Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2003-05-26Bitstream added on 2014-06-13T19:19:38Z : No. of bitstreams: 1 watanabe_l_dr_sjrp.pdf: 4283837 bytes, checksum: 4fd2d1873c6c4b18af51c7364b914145 (MD5) / A cristalografia tem tido um papel significativo no melhoramento do nosso entendimento no modo de ação das molécular biológicas, resultando em abrangentes aplicações indústriais desta técnica. Dentro das grandes linhas de estudos envolvendo a enzima Álcool Desidrogenase Secindária (SADH) de bactérias termofílicas, essa pesquisa procurou entender as bases estruturais que controlam e regulam (i) a especificidade dela por seu substrato. Com o objetivo de aperfeiçoar suas atuais aplicações como um catalisador nas fermentações alcoólicas industriais e como catalisador em sínteses assimétricas nas indústrias faramcêuticas. Poderosas técnicas de mutagênese combinadas com cristalografia foram utilizadas. Mutações de resíduos (Gly 198 r Tyr218) que interagem com o cofator e são considerados importantes para a determinação da sua especificidade, foram planejados e executados com o objetivo de permitir o uso de um cofator alternativo que é viável para uso em escala industrial. Análises cinéticas do mutante Gly198 indicam que este é um potencial candidato e é um passo na direção certa. Mutações em aminoácidos que formam o sítio ativo foram conduzidos em um pesquisa para uma mutação com uma grande habilidade em reduzir cetonas, produzindo uma grande variedade de (R)-álcoois. Onze mutantes foram desenvolvidos e que podem exibir essas característica desejadas. Três destas enzimas mutantes foram cristalizadas e duas delas na presença de NADP e suas estruturas foram determinadas e refinadas com o objetivo de entender as bases estruturais da sua enantioseletividade para posterior desenvolvimento de uma enzima mais eficiente na utlização de cofator e produção de substratos específicos / Crystallography has played role in significantly improving our understanding of the mode of action of biological molecules resulting in wide industrial applications of thies technique.Within the framework of research dealing with Secondary Alcohol Dehydrogenases (SADHs) isolated from thermophilic bacteria, this project aims at understanding the strucutral basis which control and regulate (i) the specificity of this enzyme for the cafactor and (ii) its stereo and enantio selectivity for its substrate. With the aim of widening its realm of application as a catalyst in industrial fermentation of alcohols and as calyst in the asymmetric synthesis as applied pharmaceutically. The powerful techniques of mutagenesis combined with crystallography were utilized. Mutations of residues (Gly198 and Tyr218) wich interact with the cofactor and are considered important for determinimg its specificity were planned and executed in an attempt to permit the use of an alternative cofactor which is viable for use in an industrial scale. Kinetic analysis of the mutant (Gly198) indicates that this is a potential candiadate and is a step in the right direction. mutations of amino acids that form the active site were conducted in a search for a mutant with a greater ability to reduce ketones, producing a wide variety of r-alcohols

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-05-03Bitstream added on 2014-06-13T20:40:53Z : No. of bitstreams: 1 jacomini_dlj_dr_rcla_parcial.pdf: 158359 bytes, checksum: 5b3ccdcc2d04ce3c969f5033ea58d88b (MD5) Bitstreams deleted on 2015-05-28T14:25:07Z: jacomini_dlj_dr_rcla_parcial.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-05-28T14:26:12Z : No. of bitstreams: 1 000713709.pdf: 1594949 bytes, checksum: 3eda36f23e8872cc034c5b89501ce98a (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A vespa social Polybia paulista tem sido muito estudada nos campos da bioquímica, proteômica e imunologia pelas suas características de habitat, composição de seu veneno e pelas conseqüencias dos acidentes decorrentes de suas ferroadas. O cDNA de hialuronidase (GI: 302201582), um dos principais alérgenos desse veneno, foi clonado em vetores de expressão - pET-28a e pPICZA - em bactéria Escherichia coli DE3 (BL21) e em levedura Pichia pastoris, respectivamente. A proteína Hyal recombinante (Pp-Hyal-rec) de bactéria foi expressa em corpúsculos de inclusão, enquanto que a de levedura na forma solúvel. Ambas foram purificadas por cromatografia de