Submitted by Setor de Tratamento da Informa??o - BC/PUCRS (tede2@pucrs.br) on 2015-07-08T21:47:56Z No. of bitstreams: 1 471802 - Texto Parcial.pdf: 3735530 bytes, checksum: 4d5d2bdf0acc100c891cf110e11d4904 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-08T21:47:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 471802 - Texto Parcial.pdf: 3735530 bytes, checksum: 4d5d2bdf0acc100c891cf110e11d4904 (MD5) Previous issue date: 2015-03-23 / Biomolecular recognition processes are intrinsically related to protein flexibility. To understand how ligands interact with its partners, how proteins can cooperate with each other, or why aggregation process occurs, are particularly important, not only to biophysics, but also in the rational drug design process. X-ray crystallography, nuclear magnetic resonance, and molecular dynamics simulations are broadcasted approaches used to try to comprehend flexibility in biological macromolecules, although, this is not an easy task. This Ph.D. thesis will discuss the role of the flexibility using two different systems, (i) Mycobacterium tuberculosis EPSP synthase and (ii) Calmodulin from Mus musculus. Our main goal with this first system was to analyse in detail the structural information of the EPSP synthase, using molecular dynamics simulation. As a result, we have hypothesised how EPSP synthase flexibility could affect its activity, as well as its implications in the process of molecular docking experiments. Calmodulin project was developed during a ten month internship at the University of Cambridge. Our main goal was to study the influence of peptide mutated sequences in the process of molecular recognition, using nuclear magnetic resonance and isothermal titration calorimetry. As a product of this work, we have observed the impact of the linker domain to the peptide recognition, as well as, we have presented the importance of the entropy? enthalpy balance in the association with Calmodulin. / O reconhecimento biomolecular est? diretamente ligado ? capacidade de uma prote?na a suportar mudan?as conformacionais, ou seja sua plasticidade. Compreender como ocorre a associa??o de ligantes com seus receptores, como prote?nas se interrelacionam, porque ocorrem os processos de agrega??o, s?o de extrema import?ncia, n?o apenas para a ?rea da biof?sica, como tamb?m para o desenho racional de f?rmacos. T?cnica como cristalografia por difra??o de raios X, resson?ncia magn?tica nuclear e din?mica molecular, s?o algumas das principais abordagens para o estudo da flexibilidade em macromol?culas biol?gicas. No entanto, esta n?o ? uma tarefa simples. Esta tese de doutorado versar? sobre o papel da flexibilidade em dois sistemas distintos, (i) a enzima EPSP sintase de Mycobacterium tuberculosis e (ii) a prote?na Calmodulina de Mus musculus. A Parte 1 trar? como modelo de estudo a enzima EPSP sintase de Mycobacterium tuberculosis. O nosso objetivo com esta parte foi analisar em detalhes as informa??es estruturais desta enzima, por meio da t?cnica de din?mica molecular. Como resultados, propomos como a flexibilidade pode atuar na modula??o da atividade enzim?tica, a hip?tese dos cinco m?nimos locais de energia, bem como, suas implica??es para o processo de docagem molecular a partir de uma estrutura. A Parte 2 foi desenvolvida durante o per?odo de doutorado sandu?che e teve como alvo a prote?na Calmodulina de Mus musculus. O objetivo na Parte 2 desta tese foi estudar a influ?ncia de muta??es no processo de reconhecimento molecular com a Calmodulina, por meio das t?cnicas de resson?ncia magn?tica nuclear e calorimetria por titula??o isot?rmica. Como resultados, observamos a influ?ncia da regi?o de dobradi?a para o reconhecimento dos pept?deos avaliados, bem como, um processo de balan?o entr?pico?ent?lpico na associa??o destas mol?culas.

