Orientador: Heloiza Ferreira Alves do Prado / Banca: João Cláudio Thoméo / Banca: Ana Maria Rodrigues Cassiolato / Resumo: Em conjunto com outras enzimas que degradam amido, as α-amilases e CGTases são incluídas na família 13 glicosilhidrolases caracterizada por uma conformação (α/β)8-barril. As amilases são grupo importante de enzimas industriais, representando cerca de 25% do mercado mundial de enzima.. Foram isoladas linhagens bacterianas de áreas do Cerrado que apresentaram alta produção de amilases em estudos anteriores. Devido ao interesse em ampliar os conhecimentos de α-amilases e CGTase com potencial de aplicação industrial, no presente trabalho, propôs-se realizar estudos de análises físico-químicas e do efeito da fonte de carbono, na produção de α-amilase das linhagens microbianas A-1.2 e A-18 e de CGTase produzida por Paenibacillus campinasensis H69-3 utilizando na fermentação submersa os amidos solúvel, trigo, milho, batata e mandioca; farelo de trigo e mandioca; Maizena e Arrozina como diferentes fontes de carbono alternativas Além disso, propôs-se aperfeiçoar os estudos de produção de amilases pela linhagem microbiana A-1.2 por meio da otimização dos constituintes nutricionais do meio de cultivo em que cada um dos ensaios do planejamento fatorial foi executado em triplicata e dessa forma, consideraram-se as médias dos resultados obtidos dessas repetições. Iniciar estudos de biologia molecular com a CGTase produzida por P. campinasensis H69-3 buscando estratégias para a clonagem e expressão da CGTase em hospedeiro heterólogo (Escherichia coli). As linhagens A-1.2 e A-18 tiveram as fontes de carbono amido solúvel, amido de mandioca, amido de milho e farelo de mandioca como os substratos que maximizaram a produção da enzima por ambas as linhagens, e o tempo de fermentação com maiores atividades foi entre 72 e 96 horas. O perfil de produção ao longo do tempo da CGTase de P. campinasensis H69-3 indicou o amido solúvel, amido de mandioca e a Maizena como as fontes de carbono que propiciaram as mais altas... / Abstract: Together with other enzymes that degrade starch, α-amylases and CGTases are included in the family 13 glycosylhydrolases, characterized by a conformation (α/β)8-barrel. Amylases are an important group of industrial enzymes, accounting for approximately 25% of the world enzyme market. Bacterial strains from the Cerrado areas, which have shown a high production of amylase in the previous studies, have been isolated. Due to the interest in expanding the knowledge of α-amylase and CGTase with potential for industrial application, the present work proposes to conduct studies of physical and chemical analysis and the effect of carbon source on the production of α-amylase of A-1.2 and A-18 microbial strains, as well as CGTase produced by Paenibacillus campinasensis H69-3 in submerged fermentation using the soluble starch, wheat, corn, potato and cassava; wheat bran and cassava; Maizena and Arrozina like various alternative sources of carbon. Furthermore, it proposes enhancing the amylase study of the microbial strain A-1.2 by optimizing the nutritional components of the culture medium in which each of the factorial design experiments has been carried out in triplicate, and thus considering the average results of these repetitions. To initiate molecular biology studies with CGTase produced by P. campinasensis H69-3 searching strategies for the cloning and expression of the CGTase in a heterologous harbourer (E. coli). The A-1.2 and A-18 strains were the carbon sources of soluble, cassava and corn starch, and cassava bran as the substrate that maximized the enzyme production by both strains. And the fermentation time with higher levels of activity was between 72 and 96 hours. The production profile over the CGTase P. campinasensis H69-3 time has indicated the soluble and cassava starch and Maizena as carbon source that provided the highest enzymatic activities. The 72 hours period of time has been more appropriate in enzymatic tests, ... / Mestre

Orientador: José Geraldo Nery / Banca: Eleni Gomes / Banca: Adriano Aguiar Mendes / Resumo: O biodiesel (ésteres de ácidos graxos) tem sido produzido a partir da transesterificação direta de óleos ou de gorduras, em que triglicerídeos reagem com um álcool de cadeia curta (metanol ou etanol) na presença de um catalisador químico como, por exemplo, certos ácidos ou hidróxidos. Alternativamente, foi utilizada a via enzimática. Nesse caso, empregam-se enzimas lipases como catalisadores. Reações de transesterificação catalisadas por lipases têm se tornado cada vez mais atrativa, uma vez que o glicerol gerado na reação pode ser facilmente recuperado e a purificação de ésteres de acido graxo é simples. Todavia, as enzimas utilizadas como catalisadores possuem alto custo no mercado, dificuldade de recuperação e, além disso, estão sujeitas à inativação. Desse modo, uma maneira encontrada para superar alguns desses obstáculos é a imobilização das enzimas em um suporte sólido. A imobilização da enzima em uma matriz aumenta sua estabilidade química e térmica, reduz a sua inativação, e facilita a sua recuperação na reação. Microesferas de Poli (álcool vinilico) (PVA) com diferentes graus de cristalinidade foram usados como suportes sólidos para a imobilização da lipase de Rhizomucor miehei. Microsferas de PVA com estrutura amorfa (PVA4) imobilizaram 0,03 mg da enzima/ g de suporte, enquanto que microesferas com estrutura cristalina (PVA12) imobilizaram 0,024 mg/g e a de alta cristalinidade (PVA25) imobilizou 0,029 mg/g. A atividade enzimática das enzimas imobilizadas foi dependente do grau de cristalinidade das microesferas de PVA. O complexo Enzima-PVA4 apresentou uma atividade enzimática de (6,13 U/mg de enzima), o complexo Enzima-PVA12 apresentou uma atividade enzimática de (67,23 U/mg de enzima) e o complexo Enzima-PVA25 revelou uma alta atividade enzimática (149,15 U/mg de enzima). A atividade... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Biodiesel (fatty acid esters) is produced from the direct transesterification of oils or fats in which triglycerides react with a short chain alcohol (methanol or ethanol) in the presence of a chemical catalyst like acids or hydroxides. In the other hand, enzymatic route is used and, in this case, employing lipases as catalysts. Transesterification reactions catalyzed by lipases has become ever more attractive, since glycerol produced in the reaction can be easily recovered and purification of fatty acid esters is simple. One way to overcome these barriers by using free lipases is their immobilization on a solid support. The immobilized enzyme increases its chemical and thermal stability, reduces inactivation, improves handling and facilitates its recovery in the reaction. Microspheres of poly vinyl alcohol (PVA) with different degrees of crystallinity were then used as solid supports for immobilization of lipase from Rhizomucor miehei. PVA microspheres with amorphous structure (PVA4) immobilized 0,029 mg of enzyme/ g of support, while crystalline structure microspheres (PVA12) immobilized 0,024 mg/g and high crystallinity microspheres (PVA25) immobilized 0,03 mg/g. The enzymatic activity of the immobilized enzymes was dependent on the degree of crystallinity of PVA microspheres. The enzyme-PVA4 complex revealed an enzymatic activity of (6.13 U/mg of enzyme) while the Enzyme-PVA12 complex an enzymatic activity of (67.23 U/mg of enzyme) and Enzyme-PVA25 complex provided a high activity enzymatic (149.15 U/mg enzyme). The enzymatic activity of the lipase in its free form was also measured and, in this case, was found to be (11.6 U/mg enzyme). A synergistic effect was also observed for the complex Enzyme-PVA25 during the transesterification reaction. The yield of esters for complex Enzyme-PVA25 was 66.3% followed by Enzyme-PVA12 (40.7%)... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Eleni Gomes / Coorientador: Fábio Márcio Squina / Banca: Roberto da Silva / Banca: Henrique Ferreira / Banca: Leandro Cristante de Oliveira / Banca: André Ricardo de Lima Damásio / Resumo: A conversão enzimática dos polissacarídeos da biomassa é um fator chave no desenvolvimento de bioetanol de segunda geração. A recalcitrância da lignocelulose para a degradação enzimática e o custo elevado de enzimas hidrolíticas necessárias para a despolimerização de polissacarídeos encontrados na parede celular da planta são barreiras significativas para a produção em larga escala e para a comercialização de biocombustíveis e bioprodutos derivados da biomassa vegetal. A fim de aumentar rapidamente a produção de biocombustíveis celulósicos e bioprodutos, existe a necessidade de desenvolver coquetéis enzimáticos mais eficientes e de menor custo para a conversão de biomassa em açúcares fermentáveis. Nesse contexto, o estudo de enzimas degradadoras da parede celular é essencial. No presente trabalho a enzima endo-1,4-β-D-glucanase de Aspergillus terreus (ATEG_09894) foi clonada para expressão em A. nidulans. O teste de expressão mostrou a expressão solúvel da proteína. Sua identidade foi confirmada por espectrometria de massas. O pH ótimo e a temperatura ótima para sua atividade enzimática foram de 5,0 e 55ºC, respectivamente. A desnaturação térmica mostrou que a partir de 60ºC a enzima começa a perder estrutura. Interessantemente a enzima apresenta atividades β-glucanase e xiloglucanase, tendo preferência por β-glucano. A caracterização estrutural mostrou que ATEG_09894 foi expressa corretamente e os resultados de SEC e SAXS mostram que a proteína é monomérica em solução e o modelo de sua estrutura tridimensional indica que a superfície eletrostática da molécula contribui para um monômero estável. Os dados apresentados nesse trabalho são importantes pois identificam peculiaridades da enzima ATEG_09894, que atua na degradação da biomassa, sugerem os determinantes de sua seletividade enzimática e apresenta a degradação, não usual, de β-glucanos... / Abstract: The enzymatic conversion of polysaccharides from biomass is a key factor in the development of second generation bioethanol. The recalcitrance of lignocellulose to enzymatic degradation and the high cost of hydrolytic enzymes necessary for the depolymerization of polysaccharides found in plant cell wall are significant barriers to large-scale production and commercialization of biofuels and bioproducts derived from plant biomass. In order to rapidly increase the production of biofuel and byproducts cellulosic, a need exists to develop more efficient and lower cost enzymatic cocktails for the conversion of biomass into fermentable sugars. In this context, the study of cell wall degrading enzymes is essential. In this work the enzyme endo-1,4-β-D-glucanase from Aspergillus terreus (ATEG_09894) was cloned for expression in A. nidulans. The expression test showed the expression of a soluble protein. Its