission et son endocytose (Smith et al. 2017). Récemment, plusieurs mécanismes alternatifs ont été découverts facilitant l'absorption endocytique des protéines cargo et des récepteurs membranaires, même en l'absence de la voie clathrine dépendante (Mayor et al.2014). Un modèle d'endocytose qui ne requiert pas de clathrine mais à la place des galectines et des glycolipides a été proposé par le groupe de Ludger Johannes (Lakshminarayan et al. 2014). Les galectines sont des lectines qui se lient aux bêta-galactosides et qui, à ce jour, regroupent 15 membres (galectine-1 à galectine-15) chez les mammifères et sont retrouvées dans de nombreux types de cellules et tissus (Leffler et al., 2004). Les galectines sont probablement sécrétées extra-cellulairement par une voie inconnue et non-classique (Hughes, 1999). Les glycosphingolipides (GSL) sont des constituants membranaires ubiquitaires, divisés en fractions neutres ou acides. Le terme GSL s'applique aux composés contenant au moins un monosaccharide et une céramide. Il est à noter que l’enzyme UDP-glucose céramide glucosyltransférase (Ugcg) catalyse l’étape initiale de la biosynthèse de GSLs à base de glycosylcéramides.Notre modèle de travail actuel, impliquant les glycolipides et les lectines, a été qualifié d'hypothèse GL-Lect (Johannes et al. 2016), et préliminairement soutenu par des données expérimentales comme décrit par Lakshminarayan et al. en 2014. Il peut être décrit comme suit:i) le monomère Gal3 se lie aux glycoprotéinesii) Gal3 commence alors à oligomériseriii) Gal3 oligomérisé a la capacité de se lier aux glycosphingolipides, ce qui peut induire la formation de clusters de GSLsiv). Ces clusters Gal3-GSL induisent une invagination de la membrane plasmique, une endocytose des protéines cargo liées à Gal3 et la formation subséquente de CLIC (clathrin-independent carriers ), endosomes pré-précoces.Selon ce modèle, l’oligomère Gal3 est capable de se lier aux GSLs et d’induire une déformation de la membrane de la même manière qu’une autre lectine, la sous-unité pathogène shiga toxine-B (STxB). Par conséquent, les deux processus pourraient être résumés sous la même hypothèse GL-Lect, où GL représente les glycosphingolipides (Gb3 pour STxB et des GSLs non identifiés pour Gal3) et Lect corresponds aux lectines (STxB, Gal3 et éventuellement d'autres). Comprendre si les voies d'internalisation indépendantes de la clathrine, mais dépendantes de la galectine 3, sont conservées, non seulement pour les modèles in vitro mais également in vivo, est un défi majeur dans le domaine du trafic cellulaire.Nous avons caractérisé, pour la première fois, un nouveau mécanisme dans l’intestin facilitant le transport endocytique d’un cargo. Ce mécanisme est conduit par la Galectine 3 et agit dans les entérocytes intestinaux dans le processus analogue de transcytose et dépend des glycosphingolipides. En effet, nous avons découvert que la lactotransferrine (LTF), un cargo de Gal3 que nous avons identifié par Mass spec, dépendait fortement de la Galectine3 pour son endocytose efficace, et des GSLs pour son mode de distribution analogue à la transcytose. Sur la base de ces découvertes dans l'épithélium intestinal de souris, nous avons établi un système modèle in vivo fonctionnel dans lequel le mécanisme endocytique récemment proposé, appelé dans notre laboratoire GL-Lect, a été étudié physiologiquement. / A host of endocytic pathways exist at the surface of eukaryotic cells, which lead to the internalization of the bulk of membranes along with membrane proteins, signaling receptors, growth factors, and other cargoes (Smith et al. 2017). For decades, the clathrin-mediated pathway has been the major well characterized endocytic process where clathrin polymerizes along with the associated adaptor proteins to include ligand-bound receptors, leading to membrane bending, membrane scission, and endocytosis (Smith et al. 2017). Recently, multiple alternative mechanisms have been uncovered which facilitate the endocytic uptake of cargo molecules and membrane receptors even in the absence of clathrin machinery (Mayor et al.2014). A model of endocytosis that doesn’t require clathrin but rather sugar-binding galectins and glycolipids has been proposed by my host laboratory (Lakshminarayan et al. 2014). Galectins constitute a family of beta-galactoside–binding lectins, which to date consists of 15 members in mammals. Galectins are broadly distributed in a variety of cells and tissues (Leffler et al. 2004). They are translocated from the cytosol to the extracellular space by a process of non-classical secretion (Hughes 1999). Glycosphingolipids (GSLs) are ubiquitous membrane constituents that are subdivided in neutral or acidic fractions. The term GSLs applies to compounds that contain at least one