Introdução: Rhipicephalus microplus é um parasito importante na bovinocultura. Novas estratégias de controle dependem de um maior entendimento da sua fisiologia e da relação parasito-hospedeiro, e moléculas envolvidas na aquisição e digestão de sangue são alvos interessantes. Objetivo: determinar o mecanismo de ação do inibidor de coagulação BmGTI (Boophilus microplus Midgut Thrombin Inhibitor). Metodologia: BmGTI foi obtido a partir do homogenato de intestino de fêmeas de R. microplus parcialmente ingurgitadas utilizando técnicas de cromatografia de troca iônica, gel filtração e afinidade por trombina. A atividade inibitória foi monitorada pelo ensaio de coagulação do fibrinogênio induzida por trombina. A preparação de BmGTI foi avaliada por SDS-PAGE e analisada por LC-MS/MS. A provável ORF de BmGTI foi clonada no plasmídeo pPIC9, expressa em Pichia pastoris e purificada. Diferentes razões molares de trombina:rBmGTI foram examinadas para atividade inibitória de trombina sobre a clivagem do fibrinogênio em pH 7,5. E64 foi usado para bloquear o sítio ativo de rBmGTI e o ensaio de inibição foi realizado. Diferentes razões molares de trombina:rBmGTI foram incubadas e analisadas por SDS-PAGE para verificar interações entre as proteases. A atividade de rBmGTI sobre o fibrinogênio foi analisada pela incubação de ambos. Resultados e Discussão: Baseado na m/z dos fragmentos trípticos de BmGTI sua sequência foi identificada como BmCL1, uma catepsina Llike protease ativa em pH ácido, mas sem capacidade de hidrolisar substrato sintético em pH ≥7,0. rBmCL1/BmGTI foi expressa em P. pastoris como próenzima e após ativação, a enzima foi purificada. Diferentes razões molares de trombina:rBmCL1/BmGTI foram ensaiadas; quando a concentração de rBmCL1/BmGTI estava 64 vezes maior do que a de trombina, esta apresentou atividade residual de 37%. Quando rBmCL1/BmGTI teve seu sítio ativo bloqueado por E64, não houve inibição da atividade de trombina sobre fibrinogênio. A análise do fibrinogênio por SDS-PAGE, após incubação com rBmCL1/BmGTI, mostrou que as cadeias α e β do fibrinogênio são hidrolisadas. Conclusão: A partir destes resultados, concluímos que BmGTI inibe a coagulação sanguínea pela hidrólise das cadeias α e β do fibrinogênio. / Introduction: Rhipicephalus microplus is an important parasite of cattle. New strategies for control depend on a better knowledge of its physiology and hostparasite relationship, and molecules involved in acquisition and digestion of blood meal are interesting targets. Objectives: to determine how BmGTI (Boophilus microplus Midgut Thrombin Inhibitor) inhibits coagulation. Materials and Methods: BmGTI was obtained from partially engorged females midguts homogenate through ion exchange, size exclusion and thrombin-affinity chromatographies. Thrombin inhibition activity was measured by thrombin-induced fibrinogen clotting assay. BmGTI preparation was checked by SDS-PAGE and analyzed by LCMS/ MS. BmGTI putative ORF was cloned in pPIC9 plasmid, expressed in Pichia pastoris and purified. Different molar ratios of thrombin:BmGTI were examined for inhibitory activity of thrombin upon fibrinogen cleavage at pH 7.5. E64 was used to block BmGTI active site and inhibitory activity was assayed. Different molar ratio of thrombin:BmGTI were incubated and analyzed by SDS-PAGE to verify proteaseinhibitor interactions. BmGTI direct activity upon fibrinogen was analyzed after incubation by SDS-PAGE. Results and Discussion: Based on m/z of the BmGTI tryptic fragments it was identified as BmCL1, a cathepsin L-like proteinase active at acidic pH, but unable to hydrolyze synthetic substrate at pH ≥7.0. BmCL1/BmGTI was expressed in P. pastoris as pro-enzyme and after activation the enzyme was purified. Different molar ratios of thrombin:rBmCL1/BmGTI were assayed, and when rBmCL1/BmGTI concentration was 64-fold higher than thrombin concentration, this enzyme residual activity was 37%. When rBmCL1/BmGTI has its active site blocked with E-64, it was unable to inhibit thrombin activity upon fibrinogen. Analysis by SDS-PAGE of fibrinogen after incubation with rBmCL1/BmGTI showed that fibrinogen chains α and β were hydrolyzed. Conclusion: Based on these results, we concluded that rBmGTI/BmCL1 inhibits blood coagulation through hydrolyzes of fibrinogen chain- α and β.

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:35:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 452946.pdf: 4295769 bytes, checksum: 7a8634a037c064cad84539c03a441c4a (MD5) Previous issue date: 2013-11-26 / Human thymidine phosphorylase (hTP) also known as platelet-derived endothelial cell growth factor (PD-ECGF) or gliostatin, has an important role in nucleotide metabolism. hTP is a molecular target for anticancer drug development since it is overexpressed in certain solid tumours, and its catalityc activity has been shown to be essencial to promote angiogenesis. This work describes amplification, cloning, and recombinant expression in E. coli, purification to homogeinity of both precursor and mature protein hTP. Mass spectrometry analysis confirmed the identity of homogeneous hTP and size exclusion chromatography showed that hTP proteins are a dimer in solution. Kinetic studies allowed the determination of apparent and true kinetic constants for forward reaction, and showed that enzymes displayed substrate inhibition for