afinidade em resina Ni2+ (Ni-NTA-Agarose). A proteína nativa de Hyal (Pp-Hyal-nat) também foi obtida e purificada até a homogeneidade por meio de cromatografia de troca catiônica em coluna Hiprep FF CM, acoplado a um sistema de Akta FPLC, e as análises realizadas por espectrometria de massa em MALDI ToF/ToF-MS. Anticorpos policlonais foram produzidos em camundongos BALB/c contra a Pp-Hyal-nat e a Pp-Hyal-rec de bactéria, demonstrando alta especificidade nos testes de imunoblotting realizados. Estes alérgenos foram avaliados quanto ao reconhecimento de imunoglobulina E (IgE) Pp-Hyal-específico no soro de pacientes sabidamente alérgicos ao veneno desta vespa. Os soros imunes foram capazes de reconhecer especificamente, em maior intensidade as bandas correspondentes à proteína Pp-Hyal-rec de bactéria (43 kDa) e a Pp-Hyal-rec de levedura (37 kDa) em relação ao alérgeno Pp-Hyal-nat (39 kDa). No extrato de veneno bruto de P. paulista, os soros reconheceram outras proteínas provavelmente correspondentes aos demais alérgenos do veneno, tais como Fosfolipase (37 kDa), Antígeno 5 (25 kDa), e proteases. Os dados aqui obtidos com ambos... / The social wasp Polybia paulista has been well studied in fields of biochemistry, proteomics and immunology due to its habitat characteristics, venom composition and the consequences of accidents arising from their stings. The hyaluronidase cDNA (GI: 302201582), one of the major venom allergens, was cloned into expression vectors - pET-28a and pPICZA - in Escherichia coli DE3 (BL21) and yeast Pichia pastoris, respectively. The recombinant protein Hyal (Pp-Hyal-rec) of bacteria was expressed in inclusion corpuscles, whereas the yeast in soluble form. Both were purified by affinity chromatography on Ni2+ (Ni-NTA-Agarose) resin. The native protein Hyal (Pp-Hyal-nat) was also obtained and purified to homogeneity by cation exchange chromatography on Hiprep CM FF column, to an Akta FPLC coupled system, and the analysis performed by mass spectrometry MALDI ToF / ToF-MS. Polyclonal antibodies were produced in BALB/c mice against Pp-Hyal-nat and Pp-Hyal-rec from bacteria, demonstrating an high specificity in the immunoblotting tests performed. These allergens were evaluated for recognition of immunoglobulin E (IgE) Pp-Hyal-specific in serum from patients known to be allergic to the venom of this wasp. The immune sera were able to recognize specifically in a higher intensity the bands corresponding to protein Pp-Hyal-rec of bacteria (43 kDa) and Pp-Hyal-rec of yeast (37 kDa) in relation to the allergen Pp-Hyal-nat (39 kDa). In the P. paulista crude venom extract, all sera recognized other proteins probably corresponding to other venom allergens, such as phospholipase (37 kD), antigen 5 (25 kDa), and protease. The data obtained here with both recombinant allergens strongly suggest the possibility of using... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-12-18Bitstream added on 2014-06-13T19:19:56Z : No. of bitstreams: 1 marques_dp_dr_arafcf.pdf: 1011746 bytes, checksum: 390ce3f3fe90df8ee33232cb2c868a7d (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação para o Desenvolvimento da UNESP (FUNDUNESP) / Os hidrolisados de proteínas do soro de queijo vêm sendo amplamente utilizados para diversos fins. Dependendo das enzimas utilizadas e meio de reação, podemos obter hidrolisados com diferentes características. O intuito do presente trabalho foi hidrolisar as proteínas do soro de queijo bovino de diferentes maneiras, variando-se a temperatura de reação e modo de adição das enzimas, a fim de se obter hidrolisados com diferentes graus de hidrólise para posterior aplicação em ensaios animais. Os hidrolisados escolhidos para aplicação nos ensaios biológicos foram obtidos pela ação das enzimas pepsina, tripsina, quimotripsina e carboxipeptidase a 50ºC. Dois hidrolisados diferentes foram preparados: um com maior quantidade de pequenos peptídeos (oligo, di e tripeptídeos) e outro com maior quantidade de aminoácidos livres. O soro sem hidrólise também foi utilizado como suplementação para um outro grupo de animais. A intenção foi testar os dois diferentes hidrolisados e o soro sem hidrólise como suplemento para ratos idosos, visando a minimização da sarcopenia. Diversos estudos apontam que fórmulas contendo oligopeptídeos, especialmente di- e tripeptídeos, possuem maior valor nutricional do que uma mistura equivalente