monosaccharide and a ceramide. Of note, the enzyme UDP-glucose ceramide glucosyltransferase (Ugcg) catalyzes the initial step for the biosynthesis of glycosylceramide-based GSLs.Our current working model, which involves glycolipids and lectins, was termed the GL-Lect hypothesis (Johannes et al. 2016). It is backed up by experimental data as described in Ref. (Lakshminarayan et al. 2014) and can be described as follows:i) Monomeric Gal3 binds to glycoproteinsii) Gal3 then starts to oligomerizeiii) Oligomerized Gal3 has the capacity to bind to glycosphingolipids and this may induce clustering of GSLsiv) Gal3-GSL cluster are inducing the invagination of the plasma membrane to generate tubular endocytic pits from which clathrin-independent carriers (CLICs, which are pre-early endosomes) are generated.Oligomeric Gal3 is indeed able to bind to GSLs and to induce membrane deformation (Lakshminarayan et al. 2014) in a similar way the pathogenic lectin Shiga toxin-B subunit (STxB) does. Therefore, both processes could be summarized under the same hypothesis, the GL-Lect hypothesis, where GL stands for the glycosphingolipids (Gb3 for STxB and gangliosides for Gal3) and Lect summarizes the lectins (STxB, Gal3 and possibly others as well).Understanding if this clathrin-independent but Gal3-dependent internalization mechanism is conserved not only in vitro model systems but in vivo is a main challenge in the field of trafficking.We characterized for the first time that in the gut a new mechanism facilitates endocytic uptake of cargo. This mechanism is driven by Galectin3 and operates in intestinal enterocytes for transcytosis like process and is glycosphingolipid dependent. Indeed, we have found that the lactotransferrin (LTF), a Gal3 cargo that we have identified by Mass spec, strongly required Gal3 and GSLs for its efficient endocytosis and its transcytosis like distribution pattern, respectively. Based on these findings in mouse intestinal epithelium, we established a functional in vivo model system where the newly proposed endocytic mechanism termed in our lab as GL-Lect, was physiologically investigated.

La migration cellulaire est un processus fondamental au maintien des fonctions physiologiques de l’organisme. Elle est également centrale dans de nombreuses pathologies et entre notamment en jeu lors de la dissémination métastatique. Lorsqu’elles migrent, les cellules utilisent des structures d’adhésion afin de s’appuyer sur leur environnement. Nous avons récemment montré que les puits recouverts de clathrine, plus connus pour leur rôle dans l’endocytose, peuvent également servir de structures d’adhésion. Dans ce manuscrit, je démontre que certains ligands internalisés par la voie d’endocytose clathrine peuvent également se lier à la matrice et orienter la migration cellulaire en régulant les structures adhésives de clathrine.J’ai commencé par montrer que le collagène est associé à plus de structures de clathrine et a plus de protrusions lorsqu’il est recouvert par des ligands. J’ai ensuite montré que les cellules appliquaient plus de forces sur des fibres de collagènes décorées par des ligands et que ce surplus de force nécessite la présence de structures de clathrine. Enfin j’ai montré que les cellules suivent les ligands liés à des réseaux de collagène en 3D et que cette migration dirigée nécessite également la présence de structures de clathrine. Ce mécanisme de migration pourrait notamment permettre aux cellules de suivre des gradients de ligands liés à la matrice in vivo et ainsi de s’orienter dans l’organisme. / Cell migration is a fundamental process in the development and homeostasis of multicellular organisms. It is also central to many pathologies and it is especially important for metastatic dissemination. When migrating, cells use adhesion structures to push on their substrate in order to move forward. We recently showed that clathrin coated structures, primarily known as endocytic structures, can also serve as adhesion structures. In this manuscript, I show that some ligands internalized through clathrin mediated endocytosis can also bind to the extracellular matrix and orient cell migration using adhesive clathrin structures.I first showed that ligand-decorated collagen fibers are associated with more clathrin structures and more protrusions. I then showed that cells applied more forces to the ligand-decorated collagen fibers and this extra amount of forces requires the presence of clathrin structures. Finally, I showed that cells can migrate following collagen-bound ligands in 3D, this directed migration also requiring the presence of clathrin structures. Such migration mechanism could be used by cells to follow in vivo gradient of matrix-bound ligands and thus find their way when migrating inside the body.