thymidine. Initial velocity and isothermal titration calorimetry (ITC) studies suggested that hTP catalysis follows a rapid-equilibrium random bi-bi kinetic mechanism. Thermodynamics constants and discrimination profile allowed natural enzyme s substrates/products binding patterns identification. Additionally, these studies showed differences in the kinetic constants and the thermodynamic parameters between the precursor and the mature protein and these differences were revealed by structural analysis using molecular modeling. The pH-rate profiles suggested that maximal enzyme activity was achieved at low pH values, and functional groups with a pK values of 5.1 5.2 and 9.0 9.2 are involved in thymidine binding, and groups with pK value of 6.1 6.2 and 7.8 8.6 are involved in phosphate binding. The enzyme characterization provides additional data that may be useful for the rational design of novel inhibitors hTP. Chemical compounds designed and synthesized as potential inhibitors against hTP activity were active in both forms of the enzyme, whereas the compound 5g showed the best inhibitory potential. The compound 5g was characterized as noncompetitive inhibitor towards hTP substrates thymidine and phosphate. The noncompetitive inhibiton mechanism points to the existence of an allosteric binding site at hTP, different from the substrate binding sites. This allosteric site could be considered an important molecular target for the development of potent and selective hTP inhibitors. / A Timidina fosforilase humana (hTP), tamb?m conhecida como PD-ECGF e gliostatina, ? uma enzima importante no metabolismo de nucleot?deos. A hTP ? um alvo molecular para o desenho de inibidores enzim?ticos com poss?vel uso na terapia do c?ncer, visto que essa enzima encontra-se superexpressa em alguns tipos de tumores s?lidos e sua atividade catal?tica ? essencial para promo??o da angiog?nse. Esta tese descreve a amplifica??o, clonagem, express?o heter?loga em E. coli, purifica??o e caracteriza??o bioqu?mica do precursor e da prote?na madura hTP. An?lises de espectrometria de massa confirmaram a identidade das prote?nas recombinantes e ensaios de cromatografia de exclus?o por tamanho revelaram que ambas as enzimas encontram-se como d?meros em solu??o. Estudos cin?ticos permitiram a determina??o das constantes cin?ticas aparentes e verdadeiras para a rea??o direta e mostraram que as enzimas apresentam inibi??o pelo substrato tidimina. Estudos espectofotom?tricos de velocidade inicial e estudos de liga??o por microcalorimetria de titutala??o isot?rmica (ITC) sugerem que a cat?lise enzim?tica segue um mecanismo cin?tico bi-bi aleat?rio de r?pido equil?brio. As constantes termodin?micas e o perfil de discrimina??o termodin?mica permitiram a identifica??o dos modos de intera??o dos substratos/produtos naturais das enzimas com seus s?tios de liga??o. Al?m disto, esses estudos revelaram diferen?as nas constantes cin?ticas e nos par?metros termodin?micos entre o precursor e a prote?na madura e tais diferen?as foram evidenciadas por meio da an?lise estrutural de ambas as enzimas. O perfil de pH mostrou que a atividade enzim?tica m?xima foi obtida em valores de pH baixos, e que grupamentos funcionais com valores de pK de 5,1 5,2 e 9,0 9,2 est?o envolvidos na liga??o ? timidina e grupamentos com valores de pK de 6,1 6,2 e 7,8 8,6 est?o envolvidos na liga??o ao fosfato. Os resultados da caracteriza??o da enzima fornecem dados adicionais que podem ser ?teis para o desenho racional de novos inibidores da hTP. Os compostos qu?micos planejados e sintetizados como poss?veis inibidores da atividade da hTP foram ativos em ambas as formas da enzima, sendo que o composto 5g apresentou o melhor potencial inibit?rio. O composto 5g foi caracterizado como um inibidor n?o competitivo em rela??o aos substratos naturais timidina e fosfato. O mecanismo de inibi??o n?o competitiva sugere a exist?ncia de um sit?o de liga??o alost?rico na hTP, diferente dos s?tios de liga??o aos substratos, podendo ser considerado um alvo molecular importante para a busca de inibidores potentes e seletivos para hTP.

Orientador: Luiz Francisco Prata / Banca: Elizabete Regina Leone Pelicano / Banca: Maria Stella Beregeno Lemos de Melo Saab / Resumo: O presente trabalho teve como objetivo relacionar elementos qualitativos e quantitativos do pré-abate e abate de bovinos que pudessem caracterizar situação ou evolução desses, visando às boas práticas agropecuárias e as condições de bem-estar animal e suas possíveis consequências. Para isso foram monitorados os seguintes aspectos: lesões musculares visíveis nas carcaças quanto a sua localização e seu grau de severidade; atividade de enzimas séricas músculo específicas indicativas de lesão (CK, AST, LDH) e, finalmente, a evolução do pH post mortem das carcaças. Esses parâmetros foram avaliados em diferentes sistemas de terminação de bovinos (animais oriundos de pasto ou confinamento) e classes sexuais (machos ou fêmeas). Foi constatada ao menos uma contusão em 58,1% das carcaças, sendo 96,11% de grau I, sendo o grupo das fêmeas o mais afetado, com 81,3%. De maneira geral, as enzimas séricas mostraram-se elevadas quando comparadas aos valores de referência utilizados, principalmente CK e LDH. Os animais de pasto apresentaram valores de enzimas significativamente maiores que os de confinamento e as fêmeas maiores