de aminoácidos livres ou proteínas intactas. Tomando-se como base essa informação, delineou-se a pesquisa esperando-se que, o grupo suplementado com as proteínas parcialmente hidrolisadas obtivesse um melhor desempenho na minimização da sarcopenia. Todos os 3 grupos suplementados obtiveram aumento na massa muscular e óssea diferindo significativamente em relação ao controle (não suplementado) porem, o que apresentou efeitos mais positivos na minimização da sarcopenia foi realmente o grupo suplementado por proteínas parcialmente hidrolisadas. Paralelamente a esse estudo... / The cheese whey hydrolysates have been widely used for various purposes. Depending on the enzymes used and the reaction medium, we can obtain hydrolysates with different characteristics. The purpose of this study was to hydrolyze bovine cheese whey proteins in different ways, varying the temperature of reaction and enzyme addition, in order to obtain hydrolysates with different degrees of hydrolysis for application in animal tests. The hydrolysates chosen for application in biological assays were obtained by the action of enzymes pepsin, trypsin, chymotrypsin and carboxypeptidase at 50°C. Two different hydrolysates were prepared: one with a larger amount of small peptides (oligo-, di-and tripeptides) and another with larger amount of free amino acids. Serum without hydrolysis was also used as a supplement to another group of animals. The intention was to test the two different hydrolysates and whey without hydrolysis as a supplement to old age rats in order to minimize the sarcopenia. Several studies indicate that formulas containing oligopeptides, especially di-and tripeptides, have higher nutritional value than an equivalent mixture of free amino acids or intact proteins. Taking this information as a basis, the research was then outlined expecting that the group supplemented with partially hydrolyzed protein could obtain a better performance in reducing the sarcopenia. The all 3 supplemented groups showed increase in muscle mass and bone and differ significantly from control (not supplemented). However, the group who presented the most positive effects in reducing the sarcopenia was actually the group supplemented with partially hydrolyzed protein. In parallel with this study, in sandwich PhD, the attainment of immobilized pepsin and trypsin (derivatives) in solid support, stable was studied, for further application to obtain... (Complete abstract click electronic access below)

Submitted by Nicholas Tadeu Vannuchi da Costa Almeida null (nickvannuchi@gmail.com) on 2017-03-19T21:14:44Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Final Nicholas.pdf: 2021480 bytes, checksum: dc0768b26ab211662ab51597c3de24ec (MD5) / Rejected by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo a orientação abaixo: Incluir o número do processo de financiamento nos agradecimentos da dissertação/tese. Corrija esta informação e realize uma nova submissão com o arquivo correto. Agradecemos a compreensão. on 2017-03-22T13:15:24Z (GMT) / Submitted by Nicholas Tadeu Vannuchi da Costa Almeida null (nickvannuchi@gmail.com) on 2017-03-27T02:04:59Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Final Revisada.pdf: 1959716 bytes, checksum: c28329d635753862457d50d7697b98ec (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-03-29T17:36:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 almeida_ntvc_me_svic.pdf: 1959716 bytes, checksum: c28329d635753862457d50d7697b98ec (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-29T17:36:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 almeida_ntvc_me_svic.pdf: 1959716 bytes, checksum: c28329d635753862457d50d7697b98ec (MD5) Previous issue date: 2017-02-19 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O Instituto Nacional do Câncer (INCA) estima que em 2016 sejam registrados cerca de 12.600 novos casos pediátricos de câncer, sendo que 25% devem ser representados pela leucemia linfoide aguda (LLA). Todos os quimioterápicos utilizados no tratamento da LLA levam a diversos efeitos colaterais como: mutagenicidade, teratogenicidade, efeitos citotóxicos e alergias, sendo premente a necessidade da descoberta de novas drogas com efeitos indesejados reduzidos ou ausentes. Já foi demonstrado que em células tumorais a expressão de peroxidases é aumentada de modo a manter níveis adequados para o crescimento e evitar a