identity was confirmed by mass spectrometry. The optimum pH and optimum temperature for the enzyme activity were 5.0 and 55 ºC, respectively. The thermal denaturation showed that above 60 ºC the enzyme starts to lose structure. Interestingly, the enzyme has β-glucanase and xiloglucanase activities, preferring β-glucan. Structural characterization showed that ATEG_09894 was expressed correctly folded and the results of SEC and SAXS show that the protein is monomeric in solution and the model of its three dimensional structure indicates that the electrostatic surface molecule contributes to a stable monomer. The data presented in this study are important because they identify peculiarities of ATEG_09894, which acts in the degradation of biomass, suggest the determinants of its selectivity and enzymatic degradation presents, unusual, of β-glucans and xyloglucans, promising feature for degradation of lignocellulosic material / Doutor

Orientador: Hamilton Cabral / Banca: Rodrigo Simões Ribeiro Leite / Banca: Fabiana Fonseca Zanoelo / Resumo: A produção de proteases de origem microbiana depende das condições de cultivo e da diversidade bioquímica de cada espécie. Estudos comparativos entre fermentação em estado sólido (FES) e fermentação submersa (FSm) usando farelo de trigo e meio sintético, respectivamente, foram realizados para a determinação dos parâmetros de produção de proteases pelo fungo Aspergillus fumigatus Fresenius. A melhor produção de protease foi em FES no período de 96 horas utilizando farelo de trigo, temperatura de 30 ºC e 1x106 esporos/5g de substrato com 1.517 U/mL. Em FSm o pico de produção foi em pH 6,0, a 30ºC, 5x105 esporos/mL de meio no período de 72 e 96 horas em meio contendo 0,5 e 0,25% de caseína, respectivamente, ambos com 40 U/mL. Conforme a produtividade dos processos fermentativos, o extrato enzimático da FES foi utilizado para estudos de purificação e caracterização bioquímica. Neste estudo, a protease purificada apresentou atividade ótima em pH 7,5 e 50ºC, sendo inibida por Fenil-metil-sulfonil-fluoreto (PMSF) e mais intensamente por antipaína (1,6 µM). Sobre efeito de íons, foi observado modulação da atividade proteolítica, principalmente com inibição por AlCl3, cuja atividade proteolítica residual foi de 18% após incubação com este íon. Na presença de Ditiotreitol (DTT) e uréia houve diminuição da atividade proteolítica, apresentando atividades residuais de 63% em 200 mM de DTT e 10% com 5 M de uréia. Comparativamente, na concentração de 0,1% de cada surfactante estudado, notou-se redução da atividade proteolítica, sendo 97% em presença de Brometo de cetil-trimetil amônio (CTAB), 79% para 4 - (1,1,3,3 - Tetrametilbutil) fenil- polietileno glicol (Triton X-100), 55% com Polyoxyethylenesorbitan monolaurato (Tween-20) e completa redução da atividade (0%) em... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The microbial protease production depends on growing conditions and the biochemical diversity of each species. Comparative studies between solid-state fermentation (SSF) and submerged fermentation (SmF) using wheat bran and synthetic medium, respectively, were performed to determine the optimum parameters for protease production by the fungus Aspergillus fumigatus Fresenius. The best protease production was in SSF within 96 hours using wheat bran, temperature 30°C and 1x106 spores/5g of substrate, with 1,517 U/mL. In SmF peak production was at pH 6.0 at 30°C, 5x105 spores/mL of media within 72 and 96 hours in medium containing 0.5 and 0.25% casein, respectively, with 40 U/mL. According to the productivity of the fermentative processes, enzymatic extract was used from SSF to study purification and biochemical characterization. In this study, purified protease showed optimum activity at pH 7.5 and 50°C, and inhibited by Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) and more intensely for antipain (1,6 µM). Concerning to the effect of ions, we observed modulation of the proteolytic activity, especially with inhibition by AlCl3, which residual activity was of 18 % after incubation with this ion. In the presence of Dithiothreitol (DTT) and ureia, we observed progressive decrease in proteolytic activity, presenting residual activities of 63% with 200 mM DTT, and 10% with 5 M ureia. Comparatively, in the concentration of 0.1% of each surfactant studied, there was a reduction in the proteolytic activity in 97% in presence of Cetyl trimethylammonium bromide (CTAB), 79% with 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol (Triton X-100), 55% with Polyoxyethylenesorbitan monolaurate (Tween-20) and a complete inactivation in the presence of Sodium dodecyl sulfate... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:48Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-02-10Bitstream added on 2014-06-13T18:59:35Z : No. of bitstreams: 1 bezerra_cs_me_sjrp.pdf: 695636 bytes, checksum: defed0b782768f078c9f788c311db8d1 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A diversidade de espécies de leveduras presentes na filosfera de uvas e mostos em uma área produtora de uvas e vinhos artesanais na região de Jales (SP) foi estudada usando técnicas de cultivo acoplada a ferramentas moleculares com sequenciamento dos isolados. Foram realizadas duas coletas: Maio de 2009 e Agosto de 2009 obtendo um total de 132 linhagens de leveduras isoladas de duas variedades de uvas (Isabel – Vitis labrusca e Bordô ) em suas diferentes partes (casca, engaço e baga) e também de mostos obtidos de cultivares Isabel, Niágara e Cabernet Sauvignon. A identificação molecular das espécies por Reação em Cadeia da Polimerase seguida da técnica de PCR-RFLP da região ITS incluindo o gene 5,8S e 26S do DNAr e subseqüente sequenciamento gênico foi eficiente para a identificação de 13 espécies: Candida quercitrusa (3), Candida stellata (3), Cryptococcus flavescens (6), Cryptococcus laurentii (1), Hanseniaspora uvarum (40), Issatchenkia occidentalis (2), Issatchenkia orientalis (10), Issatchenkia terricola (4), Pichia kluyveri(5), Pichia quilliermondii (7), Pichia sp.