valores de CK comparadas aos machos. O pH mostrou-se comparativamente maior nos animais de pasto e nos machos / Abstract: This study aimed to relate qualitative and quantitative elements of the preslaughter and slaughter of cattle that could characterize the situation and evolution of these in order to good farming practices and the conditions of animal welfare and its possible consequences. For this it was monitored the following: muscle injuries visible on the carcasses as its location and its severity; activity of specific serum enzymes indicative of muscle damage (CK, AST, LDH) and, finally, the evolution of post mortem pH of carcasses . These parameters were evaluated in different cattle feeding production systems (cattle from pasture or feedlot) and sex classes (male or female). It has been found at least one injury in 58.1% of the carcasses, and 96.11% grade I, being the group most affected females, with 81.3%. In general, the serum enzymes were high compared to the reference values are used, primarily CK and LDH. Animals from pasture showed significantly higher values of enzymes that feedlot and higher values of CK in females compared to males. The pH was found to be comparatively higher in grazing animals and in males / Mestre

Orientador: Jorge de Lucas Junior / Banca: Mônica Sarolli Silva de Mendonca Costa / Banca: Mauro dal Secco Oliveira / Resumo: O experimento foi realizado na Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da UNESP de Jaboticabal, objetivando-se avaliar os benefícios da utilização de dois ativadores biológicos comerciais, Microsource "S"® e uma mistura de microrganismos e enzimas (B. subtilis, B. firmus, B. licheniformis, lipase, protease e lactase) na digestão anaeróbia de dejetos de bovino de corte e de dejetos suínos. Na primeira parte do experimento foram testadas duas doses de cada produto com os dois dejetos, utilizando 30 digestores batelada, a fim de determinar qual produto e em qual dose proporcionaria o maior aumento na produção específica de biogás (PEB). O tempo de retenção hidráulica (TRH) dos dejetos bovinos nos digestores batelada foi de 150 dias e dos suínos 100 dias. Periodicamente foram calculados o volume de biogás produzido e os teores de CH4 e CO2. Ao término da primeira fase foi escolhido, para a segunda fase do experimento, o produto Microsource "S" ® na dose de 500g/t de dejeto. Na segunda fase do experimento foram utilizados 12 biodigestores contínuos, com TRH de 30 dias, a fim de testar o tratamento escolhido em um processo anaeróbio de tipo contínuo. Nesta fase foram repetidas as análises supracitadas com maior frequência, a fim de se monitorar a evolução do processo. A análise da variância, efetuada com o software SAS®, apontou como o Microsource "S"®, aplicado a dejetos de bovinos de corte, na dose de 500g por tonelada de substrato, proporciona um aumento de 15,03% na PEB / Abstract: A trial was carried out at the Faculty of Agriculture and Veterinary Sciences, UNESP, Jaboticabal, aiming to evaluate the benefits of using two commercial biological activators, Microsource "S"® and a mixture of enzymes and microorganisms (B. subtilis, B. firmus, B. licheniformis, lipase, protease e lactase) in the anaerobic digestion of beef cattle and swine manure. During the first stage of the experiment, two doses of each product have been tested with the two manures in order to determine which dose of which product provide the highest increase of specific biogas production, using 30 batch digesters. The hydraulic retention time have been of 150 days for the beef cattle manure and 100 days for the swine manure. Periodically produced volume of biogas and contents of CH4 and CO2 have been calculated. At the end of the first stage has been selected for the second phase of the experiment the product Microsource "S"® at a dose of 500g/t of manure. In the second stage of the experiment 12 anaerobic digesters have been used to test the chosen treatment in a continuous anaerobic process with a 30 days hydraulic retention time. At this stage the tests were repeated more often above, in order to monitor the progress of the process. The analysis of variance, performed with SAS® software, pointed out Microsource "S"®, applied to beef cattle at a dose of 500 g per ton of substrate, provides an increase of 15,03% in biogas specific production / Mestre

Orientador: Márcia Justino Rossini Mutton / Coorientador: Sarita Cândida Rabelo / Banca: Carlos Eduardo Vaz Rossell / Banca: Leonardo Lucas Madaleno / Banca: Sandra Regina Ceccato Antonini / Banca: Raúl Andres Martinez Uribe / Resumo: O etanol de cana-de-açúcar vive uma crise devido, principalmente, a não expansão dos processos fermentativos que terminam por depender de apenas uma fonte e que ainda apresenta o agravante de ter que ser segregado à produção de açúcar. Desta forma, o sorgo surge como cultura energética, como matéria-prima para produção de etanol, tanto do ponto de vista agronômico quanto industrial. O sorgo apresenta colmos ricos em açúcares fermentáveis, semelhantes à cana-de-açúcar. Objetivou-se com a presente pesquisa avaliar a potencialidade de 3 genótipos de sorgo (sacarino, forrageiro e biomassa) para produção de etanol 2G, com ênfase na caracterização do bagaço antes e após pré-tratamento ácido e hidrólise enzimática, e na fermentação dos hidrolisados por duas leveduras, sendo a LJ3, fermentando as pentoses e as hexoses com Saccharomyces cerevisiae (PE-2). Avaliou-se a composição dos bagaços dos 3 genótipos de sorgo em relação aos nutrientes, além da análise de microscopia eletrônica para visualização das biomassas após os tratamentos realizados. Os resultados evidenciaram a eficiência do pré-tratamento e da hidrólise enzimática possibilitando a recuperação dos açúcares presentes no bagaço de sorgo para composição do mosto a ser fermentado; a cepa LJ03 foi classificada como Pichia kudriavzevii, que apresentou habilidade para metabolizar pentoses e hexoses a etanol. A hidrólise enzimática foi eficiente e possibilitou a produção de 11,83; 12,28 e 7,79g etanol/kg bagaço m.s., para os genó... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Sugarcane ethanol is experiencing a crisis, mainly due to the nonexpansion of the fermentation processes that end up depending on only one source that still presents the aggravating factor of having to be segregated to the sugar production. In this context, sorghum emerges as an energy crop, as a raw material for the ethanol production, both from an agronomic and industrial point of view. Sorghum has stalks rich in fermentable sugars, similar to sugarcane. The objective of this research was to evaluate the potentiality of 3 genotypes of sorghum (sweet, forage and biomass) for the production of 2G ethanol, with emphasis on the characterization of bagasse before and after acid pretreatment and enzymatic hydrolysis, and in the fermentation of the hydrolysates by two yeasts, the LJ3 fermenting pentoses and Saccharomyces cerevisiae (PE-2) fermenting hexoses. The composition of the three sorghum genotypes in relation to the nutrients was evaluated, as well as the analysis of electron microscopy to visualize the biomass after the treatments. The results evidenced the efficiency of the pretreatment and the enzymatic hydrolysis allowing the recovery of the sugars present in the sorghum bagasse for the composition of the must to be fermented. The LJ03 strain was classified as Pichia kudriavzevii, which showed ability to metabolize pentoses and hexoses to produce ethanol. The enzymatic hydrolysis was efficient and allowed the production of 11.83; 12.28 and 7.79g ethanol/kg bagasse, for the sweet, forage and biomass genotypes, respectively, employing yeast PE-2. It was observed in the nutrient analyzis of the bagasse of the different sorghum genotypes, that nutrients reduced significantly of the in natura biomasses, for pretreated biomass and after enzymatic hydrolysis. The calorific value (HHV, LHV, and UHV) of the waste gen... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

A menopausa é marcada por um progressivo decréscimo nos níveis hormonais sexuais circulantes, sendo que esta tem sido associada a aumento dos riscos de eventos cardiovasculares. Uma vez que o estrogênio tem sido apontado como um possível antioxidante, buscou-se verificar o efeito da terapia estrogênica na função cardiovascular e sua correlação com o estresse oxidativo. Assim, este estudo foi realizado com ratas fêmeas Wistar castradas e com reposição hormonal, onde foram investigados os efeitos do estrogênio no estresse oxidativo cardíaco e sistêmico, a produção do ânion superóxido (O2 •-) em aorta, a produção do óxido nítrico (NO) avaliado pelos seus metabólitos: nitratos (NO3) e nitritos (NO2) teciduais e plasmáticos. Foram avaliados os parâmetros hemodinâmicos e o coração foi isolado e perfundido, para a realização de curvas de Starling e isquemia seguida da reperfusão. Três grupos experimentais foram estabelecidos: Controle (CO) foi realizado simulação ovariectomia + placebo; grupo Castrado (CS) foi realizada ovariectomia + placebo; Grupo Castrado+Hormônio (CH) foi realizada a ovariectomia e recebeu 17b-estradiol. O estradiol foi administrado intramuscular (IM), intraperitonealmente (IP) e implantado subcutaneamente (transdermal) (VT). A dose utilizada nas vias IM e IP foi de 40μg/Kg de peso, ou igual volume de placebo, durante sete dias; os pellets 0,25 mg/pellet durante 21 dias de liberação contínua. Os resultados da lipoperoxidação (LPO) avaliada por quimiluminescência (QL) e as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), demonstraram que o grupo CH apresentou menor LPO que o grupo CS, e estes valores foram semelhantes ao grupo CO, estes valores foram semelhantes tanto no tecido cardíaco, nas três vias de administração, quanto sistêmico. Quanto às enzimas antioxidantes foi encontrado que o grupo CH apresentou aumentadas as atividades das enzimas SOD, GPX, GST e alta concentração da GSH, bem como na avaliação sistêmica em relação ao CS. Na avaliação dos metabólitos do NO observamos os níveis de nitrato tecidual e plasmático apresentam-se elevados no grupo CH, e nitrito está aumentado também no plasma neste grupo. Isto reforça a idéia de que o estrogênio induz a formação do NO. A produção do O2 •-, pelo método da lucigenina, avaliou a atividade da enzima NADH/NADPH oxidase em aorta isolada. A atividade da enzima estava aumenta no grupo CH. Os animais castrados que receberam reposição hormonal mostraram, não somente, maior formação do O2 •-, mas também níveis maiores de NO que os CS. Assim, não foram observadas diferenças na avaliação hemodinâmica. A curva de Starling não mostrou diferenças entre os grupos estudados. No processo de isquemia e