apoptose. Em mamíferos, a peroxidase denominada de peroxirredoxina II (PrxII) aparenta ter papel fundamental na progressão e manutenção das células tumorais e e estudos recentes indicam que esta enzima possui altos níveis de expressão em células neoplásicas ao passo que sua inibição é capaz de tornar células neoplásicas mais suscetíveis ao tratamento com radioterapia ou mesmo induzir a diferenciação celular das células tumorais. Foi descoberto que o diterpenóide natural, adenantina (Adn), é capaz de inibir de forma bastante eficaz o crescimento celular in vitro e in vivo de células de LLA atuando sobre PrxII. Entretanto, não se tem informações de seus efeitos na leucemia linfoide aguda. O projeto tem como objetivos avaliar efeitos inibitórios em PrxII humana de moléculas isoladas em projetos anteriores, incluindo aquelas similares a Adn, oriundas da biota brasileira e também moléculas disponíveis comercialmente e também de avaliar os efeitos da ligação de moléculas sobre a estrutura de PrxII. Inicialmente foi avaliado o potencial inibitório de 33 moléculas selecionadas. Neste contexto, foram identificadas três moléculas com potencial inibitório significativo: 2,4 metoxichalcona (MCN), colina ácido fosfórico (CPA) e o ácido acetilsalicílico (ASA). Neste estudo foram detectadas maiores diferenças estruturais do complexo enzima-inibidor na seguinte ordem CPA > MCN > Adn >ASA. Cabe ressaltar que para CPA as diferenças foram bastante relevantes, sendo detectadas grandes divergências na quantidade de  hélices (15.9%) e fitas  (31.5 %) quando comparado com a enzima selvagem (25.2 e 27 %, respectivamente). A avaliação da estrutura quaternária revela que a proteínas tratadas com CPA apresentou duas forma oligoméricas de baixo peso molecular ao passo que a enzima sem CPA se mostrou decamérica. Ensaios em SDS-PAGE demonstraram forte interferência na formação de dissulfetos entre os monômeros da proteína quando exposta a CPA e MCN. Ensaios de citotoxicidade no entanto não demonstraram atividade citotóxica nas condições do ensaio. / FAPESP: 2015/04349-3

Orientador: Marcos Omir Marques / Coorientador: Luiz Carlos Tasso Júnior / Banca: Cláudio Lima de Aguiar / Banca: Tadeu Alcides Marques / Banca: Wanderley José de Melo / Banca: José Marques Júnior / Resumo: O estudo detalhado das partes constituintes do colmo de cana, por meio de análises bioquímicas e tecnológicas, pode possibilitar o conhecimento minucioso da qualidade do caldo e assim, auxiliar em diversas ações ao longo do processo de industrialização. Sendo assim, o presente trabalho foi conduzido com o objetivo de comparar diferentes partes do colmo de cultivares de cana-de-açúcar, e sua influência na qualidade da matéria-prima. As coletas dos colmos de cana ocorreram em área experimental da Fazenda de Ensino Pesquisa e Extensão da FCAV/UNESP-Jaboticabal, SP. As análises bioquímicas e tecnológicas foram realizadas no Laboratório de Tecnologia do Açúcar e Etanol da mesma Universidade. Os cultivares apresentaram diferenças em relação às variáveis estudadas, e o cultivar SP81-3250 apresentou os resultados mais satisfatórios. O caldo extraído dos entrenós apresentou maior porcentagem de sacarose aparente, teor de açúcares redutores totais, níveis de fósforo inorgânico e, menor teor de polissacarídeos e atividade enzimática da polifenoloxidase e peroxidase. De modo inverso, o caldo dos nós apresentou baixa qualidade, durante toda a safra, evidenciando assim menor predisposição para a produção de açúcar. O terço superior do colmo e a presença da casca apresentaram maior atividade enzimática, o que poderia proporcionar caldo de cana mais escuro, dificultando a produção de açúcar de qualidade. A região do colmo representada pelo entrenó obteve maior potencial de geração de bioenergia / Abstract: The detailed study of the constituent parts from sugarcane stalks by means of biochemical and technological analysis, may enable a thorough knowledge of the quality of the juice and thus aid in several actions throughout the process of industrialization. Therefore, this study was conducted in order to compare different parts of the sugarcane cultivars stlaks, and their influence on the quality of the raw material. The collections of the sugarcane stalks occurred in Fazenda de Ensino Pesquisa e Extensão from FCAV/UNESP-Jaboticabal, SP. The biochemical and technological analyzes were performed at the Laboratório