(4), Saccharomyces cerevisiae (44), Sporidiobolus pararoseus (2). Estes resultados mostram uma diversidade de espécies nas diferentes fases de fermentação, com uma predominância de leveduras não-Saccharomyces nas etapas iniciais, sendo estas substituídas consecutivamente por leveduras Saccharomyces cerevisiae com o progresso da fermentação, semelhante ao que é encontrado na literatura. As leveduras isoladas foram analisadas quanto a produção de enzimas hidrolíticas adequadas ao processamento de vinhos. Dentre as leveduras isoladas e identificadas, apenas a espécie Cryptococcus laurentii (linhagem U2) apresentou atividade para β-glicosidase após fermentação submersa, utilizando celobiose a 2% como fonte de carbono. Porém, esta atividade foi baixa (0,2 U/ml após 96h de fermentação)... / The diversity of yeast species present in the phyllosphere of grapes and musts from Vinhos Santin winery (Jales region, Sao Paulo State, Brazil) was studied using cultivation techniques with molecular tools coupled with sequencing of the isolates. There were two collections: May 2009 and August 2009 gaining a total of 132 yeast strains isolated from two grape varieties (Isabel and Bordeaux – Vitis labrusca) in different parts of the grape (bark, stem and berry) and also must obtained from Isabel, Niagara and Cabernet Sauvignon cultivars. The molecular identification of species by PCR-RFLP in the region of the ITS, including 5,8S gene, and 26S rDNA gene and subsequent sequencing was useful for the identification of 13 species: Candida quercitrusa (3), Candida stellata (3), Cryptococcus flavescens (6), Cryptococcus laurentii (1), Hanseniaspora uvarum (40), Issatchenkia occidentalis (2), Issatchenkia orientalis (10), Issatchenkia terricola (4), Pichia kluyveri(5), Pichia quilliermondii (7), Pichia sp.(4), Saccharomyces cerevisiae (44), Sporidiobolus pararoseus (2). These results show a diversity of species in different stages of fermentation, with a predominance of non-Saccharomyces yeasts in the early stages, and these are replaced consecutively to yeast Saccharomyces cerevisiae with the progress of fermentation, according to what is found in the literature. The yeasts were screened for production of hydrolytic enzymes for the processing of wine. Among the yeasts isolated and identified, only the species Cryptococcus laurentii (strain U2) exhibited β-glucosidase activity after submerged fermentation (SmF) using 2% cellobiose as carbon source. However, this activity was too low (0.2 U/ml after 96h of fermentation). In previous collections, held in 2008, we isolated a strain from the bark of Bordeaux grapes, identified as Aureobasidium pullulans... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Maurício Boscolo / Banca: Sandra Helena da Cruz / Banca: Roberto da Silva / Resumo: No presente trabalho foi avaliada a utilização de pré-tratamentos com micro-ondas e ultrassom, associados ou não a agentes químicos, sobre o bagaço de cana-de-açúcar para posterior sacarificação enzimática para produção de açúcares fermentescíveis. Os sobrenadantes dos pré-tratamentos foram analisados por HPLC-RI para quantificação de açúcares e HPLC-UV para determinação de compostos fenólicos, provenientes da degradação da lignina e inibidores da sacarificação. Os bagaços pré-tratados foram hidrolisados com dois complexos enzimáticos fornecidos pela Novozymes, o complexo NS50012 contendo diversas enzimas como celulases, xilanases e hemicelulases e o complexo NS50013 mais específico, contendo maior atividade de -glicosidase. Verificou-se que as amostras controle tratadas com micro-ondas e ultrassom sofreram perda de massa de 3% e 1,6% respectivamente, porém, variações consideráveis ocorreram com as amostras tratadas com ácidos minerais, chegando a 55,8 % de perda de massa com ácido clorídrico, seguido do ácido nítrico, com perda de 51,5%, ambas com liberação de açúcares, como glicose e xilose. Em meio alcalino, a maior perda foi com o tratamento de NaOH , com 17,3%. O uso de peróxido de hidrogênio seguido de hidróxido de sódio mostrou-se eficiente na deslignificação, com perdas de massa na ordem de 22 e 17%, com o uso de micro-ondas e ultrassom, respectivamente. O uso de CaO proporcionou perda de massa de 45,7 % e o tratamento realizado com sais cujos cátions são ácidos de Lewis como o CaCl2 e o FeCl2 resultaram em redução de 30-35% na massa do bagaço. No tratamento ultrassônico destacam-se valores entre 11-29% para os ácidos, mas, de modo geral, os tratamentos com uso de ultrassom demonstraram serem menos efetivos... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In this work it was tested the utilization of microwave and ultrasound as pretreatments of the sugarcane bagasse associated or not with chemical agents, for later enzymatic saccharification for the production of fermentable sugars. The supernatants of the pretreatments was analyze by HPLC-RI for sugars quantification and HPLC-UV for determination of fenolic compounds, from the lignin degradation and fermentation inhibitors. The treated bagasse was hydrolyzed with two different enzymatic complexes provided by Novozymes, the NS50012 complex that content some different enzymes like cellulases, xylanases and hemicellulases, and the NS50013 complex that is more specific, with larger values of -glucosidase. It was checked that the control samples treated with microwave and ultrasound suffered weight loss of 3% and 1,6% respectively, and considerable variations occurred with the samples treated with mineral acids, reaching to 55,8% of weight loss with chloridric acid, followed of nitric acid, with loss of 51,5%, both with sugar liberation, as such as glucose and xylose. In alkaline medium, the larger weight loss was with the treatment with NaOH, com 17,3%. The utilization of hydrogen peroxide followed by NaOH showed efficiency in the delignification, with weight losses in the order of 22% and 17%, with microwave and ultrasound, respectively. The utilization of CaO provided weight loss of 45,7% and the treatment realized with salts that the cation are Lewis acids like CaCl2 and FeCl2 resulting in reductions of 30-35% in bagasse weight. In the ultrasound treatment stand out values between 29-11% for the acids, but, in overall, the ultrasound treatments showed be fewer effective in weight loss when compared with microwave utilization. Was detect liberation of sugars like glucose, xylose and cellobiose, after treatments... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Resumo: Muitos fungos decompositores de materiais lignocelulósicos vêm sendo utilizados como produtores de enzimas em processos fermentativos nos quais são utilizados substratos de baixo valor comercial, como os resíduos agrícolas e agroindustriais. No entanto, apenas uma pequena parte destes resíduos são utilizados na alimentação de animais de produção. O presente trabalho visou: 1) a obtenção de preparado enzimático termoestável, com alta atividade de xilanase, pectinase e celulases, a partir do cultivo de fungos filamentosos termofílicos por fermentação em estado sólido; 2) uso de suplemento mineral comercial como meio de cultivo para os fungos na fermentação sólida; 3) avaliar a estabilidade das enzimas frente às características do rúmen; 4) hidrólise enzimática. Os fungos Thermomyces lanuginosus, Thermomucor indicae-seudaticae e Rhizomucor pussilus escolhidos para essa finalidade, foram cultivadas a 45°C por 360 horas em fermentação em estado sólido (FES), utilizando-se como substratos, suplemento comercial (B) (Bellpeso SV* - composto de sais minerais, farelo de algodão e polpa cítrica e para efeitos de comparação farelo de algodão e polpa cítrica (35% e 65%) (A). A amostra foi retirada em 24h e todas as outras de 48h em 48h. A produção máxima de pectinase produzida pelo fungo T. indicae-seudaticae foi obtida em 168h (421,31U/g) no substrato A, e a máxima atividade de xilanase produzida pelo T. lanuginosus TO-03 e ROB foram de 644,30Ug e 865,15 U/g em 168h, respectivemente. A amilase foi produzida por todos os fungos, porém CMCase e Avicelase tiveram uma baixa produção e ligninases não foram detectadas. A temperatura e pH ótimo de pectinase produzida pelo fungo T. indicae-seudaticae foi de 55ºC e pH 4,5 e para xilanase produzida pelas duas linhagens de T. lanuginosus, em ambos os substratos foram 70ºC e pH ótimo 6,5, com exceção... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Many rot fungi of lignocellulosics material are being utilized as producers of enzymes in fermentation processes, in which, substrates of very little commercial value such as agricultural and agroindustrial residues are used. However, only a small portion of these residues are utilized in the production of animal feed. The present project proposes: 1) the attainment of prepared enzymatic thermostable, with high activity of xylanase, pectinase and cellulases, from the cultivation of filamentous thermophylic fungi from solid state fermentation; 2) the use of commercial mineral supplementation as medium of cultivation for the fungi in solid fermentation; 3) to evaluate the enzymes stability when facing the characteristics of the rumen; 4) enzymatic hydrolysis. Thermomyces lanuginosus, Thermomucor indicae-seudaticae and Rhizomucor pusillus fungi chosen for this purpose, were cultivated at 45°C, for 360 hours in solid state fermentation (SSF), utilizing as substrates, commercial supplement (Bellpeso SV* - composed of mineral salt, cotton meal and citrus pulp) (B) and for comparison purpose cotton meal and citrus pulp at 35% and 65% (A). The first sample was taken in 24hrs and all the others every 48hrs. The maximum production of pectinase produced by the fungus T. indicae-seudaticae was obtained in 168hrs (421.31U/g) in the commercial substrate A, and to maximum activity of xylanase produced by the T. lanuginosus TO-03 and ROB was of 644.30 U/g and 865.15 U/g in 168hrs, respectively. Amylase was produced by all of the fungi, however CMCase and Avycelase had a low production and ligninases was not detected. The optimun temperature and pH of pectinase produced by the fungus T. indicae-seudaticae were of 55ºC and pH 4.5 and for xylanase produced by the two lineages of T. lanuginosus, in both substrates were 70ºC and optimun pH 6.5, with the exception to ROB in the substrate B that presented... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Érika Barbosa Neves Graminha / Coorientador: Eleni Gomes / Banca: Maria de Lourdes Teixeira de Moraes Polizeli / Banca: Hamilton Cabral / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-23Bitstream added on 2014-06-13T20:32:10Z : No. of bitstreams: 1 zanelato_ai_me_sjrp.pdf: 1477010 bytes, checksum: e2437c2c0ba00be5a6b7df73d8be90f5 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Este trabalho teve como objetivo produzir enzimas celulolíticas por fermentação em estado sólido (FES), em um bioreator de leito fixo, empregando-se o fungo termofílico Myceliophthora sp. e utilizando-se como substratos bagaço de cana-de-açúcar e farelo de trigo. Os testes foram realizados inicialmente em sacos de polipropileno apresentando uma boa produção de CMCase (550U/g) no período de 96 horas de fermentação. As variáveis controladas foram a temperatura de fermentação (40, 45 e 50ºC), umidade inicial (75, 80 e 85% b.u.) e proporção do substrato de bagaço de cana e farelo de trigo (1:1, 3:7 e 1:9 peso). Os estimadores estatísticos não indicaram diferença significativa da produção de celulase com as variações da proporção de bagaço de cana e de farelo de trigo, com a temperatura e com a umidade inicial do substrato, contudo, os melhores resultados foram obtidos para a proporção de 70% de bagaço de cana e 30% de farelo de trigo, temperatura de 50oC e umidade inicial do substrato de 80%. Nos testes em escala de bioreator, foi empregado um leito fixo de 7cm de diâmetro e 50cm de comprimento, encamisado, operado nas condições experimentais de melhor resultados obtidos na escala de sacos, sendo a temperatura da camisa e vazão de ar as variáveis de interesse. O fungo apresentou um bom desenvolvimento no reator, tendo uma produtividade enzimática semelhante à encontrada em escala de saco. Foi observado um gradiente de umidade no interior do leito, sendo este crescente do fundo para o topo do bioreator, comportamento inverso ao da atividade enzimática. As vazões variaram entre 80 e 120 L/h e não afetaram estatisticamente a fermentação, possuindo pouca influência sobre as distribuições longitudinais de umidade e de atividade enzimática. Já os ensaios para as temperaturas de 45 e 50oC mostraram-se distintos, sendo a maior produção de enzimas após 96h... / This work aimed to produce celullolytic enzymes through solid state fermentation in a fixed bed bioreactor, using the fungus Myceliophtora sp. and wheat bran and sugar cane bagasse as substrate. Initial tests were performed in polypropylene plastic bags, and satisfactory production of CMCase (550U/g.d.s.) was observed at 96h of fermentation. The controlled variables were the temperature (40, 45, and 50o C), the initial moisture content (75, 80, and 85%, w.b.), and wheat bran to sugar cane bagasse proportion (1:1, 3:7, and 1:9, weight). The experimental results did not differ statistically for any experimental condition adopted, even though the best results were obtained using the proportion 3:7 wheat bran/sugar cane bagasse 3:7, 50o C temperature, and 80% initial moisture content. A jacketed fixed bed bioreactor 7.62cm ID and 50cm long was used for scaling-up, and temperature, solid initial moisture content, and air flow rate were used as variables. The fungus adapted well to the bioreactor and to the experimental conditions, and the production of enzymes was similar to the tests performed in the plastic bags. It was observed a longitudinal gradient of moisture, increasing from the bottom to the top of the reactor, opposite effect observed for the enzyme production. The air flow rate was varied from 80 to 120L/h and did not affect neither the moisture nor the enzyme distributions. However, the experiments carried out at 45 and 50o C were statistically distinct, and the enzyme production at 50o C at 96h was larger than at 45o C. At 144h of fermentation, the results at 45o C were similar to those observed at 50o C and 96h. It was observed temperature peaks, the higher one at 18h of fermentation, which was 6o C above the temperature fixed through the jacket and the air at the entrance, for 45o C temperature and 80L/h air flow rate

Neste trabalho, são descritos os detalhes da montagem de um sistema de cultivo microbiano em estado sólido, cujo elemento principal é um biorreator de tambor rotativo em escala de bancada, com casco em vidro refratário com aproximadamente 6,2 litros de volume. A montagem do equipamento exigiu estudos para a definição dos seguintes aspectos: geometria do reator; controle de frequência e período de agitação; umidificação, aquecimento e controle do fluxo do ar injetado no sistema; mistura do meio de cultivo; medição e controle da temperatura do meio; retirada de amostras. O sistema desenvolvido foi avaliado, tendo como processo fermentativo modelo o cultivo de Aspergillus niger T0005/007-2, microrganismo produtor de enzimas pectinolíticas. Os testes foram feitos em um meio contendo farelo de trigo como suporte sólido, avaliando-se a influência de três parâmetros principais agitação, massa de meio de cultivo e temperatura do meio sobre o crescimento celular e a produção de endo-poligalacturonase (PG) por A. niger. Três formas de agitação do meio sólido foram comparadas: sem agitação; agitação a 1 rpm por 5 minutos a cada duas horas; agitação a 1 rpm por 1 hora e 55 minutos a cada duas horas. A segunda forma de agitação levou ao melhor crescimento celular, 81 mg.g-1, e a atividade de endo-PG da ordem de 80 U.g-1, semelhante ao estimado com o sistema estático. Com a terceira forma de agitação, aparentemente houve dano ao micélio fúngico e, com isso, resultados inferiores foram alcançados. A avaliação do efeito da massa de meio de cultivo sobre o processo foi feita com cargas crescentes de meio que resultaram na ocupação de 30, 45 e 60 % do volume útil do reator. Quanto ao crescimento celular, o melhor resultado foi alcançado com a menor carga de meio, enquanto que a carga intermediária resultou no mais alto título enzimático final, 107,2 U.g-1. Nos experimentos sobre a influência da temperatura sobre o cultivo de A. niger, a maior atividade enzimática (80,6 U.g-1) foi obtida numa condição de trabalho que permitiu que a temperatura do meio atingisse valores da ordem de 45ºC. Com o meio mantido a 30ºC, a atividade enzimática máxima foi substancialmente mais baixa, 46,4 U.g-1. Nos testes realizados com o processo modelo, não se verificou uma clara influência positiva da agitação sobre a produção de endo-PG. Entretanto, a partir dos experimentos com temperatura controlada, é possível sugerir que a formação de endo-PG é favorecida por uma condição de estresse para o microrganismo, no caso representado por temperaturas do meio acima de 40ºC, visto que a temperatura ideal de crescimento de A. niger encontra-se na faixa de 28 a 34ºC. Este resultado, que discorda do que é genericamente descrito na literatura especializada sobre cultivos em estado sólido, é um exemplo da importância de dispor-se de um biorreator de tambor rotativo de pequena escala como equipamento básico para a realização de estudos fundamentais a respeito deste tipo de processo. Adicionalmente, o fato de o corpo do reator ser construído em vidro permite a visualização do espaço interno do tambor rotativo e observar o efeito da agitação sobre o meio de cultivo. / Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-06-02T17:41:21Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Tomas Augusto Polidoro.pdf: 1493269 bytes, checksum: 0ed8a1384e54fe0a00f47be237707cbf (MD5) / Made available in DSpace on 2014-06-02T17:41:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Tomas Augusto Polidoro.pdf: 1493269 bytes, checksum: 0ed8a1384e54fe0a00f47be237707cbf (MD5) / In this work, details on the assembling of a solid state cultivation system, whose main component is a bench scale rotating-drum bioreactor, are described. The bioreactor was built in refractory glass and has an approximate volume of 6.2 liters. To assemble the equipment, the following aspects have been studied: geometry of the bioreactor; control of frequency and period of agitation; moistening, warming and controlling of the inlet air flux; mixing of cultivation medium; determination and control of medium temperature; sample withdrawn. The developed system was evaluated, being the cultivation of the pectinolytic enzymeproducing microorganism Aspergillus niger T0005/007-2 used as the model process. The fermentative tests were carried out in a medium containing wheat-straw as solid support and were used to evaluate the effects of three main parameters agitation, mass of cultivation medium and medium temperature on the cell growth and the production of endopolygalacturonase (endo-PG) by A. niger. For agitation of the solid medium, three modes were compared: no agitation; agitation of 1 rpm for 5 minutes each 2 hours; agitation for 1 hour and 55 minutes, each 2 hours. The second mode of agitation led to the best cell growth, 81 mg.g-1, and to endo-PG activity of approximately 80 U.g-1, similar to that obtained with the static system. With the third mode of agitation occurred, apparently, some damage to fungus mycelium and inferior results were achieved. The evaluation of the mass of cultivation medium on the process was done by loading the reactor with masses that result in the occupation of 30, 45 and 60% of the working volume of the bioreactor. With respect to the cell growth, the best result was attained with the smallest load of medium, whereas the intermediate load resulted in the highest endo-PG activity, 107.2 U.g-1. In the experiments on the influence of the temperature on the cultivation of A. niger, the largest endo-PG activity (80.6 U.g-1) was obtained in a process condition that allowed that the temperature reached values close to 45ºC. When the medium temperature was controlled at 30ºC, the endo-PG activity was substantially lower, 46.4 U.g-1. In the tests with the model process, no clearly positive influence of agitation on the production of endo-PG was observed. From the temperature-controlled experiments however, it is possible to suggest that endo-PG formation is favored by a stress condition for the microorganism, represented in this case by medium temperatures over 40ºC, since the optimal temperatures for A. niger growth is found in the range of 28 to 34ºC. This result disagrees from what is generically described in the specialized literature for the solid state cultivations, being this fact an example of the importance of having a small-scale rotating-drum bioreactor as a basic equipment for fundamental studies on that type of fermentative process. Additionally, the fact of the reactor body being built on glass allows the inspection of the internal space of the rotating drum and to observe the effects of agitation on the cultivation medium.

Neste trabalho, são descritos os detalhes da montagem de um sistema de cultivo microbiano em estado sólido, cujo elemento principal é um biorreator de tambor rotativo em escala de bancada, com casco em vidro refratário com aproximadamente 6,2 litros de volume. A montagem do equipamento exigiu estudos para a definição dos seguintes aspectos: geometria do reator; controle de frequência e período de agitação; umidificação, aquecimento e controle do fluxo do ar injetado no sistema; mistura do meio de cultivo; medição e controle da temperatura do meio; retirada de amostras. O sistema desenvolvido foi avaliado, tendo como processo fermentativo modelo o cultivo de Aspergillus niger T0005/007-2, microrganismo produtor de enzimas pectinolíticas. Os testes foram feitos em um meio contendo farelo de trigo como suporte sólido, avaliando-se a influência de três parâmetros principais agitação, massa de meio de cultivo e temperatura do meio sobre o crescimento celular e a produção de endo-poligalacturonase (PG) por A. niger. Três formas de agitação do meio sólido foram comparadas: sem agitação; agitação a 1 rpm por 5 minutos a cada duas horas; agitação a 1 rpm por 1 hora e 55 minutos a cada duas horas. A segunda forma de agitação levou ao melhor crescimento celular, 81 mg.g-1, e a atividade de endo-PG da ordem de 80 U.g-1, semelhante ao estimado com o sistema estático. Com a terceira forma de agitação, aparentemente houve dano ao micélio fúngico e, com isso, resultados inferiores foram alcançados. A avaliação do efeito da massa de meio de cultivo sobre o processo foi feita com cargas crescentes de meio que resultaram na ocupação de 30, 45 e 60 % do volume útil do reator. Quanto ao crescimento celular, o melhor resultado foi alcançado com a menor carga de meio, enquanto que a carga intermediária resultou no mais alto título enzimático final, 107,2 U.g-1. Nos experimentos sobre a influência da temperatura sobre o cultivo de A. niger, a maior atividade enzimática (80,6 U.g-1) foi obtida numa condição de trabalho que permitiu que a temperatura do meio atingisse valores da ordem de 45ºC. Com o meio mantido a 30ºC, a atividade enzimática máxima foi substancialmente mais baixa, 46,4 U.g-1. Nos testes realizados com o processo modelo, não se verificou uma clara influência positiva da agitação sobre a produção de endo-PG. Entretanto, a partir dos experimentos com temperatura controlada, é possível sugerir que a formação de endo-PG é favorecida por uma condição de estresse para o microrganismo, no caso representado por temperaturas do meio acima de 40ºC, visto que a temperatura ideal de crescimento de A. niger encontra-se na faixa de 28 a 34ºC. Este resultado, que discorda do que é genericamente descrito na literatura especializada sobre cultivos em estado sólido, é um exemplo da importância de dispor-se de um biorreator de tambor rotativo de pequena escala como equipamento básico para a realização de estudos fundamentais a respeito deste tipo de processo. Adicionalmente, o fato de o corpo do reator ser construído em vidro permite a visualização do espaço interno do tambor rotativo e observar o efeito da agitação sobre o meio de cultivo. / In this work, details on the assembling of a solid state cultivation system, whose main component is a bench scale rotating-drum bioreactor, are described. The bioreactor was built in refractory glass and has an approximate volume of 6.2 liters. To assemble the equipment, the following aspects have been studied: geometry of the bioreactor; control of frequency and period of agitation; moistening, warming and controlling of the inlet air flux; mixing of cultivation medium; determination and control of medium temperature; sample withdrawn. The developed system was evaluated, being the cultivation of the pectinolytic enzymeproducing microorganism Aspergillus niger T0005/007-2 used as the model process. The fermentative tests were carried out in a medium containing wheat-straw as solid support and were used to evaluate the effects of three main parameters agitation, mass of cultivation medium and medium temperature on the cell growth and the production of endopolygalacturonase (endo-PG) by A. niger. For agitation of the solid medium, three modes were compared: no agitation; agitation of 1 rpm for 5 minutes each 2 hours; agitation for 1 hour and 55 minutes, each 2 hours. The second mode of agitation led to the best cell growth, 81 mg.g-1, and to endo-PG activity of approximately 80 U.g-1, similar to that obtained with the static system. With the third mode of agitation occurred, apparently, some damage to fungus mycelium and inferior results were achieved. The evaluation of the mass of cultivation medium on the process was done by loading the reactor with masses that result in the occupation of 30, 45 and 60% of the working volume of the bioreactor. With respect to the cell growth, the best result was attained with the smallest load of medium, whereas the intermediate load resulted in the highest endo-PG activity, 107.2 U.g-1. In the experiments on the influence of the temperature on the cultivation of A. niger, the largest endo-PG activity (80.6 U.g-1) was obtained in a process condition that allowed that the temperature reached values close to 45ºC. When the medium temperature was controlled at 30ºC, the endo-PG activity was substantially lower, 46.4 U.g-1. In the tests with the model process, no clearly positive influence of agitation on the production of endo-PG was observed. From the temperature-controlled experiments however, it is possible to suggest that endo-PG formation is favored by a stress condition for the microorganism, represented in this case by medium temperatures over 40ºC, since the optimal temperatures for A. niger growth is found in the range of 28 to 34ºC. This result disagrees from what is generically described in the specialized literature for the solid state cultivations, being this fact an example of the importance of having a small-scale rotating-drum bioreactor as a basic equipment for fundamental studies on that type of fermentative process. Additionally, the fact of the reactor body being built on glass allows the inspection of the internal space of the rotating drum and to observe the effects of agitation on the cultivation medium.