reperfusão, o grupo CH recuperou-se melhor quando comparado com os demais grupos, os quais mostraram uma contratura isquêmica importante. Estes resultados demonstram claramente um papel benéfico da terapia estrogênica no insulto isquêmico cardíaco, sem alterar variáveis hemodinâmicas, sendo que estas respostas coincidem com uma redução do dano oxidativo e aumento das defesas antioxidantes. / Menopause is characterized by a progressive decrease on hormonal level and is usually associated with an increase in cardiovascular disfunctions. Given that estrogen has been considered as a possible antioxidant, this work deals with experimental evaluation of the effects of estrogen withdrawal and replacement therapy on myocardial and systemic oxidative stress. Superoxide anion production and nitric oxide (NO) metabolites (nitrate and nitrite) in plasma and cardiac tissue of female Wistar rats were investigated. Hemodynamic evaluations were performed in the whole animal and analysis of Starling curves and ischemia and reperfusion effects were studies in the isolated and perfused heart. Three experimental groups were established: a) Control (CO): ovariectomy was simulated and received placebo pellets; b) Castrated (CS): bilateral ovarietomy was done and received placebo pellets; c) Castrated + hormone (CH): ovariectomy was done and 17 b-estradiol pellets were implanted. 17 b-estradiol was given by three different ways: intramusculary (IM), intraperitoneal (IP) and transdermal (VT). In the IM and IP way, the estradiol dose utilized was 40 μg/Kg bodyweight or the same volume of placebo during seven days. In the VT, 0.25 mg pellets were implanted and hormone was released during 21 days. Lipid peroxidation (LPO) was evaluated by chemiluminescence (CL) and thiobarbituric acid reactive substance (TBARS). The CH group has shown lower myocardial as well as systemic LPO than CSl, and the last was not different from CO. In terms of antioxidant enzyme activities, in the CH group was found higher SOD, GPx, GST activities and higher GSH concentration in cardiac tissue as compared to the CS ones. In the NO/metabolites evaluation, cast+horm group presented higher plasma and tissue levels of nitrate. This data reinforces the idea that estrogen induces NO formation. Superoxide anion production was estimated through lucigenin method, which evaluates NADH/NADPH oxidase activity in isolated aorta. The activity of this enzyme was enhanced in the CH group. Since not only did the group animals that received hormone replacement show higher superoxide anion formation but also higher levels of NO than CS group, no significant hemodynamic changes were observed. Analysis of Starling curves did not show differences among the three groups studied. In terms of ischemia and reperfusion, the CH group has shown the best recovery as compared to the others while CS group exhibited an important ischemic contracture. The achieved results clearly indicate cardiovascular benefits when using estrogen therapy with the isquemic cardiac damages. Additionally, no major variations in the hemodynamics variables could be observed. These results also indicate that an increase in the antioxidants defenses led to a reduction in the oxidative stress.

Metarhizium anisopliae é um fungo entomopatogênico usado como agente de controle biológico devido a sua capacidade de infectar mais de 300 espécies de artrópodes. É um organismo muito utilizado como modelo de estudo de interação patógeno-hospedeiro sendo um dos focos de estudo a descrição de genes envolvidos no processo de infecção pela construção de mutantes funcionais. Esse processo pode ser facilitado pelo uso da metodologia do sistema CRISPR/Cas9 para manipulação genômica, que foi derivada do sistema imune adaptativo de procariotos que vem demonstrando potencial tecnológico em edição genética de eucariotos pela incorporação de protoespaçadores (sequencias oriundas de bacteriófagos ou plasmídeos invasores) em seus loci. CRISPR e a proteína associada à CRISPR (Cas) formam uma endonuclease guiada (Cas9) a qual tem como alvo o sítio específico do DNA invasor, provocando a clivagem da dupla fita do DNA alvo em uma sequência específica. Muitos estudos realizados pela edição gênica têm sido desenvolvidos em diferentes organismos por meio da sua adaptação em eucariotos. Com o objetivo de melhorar a eficiência na geração de mutantes em em M. anisopliae, o sistema CRISPR/Cas9 e um sistema de RNAi foram usados a fim de desenvolver novas ferramentas. As metodologias CRISPR/Cas9 e RNAi foram desenvolvidas para ter como alvo o gene reporter gfp da linhagem M. anisopliae E6 GFP+. Para realizar a edição genômica em M. anisopliae, foram gerados, por transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens, fungos transgênicos estáveis que expressam a endonuclease Cas9 códon-otimizada para fungos filamentosos. Oligonucleotídeos foram projetados para ter como alvo quatro regiões diferentes na sequencia do gene gfp com o auxílio da ferramenta CRISPR RGEN tool com o objetivo de evitar o pareamento aleatório. O vetor binário utilizado foi o plasmídeo pPZP com o promotor U6-1 para a expressão do RNA guia. Para a metodologia de RNA interferente foi reproduzido o knockdown do gene repórter gfp por meio de agrotransformação do vetor pPZP::SUR::DP que contém um sistema de dois promotores em direções opostas (dual promoter