de Tecnologia do Açúcar e Etanol in the same University. The cultivars showed differences in the studied variables, and the cultivar SP81-3250 showed the most satisfactory results. The juice extracted from internodes had a higher percentage of apparent sucrose level, total reducing sugars, inorganic phosphorus levels and lower content of polysaccharides and enzymatic activity of polyphenol oxidase and peroxidase. In reverse, node juice had low quality, throughout the crop, showing their lower predisposition to produce sugar. The upper third of the stalk and the presence of the bark showed higher enzyme activity, which could provide cane juice darker, hindering the production of quality sugar. The region of the stalk represented by internode got greater potential for bioenergy generation / Doutor

Orientador: Luciana Francisco Fleuri / Coorientador: Margarida Maria Barros / Banca: Pedro de Magalhães Padilha / Banca: Ruann Janser Soares de Castro / Banca: Fernanda Mani / Banca: Gabriela Alves Macedo / Resumo: Este estudo foi realizado para o rastreio da produção de fitase utilizando resíduos agroindustriais como substrato para fermentação em estado sólido (SSF) e várias cepas fúngicas. A alta produção de fitase foi observada para a maioria dos microrganismos estudados, bem como características muito diferentes actividades bioquímicas, incluindo a valores de pH específicos. As fitases mostrou um comportamento muito distinto de óptimo e estabilidade do pH, os valores ideais de temperatura e estabilidade. A. niger mostrou os maiores valores de atividade enzimática. Enzima liofilizada produzida por A. niger atingiu 8,575 U / g e rendimento de 826,096.50 U / Kg de substrato quando fermentado em farelo de trigo. Portanto, o substrato, bem como a estirpe de microorganismo pode alterar as características bioquímicas da enzima produzida. A alta atividade de fitase e características muito distintas estabelecidas, além do baixo custo de substratos, fazer estes fungos fitases alternativas potenciais para a indústria biotecnológica. / Abstract: This study was carried out for screening the phytase production using agroindustrial residues as substrate for solid state fermentation (SSF) and several fungal strains. High phytase production was observed for most of the microorganisms studied, as well as very different biochemical characteristics, including activities at specific pH values. The phytases showed very distinct behavior of optimum and stability pH, optimal values of temperature and stability. A. niger showed the higher values of enzyme activity. Lyophilized enzyme produced by A. niger reached 8,575 U/g and yield of 826,096.50 U/Kg of substrate when fermented in wheat bran. Therefore, the substrate as well as the microorganism strain can affect the biochemical character of the enzyme produced. The high phytase activity and very distinct characteristics established, plus the low cost of substrates, make these fungal phytases potential alternatives for biotechnological industry. / Doutor

Orientador: Izolete Aparecida Thomazini Santos / Banca: Newton Key Hokama / Banca: Michele Janegitv Acorsi Valério / Resumo: A Citogenética humana é o estudo dos cromossomos, sua estrutura e sua herança, aplicado à prática da genética médica. Há quase 50 anos as anomalias cromossômicas, alterações microscopicamente visíveis no número e/ou na estrutura dos cromossomos, podem ser responsáveis por uma série de condições clínicas denominadas aberrações cromossômicas, que constituem uma categoria de doenças genéticas constitucionais ou adquiridas. Diversas alterações foram descritas em doenças genéticas e doenças neoplásicas de origem hematológica, auxiliando no diagnóstico, prognostico, classificação e monitoramento da doença. O objetivo do presente estudo foi padronizar a técnica clássica em citogenética através da avaliação do bandeamento G pela digestão enzimática com tripsina e pela desnaturação com tampão citratado em alta temperatura, auxiliando na visualização do cariótipo. Neste estudo utilizamos amostras de sangue periférico de indivíduos normais. A cultura celular foi realizada pelo método de cultura in situ, seguindo a metodologia de Moorhead et al. modificada (1960). Em todos os casos foram obtidas metáfases adequadas para análise e o índice mitótico foi satisfatório. Os resultados obtidos pelo emprego de diferentes técnicas de bandeamento