Orientador: Fernando Carlos Pagnocca / Coorientador: André Rodrigues / Banca: Lara Durães Sette / Banca: Vanderlei Gerlado Martins / Banca: Paula Benevides de Morais / Banca: Aline Silva / Resumo: Atualmente, existe um crescente interesse em explorar diversos habitats, a fim de revelar a biodiversidade microbiana, incluindo as leveduras. Tal diversidade ainda não acessada guarda a descoberta de novas espécies para ciência, provavelmente muitas das quais com potencial para aproveitamento em processos biotecnológicos. Com o objetivo de explorar e conservar a diversidade de fungos, o Central de Recursos Microbianos da UNESP (CRM - UNESP) mantém em seu acervo várias estirpes de leveduras isoladas de ecossistemas diversos, sendo alguns deles pouco explorados. No início deste trabalho sabíamos que muitas das leveduras depositadas no acervo do CRM - UNESP não estavam totalmente caracterizadas tanto em nível taxonômico, quanto em relação ao potencial biotecnológico que poderiam apresentar. Portanto, o presente estudo foi desenhado para caracterizar e identificar taxonomicamente leveduras depositadas no CRM - UNESP, bem como selecionar estirpes que produzem enzimas extracelulares degradadoras de polissacarídeos como amilase, celulase, xilanase, pectinase e ligninase. Usando uma abordagem polifásica, um total de 340 isolados de leveduras foi identificado, sendo que 71,2% compreendem 43 taxa de ascomicetos e os restantes 28,8% foram classificados em 27 taxa de basidiomicetos. O estudo também levou à descoberta de 8 prováveis novas espécies. Baseado nesta constatação, a classificação taxonômica e análise filogenética foi realizada para duas espécies anamórficas de ascomicetos e uma espécie teleomórfica de basidiomiceto. A descrição destas três espécies é apresentada neste estudo. Os resultados demonstraram que Wickerhamiella kiyanii FB1-1DASPT e W. pindamonhangabaensis H10YT pertencem à clade Wickerhamiella da ordem Saccharomycetales... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In recent time, there has been an increasing interest in exploring diverse ecological habitats in order to reveal the yeast biodiversity. The increased awareness in the biotechnological potentials of yeasts has also spurred attempts to search for new species with novel biotechnological capabilities. Aiming to explore and conserve the fungal diversity from various ecosystems, the UNESP - Central for Microbial Resources (UNESP - CMR) harbors various strains of ecologically diverse yeasts isolates, some of which were yet to be identified. Therefore, this study was designed to identify and characterize some yeasts from the UNESP - MRC and to select strains possessing extracellular plant polysaccharide degrading enzymes namely amylase, cellulase, xylanase, pectinase and ligninase. Using a polyphasic approach, a total of 340 strains were identified. Taxonomic classification grouped 71.2% of these isolates into 43 ascomycetous taxa while the remaining 28.8% were classified in 27 basidiomycetous taxa. The study also led to the discovery of 8 putative new species. As a result, we classified two anamorphic species in the Ascomycota and one teleomorphic species in the Basidiomycota. In this study we provide the description of both species. Our results demonstrated that the two ascomycetous species proposed as Wickerhamiella kiyanii FB1-1DASPT and W. pindamonhangabaensis H10YT belong to the Wickerhamiella clade of the Saccharomycetales (Saccharomycetes) while the basidiomycetous species proposed as Bulleromyces texanaensis ATT064T belong to the Bulleromyces / Papiliotrema / Auriculibuller clade of the Tremellales (Agaricomycotina). In order to show the significance of intraspecific diversity in yeasts, in one of our studies, we subjected 11 strains, (including the type strain CBS 8960T) of Hannaella kunmingensis... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Atualmente à crescente a busca por uma alimentaÃÃo mais saudÃvel e com isso surge a possibilidade da inclusÃo de frutos e hortaliÃas nos hÃbitos alimentares. A manga à um fruto bastante consumido e produzido no Brasil e os minimamente processados (MP) representam praticidade porque sÃo produtos que jà vem prontos para consumo, sem perda de tempo com operaÃÃes de descasque, corte, etc. Durante as etapas de processamento hà um estresse dos tecidos, que leva à geraÃÃo de radicais livres que podem causar a degradaÃÃo do fruto, por isso, se faz necessÃrio a utilizaÃÃo de tratamentos capazes de minimizar as perdas de qualidade. Nesse contexto surge o ultrassom (US) que à uma tecnologia emergente com potencial de exploraÃÃo e utilizaÃÃo. As ondas ultrassÃnicas provocam principalmente a compressÃo e expansÃo dos tecidos, cujos resultados vÃo depender da matriz alimentar. Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito do US na qualidade de mangas âTommy Atkinsâ MP, analisando o sistema de defesa antioxidante, componentes do metabolismo oxidativo e a atividade de enzimas hidrolÃticas da parede celular. Para tanto, as amostras foram expostas à sonicaÃÃo na frequÃncia de 25 kHz por 30 minutos em banho de US. Observouâse que o tratamento causou uma reduÃÃo na acidez titulÃvel (AT) e nos sÃlidos solÃveis (SS), porÃm apÃs sete dias de armazenamento a 4 oC, manteve elevada a relaÃÃo SS/AT (46,54). Os teores de aÃÃcares tambÃm foram reduzidos (15%), bem como Ãgua foi incorporada (4,6%), o que mostra uma modificaÃÃo na estrutura celular, que pode ser comprovada pelo decrÃscimo na firmeza apÃs sete dias (de 241,73 para 139,38 N) e aumento na atividade da pectinametilesterase. A cor foi degradada apÃs sete dias (∆L = 3,24 e ∆C = 4,42), resultando em escurecimento, contudo as amostras controle tambÃm escureceram. Em relaÃÃo ao sistema antioxidante, nÃo houve grandes modificaÃÃes, tendo em vista ser um fator benÃfico se comparado a outros mÃtodos de conservaÃÃo, com destaque apenas para a perda de vitamina C (de 328,10 para 190,18 mg Ãcido ascÃrbico/kg matÃria fresca (MF)). Houve ainda reduÃÃo na peroxidaÃÃo de lipÃdios de membrana com o tratamento (de 23,58 para 18 ηmol MDA/g MF). Concluiâse com base neste estudo, que a aplicaÃÃo de US em mangas âTommy Atkinsâ MP tem seus pontos negativos na firmeza e na cor, contudo, nÃo afetou drasticamente os sistemas antioxidante enzimÃtico e nÃo enzimÃtico, alÃm de levar a uma reduÃÃo no teor de aÃÃcar. Todavia, fica claro a necessidade de explorar esta tecnologia na fisiologia pÃsâcolheita de frutos, assim como, otimizar e combinar a tÃcnica com outros processos que diminuam seus efeitos negativos e favoreÃam os positivos. / Currently is growing to search for healthier eating with that comes the possibility for inclusion of fruits and vegetables in the diet. Mango fruit is widely consumed and produced in Brazil and fresh â cut (FC) represents convenience because them are products that comes ready for consumption without loss of time with operations peeling, cutting, etc., and these steps there is a stress tissue leading to generation of free radicals that can lead to a degradation fruit, so it is necessary a type of processing that minimize the loss of quality and yet ensures the safety of the final product. In this context arises the ultrasound (US) that is an emerging technology that has potential for exploitation and utilization. The ultrasonic waves cause primarily tissue compression and expansion, whose the results will depend on the food matrix. This study aimed to evaluate the effect of US in quality of FC 'Tommy Atkins' mangoes, analyzing the antioxidant defense system, metabolism oxidative compounds and the activity of cell wall hydrolytic enzymes. The samples were exposed to 25 kHz frequency sonication for 30 minutes in US bath. It was observed tha t the treatment caused a reduction in titratable acidity (TA) and soluble solids (SS), but after seven days of storage at 4 o C, maintaining the high SS/TA ratio (46.54). The sugars was also reduced (15%) and water incorporated (4.6%), which indicates a change in cell structure, that can be evidenced by decreased in firmness after seven days (from 241.73 to 139.38 N) and increased activity of pectinmethylesterase. The color wa s degraded after seven days (ΔL = 3.24 and ΔC = 4.42), resulting in darkening, but the control samples also darkened. In relation to the antioxidant system, there were no significant changes in order to be a beneficial factor compared to other preservation methods, particularly only to the loss of vitamin C (328.10 to 190.18 mg ascorbic acid/kg weight fresh (WF), still there was a reduction in lipid peroxidation of membrane (from 23.58 to 18 η mol MDA/g WF). It concluded to base on this study, FC 'Tommy Atkins' mango has its drawbacks on firmness and color, however, did not affect severely the enzymatic and non â enzymatic antioxidant x systems, and lead to a reduction in sugar content. However, it is clear the necessitate to explore the application of this technology in post harvest fruits physiology as well as to optimize and to combine the technique with other processes that reduce their negative effects and promote the positives.

Submitted by Alisson Mota (alisson.davidbeckam@gmail.com) on 2015-06-15T20:20:22Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Aline Oliveira Barros.pdf: 151056 bytes, checksum: 60016ead165c5cb85f0e67185b407127 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-06-16T14:44:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Aline Oliveira Barros.pdf: 151056 bytes, checksum: 60016ead165c5cb85f0e67185b407127 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-06-16T14:48:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Aline Oliveira Barros.pdf: 151056 bytes, checksum: 60016ead165c5cb85f0e67185b407127 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-06-16T14:48:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação - Aline Oliveira Barros.pdf: 151056 bytes, checksum: 60016ead165c5cb85f0e67185b407127 (MD5) Previous issue date: 2012-02-24 / Não Informada / The skin is the largest organ in the human body and is intended to serve as a barrier against external agents. The loss of integrity of this tissue can cause injury or illness that can lead to death. The aging of the skin, which is also a natural process of the body, has its root causes and can be accelerated due to extrinsic causes, such as exposure to solar radiation, which causes physical changes to the skin, due to changes that occur in the connective tissue through the formation of lipid peroxides, contents of cells and enzymes and reactive oxygen species. Due to the important role in tissue remodeling processes in health and disease involving the skin, some studies have shown investigations with plant extracts as inhibitors of enzymes and antioxidants. The Libidibia ferrea Mart. is a tree that belongs to the family Leguminosae-Caesalpininoideae which grows in Brazil widely distributed in North and Northeast, especially in Pernambuco and Ceará. The species is popularly known as “jucá”, “pau-ferro”, “ibirá-obi”, “imirá-itá”, “muirá-obi”, “muiré-itá”. The phytochemical investigation of the hydroalcoholic extract of L. ferrea revealed the presence of flavonoids, saponins, tannins, curmarinas, steroids and other phenolic compounds, classes of substances already mentioned in the literature as potential antioxidants and enzyme inhibitors. We used extracts from the bark and pods of L. ferrea in different concentrations to perform the tests anti-elastase, anti-collagenase, anti-hyaluronidase test and in vitro antioxidant and in NIH3T3 murine fibroblast cells. The anti-elastase test, the skin showed inhibition constant average of 42% at concentrations of 63 μg / mL to 1000 μg / mL. In assessing the inhibitory activity of collagenase, it was found that the bark extract of L. ferrea showed no significant activity at the concentrations tested (25, 50 and 100 μg / mL), and inhibition of 15.2%. At the highest concentration tested (100 μg / mL) extract produced from the pod L. ferrea showed greater inhibition of enzyme activity compared with the extract made from the bark. Although the extracts of bark and pods of L. ferrea have been shown to be good scavengers of DPPH radicals in vitro test, the test cell with fibroblasts NIT3T3, extracts, in concentrations non-toxic, have not been able to capture radicals significantly. These results demonstrate that extracts of L. ferrea can be considered promising in studies on aging and skin diseases. / A pele é o maior órgão do organismo humano e tem finalidade de servir como barreira contra agentes externos. A perda da integridade deste tecido pode causar lesões ou doenças que podem levar a morte. O envelhecimento da pele, que também é um processo natural do organismo, tem suas causas intrínsecas e pode ser acelerado devido a causas extrínsecas, como a exposição à radiação solar, que provoca mudanças físicas para a pele, devido a alterações que ocorrem no tecido conjuntivo através da formação de peróxidos lipídicos, conteúdo das células e enzimas e espécies reativas de oxigênio. Devido ao papel importante na remodelação tecidual nos processos que envolvem saúde e doença da pele, alguns estudos tem mostrado investigações com extratos de plantas como inibidores de enzimas e antioxidantes. A Libidibia ferrea Mart. é uma árvore que pertence à família Leguminosae-Caesalpininoideae e que cresce em todo o Brasil largamente distribuída nas regiões Norte e Nordeste, principalmente em Pernambuco e no Ceará. A espécie é conhecida popularmente como jucá, pau-ferro, ibirá-obi, imirá-itá, muirá-obi, muiré-itáe. A investigação fitoquímica do extrato hidroalcoólico das cascas e folhas de L. ferrea revelou a presença de flavonóides, saponinas, taninos, curmarinas, esteróides e outros compostos fenólicos, classes de substâncias já citadas na literatura como potenciais antioxidantes e inibidores de enzimas. Foram utilizados extratos da casca e vagem de L. ferrea em diferentes concentrações para realizar os testes anti-elastase, anti-colagenase, anti-hialuronidase e teste antioxidante in vitro e em células de fibroblastos murinos NIH3T3. O teste anti-elastase, a casca mostrou inibição média constante de 42% nas concentrações de 63 μg/mL até 1000 μg/mL. Na avaliação da atividade inibitória da colagenase, verificou-se que o extrato da casca de L. ferrea não apresentou atividade importante nas concentrações testadas (25, 50 e 100 μg/mL), sendo a inibição de 15,2%. Na maior concentração testada (100 μg/mL). o extrato produzido a partir da vagem de L. ferrea apresentou maior inibição da atividade enzimática quando comparado com o extrato feito a partir da casca. Apesar dos extratos da casca e vagem de L. ferrea terem se mostrado bons varredores de radicais de DPPH no teste in vitro, no teste celular com fibroblastos NIT3T3, os extratos, em concentrações não tóxicas, não foram capazes de captar radicais de maneira significativa. Estes resultados demonstram que os extratos de L. ferrea podem ser considerados promissores nos estudos referentes a antienvelhecimento e doenças da pele.

O cobre está associado ao metabolismo de lipídios, sendo bastante importante na redução do colesterol, e à estabilidade oxidativa da carne, por fazer parte de algumas enzimas antioxidantes. Porém, quando na forma iônica, é considerado um elemento pró-oxidante. O cobre orgânico não apresenta esse efeito e, além disso, geralmente apresenta maior biodisponibilidade que fontes inorgânicas. Desse modo, o objetivo deste estudo foi determinar o efeito da suplementação com dois níveis e duas fontes de cobre (inorgânica e orgânica) sobre o desempenho, concentração de cobre no fígado, músculo e sangue, fermentação ruminal, parâmetros oxidativos e metabolismo de lipídios e colesterol. Trinta e cinco bovinos da raça Nelore em fase de terminação foram divididos em 5 grupos, com 7 animais por tratamento, conforme descrição: 1) C: Dieta controle, sem a suplementação adicional de cobre; 2) I10: suplementação de 10mg de Cu/kg de MS na forma de sulfato de cobre; 3) I40: suplementação de 40mg de Cu/kg de MS na forma de sulfato de cobre; 4) O10: suplementação de 10mg de Cu/kg de MS na forma de proteinato de cobre; 5) O40: suplementação de 40mg de Cu/kg de MS na forma de proteinato de cobre. A suplementação com cobre proporcionou maior concentração e acúmulo de Cu no fígado (p<0,05), sendo a maior média observada para o tratamento O40, porém, o status de Cu no músculo e no soro não foram alterados pelos tratamentos. A maior atividade da ceruloplasmina (p<0,05) foi observada para o tratamento I40. Não houve efeito significativo (p>0,05) para ganho de peso diário, ingestão de matéria seca, eficiência alimentar, rendimento de carcaça quente e fria, perda pelo frio, espessura de gordura subcutânea e área de olho de lombo dos bovinos, entre os tratamentos controle e suplementação com cobre inorgânico ou orgânico. O pH ruminal, os ácidos graxos voláteis e o nitrogênio amoniacal também não foram influenciados (p>0,05) pelos tratamentos. Em geral, a suplementação com cobre alterou o perfil de ácidos graxos da carne (p<0,05), com aumento na proporção de ácidos graxos insaturados em detrimento dos ácidos graxos saturados. Não houve efeito de tratamento para TBARS (substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico) no fígado e na carne embalada a vácuo (p>0,05), porém houve redução nos valores de TBARS na carne dos bovinos suplementados com Cu para as amostras dispostas no Display Life (tratamentos I40 e O40, p=0,06), e na atmosfera modificada (tratamentos I10, I40, O10 ou O40, p<0,05), em relação ao tratamento controle. A suplementação com Cu (tratamentos I40 e O40) aumentou a atividade da SOD (superóxido dismutase) (p<0,05), em relação ao tratamento controle, mas não influenciou a atividade da GSH-Px (glutationa peroxidase) (p>0,05). Não houve efeito da suplementação sobre triglicérides e colesterol no sangue; entretanto, em geral, houve redução da concentração de colesterol no músculo L. dorsi (p<0,05), em relação ao tratamento controle, através da redução (p<0,05) da concentração de GSH e da relação GSH/GSSG. / Copper is associated with lipid metabolism, becoming very important in reducing cholesterol, and with oxidative stability of meat, because it is part of some antioxidant enzymes. However, when in the ionic form, is considered a pro-oxidant element. The organic copper did not exhibit this effect and, besides, presents higher bioavailability than inorganic sources. Thus, the aim of this study was to determine the supplementation effect of two levels and two sources of copper (inorganic and organic) on the performance, Cu concentration in liver, muscle and blood, ruminal fermentation, oxidative parameters and metabolism of lipids and cholesterol. Thirty-five Nellore cattle in the finishing phase were divided into 5 groups with 7 animals per treatment, as described: 1) C: control diet, without additional Cu supplementation; 2) I10: 10mg Cu/kg DM, as Cu sulfate; 3) I40: 40mg Cu/kg DM, as Cu sulfate; 4) O10: 10mg Cu/kg DM, as Cu proteinate; 5) O40: 40mg Cu/kg DM, as Cu proteinate. Supplementation with copper provided higher Cu concentration and accumulation in the liver (p<0.05), with the highest mean observed for the O40 treatment, nevertheless the Cu status in muscle and serum were not affected by treatments. The highest activity of ceruloplasmin (p<0.05) was observed for the I40 treatment. There was no significant effect (p>0.05) for daily weight gain, dry matter intake, feed efficiency, hot and cold carcass yield, cold loss, backfat and loin eye area of cattle, among control treatment and supplementation with inorganic or organic copper. Ruminal pH, volatile fatty acids and ammonia were not influenced (p>0.05) by treatments. In general, copper supplementation altered the meat fatty acid profile (p<0.05), with an increase in the proportion of unsaturated fatty acids over saturated fatty acids. There was no treatment effect for TBARS (thiobarbituric acid reactive substances) in liver and meat vacuum packed (p>0.05), but there was a reduction in TBARS values in meat from cattle supplemented with Cu for samples prepared on Display Life (treatment I40 and O40, p=0.06), and modified atmosphere (treatment I10, I40, O10 and O40, p <0.05), compared to the control treatment. Supplementation with Cu (treatment I40 and O40) increased the activity of SOD (superoxide dismutase) (p<0.05) compared to control treatment, but did not influence the activity of GSH-Px (glutathione peroxidase) (p>0.05). There was no effect of supplementation on triglycerides and cholesterol in blood, however, there was a reduction in cholesterol concentration in L. dorsi muscle (p<0.05) compared to the control treatment, by reducing (p<0.05) of GSH concentrations and the GSH/GSSG ratio.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 462290.pdf: 2133615 bytes, checksum: 5c5628b9cc5fd71ee1dcc7d68f182c36 (MD5) Previous issue date: 2014-08-22 / Tuberculosis (TB) is an infectious disease caused mainly by Mycobacterium tuberculosis. The increasing number of infected patients among immune compromised populations and emergence of drug-resistant strains has created urgent need of new strategies to treat TB. Understanding relevant pathways (as the purine salvage) will reveal details of M. tuberculosis that might be used to develop new strategies to combat this pathogen. Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT) is an enzyme from the purine phosphoribosyltransferase (PRTase) family and catalyzes the conversion of hypoxanthine or guanine and 5-phosphoribosyl-&#945;-1-pyrophosphate (PRPP) to inosine 5 -monophosphate (IMP) or guanosine 5 -monophosphate (GMP), and pyrophosphate (PPi). Here we describe the mode of action of M. tuberculosis HGPRT (MtHGPRT) through kinetic and thermodynamical analysis. Experiments were also performed to determine the oligomeric state in solution, pH, temperature and solvent isotope effects. These data allows us to compare MtHGPRT to homologues from other species and look for similarities and differences in its mechanism and constants. We hope the experiments presented here will contribute to the understanding of this pathogen purine salvage pathway. / A Tuberculose (TB) ? uma doen?a infecciosa causada principalmente por Mycobacterium tuberculosis. O aumento de pacientes infectados entre a popula??o imunocomprometida e a emerg?ncia de cepas resistentes a drogas criam uma necessidade de novas estrat?gias para tartar a TB. Entender como funcionam as vias metab?licas relevantes, como a via de salvamento de purinas, poder? revelar detalhes do M. tuberculosis que poder?o ser ?teis para o desenvolvimento de novas estrat?gias de combate a este pat?geno. A hipoxantina-guanina fosforribosiltransferase (HGPRT) ? uma enzima da familia das purina fosforribosiltransferases (PRTase) e catalisa a convers?o de hipoxantina ou guanina e 5-fosforribosilpirofosfato-&#945;-1-pirofosfato (PRPP) em inosina 5 -monofosfato (IMP) ou guanosina 5 -monofosfato (GMP) respectivamente, com a libera??o de pirofosfato inorg?nico (PPi). Aqui n?s descrevemos o modo de a??o da HGPRT de M. tuberculosis (MtHGPRT) atrav?s de an?lises cin?ticas e termodin?micas. Tamb?m foram realizados experimentos para determinar o estado oligom?rico da enzima em solu??o e os efeitos de pH, temperatura e efeitos isot?picos do solvente. Esses dados nos permitem comparar a MtHGPRT com hom?logos de outras esp?cies e procurar por similaridades e diferen?as nos seu mecanismo e constantes. N?s esperamos que os experimentos apresentados aqui contribuam para o entendimento da via de salvamento de purinas desse pat?geno.

A Doença de Pompe (DP), também conhecida como Doença de Armazenamento do Gligogênio Tipo II, é uma doença lisossômica de depósito (DLD) causada pela deficiência da enzima α-glicosidase ácida (GAA). A GAA catalisa a clivagem das ligações glicosídicas α-1,4 e α-1,6 da molécula de glicogênio, e sua deficiência gera um acúmulo intralisossomal de glicogênio em vários tecidos. Esse acúmulo é expressivo no tecido muscular, e com isso surge o aparecimento dos sintomas clínicos. Clinicamente, a DP manifesta-se através de um amplo espectro de fenótipos, que apresentam em comum a ocorrência de fraqueza muscular progressiva. O diagnóstico da DP é realizado através da medida da atividade enzimática em células sanguíneas e tecidos ou por análise da mutação gênica. O padrão-ouro para o diagnóstico é a medida da atividade da GAA em amostras de fibroblastos e, embora este tipo de diagnóstico seja definitivo, amostras de sangue também estão sendo utilizadas. A medida da atividade das enzimas lisossomais vem sendo atualmente realizada em amostras de sangue impregnado em papel filtro (SPF) como método de triagem neonatal e de populações de alto risco. Sabendo que a Terapia de Reposição Enzimática para DP já está disponível e melhora a sobrevida dos pacientes, o diagnóstico precoce da DP é essencial, deve ser adequado e de fácil acesso para que o tratamento inicie cedo e seja mais eficaz. Assim, este estudo teve como objetivo avaliar algumas caracteristicas bioquímicas e cinéticas da enzima em amostras de leucócitos totais e SPF de modo a observar as diferenças quanto ao seu comportamento, entre controles e pacientes, estabelecer valores de coeficientes de variação para as técnicas e observar o efeito do uso de diferentes concentrações do inibidor acarbose. A GAA de pacientes com DP mostrou um comportamento diferente do observado em controles saudáveis em termos dos parâmetros analisados (Km, Vmax, estabilidade térmica), em leucócitos totais. Em SPF, GAA mostrou um comportamento diferente do observado nos controles saudáveis em termos de pH ótimo e estabilidade térmica; e valores de Km e Vmax para GAA foram estabelecidos somente em SPF de controles saudáveis. O uso do inibidor acarbose é essencial para a análise enzimática da GAA em amostras de leucócitos totais e SPF por inibir seletivamente a isoenzima MGA e assim, garantir o diagnóstico da DP. Os valores de coeficiente de variação estabelecidos para as técnicas em leucócitos e SPF estão dentro do aceitável e expressam boa precisão e reprodutibilidade das técnicas. A técnica fluorimétrica usando o substrato 4- Metilumbeliferil-α-D-glicopiranosideo em leucócitos é confiável podendo ser utilizada para diagnóstico definitivo e padrão da Doença de Pompe; em SPF, pode contribuir para melhorar a triagem desta doença, diferenciando pacientes com PD de indivíduos normais, tornando o processo de investigação e diagnóstico mais preciso e confiável. / Pompe disease (PD), also known as Glycogen Storage Disease Type II, is a lysosomal storage disorder (LSD) caused by the deficiency of the acid α-glucosidase enzyme (GAA). GAA catalyzes the cleavage of the glycosidic bonds α-1,4 and α-1,6 of the glycogen molecule, and when GAA activity is deficient glycogen accumulates intralysosomally in several tissues. This accumulation is significant in muscle tissue, which leads to the onset of clinical symptoms. Clinically, PD is manifested through a wide escpectro phenotypes, which have in common the occurrence of progressive muscle weakness. PD is diagnosed by measuring GAA activity in blood cells and tissues or by gene mutation analysis. The gold standard for diagnosis is the measurement of GAA activity in fibroblast samples and although this diagnosis is definitive, blood samples are also being used. Lysosomal enzyme activity currently has been measured in dried blood spot (DBS) samples as a method for screening newborns and high-risk populations. Since enzyme replacement therapy is already available for PD and improves patient life expectancy, the early PD diagnosis is crucial and must be appropriate and easily available so that the treatment can be initiated early and be more effective. Thus, this study aimed to evaluate some biochemical and kinetic characteristics of the enzyme in samples of total leukocytes and DBS in order to observe the differences in behavior between controls and patients, establish values of coefficients of variation for the techniques and observe the effect of using different concentrations of inhibitor acarbose. GAA from PD patients showed a different behavior from that observed in healthy controls in terms of the analyzed parameters (Km, Vmax, thermal stability) in total leukocytes. In DBS, GAA showed a different behavior from that observed in healthy controls in terms of optimum pH and thermal stability. Km and Vmax values for GAA were established only in DBS healthy controls. The use of acarbose inhibitor is essential for enzymatic analysis of GAA in total leukocyte and DBS samples for selectively inhibiting MGA isozyme and thereby secures the diagnosis of PD. The coefficients of variation values established for techniques in leukocytes and DBS are acceptable, precise, and can be appropriately reproduced. The fluorimetric technique using 4- methylumbelliferyl-α-D-glucopyranoside substrate in leukocytes is reliable and can be used for definitive diagnosis of Pompe disease; in DBS, can help to improve the screening of this disease, differentiating PD patients from normal individuals, making the research process and more accurate and reliable diagnosis.

Orientador: Priscila Lupino Gratão / Resumo: A seca é um problema substancial que afeta negativamente parte das áreas de cultivo de cana-de-açúcar, o que limita a produção das lavouras. O déficit hídrico provoca uma redução no crescimento e desenvolvimento das plantas devido à superprodução descontrolada de espécies reativas de oxigênio (ERO). Por outro lado, a aplicação de herbicidas para controle de plantas daninhas é uma estratégia muito usual de manejo nas culturas para manter altos índices de produtividade, mesmo quando as culturas são afetadas por condições adversas, como a seca. Assim, o objetivo deste trabalho foi investigar as diferentes respostas bioquímicas e no crescimento de duas cultivares de cana-de-açúcar, um tolerante à seca (CTC 9002) e outra tolerante a herbicidas (CTC 2), que caracterizem maior tolerância a condição de déficit hídrico associada à aplicação de herbicidas com diferentes mecanismos de ação. Os tratamentos foram dispostos em esquema fatorial triplo 2 x 2 x 3, sendo o fator cultivares CTC2 e CTC9002, fator condição hídrica de 70% ou 35% da capacidade de campo e fator herbicida, ametrina (1750 g i.a. ha-1), sulfentrazone (700 g i.a. ha-1) ou sem aplicação. A peroxidação lipídica, as concentrações de H2O2 e prolina; as atividades antioxidantes das enzimas superóxido dismutase (SOD, EC 1.15.1.1), catalase (CAT, EC 1.11.1.6), ascorbato peroxidase (APX, EC 1.11.1.11), glutationa redutase (GR, EC 1.6.4.2); e o acúmulo de massa seca da parte aérea e da raiz foram analisados. A aplicação do herbi... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Drought is currently a substantial problem worldwide, affecting part of sugarcane grown areas, and it is the main yield-limiting factor of crops. Drought stress provokes a reduction in growth and development due to uncontrolled overproduction of reactive oxygen species (ROS). By the other way, herbicide application to control weeds is a common crop management strategy to maintain high sugarcane yields, even when crops are affected by adverse conditions, such as drought. Thus, the aim of this study was to investigate differences in biochemical and growth responses of two sugarcane genotypes, drought-and herbicide-tolerant, which characterize a greater tolerance to drought stress condition combined to herbicides application with different modes of action. The treatments were arranged in a 2 x 2 x 3 triple factorial scheme, with the cultivar factor CTC2 and CTC9002, a water condition factor of 70% or 35% of field capacity and herbicide factor, ametryn (1750 g a.i ha-1 ), sulfentrazone (700 g a.i ha -1 ) or without application. Lipid peroxidation, H2O2 and proline content; the activities of superoxide dismutase (SOD, EC 1.15.1.1), catalase (CAT, EC 1.11.1.6), ascorbate peroxidase (APX, EC 1.11.1.11), glutathione reductase (GR, EC 1.6.4.2); and shoot and root dry mass accumulation were analyzed. The ametryn herbicide application was harmful to sugarcane plants due to the higher lipid peroxidation and root dry mass reduction. Increased GR activity in response to sulfentrazone appli... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Luis Henrique Souza Guimarães / Banca: Saulo Santesso Garrido / Banca: Hamilton Cabral / Resumo: As invertases ou β-D-frutofuranosidases (EC 3.2.1.26) são responsáveis pela produção da mistura equimolar de glicose e frutose, conhecida como açúcar invertido, através da hidrólise da ligação β 2-1 da molécula de sacarose. Essa mistura apresenta sabor mais doce que a sacarose e é destinada à diversos fins na indústria alimentícia (doces, xaropes, leite condensado e bebidas). É importante destacar que o produto obtido por hidrólise enzimática é bastante superior ao obtido por hidrólise ácida. A hidrólise catalisada pela enzima β-D-frutofuranosidase produz um xarope de alta qualidade com ausência de hidroximetilfurfural e sem desenvolvimento de cor. Diante do interesse industrial e biotecnológico, e das diversas aplicações dessa enzima, o objetivo deste trabalho foi investigar a produção de β-D-frutofuranosidase extracelular pelo fungo filamentoso Aspergillus niveus através de Fermentação em Estado Sólido (FES) purificando-a e caracterizando-a bioquimicamente. Entre os substratos testados em FES, a maior produção β-D-frutofuranosidásica foi obtida em casca de mandioca, com granulometria de 10 mesh, umidificada na proporção de 1:1 com água de torneira, a uma temperatura de 30ºC com umidade relativa de 30%, por um período de 9 dias de incubação. A β-D-frutofuranosidase extracelular obtida em FES foi purificada 6,53 vezes com recuperação de 5,27%, obtendo-se em SDS-PAGE 8% uma única banda protéica (37 kDa), e massa molecular nativa de 91,2 kDa estimada por Sepharose CL-6B. A temp... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The invertases or β-D-fructofuranosidases (EC 3.2.1.26) are responsible for the production of an equimolar mixture of glucose and fructose, known as invert sugar, by hydrolysis of β 2-1 bond of the sucrose molecule. This mixture is sweeter than sucrose and is intended for various purposes in the food industry (sweets, syrup, condensed milk and drinks). It is important to note that the product obtained by enzymatic hydrolysis is much higher than that obtained by acid hydrolysis. The hydrolysis catalyzed by β-D-fructofuranosidase enzyme produces a high-quality syrup without hydroxymethylfurfural and color development. Before the industrial and biotechnological interest, and the various applications of this enzyme, the aim of this study was to investigate the production of the extracellular β-D-fructofuranosidase by filamentous fungus Aspergillus niveus under Solid Fermentation State (SSF) purifying it and characterizing it biochemically. Among the substrates tested in the SSF, the highest yield of β-D-fructofuranosidase was obtained in cassava hulls with a particle size of 10 mesh, humidified in the ratio 1:1 with tap water and maintained at 30°C with a relative humidity of 30%, for 9 days of incubation. The extracellular β-Dfructofuranosidase obtained in SSF was purified 6.53-folds with a recovery of 5.27%. A single protein band (37 kDa) was obtained in 8% SDS-PAGE and the native molecular mass was estimated as 91.2 kDa by Sepharose CL-6B. The optimum temperature and pH for ac... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Los flavivirus se encuentran distribuidos en las principales zonas tropicales del mundo, nuestra Amazonía es endémica para virus como el dengue; sin embargo, alberga también otros virus que aún no han sido estudiados. El objetivo fue determinar la presencia de anticuerpos neutralizantes contra los virus Rocío, Ilheus y Oeste del Nilo; utilizando la técnica del ELISA como tamizaje para la detección de muestras positivas y la microneutralización como prueba confirmatoria. Se analizaron un total de 400 sueros por ELISA IgG de personas en fase convaleciente de la localidad de Iquitos entre los años 2003 y 2007. 152 sueros fueron negativos y 248 dieron positivo por ELISA IgG, de las cuales se confirmó mediante microneutralización 23 sueros positivos para el virus Ilheus y 7 sueros positivos para el virus Rocío. El valor de reacción cruzada para la prueba de ELISA fue de 87%. Los resultados indican la existencia de anticuerpos neutralizantes contra el virus Ilheus en un 5.75% de los sueros analizados y también la presencia de anticuerpos neutralizantes contra el virus Rocío en un 1.75% de los sueros, afortunadamente las infecciones por estos virus en la localidad de Iquitos no es significativa con respecto a la observada para el virus dengue (34.7%). / The flavivirus are distributed in major tropical areas around the world, our Amazonia is endemic to viruses such as dengue, but also houses many others which have not yet been studied. The aim was to evaluate the presence of neutralizing antibodies against Rocio, Ilheus and West Niles viruses using the technique of ELISA as screening for the detection of positive samples and the microneutralization as confirmatory test. Were analyzed a total of 400 sera by Elisa IgG from people in convalescent phase of the city of Iquitos during the years 2003 - 2007. 152 were negative and 248 were positive by Elisa IgG, of which was confirmed by microneutralization 23 sera positive for the virus Ilheus and 7 sera positive for the virus Rocio. The value of cross-reactivity for the ELISA was 87%. The results indicate the existence of neutralizing antibodies against the Ilheus virus in 5.75% of the sera analyzed and the presence of neutralizing antibodies against the Rocio virus in 1.75% of the sera. Fortunately the presence of these viruses in the city of Iquitos is not significant compared to that observed for the dengue virus (34.7%). / Tesis

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Describe la purificación y caracterización bioquímica, estructural y funcional del principio coagulante del veneno de la serpiente endémica del Perú Bothrops pictus, denominada pictobina. La enzima es purificada por la combinación de tres pasos cromatográficos, empleando intercambio catiónico CM-Sephadex C-50 seguida de dos pasos de filtración molecular en Sephadex G-100 y Sephadex G-75 respectivamente. La Pictobina es una glicoproteína monomérica con una masa molecular de 49 kDa medida por PAGE-SDS bajo condiciones reductoras y de 41 kDa por MALDI-TOF-TOF. El contenido de carbohidratos es de aproximadamente 45% de la masa y pueden ser removidos por deglicosilación con PNGasa F. Los carbohidratos asociados detectados fueron hexosas (25.76%), hexosaminas (13.12%) y ácido siálico (0.76%). La secuencia N-terminal (VIGGDECNINEHRFLAFTYS) muestra semejanza con las enzimas similares a trombina. La Pictobina tiene actividad coagulante sobre plasma humano y fibrinógeno humano y bovino. La actividad coagulante específica de la enzima es equivalente a 131.1 NIH U/mg de trombina liberando solo el fibrinopéptido A del fibrinógeno humano y tuvo un efecto defibrinogenante en roedores. La enzima produce una malla de fibrina porosa visualizada por microscopía electrónica de barrido, así como agregación plaquetaria. La Pictobina posee actividad catalítica sobre los sustratos sintéticos BApNA, S-2266, S-2302, S-2160 y S-2238. El tripéptido sintético D-Val-Leu-Arg-pNa el cual es considerado como el mejor sustrato. La actividad amidolítica es inhibida por PMSF, DTT y 2-β mercaptoetanol. La enzima muestra estabilidad a diferentes temperaturas (25 a 55°C), valores de pH (5.0 a 11.0) o en presencia de iones (Mg+2, Mn+2, Ca+2, Na+ y K+) pero es inhibida por el Zn+2. La enzima interacciona con el inhibidor endógeno α:2-macroglobulina y con el suero antibotrópico polivalente. La deglicosilación de la enzima produjo alteración en la actividad y el reconocimiento del antiveneno. El cDNA de la Pictobina (760 pb) codifica una proteína madura de 233 aminoácidos que conserva dominios estructurales con otras enzimas similares a trombina como el sitio catalítico (His40, Asp89 y Ser179) y los sitios de unión a sustrato S1, S2 y S3. Se identifican tres motivos para la N glicosilación. El modelamiento de la Pictobina revela un plegamiento tipo quimotripsina presentando un bolsillo hidrofóbico sobre su superficie, involucrado en el reconocimiento del sustrato y un importante bucle 90’s clave en la restricción del sitio catalítico. Los análisis de interacción molecular revelan que los residuos Phe194 y Trp195 de la Pictobina forman una interacción estable con los residuos Gly13, Gly14 y Val15 del fibrinopéptido A posicionando el puente de los residuos Arg16 y Gly17 del sustrato para el clivaje en el sitio catalítico. Tomando en conjunto estos resultados, se concluye que Pictobina es una enzima similar a trombina presente en el veneno de la serpiente Bothrops pictus. / Tesis