Pdgp e Ptrpc) e um cassette de expressão com o gene marcador sur (resistência a sulfoniluréia) para a seleção dos transformantes. Foram clonados 420 pares de bases do gene gfp entre os promotores gerando o plasmídeo pPZP::SUR::DP::GFP. O desenvolvimento dessas duas metodologias se mostra viável para análise funcional de genes de M. anisopliae. / Metarhizium anisopliae is an entomopathogenic fungus used as a biological control agent due to its capacity to infect more than three hundred species of arthropods. It is broadly used as a model to the development of host-pathogen interaction studies, including the study of the description of the involved genes in the infection process by the construction of functional mutants. This process may be facilitated by the use of the CRISPR/Cas9 methodology to genomic manipulation, which was derived from the immune adaptive system in prokaryotes and has demonstrated technological potential in genetic of eukaryotes edition through the activity of incorporation of protospacers (sequences arising from bacteriophages or plasmids invaders) in their loci. CRISPR and CRISPR associated protein (Cas) code a guided nuclease (Cas9) that targets a specific site of the invading DNA leading to breakage of double-stranded target DNA in a specific sequence. Multiple gene editing studies have been developed in different organisms including its adaptation to eukaryotes. In order to improve the efficiency of the generation of mutants in M. anisopliae, CRISPR/Cas9 system and a RNAi system were used in order to develop new tools. Both CRISPR/Cas9 and RNAi methodologies were developed having as a target the gfp gene from M. anisopliae E6 GFP+ strain. To perform genome editing in M. anisopliae, stable transgenic fungi that express fungal codon-optimized Cas9 were generated by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Oligonucleotides were designed to target four different regions along the gfp gene by using the CRISPR RGEN tool in order to avoid off-targets. The binary vector was the pPZP plasmid with the U6-1 to RNAi expression. For RNAi analysis, gene knockdown were developed by agrotransformation with a suitable plasmid (pPZP::SUR::DP) containing dual promoters with opposite directions (Pdgp and Ptrpc) and a cassette for the expression of the selective marker (gene sur, conferring sulfonylurea resistance) for the selection of transformants. The 420 bp gfp sequence was cloned between promoters, obtaining thus the plasmid pPZP::SUR::DP::GFP. The development of these two techniques proves itself viable for functional analysis of M. anisopliae genes.

A teca, Tectona grandis L.f., é uma espécie arbórea originária do sudeste asiático. Com o surgimento de políticas públicas nos países de origem, bem como a deficiência em tecnologia dos tratos silviculturais, a espécie passou a ser disseminada pelo mundo, principalmente nas Américas central e do sul. O principal destino do produto final dos plantios de teca é o mercado de móveis de luxo e embarcação naval. As características da sua madeira possibilita sua inserção neste mercado, bem como proporciona um alto valor de venda. Com o mercado em constante ascenção vê-se a necessidade de uma produção de madeira com alto valor agregado. A melhor opção para manter a produção de qualidade é o uso dos plantios clonais. Para tanto, ainda existem algumas falhas nos programas clonais de teca, sendo a principal delas a clonagem de matrizes com características ótimas para o mercado. Para alcançar o sucesso no processo de clonagem de espécies lenhosas tem-se utilizado das ferramentas biotecnológicas, como a cultura de tecido. A cultura de tecidos possibilita a morfogênese vegetal a partir de tecidos vegetais somáticos. A embriogênese somática é uma técnica em desenvolvimento para as espécies lenhosas, e tem contribuido para os programas clonais através da produção em larga escala de plântulas, bem como sementes sintéticas. A embriogênese somática em teca ainda tem sido estudada, e apresenta como suas principais barreiras a escolha do explante a ser introduzido in vitro e a oxidação durante a cultura de tecidos. Diante disso, o presente trabalho objetivou estudar a bioquímica do estresse, os aspectos ultraestruturais e histoquímica de calos de teca provenientes de explantes foliares, visando propor possíveis melhorias nas técnicas de cultivo in vitro para se obter sucesso na produção de embriões somáticos. O material vegetal utilizado foram explantes foliares coletados de matrizes de teca envasadas em viveiro. O material passou por desinfestação e foi introduzido em 16 diferentes tratamentos com diferentes balanços de 2,4-D e BAP. Através de análises morfológicas visuais e teste histoquímico com Carmim acético foram selecionados o melhor e pior tratamento para produção de calos embriogênicos. Foram selecionados T08, 0,5mgL-1 de 2,4-D e 2,0mgL-1 de BAP, como melhor resultado para produção de calos embriogênicos, e T06, 0,5mgL-1 de 2,4-D e 0,1mgL-1 de BAP, como calos não embriogênicos. Os calos provenientes dos dois tratamentos foram analisados quanto sua ultraestrura, através da microscopia eletrônica de varredura, e também avaliados bioquimicamente, sendo avaliados: quantificação de proteínas, peróxido de hidrogênio, MDA, e atividade das enzimas CAT, APX e SOD. Os resultados possibilitaram confirmar a produção de estruturas