cromossômico revelaram que o bandeamento G pela ação enzimática da tripsina embora considerado padrão-ouro é mais sensível, trabalhoso e ocorre com um número maior de tentativas devido a variabilidade do tempo para que ocorra a degradação das proteínas, sendo necessário o retrabalho tornando-se ineficiente em amostras com baixo índice mitótico e aumentando consequentemente o custo do exame. Enquanto o bandeamento pela técnica utilizando tampão citratado em alta temperatura é simples, produtivo, ágil e de menor custo / Abstract: Human Cytogenetics is the study of chromosomes, their structure and their inheritance, applied to the practice of medical genetics. For nearly fifty years the chromosomal abnormalities, microscopically visible changes in the number and / or structure of chromosomes, may be responsible for a number of clinical conditions known as chromosomal aberrations, which are a category of constitutional or acquired genetic diseases. Several amendments were described in genetic diseases and neoplastic diseases of hematologic origin, aiding in the diagnosis, prognosis, classification and monitoring of the disease. The aim of this study was to standardize the classical technique in cytogenetics by evaluating the banding G by enzymatic digestion with trypsin and by denaturation with citrate buffer at high temperature, assisting in the karyotype view. In this study we used peripheral blood samples of normal individuals. Cell culture was performed by culturing in situ method, following the method of Moorhead et al. modified (1960). In all cases appropriate metaphases were obtained for analysis and the mitotic index was satisfactory. The results obtained by using different chromosome banding techniques revealed that the G banding by the enzymatic action of the trypsin although considered the gold standard it is more sensitive, cumbersome and it occurs with a larger number of retries due to a variability of the time for degradation of the proteins, requiring rework, this way becoming inefficient in samples with low mitotic index and consequently increasing the cost of the exam. While the banding technique using citrate buffer in high temperature is simple, productive, agile and less expensive / Mestre

Orientador: Raghuvir Krishnaswamy Arni / Banca: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Banca: Ana Marisa Chudzinsky-Tavassi / Banca: Francisco Javier Medrano Martin / Banca: Richard Charles Garratt / Resumo: A cristalografia tem tido um papel significativo no melhoramento do nosso entendimento no modo de ação das molécular biológicas, resultando em abrangentes aplicações indústriais desta técnica. Dentro das grandes linhas de estudos envolvendo a enzima Álcool Desidrogenase Secindária (SADH) de bactérias termofílicas, essa pesquisa procurou entender as bases estruturais que controlam e regulam (i) a especificidade dela por seu substrato. Com o objetivo de aperfeiçoar suas atuais aplicações como um catalisador nas fermentações alcoólicas industriais e como catalisador em sínteses assimétricas nas indústrias faramcêuticas. Poderosas técnicas de mutagênese combinadas com cristalografia foram utilizadas. Mutações de resíduos (Gly 198 r Tyr218) que interagem com o cofator e são considerados importantes para a determinação da sua especificidade, foram planejados e executados com o objetivo de permitir o uso de um cofator alternativo que é viável para uso em escala industrial. Análises cinéticas do mutante Gly198 indicam que este é um potencial candidato e é um passo na direção certa. Mutações em aminoácidos que formam o sítio ativo foram conduzidos em um pesquisa para uma mutação com uma grande habilidade em reduzir cetonas, produzindo uma grande variedade de (R)-álcoois. Onze mutantes foram desenvolvidos e que podem exibir essas característica desejadas. Três destas enzimas mutantes foram cristalizadas e duas delas na presença de NADP e suas estruturas foram determinadas e refinadas com o objetivo de entender as bases estruturais da sua enantioseletividade para posterior desenvolvimento de uma enzima mais eficiente na utlização de cofator e produção de substratos específicos / Abstract: Crystallography has played role in significantly improving our understanding of the mode of action of biological molecules resulting in wide industrial applications of thies technique.Within the framework of research dealing with