La neurotransmission nécessite la fusion de vésicules synaptiques (VS) avec la membrane pré-synaptique pour libérer les neurotransmetteurs qui vont activer les récepteurs du neurone post-synaptique. Le nombre de VS dans le bouton pré-synaptique est limité, ce qui nécessite des mécanismes efficaces pour régénérer ces vésicules. Parmi ces mécanismes, il existe l’endocytose dépendante de la clathrine, l'endocytose ultra-rapide et l'endocytose de masse (ADBE), ces deux dernières étant indépendantes de la clathrine. Dans cette étude, il est montré que l'absence d'Alix (ALG-2 interacting protein-X) entraîne des modifications morphologiques et fonctionnelles des synapses qui pourraient être la conséquence d’un recyclage défectueux des VS. Nous avons récemment montré que Alix et l’un de ses partenaires, l'endophiline-A, sont essentiels pour l'endocytose indépendante de la clathrine dans les fibroblastes, ce qui nous amène à penser que Alix pourrait jouer le même rôle dans le bouton pré-synaptique. Au cours de ce travail, j’ai montré que Alix se concentre au niveau des boutons pré-synaptiques après une stimulation à haute fréquence des neurones. En utilisant des formes mutantes d’Alix, j’ai montré que le recrutement d’Alix à la membrane pré-synaptique était dépendant de son interaction avec ALG-2 (protéine de liaison au calcium). De même la relocalisation de l’endophiline-A à la synapse est dépendante de son interaction avec Alix. Par ailleurs, l’absence d'Alix dans les neurones conduit à une altération de l'ADBE, qui peut être restaurée par l'expression d'Alix, mais pas avec ses mutants incapables d'interagir avec ALG-2 ou l'endophiline-A.Les résultats de cette étude démontrent qu'Alix est important pour l'endocytose indépendante de la clathrine dans les synapses, processus indispensable au recyclage des vésicules synaptiques au cours d'une activité neuronale normale. / Neurotransmission involves the fusion of synaptic vesicles (SVs) to the presynaptic membrane to release neurotransmitters that will bind receptors on the postsynaptic neuron. The number of SVs in central nerve terminals is limited, necessitating a set of reliable mechanisms to regenerate SVs. Among such mechanisms are clathrin-mediated endocytosis, ultrafast endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis (ADBE), where the latter two are clathrin-independent. The present study reveals that the depletion of Alix (ALG-2 interacting protein-X) leads to morphological and functional changes of synapses that indicate defective SV recycling. Our recent finding that Alix and its major partner, endophilin-A, is crucial for clathrin-independent endocytosis in fibroblasts, led us to hypothesise that Alix may have such a role at the presynapse. The present study has allowed us to demonstrate that Alix concentrates at presynaptic boutons during intense stimulation. Using mutant forms of Alix, we demonstrate that this recruitment of Alix is depends on the ability of Alix to interact with the calcium binding protein, ALG-2. Endophilin-A is also recruited to presynaptic boutons and this recruitment is dependent on its capacity to interact with Alix. It is then revealed that the lack of Alix in neurons leads to impaired ADBE, suggesting the importance of Alix in ADBE. Such a role of Alix depends on its ability to interact with ALG-2 and endophilin since the impairment of ADBE was reversed upon rescuing the expression of wild-type Alix, but not with Alix mutants unable interact with ALG-2 or endophilin-A.The findings of this study demonstrate that Alix is important for clathrin-independent endocytosis at synapses, a process necessary for the recycling of synaptic vesicles during normal neuronal activity.