pró-embriogênicas no tratamento T08 através da MEV. E a análise bioquímica evidenciou a enzima SOD como um possível marcador de resposta morfogênica. Além disso, as análises de estresse oxidativo permitiram verificar a qualidade das plantas matrizes, bem como inferir o estímulo do MDA e do peróxido de oxigênio como estimulantes a indução de embriões somáticos em calos de teca quando em baixas concentrações. Os resultados ainda possibilitaram identificar possíveis alterações no protocolo de indução da embriogênese em explantes foliares de teca. / Teak, Tectona grandis L.f., is a tree species originating in Southeast Asia. With the emergence of public policies in the countries of origin, as well as the technology deficiency of silvicultural treatments, the species began to be disseminated throughout the world, mainly in central and southern America. The main destination for the final product of teak plantations is the market for luxury furniture and naval vessels. The characteristics of its wood enable its insertion in this market, as well as provides a high value of sale. With the ever-rising market, we see the need for a high value-added wood production. The best option to maintain quality production is the use of clonal plantations. In addition, there are still some flaws in teak clonal programs, the main one being the cloning of matrices with optimal characteristics for the market. To achieve success in the process of cloning woody species has been used of biotechnological tools, such as tissue culture. Tissue culture enables plant morphogenesis from somatic plant tissues. Somatic embryogenesis is a developing technique for woody species and has contributed to clonal programs through the large-scale production of seedlings as well as synthetic seeds. Somatic embryogenesis in teak has been studied, and presents as its main barriers the choice of explant to be introduced in vitro and oxidation during tissue culture. The aim of this study was to study stress biochemistry, ultrastructural aspects and histochemistry of teak calli from leaf explants, aiming at proposing possible improvements in in vitro culture techniques to be successful in the production of somatic embryos. The plant material used was foliar explants collected from nursery potted teak matrices. The material underwent disinfestation and was introduced in 16 different treatments with different 2,4-D and BAP balances. The best and worst treatment for embryogenic callus production was selected through visual morphological analysis and histochemical test with Acetic Carmim. T08, 0.5mgL-1 of 2,4-D and 2,0mgL-1 of BAP were selected as the best result for the production of embryogenic callus, and T06, 0.5mgL-1 of 2,4-D and 0, 1mgL-1 of BAP, as non-embryogenic callus. The calluses from the two treatments were analyzed by ultrasound using scanning electron microscopy and biochemically evaluated. Protein quantification, hydrogen peroxide, MDA, and CAT, APX and SOD enzymes were evaluated. The results allowed to confirm the production of pro-embryogenic structures in the T08 treatment through SEM. And the biochemical analysis evidenced the SOD enzyme as a possible marker of morphogenic response. In addition, the oxidative stress analyzes allowed to verify the quality of the matrix plants, as well as to infer the stimulus of the MDA and the oxygen peroxide as stimulants the induction of somatic embryos in the callus when in low concentrations. The results allowed to identify possible alterations in the protocol of induction of embryogenesis in leaf explants of teak.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005-08-11Bitstream added on 2014-06-13T19:40:24Z : No. of bitstreams: 1 cabral_h_dr_sjrp.pdf: 2111647 bytes, checksum: 119e7754b951e76b7b463f93125a12db (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As peptidases ou proteases hidrolisam ligações peptídicas. Apesar de todas terem essa característica funcional comum, elas diferem acentuadamente no seu grau de especificidade. O conhecimento da especificidade das cisteíno-peptidase, nos fornece valiosas informações que podem levar a uma melhor compreensão da relação estrutura-função, do papel fisiológico destas enzimas, ou para o desenho de inibidores seletivos. Pela caracterização realizada, a Fastuosaina, uma cisteíno peptidase extraída de frutos verdes de gravatá (Bromelia fastuosa) possui um pH ótimo próximo do neutro, semelhante à Bromelina do talo e do fruto, por enquanto para a Papaína, que possui um pH ótimo de 6,3. Em relação à estabilidade térmica, a Fastuosaina mostrou ser mais resistente à desnaturação, seguida pela Papaína, a Bromelina do fruto e por último a Bromelina do talo. / Peptidases, also known as proteases, hydrolyse peptide bonds with different specificities. Knowing their preferences for cleavage sites, gives valuable informations that can lead to a better understanding of the structure-function relationships, their physiological role, or for design of selective inhibitors. We performed a characterization of Fastuosain, a cystein-peptidase isolated from unripe fruits of gravatá (Bromelia fastuosa), which showed an optimum pH near 7.0, as found also for stem and fruit bromelains. Papain showed a lower value, at pH 6.3. Concerning its thermal stability, Fastuosain showed higher resistance to denaturation, followed by Papain, Fruit and Stem Bromelain.