Secondary Alcohol Dehydrogenases (SADHs) isolated from thermophilic bacteria, this project aims at understanding the strucutral basis which control and regulate (i) the specificity of this enzyme for the cafactor and (ii) its stereo and enantio selectivity for its substrate. With the aim of widening its realm of application as a catalyst in industrial fermentation of alcohols and as calyst in the asymmetric synthesis as applied pharmaceutically. The powerful techniques of mutagenesis combined with crystallography were utilized. Mutations of residues (Gly198 and Tyr218) wich interact with the cofactor and are considered important for determinimg its specificity were planned and executed in an attempt to permit the use of an alternative cofactor which is viable for use in an industrial scale. Kinetic analysis of the mutant (Gly198) indicates that this is a potential candiadate and is a step in the right direction. mutations of amino acids that form the active site were conducted in a search for a mutant with a greater ability to reduce ketones, producing a wide variety of r-alcohols / Doutor

Orientador: Pedro de Oliva Neto / Banca: Michel Brienzo / Banca: João Claudio Thomeo / Resumo: Os xilo-oligossacarídeos (XOs) e fruto-oligossacarídeos (FOs) apresentam atividades prebióticas, favorecendo a melhora nas funções intestinais, ação imunológica, antimicrobiana e outros benefícios à saúde. A produção dos XOs pode ser realizada pela utilização de materiais lignocelulósicos (MLCs). O objetivo deste trabalho foi aperfeiçoar a extração de hemicelulose a partir do bagaço de cana-de-açúcar, além de comparar a produção de XOs com xilanases de Trichoderma reesei QM 9414 e Aspergilus fumigatus M51. Foram feitos testes de digestibilidade "in vitro" e também de fermentação "in vitro" com bactérias probióticas e patogênicas para avaliar o potencial prebiótico de XOs produzidos por tratamento alcalino e compará-los com XOs e FOs comerciais. Os pré-tratamentos alcalinos desenvolvidos com 10% de KOH a 70ºC (tratamento 1) e com 5% de KOH a 121ºC (tratamento 3) se mostraram similares ao método que utiliza 24% de KOH a 35ºC (método ZD) para extração de hemicelulose, porém são mais simplificados e econômicos. O tratamento 1 apresentou redução de 54,1% de KOH e 1,98% de etanol e o tratamento 3 reduziu em 76,2% o KOH e 40,9% o etanol. Estes três experimentos de extração de hemicelulose foram selecionados para os testes de hidrólise enzimática com xilanases dos fungos T. reesei e A. fumigatus para produção de XOs. A hidrólise com enzimas de T. reesei se mostrou mais vantajosa apenas para produção de xilose (54,9%) em 24 horas, utilizando-se hemicelulose produzida pelo tratamento número 3. Testes com enzimas de A. fumigatus apresentaram melhor rendimento de XOs (27,1%) em 24 horas e menor rendimento de xilose (19,6%), com hemicelulose do tratamento 1 (XOs LABI). Experimentos de fermentação "in vitro" demonstraram a capacidade de Lactobacillus e Bifidobacterium fermentarem XOs e FOs (Resumo completo clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The xylo-oligosaccharides (XOs) and fructo-oligosaccharides (FOs) have prebiotic activities, improving bowel function, immunological and antimicrobial activity and other health benefits. XOs production can be accomplished by the use of lignocellulosic materials (LCMs). The goal of this work was to improve the hemicellulose extraction from sugarcane bagasse and to compare the XOs production using xylanases from Trichoderma reesei QM 9414 and Aspergillus fumigatus M51. We performed "in vitro" digestibility tests and also "in vitro" fermentation with probiotic and pathogenic bacteria to evaluate the prebiotic potential of XOs produced by alkali treatment and compared it with commercial XOs and FOs. Alkaline pretreatments developed with 10% KOH at 70° C (treatment 1) and 5% KOH at 121° C (treatment 3) were similar to the method using 24% KOH at 35° C (ZD method) for hemicellulose extraction, but they were more simplified and economical. Treatment 1 presented a reduction of 54.1% KOH and 1.98% ethanol and treatment 3 reduced KOH in 76.2% and ethanol in 40.9%. These three hemicellulose extraction experiments were selected for XOs production in the enzymatic hydrolysis tests with fungal xylanases of T. reesei and A. fumigatus. Hydrolysis with T. reesei enzymes proved advantageous only for xylose production (54.9%) at 