As leishmanioses são causadas por protozoários do gênero Leishmania e apresentam diversas manifestações clínicas, sendo consideradas uma doença tropical negligenciada. Encontram-se atualmente presentes em 88 países, afetando 12 milhões de pessoas, com dois milhões de novos casos por ano. O tratamento das leishmanioses é realizado até hoje pelos mesmos quimioterápicos usados na década de 40, apesar da persistência dos efeitos colaterais. Neste sentido, o objetivo do trabalho consistiu na avaliação da atividade de derivados de benzofenonas em L. (L.) amazonensis. Além de buscar entender possíveis mecanismos de ação, através da avaliação da dosagem de óxido nítrico e do potencial de inibição enzimática nos contextos in silico e in vitro. Foram testados três benzofenonas precursoras (CM-A, CM-B e CM-C) comercialmente disponíveis e nove derivados (LFQM-115, LFQM-116, LFQM-117, LFQM-118, LFQM-119, LFQM-120, LFQM-121, LFQM-122 e LFQM-123). Inicialmente os testes foram realizados em formas promastigotas de L. (L.) amazonensis, apesar de todos os derivados serem mais eficazes que seus precursores, os melhores resultados foram exibidos por LFQM-115, LFQM-118 e LFQM-123 (IC50-PRO = 4,90; 5,05 e 5,94 μg/mL; respectivamente). A toxicidade a macrófagos peritoniais murinos foi também avaliada, e constatou-se que os derivados LFQM-117, LFQM-120, LFQM-121, LFQM-122 e LFQM123 foram os menos citotóxicos (CC50 = 140,06; 87,10; 116,20 e >160,00 μg/mL; respectivamente). A avaliação de atividade em formas amastigotas de L. (L.) amazonensis procedeu-se apenas com os derivados, sendo LFQM-120 o mais efetivo em formas intracelulares. O QlogP dos derivados de benzofenonas pode ser correlacionado com a atividade antipromastigota, bem como com a antiamastigota. A partir de então, os derivados que mostraram melhor perfil de atividade em ambas as formas do parasito e em macrófagos murinos foram selecionados (LFQM-116, LFQM-117, LFQM-119, LFQM-120 e LFQM-121) para os demais ensaios. Foi realizada a dosagem da produção de óxido nítrico (NO) nos sobrenadantes de cultura de macrófagos peritoneais murinos infectados com L. (L.) amazonensis. Neste verificou-se que os derivados benzofenônicos LFQM-119 e LFQM-120 estimularam a produção de NO, porém apenas o derivado LFQM-120 induziram uma produção de NO equivalente ao produzido por LPS. Algumas enzimas importantes para tripanossomatídeos (cruzaína, oligopeptidase B, ornitina descarboxilase e tripanotiona redutase) e representantes de importantes famílias de enzimas (papaína e tripsina) foram usadas na análise por docking molecular. Algumas destas foram também utilizadas para a avaliação do potencial de inibição enzimática experimental (papaína, cruzaína, tripsina e oligopeptidase B), tendo o derivado LFQM-116 exibido valores de IC50 = 7,54; 8,44; 8,59 e 14,25 μg/mL; respectivamente. Adicionalmente, é possível verificar a ação multi-alvo do derivado LFQM-120. Portando, este trabalho mostrou a ação de derivados de benzofenonas em ambas as formas de L. (L.) amazonensis, descrevendo ainda o ganho na atividade biológica com as modificações estruturais feitas em seus precursores. Além de ajudar a entender possíveis mecanismos de ação de tais compostos e ainda possibilitar a seleção dos compostos mais efetivos in vitro, os quais poderão então ser utilizados em futuros testes in vivo. / Leishmaniasis are caused by protozoa of the genus Leishmania and present diverse clinical manifestations being considered a neglected tropical disease. Are currently present in 88 countries affecting 12 million people with two million new cases per year. Treatment of leishmaniasis is held today by the same chemotherapy used in the 40s, despite the persistence of side effects. In this sense, the goal of the study was to evaluate the activity of benzophenone derivatives in L. (L.) amazonensis. Besides seeking to understand possible action mechanisms by evaluating the measurement of nitric oxide and the potential of enzyme inhibition in the contexts in silico and in vitro. Were tested three benzophenone precursors (CM-A, CM-B and CM-C) commercially available and nine derivatives (LFQM-115, LFQM-116, LFQM-117, LFQM-118, LFQM-119, LFQM-120-LFQM 121, LFQM-122 and LFQM-123). Initially tests were performed in promastigotes of L. (L.) amazonensis, although all derivatives being more effective than their precursors, the best results were exhibited by LFQM-115, LFQM-118 and LFQM-123 (IC50-PRO = 4.90, 5.05 and 5.94 μg/mL, respectively). The toxicity to murine peritoneal macrophages was also evaluated, and it was found that derivatives LFQM-117, LFQM-120, LFQM-121, LFQM-122 and LFQM-123 were less cytotoxic (CC50 = 140.06, 87.10, 116.20 and > 160.00 μg/mL, respectively). The assessment of activity in amastigotes of L. (L.) amazonensis proceeded only with derivatives, being LFQM-120 the most effective in intracellular forms. The QlogP of benzophenone derivatives can be correlated with antipromastigote activity, as well as antiamastigote one. Since, derivatives that showed better activity profile in both forms of the parasite and in murine macrophages were selected (LFQM-116, LFQM-117, LFQM-119, LFQM -120 and LFQM-121) for the remaining tests. Was performed the dosage of nitric oxide (NO) in the culture supernatants of murine peritoneal macrophages infected with L. (L.) amazonensis. In this, it has been found that benzophenone derivatives LFQM-119 and LFQM-120 stimulated NO production, but only the derivative LFQM-120 induced a NO production equivalent to that produced by LPS. Some important enzymes in trypanosomatids (cruzain, oligopeptidase B, ornithine decarboxylase and trypanothione reductase) and representatives of major families of enzymes (papain and trypsin) were used in the analysis by molecular docking. Some of these were also used to assess the potential for experimental enzyme inhibition assay (papain, cruzain, trypsin and oligopeptidase B), the results exhibited by LFQM-116 were IC50 = 7.54, 8.44, 8.59 and 14.25 μg/ml, respectively. Additionally, it’s possible to check the multi-target action of the derivative LFQM-120. Therefore, this work shows the action of benzophenone derivatives in both forms of L. (L.) amazonensis, also describing the gain in biological activity with structural changes made to their precursors. Besides helping to understand possible mechanisms of action of these compounds and also allow the selection of the most effective compounds in vitro, which may then be used in future in vivo tests. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG

O presente trabalho teve por objetivos coletar, isolar, identificar e comparar fungos endofíticos associados às plantas de cafeeiro cultivadas sob diferentes manejos; avaliar o potencial biotecnológico e enzimático dos fungos selecionados e correlacionar este potencial enzimático com a capacidade de remediação destes fungos sobre o corante têxtil Brilhante Azul de Remazol (RBBR) e efluentes gerados por indústrias têxteis. Foram coletadas folhas de plantas de cafeeiros mantidos sob manejos orgânico e convencional. Foram identificadas 39 morfoespécies de fungos endofíticos dentre os isolados provenientes do sistema orgânico e 27 morfoespécies oriundas do sistema convencional. Sete isolados degradaram o corante RBBR disposto em meio de cultura sólido e os quatro que apresentaram melhor descoloração detectada visualmente [CO. 5, CO. 10 (Colletotrichum sp.), CO.11a e CC. 22 (Aspergilllus niger)] e o fungo padrão Lentinula edodes (INCQS 40220) foram analisados quanto à capacidade de produção de enzimas ligninolíticas e capacidade de descoloração em efluente sintético com e sem acréscimo de madeira. Todos os fungos analisados foram capazes de secretar Lacase e/ou Manganês peroxidase e de promover a descoloração do corante RBBR. Os fungos CO.5 e CO.10 apresentaram resultados promissores em efluente sintético, promoveram descoloração e secretaram enzimas do sistema ligninolítico. No entanto, A. niger (CC.22) foi mais eficiente, removendo 94,67% da cor em apenas 48 horas e foi selecionado para a análise de biodegradação do efluente têxtil. Nas análises em efluente têxtil A. niger (CC.22) foi capaz de produzir enzimas e remover até 72,22% de cor também em 48 horas de incubação, reforçando a hipótese de que este fungo basiomiceto apresenta potencial para ser avaliado em sistemas de remediação de poluentes, como os efluentes texteis. / This study aimed to collect, isolate, identify and compare endophytic fungi associated with coffee plants grown under different managements; evaluate the enzymatic and biotechnological potential of selected fungi and correlate with the potential remediation ability of these fungi for textile dye Remazol Brilliant Blue (RBBR) and effluents generated by textile industries. We collected leaves of coffee plants kept under organic and conventional management systems. We identified 39 endophytic fungi morphospecies of isolates from organic system and 27 morphospecies from the conventional system. Seven isolates degraded dye RBBR arranged in solid medium and the four that showed better decolorization visually detected [CO. 5, CO. 10 (Colletotrichum sp.), CO.11a and CC.22 (Aspergilllus niger)] and standard fungus Lentinula edodes (INCQS 40 220) were analyzed for their capacity to produce ligninolytic enzymes and decolorization capacity in synthetic wastewater with and without addition of wood. All fungi studied secreted laccase and/or manganese peroxidase.It also promoted decolorization of the dye RBBR. Fungi CO.5 and CO.10 promoted discoloration and secreted enzymes ligninolytic, showing promising results in synthetic effluent. However, A. niger (CC.22) was more efficient, removing 94.67% of the color in only 48 hours and was selected for biodegradation analysis of textile effluent. In the analyzes in textile effluent A. niger (CC.22) was capable to produce enzymes and remove up to 72.22% color also at 48 hours of incubation, reinforcing the hypothesis that this basidiomycete fungus has potential to be measured in systems for pollutants remediation, such as textile effluents. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

A preocupação com o desenvolvimento de técnicas menos agressivas em termos ambientais contribuindo para o desenvolvimento sustentável, levou a utilização de tecnologia enzimática e materiais biodegradáveis como uma rota alternativa. A quitosana é um polímero atóxico, biodegradável e biocompatível proveniente da desacetilação da quitina, subproduto da indústria pesqueira. Uma de suas aplicações é como suporte para a imobilização de biocatalisadores com o intuito de melhorar algumas características, como estabilidade e reutilização. A imobilização pode ocorrer por diversas técnicas, não existindo um método único que abrange todo e qualquer caso. Neste contexto, esse trabalho estudou a viabilidade da utilização de um hidrogel à base de quitosana para imobilização da lipase de Rhizopus oryzae (L036P). Para isso foi realizada a imobilização da lipase por adsorção física e por ligação covalente em hidrogel de quitosana ativado com glutaraldeido. A fim de verificar modificações químicas significativas e a perda de massa das amostras em função da temperatura, os materiais foram submetidos às técnicas de termogravimetria (TG) e espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR). A massa residual foi de 30% para a enzima livre e de 45% para as enzimas imobilizadas e os espectros de FTIR comprovaram a imobilização devido a mudanças ocorridas em algumas bandas de absorção. A análise da morfologia da superfície do suporte foi realizada através de imagens obtidas por microscopia eletrônica de varredura que evidenciaram uma estrutura mais densa e menos porosa após a reticulação do hidrogel. A atividade hidrolítica da lipase imobilizada foi de 406,30 U/g para a imobilização por adsorção física; 439,82 U/g para a imobilização por ligação covalente. Os parâmetros cinéticos km e Vmáx foram determinados e não houve diferença significativa no valor de km para a ambas as lipase imobilizada já o valor de Vmáx sofreu uma queda para ambas as imobilizações indicando uma possível inibição não competitiva. A estabilidade térmica e de estocagem foram avaliadas e foi observada uma melhora na estabilidade térmica após 150 minutos e a atividade hidrolítica de todos os materiais não apresentaram perda significativa após 120 dias. Os biocatalisadores foram ainda caracterizados quanto a atividade ótima de atuação em função da temperatura e pH utilizando a técnica de planejamento de experimentos ( delineamento composto rotacional 2² com três repetições no ponto central). Os resultados encontrados mostraram que há uma variação na temperatura e pH ótimo após a imobilização, sendo encontrado valores máximos de 839,76 U/g para a lipase livre (pH 7,5 a 36°C), 574,18 U/g para a lipase imobilizada por adsorção física (pH 7,5 a 50°C) e 3572,44 U/g para a lipase imobilizada por ligação covalente (pH 8,5 60°C). A partir dos resultados obtidos, verificou-se a potencialidade da utilização de hidrogel como suporte de imobilização da lipase. / The concern with the development of less aggressive techniques for the environment contributing to sustainable development, has led to use of enzyme technology and biodegradable materials as an alternative route. Chitosan is a polymer nontoxic, biodegradable and biocompatible obtained from the deacetylation of chitin by-product of the fishing industry. One of the applications of chitosan is as a support for the immobilization of biocatalysts in order to improve certain characteristics, such as stability and reusability. Immobilization may occur for several ways, with no single method that covers every case. In this context, this study investigated the viability of using a chitosan-based hydrogel to immobilization of lipase Rhizopus oryzae (L036P). To do this was made lipase immobilization by physical adsorption and covalent linking of chitosan hydrogel activated with glutaraldehyde. In order to verify significant chemical modifications and the mass loss of samples as a function of temperature, the materials were subjected to thermogravimetric analysis (TG), and infrared spectroscopy with Fourier transform (FTIR). The residual mass was 30% for the free enzyme and 45% for immobilized enzymes and the infrared spectra confirmed the immobilization due to changes in absorption in certain bands. The analysis of the support surface morphology was performed by images obtained by scanning electron microscopy which showed a denser and less porous structure after crosslinking of the hydrogel. The hydrolytic activity of the immobilized lipase was 406.30 U / g for the immobilization by physical adsorption and 439.82 U / g for the immobilization by covalent attachment. Kinetic parameters (km and Vmáx) were determined and there was no difference difference in the amount of km for both immobilized lipase. The Vmáx value has fallen for both immobilizations indicating a possible non competitive inhibition. The thermal stability and storage were evaluated and it was observed an improvement in thermal stability after 150 minutes and the hydrolytic activity of all the materials showed no significant loss after 120 days. The biocatalysts were further characterized as the optimal activity of action as function of temperature and pH using the experimental design technique through rotational composite design with three replications 2² the center point. The results showed that there is a variation in optimal temperature and pH after immobilization being found maximum values of 839.76 U / g for the free lipase (pH 7.5 and 36 °C), 574.18 U / g for lipase immobilized by physical adsorption (pH 7.5 and 50 °C) and 3572.44 U / g to covalently immobilized lipase (pH 8.5 and 60 °C). From the results obtained, it was verified the potential use of hydrogel as lipase immobilization support. / Programa Institucional de Bolsas de Pós-Graduação - PIB-PÓS

Glicosídeos essenciais a vida podem ser sintetizados por métodos enzimáticos com altíssima especificidade. O mecanismo de reação de β-glicosidases GH1 por dupla-substituição envolve a formação de intermediário covalente (glicosil-enzima) que pode seguir duas rotas. Uma envolve sua hidrólise na ligação β-glicosídica entre glicone e aglicone do substrato, liberando o monossacarídeo da extremidade não-redutora; enquanto na outra rota, transglicosilação ou síntese por controle cinético, o intermediário é atacado por um aceptor glicosídico (2ª molécula de substrato), gerando um novo glicosídeo. BglB possui resíduos (W e H) que formam um \"canal\" por onde a água ataca o intermediário covalente no sítio ativo, sendo alvos de potenciais mutações que alteram o balanço entre as rotas e ampliando a eficiência de transglicosilação. Para caracterizar as bases moleculares da razão entre essas duas rotas catalíticas, β-glicosidases da família GH1 Spodoptera frugiperda (Sfβglu; AF052729) e Tenebrio molitor (Tmβglu; AF312017) foram produzidas como enzimas recombinantes em leveduras Pichia pastoris GS115, concentradas com 90% (p/v) de sulfato de amônio e diálise reversa com PEG 10000, e dialisadas em tampão CP 100 mM pH 6. A pureza foi confirmada por banda única com tamanho semelhante a 50 kDa (Sfβgly) e 56 kDa (Tmβgly) em SDS-PAGE. A atividade recuperada após purificação é 152% (Sfβgly) e 171% (Tmβgly) e a concentração protéica de 0,134 µg/µL (Sfβgly) e 0,217 µg/µL (Tmβgly). A razão entre as reações de hidrólise e transglicosilação (vH/vT) foi analisada utilizando os substratos pNPβ-gluco (0,1 mM a 8 mM) e MUβ-gluco (0,1 mM a 40 mM), a partir da velocidade de formação dos produtos pNP ou MU e glicose, respectivamente. Tmβgly catalisa reações de transglicosilação com ambos, mas vH/vT depende da [S] variando de +∞ (vH>>vT) a 1,5 para pNPβ-gluco e +∞ a 1 para MUβ-gluco. Sfβgly, ao contrário, não transglicosila com substrato MUβ-gluco. Além disso, vH/vT para pNPβ-gluco é 2 e independe da [S]. Já Sfβgly K201F conjuga propriedades de ambas, pois não transglicosila com MUβ-gluco, mas para pNPβ-gluco há ocorrência de transglicosilação dependente da [S], variando de +∞ (vH>>vT) a 1,25. Os parâmetros cinéticos (Vmax e Km) foram ajustados no Enzifitter e por simulação numérica na equação do modelo cinético ping-pong para dois substratos, e mostram maior (Km2) em Tmβgly e Sfβgly K201F do que em Sfβgly. Também foi avaliado o efeito da adição de aceptores alternativos que substituem a água em ensaios com pNPβ-gluco 4mM na presença de alcóois. Para as três enzimas a adição de metanol torna a vglc menor do que de vpNP, indicando ocorrência de transglicosilação. Com adição de n-propanol vH/vT diminui cerca de 7 vezes em Sfβgly e 2 vezes em Tmβgly. Os efeitos destes alcoóis sobre Sfβgly são maiores do que para Tmβgly e Sfβgly K201F, sugerindo acesso mais fácil destes ao intermediário covalente em Sfβgly, indicando diferenças entre as enzimas na configuração desta região. Portanto, notamos que vH/vT não está ligada à afinidade pela segunda molécula de substrato, podendo ser modulada por mutação do resíduo K201 de Sfβgly, posição relacionada ao acesso da água ou aceptor alternativo ao sítio ativo. / Glycosides are essential to life and can be synthesized by enzymatic methods with high specificity. The reaction mechanism of GH1 β-glucosidases by double-substitution involves the formation of covalent intermediate (glycosyl-enzyme) which may follow two routes. One of them involves hydrolysis in β-glycosidic bond between aglycone glucone and the substrate, releasing a monosaccharide from the non-reducing end, whereas in the other route, transglycosylation or synthesis by kinetic control, the intermediate is attacked by a glucosyl acceptor (second substrate molecule), generating a new glucoside. BglB has two residues (W and H) that form a \"channel\" through which water attacks the covalent intermediate on the active site. Thus, the residues are potential targets for mutations that alter the balance between routes, increasing the efficiency of transglycosylation. To characterize the molecular basis of the ratio between these two catalytic routes, two β-glycosidases from GH1 family, Spodoptera frugiperda (Sfβgly; AF052729) and Tenebrio molitor (Tmβgly; AF312017) were produced as recombinant enzymes in Pichia pastoris GS115, concentrated using 90% (w/v) ammonium sulfate and reverse dialysis with PEG 10000, and dialyzed in 100 mM CP buffer pH 6. SDS-PAGE confirmed that Sfβgly (~50 kDa) and Tmβgly (~56 kDa) were pure after that procedure. The activity recovered after purification were 152% (Sfβgly) and 171% (Tmβgly) and protein concentration were 0.134 mg/mL (Sfβgly) and 0.217 mg/mL (Tmβgly). The ratio between the hydrolysis and transglycosylation (vH/vT) was analyzed using pNPβ-gluco substrates (0.1 mM to 8 mM) and MUβ-gluco (0.1 mM to 40 mM), the rate of formation of pNP or MU and glucose. Tmβgly catalyzes transglycosylation reactions with both substrates, but vH/vT depends on [S] ranging from +∞ (vH>>vT) to 1.5 for pNPβ-gluco and + ∞ to 1 for MUβ-gluco. In contrast, Sfβgly did not catalyses transglycosilation with MUβ-gluco. Moreover, vH/vT for pNPβ-gluco-is 2 and is independent of [S]. Sfβgly K201F combines properties of both, because it does not catalyse transglycosylation with MUβ-gluco, but for pNPβ-gluco the occurrence of transglycosylation is dependent on [S], ranging from + ∞ (vH>>vT) to 1.25. The kinetic parameters (Vmax e Km) were adjusted in Enzfitter and numerical simulation showing that Km2is higher for Tmβgly and Sfβgly K201F than Sfβgly. We also evaluated the effect of adding alternative acceptors that replace the water in pNPβ gluco-4 mM. For the three enzymes the addition of methanol makes vglc less than pNP, indicating the occurrence of transglycosylation. Addition of n-propanol decreases vH/vT about 7 times in Sfβgly and 2 times Tmβgly. The effects on Sfβgly are higher than on Tmβgly and Sfβgly K201F, suggesting easier access to the covalent intermediate in Sfβgly. We observe that vH/vT is not related to affinity for the second substrate molecule and may be modulated by mutation of residue K201 Sfβgly, position related to the access of water or alternative acceptor to the active site.

O amadurecimento é uma etapa exclusiva do estágio de desenvolvimento dos frutos, que envolve uma série de transformações metabólicas a partir de diferentes fontes de energia. Ele é mediado por um dinâmico complexo enzimático, resultando em síntese/degradação e conversão de compostos que tornarão o fruto aceitável para o consumo. Dependendo do tipo de fruto, essa fonte de energia pode ser na forma de ácidos orgânicos, sacarose vinda da própria planta e na forma de amido. A banana (Musa acuminata) é uma fruta de comportamento climatérico que utiliza como principal fonte de carbono o amido, que é reduzido durante o climatério de teores que variam de 12 a 20% a menos de 1 %. Concomitante à esta degradação, o teor de sacarose pode atingir até 15%, dependendo da cultivar. O ácido giberélico (GA3) é um fitohormônio da família das giberelinas que tem sido muito estudado em cereais por aumentar a transcrição gênica das α-amilase. Em frutos, ele é responsável por manter a textura firme e o teor de sólidos solúveis, e atrasar o amadurecimento. Ao estudar a influência do GA3 no metabolismo amido-sacarose em fatias de banana, observou-se neste trabalho que o fitohormônio não alterou o pico respiratório nem a síntese de etileno. Entretanto, atrasou a degradação do amido e o acúmulo de açúcares solúveis por três dias. Este atraso foi acompanhado pela diminuição/atraso na atividade das enzimas que degradam o amido e sintetizam sacarose, α e β-amilase e sacarose fosfato sintase, respectivamente, sendo que não foi observada uma diferença no aumento de expressão gênica da sacarose fosfato sintase e das fosforilases. / The ripening is an exclusive stage of fruit development, that involves a serie of metabolic transformation from different energy source. It is mediated by a dynamic enzymatic complex, resulting in formation/degradation of different coumpouds that will render fruit acceptable for the consumption. Depending on the type of fruit, this energy source can be in the form of organic acid, sucrose of the plant or starch. Banana (Musa acuminata) is a climateric fruit that uses starch as main carbon source, which is reduced during banana ripening of levels that vary from 12 to 20% to less than 1 %. Concomitant to the this degradation, the levels of sucrose can reach up to 15%, depending of the cultivar. The gibberellic acid, GA3-mediated is a plant growth regulation of the giberellins family, that has been studied in cereals because of their enhancing effect of gene expression of αamylase. In fruits, it is responsible for keeping the texture firm and the soluble solid levels, and delaying the ripening. The influence of the GA3 in the starch-sucrose metabolism in banana slices, were observed. That the phytohormone did not modify the respiratory peak nor the synthesis of ethylene. However, it delayed the starch degradation and the soluble sugars accumulation for about three days. This delay was followed by decrease and/or delay in the activity of the enzymes related to starch degradation: the α and β-amylases; and sucrose synthesis the sucrose phosphate synthase (SPS). However, was not observed a difference in the increase of gene expression of SPS and phosphorilase

O cobre está associado ao metabolismo de lipídios, sendo bastante importante na redução do colesterol, e à estabilidade oxidativa da carne, por fazer parte de algumas enzimas antioxidantes. Atributos esses que tornam cada vez mais interessante a pesquisa do uso do mineral em várias espécies, com vista a melhorar a qualidade de vida dos consumidores, uma vez que se pode reduzir o risco de doenças cardiovasculares e câncer, assim como dos fornecedores de carne pelo possível aumento da vida de prateleira e das características organolépticas do produto. Desse modo, o objetivo deste estudo foi determinar o efeito da suplementação com dois níveis de sulfato de cobre e cobre metionina sobre o metabolismo de lipídios e colesterol e estabilidade oxidativa lipídica da carne em cordeiros Merino x Texel. Para o efeito, um experimento foi conduzindo na FZEA, USP de Pirassununga utilizando 40 cordeiros Merino x Texel, que foram distribuídos aleatoriamente em 5 tratamentos, totalizando 8 animais em cada. Os animais foram alojados em gaiolas individualizadas para estudo de metabolismo e o experimento teve a duração de 120 dias. Os tratamentos usados foram: controle, sem adição; suplementação com 10 ou 30 mg de Cu/Kg de MS na forma de sulfato de Cobre; suplementação com 10 ou 30 mg de Cu/Kg de MS na forma de cobre metionina. Foram feitas biópsias do fígado dos animais no tempo zero para análise de cobre e colhidas amostras de sangue para dosagem sérica de Cu. Nos dias 0, 28 e 56 foram colhidas amostras de sague para dosagem de colesterol total, HDL e triglicerídeos. Ao final do experimento, os animais foram abatidos para colheita de amostras de fígado para determinação dos teores de Cu; dosagem das enzimas glutationa reduzida (GSH), glutationa oxidada (GSSH), atividade das enzimas antioxidantes, superóxido dismutase (SOD) e glutationa peroxidase (GP-x) e determinação dos níveis das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). No momento da desossa foi medida a espessura da gordura subcutânea entre a 12ª e 13ª costela. No mesmo momento, foram colhidas amostras do músculo longissimus para dosagem de colesterol total, análise de perfil de ácidos graxos e TBARS. O músculo longissimus esquerdo foi retirado e congelado a vácuo por 12 meses, após os quais amostras foram colhidas e expostas no expositor refrigerado a 4°C para estudo da estabilidade oxidativa lipídica que foi acompanhada pelos valores de TBARS nos dias 0, 3 e 6. A suplementação com cobre proporcionou maior acúmulo de Cu no fígado (P<0,05), porém, a concentração do elemento no músculo não foi alterada pela suplementação. Não houve diferença significativa (P>0,05) para espessura de gordura subcutânea, concentrações séricas de triglicerídeos, colesterol total, HDL e LDL entre os tratamentos controle e suplementação com cobre, independentemente da fonte. A suplementação com cobre alterou o perfil de ácidos graxos da carne (P<0,05), com aumento na proporção do ácido láurico (C12:0) do grupo controle comparado com os demais tratamentos (P<0,05). Houve redução da concentração de colesterol no músculo longissimus (P<0,05) dos cordeiros suplementados com Cu em relação ao grupo controle, acompanhado de redução (P<0,05) da concentração da GSH e aumento da GSSG no fígado (P<0,05). Não houve efeito da suplementação para níveis de TBARS no fígado (P>0,05), mas houve efeito significativo (P<0,10) no longissimus colhido no momento da desossa. A suplementação com Cu não teve efeito sobre os valores de TBARS para as amostras dispostas na vida de prateleira, porém, houve aumento linear desses valores ao longo do tempo. A suplementação com Cu aumentou a atividade da SOD e GP-x (P<0,05) no fígado. Estes resultados sugerem que o cobre pode ser usado para melhorar a qualidade de carne sem afetar a sua estabilidade oxidativa lipídica. / Copper is associated with lipid metabolism, becoming very important in reducing cholesterol and oxidative stability of meat, because it is part of some antioxidant enzymes. These attributes make interesting the research of this mineral in various animal species to improve the quality life of consumers, since they can reduce the risk of cardiovascular diseases and cancers, as well as of the suppliers of the meat due to the possibility of increase the shelf life and organoleptic characteristics. So the aim of this study was to determine the effect of two levels of copper sulphate and copper methionine on lipid and cholesterol metabolism and lipid oxidative stability in meat of Merino x Texel lambs. For that, an experiment was conducted in the Faculty of Animal Science and Food Engineering, University of São Paulo, at the Pirassununga Campus using forty male lambs, Merino x Texel, randomly distributed into 5 treatments groups of 8 animals each. The animals were housed in individualized cages for the study of sheep metabolism, for a period of 120 days. Treatments used were: control, without addition of Cu (Co); 10 or 30 mg of Cu/kg of DM in the form of Cu sulphate (CuSO4); 10 or 30 mg of Cu/kg of DM in the form of copper methionine (Cu-methionine). Liver biopsies were carried out in all animals to determine initial hepatic Cu level. On day 0, 28 and 56 of the experiment blood were collected for analysis of total cholesterol, HDL cholesterol (HDL) and triglycerides. At the end of the experiment, animals were humanely slaughtered and liver samples were collected for later for analysis of Cu, reduced glutathione (GSH), oxidized glutathione (GSSG), glutathione peroxidase (GP-x), superoxide dismutase (SOD) and thiobarbituric acid reactive substances (TBARS). After 24 hours of cooling, left carcasses halves were sawed into two parts between the 12th and the 13th rib to obtain the fat thickness (EGSC). During sawing muscle sample from m. longissimus were collected for determination of cholesterol, fatty acids profiles and TBARS. At the same time, m. longissimus muscle entire was collected and frozen under vacuum for 12 months for study of oxidative stability. After that, steaks of m. longissimus were collected and exposed to \"display life\" (DL) (4°C) to study oxidative stability which was accompanied by TBARS values on days 0, 3 and 6. The copper supplementation resulted in higher concentration and accumulation of Cu in the liver (P<0.05), however, the concentration of Cu in muscle was not altered by supplementation (P>0.05). There was no significant effect (P>0.05) for fat thickness, serum triglycerides, total cholesterol, HDL and LDL between control and copper supplementation regardless of the source. The copper supplementation altered the fatty acid profile of the meat (P<0.05), with an increase in the proportion of lauric acid (C12: 0) in the control group compared with the other treatments (P<0.05). Copper supplementation reduced cholesterol concentration in m. longissimus (P<0.05) in supplemented lambs compared to the control group, this reduction was accompanied by reduction concentrations of GSH (P<0.05) and increasing of oxidized glutathione (GSSG) in the liver (P<0.05). There was no effect of Cu supplementation for TBARS in the liver however, there was significant effect on m. longissimus collected during sawing (P<0.10). There was no effect of Cu supplementation for TBARS in the m. longissimus exposed in the \"Display Life after 12 months vacuum freezing (P>0.05), but there was a linear increase in TBARS values during this period. Cu supplementation increased the activity of SOD and GP-x (P<0.05) in the liver. These results suggest that copper can be used to improve meat quality without affecting the oxidative stability.

Neste trabalho foi estudada a influência da homogeneização a alta pressão na retenção de antocianinas e na inativação da atividade enzimática da peroxidase e polifenoloxidase presentes naturalmente na polpa de açaí. Este trabalho foi dividido em duas etapas. Na primeira, a polpa de açaí teve suas propriedades físicoquímicas e comportamento reológico determinados. Na segunda etapa, a polpa de açaí passou por um pré-tratamento de filtração e posteriormente, foi tratada por homogeneização a alta pressão, com pressões de (100, 200 e 300) MPa e temperaturas de entrada do produto de (20 e 30) °C. Amostras da polpa de açaí processada foram analisadas quanto às propriedades físico-químicas, composição centesimal, teor de antocianinas, atividade antioxidante, teor de fenólicos totais, atividade enzimática (peroxidase e polifenoloxidase) e análise de cor. Os dados experimentais reológicos das curvas com taxas de cisalhamento ascendente e decrescente foram bem ajustados ao modelo Herschel-Bulkley. Esses dados apresentaram uma curva de histerese em sentido anti-horário, denotando um comportamento anti-tixotrópico. A polpa de açaí, utilizada na segunda parte deste trabalho, apresentou teor de sólidos totais variando entre (11,44 e 14,63) %, teor de antocianinas monoméricas (Am) (2,20 e 2,54) mg/g extrato seco, atividade antioxidante (AA) (7,68 e 8,27) mol TE/g extrato seco; fenólicos totais (FT) (25,51 e 34,57) mg GAE/g extrato seco e atividade enzimática da peroxidase (POD) entre (1,02E-2 e 3,73E-2) U/s.oBrix.g extrato seco e da polifenoloxidase (PFO) (2,87E-2 e 7,59E-2) U/s.oBrix.g extrato seco. O tratamento de homogeneização a alta pressão preservou 97,5 % do teor de antocianinas monoméricas presentes na polpa de açaí tratada após filtração. A enzima PFO apresentou uma inativação máxima de 47 % para a polpa de açaí tratada a 300 MPa; a máxima inativação obtida para a POD foi de 43,7 %, para tratamento a 300 MPa e temperatura de entrada do produto de 20 °C. O tratamento de homogeneização a alta pressão é uma alternativa ao tratamento térmico por reter as antocianinas e reduzir a atividade enzimática da POD e PFO. / The effect of high pressure homogenization on the stability of anthocyanins and on the inactivation of enzymatic activity of peroxidase and polyphenoloxidase from açaí pulp was studied in this work. Experimental investigations were carried out in two steps. Firstly, açaí pulp had its physicochemical properties and rheological behavior determined. Secondly, açaí pulp was pretreated through filtration and processed through high pressure homogenization at pressures of (100, 200 and 300) MPa and inlet product temperatures of (20 and 30) °C. The processed açaí pulp had its composition and physicochemical properties determined: analyses such as anthocyanin content, antioxidant activity, content of phenolic compounds, enzymatic activity (peroxidase and polyphenoloxidase) and color analysis were carried out. The experimental rheological data for increasing and decreasing shear rates were well correlated by the Herschel-Bulkley model. These data showed a counterclockwise hysteretic loop that indicates an anti-thixotropic behavior. The açaí used in the second part of this work presented a total solid content ranging from (11.44 and 14.63) %, total monomeric anthocyanins (Am) (2.20 and 2.54) mg / g dry matter, antioxidant activity (AA) (7.68 and 8.27) mol TE / g dry matter, total phenolic content (FT) (25.51 and 34.57) mg GAE / g dry matter, enzymatic activity of peroxidase (POD) from (1.02 E-2 and 3.73 E-2) U/s.oBrix.g dry matter and enzymatic activity of polyphenoloxidase (PFO) from (2.87 E-2 and 7.59 E-2) U/s.oBrix.g dry matter. The use of high pressure homogenization allowed the recovery of 97.5% of monomeric anthocyanins present in filtered açaí pulp. The enzyme PFO underwent a maximum inactivation of 47% for açaí pulp treated at 300 MPa, regardless of inlet temperature of the product; the maximum inactivation achieved for POD was 43.7%, for the treatment at 300 MPa and inlet temperature of the product of 20 °C. The treatment of high pressure homogenization is an alternative to heat treatment because it retains the anthocyanins and inactivates the enzymatic activity of POD and PFO.

Orientador: Antonio Celso Pezzato / Resumo: A temperatura ambiente afeta negativamente a produção de frangos de corte quando excede a termoneutralidade, por isso, alternativas nutricionais como a redução da proteína bruta da dieta são bem-vindas. Aliado a isso, a suplementação da ração com protease torna mais efetivo o aproveitamento da porção proteica, bem como o uso de vitamina C, combatendo metabólitos nocivos oriundos do estresse. A partir disso, objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da temperatura ambiente, da suplementação de protease e ácido ascórbico sobre o desempenho e digestibilidade de nutrientes de frangos de corte. Para este experimento, 720 pintos machos Cobb com 1 dia de idade foram alojados em galpão até os 15 dias de idade, em condições não experimentais, com a finalidade de evitar a adaptação dos frangos às temperaturas das câmaras bioclimáticas no período de estudo. Após esta fase inicial, os frangos foram distribuídos casualmente em três câmaras: termoneutra; quente e quente + suplementação de vitamina C. Os frangos de corte receberam duas dietas, uma delas com redução do nível de proteína bruta e aminoácidos (CN), e outra sem a redução de níveis dos mesmos nutrientes (CP). Adicionalmente, as dietas foram suplementadas com três níveis de protease: 0; 200 e 400 ppm, resultando em um esquema fatorial 3×2×3 (termoneutro, quente e quente+vit.C × dietas CP e CN × 0 ppm, 200 ppm e 400 ppm de protease). Para o desempenho avaliouse o peso corporal (PC), ganho de peso médio (GPM), consumo de ração (CR)... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:50:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 410668.pdf: 610134 bytes, checksum: 96d58c78aa5915846ec6c97a8caffdcb (MD5) Previous issue date: 2009-03-23 / A tuberculose (TB) ? considerada uma amea?a ? sa?de p?blica mundial; segundo a Organiza??o Mundial da Sa?de, cerca de dois milh?es de pessoas morrem anualmente em conseq??ncia desta doen?a. Uma das caracter?sticas mais importantes do pat?geno causador da TB ? a sua capacidade de persistir nos tecidos do hospedeiro por um longo per?odo em um estado de lat?ncia, tamb?m conhecido como persist?ncia. A import?ncia do estado de lat?ncia ? sobreviv?ncia do bacilo tem sido um atrativo fator para o desenvolvimento de trabalhos que caracterizem com maior profundidade esta fase da infec??o por M. tuberculosis. O entendimento do modo de a??o e o papel das enzimas da rota de salvamento de pirimidinas em M. tuberculosis poderia revelar novos alvos para o desenho racional de agentes anti-TB potentes e seletivos capazes de, se poss?vel, prevenir a progress?o e a reativa??o da doen?a. A citidina deaminase (CDA, EC 3.5.4.5), uma enzima evolutivamente conservada da rota de salvamento das pirimidinas, catalisa a deaminacao hidrol?tica de citidina e 2'-desoxicitidina para formar uridina e 2'-desoxiuridina, respectivamente. O prov?vel gene da CDA (cdd, Rv3315c) de M. tuberculosis foi clonado, seq?enciado e expresso em c?lulas de Escherichia coli BL21(DE3). O protocolo de purifica??o da CDA recombinante de M. tuberculosis (MtCDA) produziu 35 mg de prote?na homog?nea a partir de 10 g de c?lulas. A an?lise de espectrometria de massas, seq?enciamento N-terminal e cromatografia por gel filtra??o confirmaram a massa molecular prevista, a identidade e o estado oligom?rico de MtCDA, que foi estimada em 52,99 kDA. Estes resultados e os de alinhamento m?ltiplo de seq??ncias sugere que MtCDA ? um homotetr?mero em solu??o. Medidas de cin?tica em estado estacion?rio da CDA geraram os seguintes par?metros: valores de KM e kcat de, respectivamente, 1004 uM e 4,8 s-1 para citidina, e 1059 uM e 3,5 s-1 para 2'- desoxicitidina. A depend?ncia dos valores de kcat e kcat/KM em fun??o do pH para citidina indicam que a protona??o de um ?nico grupo ioniz?vel com valor de pKa de 4,3 elimina a atividade, e a protona??o de um grupo com pKa de 4,7 reduz a liga??o ao substrato. Foram obtidos cristais de CDA utilizando o m?todo de difus?o de vapor em gota pendente. A demonstra??o de que o locus Rv3315c codifica uma prote?na com atividade CDA em M. tuberculosis ? o primeiro passo para entender o papel do produto deste gene e dever? ajudar no desenho de agentes anti-TB e vacinas.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 448460.pdf: 1711084 bytes, checksum: 65dd3daa12164398aab7aa839028c683 (MD5) Previous issue date: 2013-04-19 / Tuberculosis remains as one of the main cause of mortality worldwide due to a single infectious agent, Mycobacterium tuberculosis. The aroK-encoded Mycobacterium tuberculosis Shikimate Kinase (MtSK), shown to be essential for survival of bacilli, catalyzes the phosphoryl transfer from ATP to the carbon-3 hydroxyl group of shikimate (SKH), yielding shikimate-3-phosphate and ADP. Here we present purification to homogeneity, and oligomeric state determination of recombinant MtSK. Biochemical and biophysical data suggest that the chemical reaction catalyzed by monomeric MtSK follows a rapid-equilibrium random order of substrate binding, and ordered product release. Isothermal titration calorimetry (ITC) for binding of ligands to MtSK provided thermodynamic signatures of non-covalent interactions to each process. A comparison of steady-state kinetics parameters and equilibrium dissociation constant value determined by ITC showed that ATP binding does not increase the affinity of MtSK for SKH. In addition, there appears to be a positive free energy coupling of 3.2 kJ mol-1 for SKH binding to MtSK:Mg2+ATP binary complex, which suggest that ATP displays negative cooperativity for SKH binding. We suggest that MtSK would more appropriately be described as an aroL-encoded type II shikimate kinase. Our manuscript also gives thermodynamic description of SKH binding to MtSK and data for the number of protons exchanged during this bimolecular interaction. The negative value for the change in constant pressure heat capacity (ΔCp) and molecular homology model building suggest a pronounced contribution of desolvation of non-polar groups upon binary complex formation. Thermodynamic parameters were deconvoluted into hydrophobic and vibrational contributions upon MtSK:SKH binary complex formation. Data for the number of protons exchanged during this bimolecular interaction are interpreted in light of astructural model to try to propose the likely amino acid side chains that are the proton donors to bulk solvent following MtSK:SKH complex formation. / A tuberculose se mant?m como uma das principais causas de mortalidade ao redor do mundo devido a um ?nico agente infeccioso, o Mycobacterium tuberculosis. O gene aroK que codifica a enzima Chiquimato quinase de Mycobacterium tuberculosis (MtSK), que se mostrou essencial para a sobreviv?ncia do bacilo, catalisa a transfer?ncia de um grupo fosforil do ATP para o chiquimato (SKH), resultando em chiquimato-3-fosfato e ADP. O presente trabalho apresenta a purifica??o da prote?na MtSK at? a homogeneidade e a determina??o de seu estado oligom?rico em solu??o. Estudos bioqu?micos e biof?sicos apresentados nesta tese sugerem que a rea??o catalisada pela MtSK monom?rica segue um mecanismo de equil?brio r?pido ordenado aleat?rio na adi??o dos substratos e uma libera??o ordenada sequencial dos produtos. A an?lise por calorimetria de titula??o isot?rmica (ITC) das intera??es n?o covalentes da enzima MtSK com diferentes ligantes resultou na determina??o de assinaturas termodin?micas para cada um desses eventos de liga??o. A compara??o entre as constantes de afinidade obtidas por espectrofotometria e ITC demostraram que o ATP n?o aumenta a afinidade da prote?na MtSK pelo SKH. Al?m disso, foi determinada em + 3,2 kJ mol-1 a energia livre de acoplamento do SKH ao complexo bin?rio MTSK:Mg2+ATP, sugerindo que o ATP possui uma cooperatividade negativa em rela??o ao SKH. Esse trabalho sugere que a MtSK deveria ser mais apropriadamente descrita como uma chiquimato quinase do tipo II codificada pelo gene aroL. Adicionalmente, estre trabalho demonstra a descri??o termodin?mica do SKH se ligando a MtSK aonde os resultados sugerem o n?mero de pr?tons que est?o sendo trocados durante a intera??o bimolecular. O valor negativo encontrado para a capacidade calor?fica em press?o constante (ΔCp) e o modelo molecular por homologia criado sugerem uma pronunciada contribui??o na dessolvata??o de grupos apolares relacionados ? forma??o do complexo. As constantes termodin?micas foram separadas na contribui??o hidrof?bica e vibracional relacionadas ? forma??o do complexo bin?rio MtSK:SKH. Os resultados obtidos relacionados ? transfer?ncia de pr?tons durante a forma??o do complexo bin?rio foram analisados tendo como refer?ncia o modelo estrutural da enzima MtSK constru?do neste trabalho. De acordo com as cadeias laterais que fazem contato com o SKH no modelo proposto, se pode indicar que os amino?cidos Arg58 e Arg136 atuam como fonte de pr?tons durante a forma??o do complexo bin?rio.