24 hours, using hemicellulose produced by treatment number 3. Testing with A. fumigatus enzymes showed better XOs production (27.1%) at 24 hours and lower release of xylose (19.6%), using hemicellulose obtained by treatment 1 (XOs LABI). Fermentation experiments "in vitro" showed the ability of Lactobacillus and Bifidobacterium to ferment commercial XOs and FOs, emphasizing the preference of L. brevis and B. breve for commercial XOs while B. lactis and L. acidophilus demonstrated preference for commercial FOs. B. longum grew in both (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Márcia Regina Brochetto Braga / Banca: Ricardo de Lima Zollner / Banca: Susana Margarida Gomes Moreira / Banca: Mario Sergio Palma / Banca: Karen Cristiane Martinez de Moraes / Resumo: A vespa social Polybia paulista tem sido muito estudada nos campos da bioquímica, proteômica e imunologia pelas suas características de habitat, composição de seu veneno e pelas conseqüencias dos acidentes decorrentes de suas ferroadas. O cDNA de hialuronidase (GI: 302201582), um dos principais alérgenos desse veneno, foi clonado em vetores de expressão - pET-28a e pPICZA - em bactéria Escherichia coli DE3 (BL21) e em levedura Pichia pastoris, respectivamente. A proteína Hyal recombinante (Pp-Hyal-rec) de bactéria foi expressa em corpúsculos de inclusão, enquanto que a de levedura na forma solúvel. Ambas foram purificadas por cromatografia de afinidade em resina Ni2+ (Ni-NTA-Agarose). A proteína nativa de Hyal (Pp-Hyal-nat) também foi obtida e purificada até a homogeneidade por meio de cromatografia de troca catiônica em coluna Hiprep FF CM, acoplado a um sistema de Akta FPLC, e as análises realizadas por espectrometria de massa em MALDI ToF/ToF-MS. Anticorpos policlonais foram produzidos em camundongos BALB/c contra a Pp-Hyal-nat e a Pp-Hyal-rec de bactéria, demonstrando alta especificidade nos testes de imunoblotting realizados. Estes alérgenos foram avaliados quanto ao reconhecimento de imunoglobulina E (IgE) Pp-Hyal-específico no soro de pacientes sabidamente alérgicos ao veneno desta vespa. Os soros imunes foram capazes de reconhecer especificamente, em maior intensidade as bandas correspondentes à proteína Pp-Hyal-rec de bactéria (43 kDa) e a Pp-Hyal-rec de levedura (37 kDa) em relação ao alérgeno Pp-Hyal-nat (39 kDa). No extrato de veneno bruto de P. paulista, os soros reconheceram outras proteínas provavelmente correspondentes aos demais alérgenos do veneno, tais como Fosfolipase (37 kDa), Antígeno 5 (25 kDa), e proteases. Os dados aqui obtidos com ambos... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The social wasp Polybia paulista has been well studied in fields of biochemistry, proteomics and immunology due to its habitat characteristics, venom composition and the consequences of accidents arising from their stings. The hyaluronidase cDNA (GI: 302201582), one of the major venom allergens, was cloned into expression vectors - pET-28a and pPICZA - in Escherichia coli DE3 (BL21) and yeast Pichia pastoris, respectively. The recombinant protein Hyal (Pp-Hyal-rec) of bacteria was expressed in inclusion corpuscles, whereas the yeast in soluble form. Both were purified by affinity chromatography on Ni2+ (Ni-NTA-Agarose) resin. The native protein Hyal (Pp-Hyal-nat) was also obtained and purified to homogeneity by cation exchange chromatography on Hiprep CM FF column, to an Akta FPLC coupled system, and the analysis performed by mass spectrometry MALDI ToF / ToF-MS. Polyclonal antibodies were produced in BALB/c mice against Pp-Hyal-nat and Pp-Hyal-rec from bacteria, demonstrating an high specificity in the immunoblotting tests performed. These allergens were evaluated for recognition of immunoglobulin E (IgE) Pp-Hyal-specific in serum from patients known to be allergic to the venom of this wasp. The immune sera were able to recognize specifically in a higher intensity the bands corresponding to protein Pp-Hyal-rec of bacteria (43 kDa) and Pp-Hyal-rec of yeast (37 kDa) in relation to the allergen Pp-Hyal-nat (39 kDa). In the P. paulista crude venom extract, all sera recognized other proteins probably corresponding to other venom allergens, such as phospholipase (37 kD), antigen 5 (25 kDa), and protease. The data obtained here with both recombinant allergens strongly suggest the possibility of using... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor