Orientador: Rubens Monti / Banca: Jonas Contiero / Banca: Luis Henrique Souza Guimarães / Banca: Guilherme Peixoto / Banca: Kátia Sivieri / Resumo: As proteases são importantes enzimas industriais com vasta área de aplicação. Como catalisam a hidrólise de proteínas, são amplamente exploradas na produção de hidrolisados proteicos a partir das proteínas do leite (caseínas e soro de queijo), soja e peixe, gerando produtos de alto valor agregado. Neste trabalho, a tripsina (EC 3.4.2.1.4) e pepsina (EC 3.4.23.1) foram imobilizadas em suporte alternativo de baixo custo pó de sabugo de milho (SM) para a obtenção de hidrolisados parciais do soro de queijo bovino e bubalino, principal subproduto da indústria de laticínios. O suporte pré-tratado foi ativado com grupos glioxil e IDA-glioxil (tripsina) e glutaraldeído (tripsina e pepsina). Os derivados apresentaram rendimentos de imobilização maiores que 80% para a tripsina e 90% para a pepsina com atividades recuperadas maiores que 85% e 94%, respectivamente. O derivado de tripsina-glioxil-SM exibiu uma excelente estabilidade térmica a 65 ° C, que foi 1111 vezes maior em comparação à enzima livre seguido pelos derivados tripsina-IDA-glioxil-SM (900 vezes) e tripsina-glutaraldeído-SM (5,38 vezes). Para o derivado pepsina-glutaraldeído-SM a estabilidade térmica foi realizada em 45ºC e foi 1,42 vezes maior com relação à enzima livre. Os derivados estabilizados tripsina-glioxil-SM e pepsina-glutaraldeído-SM foram empregados em um reator de leito empacotado para hidrólise do lactosoro bovino e bubalino. A relação derivado enzimático/volume útil foi de 1:2 e o processo foi conduzido a 45ºC com uma vazão de 10,1mL/h. Para a hidrólise, os soros de queijo bovino e bubalino foram dialisados e tratados com caulim para a redução dos teores de lactose e gordura, respectivamente. Os hidrolisados foram fracionados por cromatografia de filtração em gel (Sephadex G25) para obtenção de pools de peptídeos ˂5kDa. O transporte e a absorção de cada um dos pools de peptídeos foram avaliados pelos métodos in vitro da... / Abstract: Proteases are important industrial enzymes with wide range of application. They catalyze the hydrolysis of proteins and are widely exploited in the production of protein hydrolysates from milk protein (casein and whey), soy and fish, generating high value-added products. In this work, trypsin (EC 3.4.21.4) and pepsin (EC 3.4.23.1) were immobilized on a low cost alternative support, corn cob powder (CCP) to obtain partial hydrolysates of bovine and buffalo cheese whey, the main by-product of the dairy industry. The pretreated support was activated with glyoxyl and IDA-glyoxyl groups (trypsin) and glutaraldehyde (trypsin and pepsin). The derivatives showed immobilization yields higher than 80% and 90% for trypsin and pepsin, respectively, and recovered activities higher than 85% for trypsin derivatives and 94% for pepsin derivative. The derivative trypsin-glyoxyl-CCP showed excellent thermal stability at 65 ° C, which was 1111 times higher that obtained with free enzyme, followed by derivative trypsin-IDA-glyoxyl-CCP (900-fold) and trypsin-glutaraldehyde-CCP (5.38-fold). For the derivative pepsin-glutaraldehyde-CCP the thermal stability was held at 45 ° C and was 1.42 times greater than the free enzyme. Stabilized derivatives trypsin-glyoxyl-CCP and pepsin-glutaraldehyde-CCP were used in a packed bed reactor for the hydrolysis of bovine and buffalo cheese whey. The relationship derivative/working volume was 1:2 and the process was conducted at 45 ° C with a flow of 10.1mL/h. For the hydrolysis, bovine and buffalo cheese whey were dialyzed and treated with kaolin to reduce lactose and fats, respectively. The hydrolysates were fractionated by gel filtration chromatography (Sephadex G25) to obtain 5kDa peptide pools. The transport and absorption of each peptide pools were evaluated by in vitro methods simulating the gastrointestinal digestion/dialysability and by Caco-2 cell ... / Doutor

Orientador: Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues Pietro / Banca: Suraia Said / Banca: Luiz Henrique Souza Guimarães / Banca: Tais Maria Bauab / Banca: Edwil Aparecida de Lucca Gattás / Resumo: Enzimas são catalisadores fundamentais para os sistemas biológicos sendo amplamente estudadas e aplicadas em todo o mundo, especialmente na área da saúde. Neste trabalho foi avaliada a aplicação de enzimas quitinolíticas e queratinolíticas em ensaios in vitro contra Pedicullus humanus capitis e na degradação de calos humanos, respectivamente. Foram selecionados os micro-organismos com maior potencial para produção dessas enzimas e determinados os parâmetros de produção, as condições de separação, purificação e caracterização das enzimas. Os micro-organismos com maior potencial para a produção de quitinases e queratinases foram os fungos Metarhizium anisopliae CG374 e Aspergillus oryzae, respectivamente. As maiores produções de quitinases foram obtidas em biorreator a 28°C, pH 7,0, 1,5 vvm e 200 rpm após 120 h. Quando produzida em biorreator hiperbárico sob pressão de 5 bar, apresentou um aumento de 21,3% na produtividade em relação ao biorreator convencional. Para queratinases em biorreator, os parâmetros de produção foram 28°C, pH 6, 200 rpm, 1,5 vvm e 120 h. A produção das quitinases e queratinases em biorreator foi 83 e 154% maior do que em frascos Erlenmeyer, respectivamente. A quitinase foi concentrada 5,12 vezes na purificação apresentando massas molares aproximadas de 24, 28 e 80 kDa. Fração purificada contendo quitinase apresentou estabilidade a 40°C por 60 minutos. A queratinase foi concentrada 4,52 vezes após purificação com massas molares de 40 e 50 kDa apresentando estabilidade térmica a 40°C por 60 min. A avaliação das enzimas quitinolíticas frente a piolhos humanos apontou para uma eficiência 9,1% maior quando comparadas com produtos comerciais. A avaliação da ação de enzimas queratinolíticas na degradação de calos humanos demonstrou resultados significativos quando comparados com produtos disponíveis no mercado... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Enzymes are catalysts for fundamental biological systems is extensively studied and applied worldwide, especially in health. In this study were evaluated the application of enzymes chitinolytic and keratinolytic in tests in vitro against Pedicullus humanus capitis and degradation of human callus, respectively. Were selected microorganisms with the greatest potential for production of these enzymes and determined the production parameters, conditions of separation, purification and characterization of enzymes. The microorganisms with the higher potential for the production of chitinases and keratinases were Metarhizium anisopliae CG374 and Aspergillus oryzae, respectively. The highest yields of chitinases obtained in fermentations in a bioreactor were 28°C, pH 7.0, 1.5 vvm and 200 rpm after 120 h. When produced in the hyperbaric bioreactor at a pressure of 5 bar, an increase of 21.3% in yield over conventional production in a conventional bioreactor was observed. To keratinases in a bioreactor, the production parameters were 28°C, pH 6.0, 200 rpm, and 1.5 vvm after 120h. The production of chitinases and keratinases in bioreactor was 83 and 154% higher than in Erlenmeyer flasks, respectively. The chitinase was 5.12 times concentred on the purification presenting molar weight of approximately 24, 28 and 78 kDa. Fraction containing purified chitinase showed thermal stability of 40°C for 60 min. Keratinase was concentred 4.52 times after purification and presents molar weight of 40 and 50 kDa. The purified fraction was thermal stability at 40°C for 60 min. Evaluation of chitinolytic enzymes against human lice showed an efficiency of 9.1% higher for the enzymatic extract when compared with commercial products. The evaluation of the action of keratinolytic enzyme in the degradation of human callus showed significative results when compared to products on the market less time reaching maximum degradation / Doutor

Orientador: José Geraldo Nery / Banca: Eleni Gomes / Banca: Leandro Martins / Resumo: O termo zeólitas abrange a classe dos alumino silicatos hidratados de metais alcalinos ou alcalino-terrosos. A enzima lipase de Thermomyces lanuginosus foi imobilizada em zeolitas, produzindo um catalisador heterogêneo com potencial aplicação para a produção de biodiesel. Dois tipos de zeolita foram sintetizados: zeolita gismondina (GIS/Na) e um novo material zeolitico com topologia faujasítica (FAU/Co e FAU/Cu). A zeolita gismondina foi submetida ao processo de troca iônica com os cátions divalentes Ni 2+ , Co 2+ , Mg 2+ , Sr 2+ , Mn 2+ e Ca 2+ (GIS/Ni, GIS/Co, GIS/Mg, GIS/Sr, GIS/Mn e GIS/Ca) e a zeólita com topologia faujasítica foi submetida ao processo de troca iônica com NH4 + (FAU/Co.NH 4 e FAU/Cu.NH 4 ) e posteriormente calcinada a 500 o C (FAU/Co.H + e FAU/Cu.H + ). Estes materiais foram utilizados como suporte sólido para a imobilização enzimática, dando origem aos complexos zeolita-enzima: GIS/Ni/ENZ, GIS/Co/ENZ e FAU/Co.NH 4 /ENZ por exemplo. Foram utilizados dois métodos diferentes de imobilização. Em um deles, foi feito um pré-tratamento da lipase com o substrato (óleo de soja) e em outro a enzima foi imobilizada sem o pré-tratamento com o substrato. Foram feitos experimentos de transesterificação de triglicerídeos para a produção de biodiesel utilizando como catalisador da reação as zeolitas puras, a enzima pura e os complexos zeolita-enzima. Os catalisadores com topologia faujasitica (FAU/Co e FAU/Cu) atuando em condições experimentais de 100 o C, razão molar óleo:álcool de 1:50 por 12 horas fornecem bons rendimentos de ésteres (90%). Os catalisadores GIS/Ni/ENZ e FAU/Co.NH 4 /ENZ (imobilização com pré tratamento da enzima) apresentaram os maiores valores de atividade enzimática e bons rendimentos de ésteres etílicos. A mesma quantidade de enzima (0,4 mg) foi utilizada em sua forma livre e imobilizada... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The term zeolites comprehend the class of hydrated alkaline or earth alkaline metals alumino silicates. Thermomyces lanuginosus lipase enzyme was immobilized on zeolites, producing a heterogeneous catalyst with potential application on biodiesel production. Two types of zeolite were synthesized: gismondina zeolite (GIS/Na) and a new faujasite like zeolitic material: (FAU/Co e FAU/Cu). Gismondine zeolite was ion exchanged with divalent cations Ni 2+ , Co 2+ , Mg 2+ , Sr 2+ , Mn 2+ e Ca 2+ (GIS/Ni, GIS/Co, GIS/Mg, GIS/Sr, GIS/Mn e GIS/Ca) and the faujasite like zeolite was ion exchanged with NH4 + (FAU/Co.NH 4 e FAU/Cu.NH 4 ) and after this it was calcined at 500 o C (FAU/Co.H + e FAU/Cu.H + ). These materials were used as solid support for enzymatic immobilization originating the zeolite-enzyme complexes: GIS/Ni/ENZ, GIS/Co/ENZ and FAU/Co.NH 4 /ENZ for example. Two different methods of immobilization were used. In one of them the lipase was pretreated with the substrate (soybean oil) and in the other one the enzyme was immobilized without the pretreatment with substrate. Triglycerides transesterification experiments to biodiesel production were carried out using pure zeolite, pure enzyme and the zeolite-enzyme complexes as reaction catalyst. When used with experimental conditions of 100 o C, oil:alcohol molar ratio of 1:50 faujasite like catalyst performed good ester yield (90%). GIS/Ni/ENZ and FAU/Co.NH4 /ENZ catalysts (immobilization with pretreated enzyme) showed higher enzymatic activity values and good ethylic esters yield. The same amount of enzyme (0,4 mg) was used in its free and immobilized form in the transesterification reaction (45 o C, oil:alcohol molar ratio of 1:5 for 48 hours). Comparing transesterification reaction esters yield for the free enzyme (51,9%) and for the GIS/Ni/ENZ (70,3%) and FAU/Co.NH4 /ENZ (58,4%) catalysts, was possible... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Eleni Gomes / Banca: José Geraldo Nery / Banca: Adriano Aguiar Mendes / Resumo: A produção do biodiesel por meio da transesterificação enzimática, catalisada por lipases, tem a vantagem de gerar biodiesel de melhor qualidade devido à especificidade da catálise, e ainda permite a recuperação de um glicerol mais puro que pode ter diferentes aplicações. Entretanto, o uso da catálise enzimática no processo industrial de produção do biodiesel no Brasil ainda é inviável em função do alto custo das enzimas, requerendo desenvolvimento de tecnologias que reduzam o preço de produção e de aplicação desses biocatalisadores. Com base nestes aspectos, este trabalho teve como objetivo isolar e selecionar fungos filamentosos capazes de produzir lipases com atividade de transesterificação e aplicar estas enzimas na síntese do biodiesel, avaliando ainda as influências das condições de cultivo do microrganismo na produção das lipases. Dentre as 20 linhagens de fungos isoladas, duas apresentaram capacidade de produzir lipases com atividade de transesterificação quando cultivadas por fermentação em estado sólido (FES) em meio de bagaço de cana e farelo de soja (9:1). Nas condições empregadas, a linhagem Acremonium sp. ROG 2.1.9 apresentou atividade de transesterificação com rendimento de 1,5 g de ésteres·100g -1 de óleo de soja e atividade hidrolítica de 3,8 U·mL -1 quando avaliadas pelo método titulométrico e 0,8 U·mL -1 pelo método colorimétrico. Para determinar as condições favoráveis de fermentação, vários substratos foram testados para a cultura desse fungo e produção das lipases com atividade transesterificação, e aquele que proporcionou a maior atividade, utilizando o micélio imobilizado, foi a torta de algodão (sem adição de óleo), seguida pela mistura de bagaço de cana e farelo de soja (9:1) com rendimentos de 4,7 e 4,1 g de ésteres·100g -1 de óleo, respectivamente... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The production of biodiesel by enzymatic transesterification, catalyzed by lipase, has the advantage of produce better quality biodiesel, due to its high specificity and still allows recovery of a purer glycerol which can have several destinations. However, the use of enzymatic catalysis in an industrial production of biodiesel in Brazil is not feasible yet to the high cost of these enzymes, requiring development of technologies that reduce the cost of production and application. Based on these aspects, this study aimed to isolate and select filamentous fungi capable of producing lipase with transesterification activity and apply these enzymes in the synthesis of biodiesel, still evaluating the influences of culture conditions of the microorganism in the production of lipases. Among the 20 strains of fungi isolated, two had the ability to produce lipases with transesterification activity when grown by solid state fermentation (SSF) in the middle of sugarcane bagasse and soybean meal (9:1). Under these conditions employed the strain Acremonium sp. ROG 2.1.9 showed transesterification activity with a yield of 1.5 g of 100g -1 · esters of soybean oil and hydrolytic activity of 3.8 U · mL -1 when measured by titrimetric method and 0.8 U· ml -1 by colorimetric method, respectively. To determine favorable conditions of fermentation, various substrates were tested for the culture of this fungus and production of lipases with transesterification activity, and one that yielded the highest transesterification activity, using immobilized mycelia, was cottonseed meal (without added oil), followed by mixture of sugarcane bagasse and soybean meal (9:1) with yields of 4.7 and 4.1 g of esters · 100g -1 oil, respectively. Using the mixture of mycelium immobilized on sugarcane bagasse and soybean meal (9:1), were also evaluated nine solutions with different nitrogen... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: João Tadeu Ribeiro Paes / Banca: Edislaine Barreiros de Souza / Banca: Márcia Zilioli Bellini / Resumo: As pesquisas com células-tronco têm avançado expressivamente e ocupam um papel de destaque no contexto do novo ramo terapêutico que se convencionou denominar de medicina regenerativa. A abundância e facilidade de obtenção do tecido muscular têm permitido a ampliação dos estudos acerca de seu potencial como fonte de células-tronco mesenquimais. Neste sentido, diferentes metodologias têm sido propostas para a obtenção de células-tronco mesenquimais oriundas do tecido muscular (CTDM), objetivando cultivo e aplicação clínica em medicina humana e veterinária. Um aspecto importante a ser considerado nos diversos protocolos de isolamento de células-tronco mesenquimais refere-se ao emprego rotineiro da colagenase de origem bacteriana (Clostridium histolyticum). O emprego de reagentes xenobióticos, como a colagenase, rotineiramente empregados, obedecem às recomendações da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA - Brasil), que preconiza a não utilização desses produtos no cultivo de células destinadas à terapia celular em pacientes humanos, uma vez que podem conter agentes infecciosos e contaminantes capazes de desencadear severas reações imunológicas. Neste contexto, objetivou-se, neste estudo, a proposição de novas metodologias a fim de substituir o emprego de xenobióticos no processo de obtenção CTDM. Para tanto, foram comparados os métodos de digestão enzimática (colagenase), dissociação mecânica e explante, em diferentes meios de cultura. O conjunto de resultados mostra que as técnicas de dissociação mecânica e explante são metodologias... / Abstract: The researches with stem cells have advanced significantly and take a prominent role in the context of the new treatment branch that has been conventionally called of regenerative medicine. The abundance and ease of obtaining muscle tissue have allowed the expansion of studies on its potential as a source of mesenchymal stem cells. In this sense, different methodologies have been proposed for obtaining mesenchymal stem cells derived of muscle tissue (SCDM), aiming cultivation and clinical application in human and veterinary medicine. An important aspect to be considered in the various protocols of isolation of mesenchymal stem cells refers to the routine use of bacterial collagenase (Clostridium histolyticum). The use of xenobiotic reagents, such as collagenase, contrasts with the recommendations of the National Health Surveillance Agency (ANVISA - Brazil), which recommends the avoidance of the use of these products in the cultivation of cells destined for cell therapy in human patients, since which may contain infectious agents and contaminants that are capable of triggering severe immunological reactions. In this context, we aimed in this study to propose new methods to replace the use of xenobiotics in the process of obtaining SCDM. For this end, the methods of enzymatic digestion (collagenase), mechanical dissociation and explant were compared in different culture media. The set of results shows that the techniques of mechanical dissociation and explant are viable methodologies for replacement of collagenase procedures for obtaining SCDM. These new methodological... / Mestre

Orientador: Eleni Gomes / Coorientador: Heloiza Ferreira Alves do Prado / Banca: Luis Henrique Souza Guimarães / Banca: Eleonora Cano Carmona / Banca: Lara Durães Sette / Banca: Valéria Marta Gomes de Lima / Resumo: Organismos termofílicos produzem enzimas que, em geral, são mais termoestáveis que aquelas produzidas por mesofílicos. Além disso, essas enzimas geralmente apresentam várias características importantes sob o ponto de vista de aplicação industrial, como estabilidade em ampla faixa de pH e maior tolerância a solventes e outros desnaturantes proteicos. O tipo de processo fermentativo usado também pode influênciar a produção e as propriedades das enzimas obtidas. Foram isoladas várias cepas fúngicas termofílicas e pectinolíticas e entre elas, o fungo termofílico Thermomucor indicae-seudaticae N31 foi o que apresentou maior potencial de produção de poligalacturonase (PG) usando meios a base de resíduos agro-industriais. Em fermentação em estado sólido (FES) usando como meio de cultura uma mistura de farelo de trigo e bagaço de laranja (1:1) a 70% de umidade, o fungo produziu 14 U/mL em 48 horas e em fermentação submersa (FSm) com 1% farelo de trigo e 1% bagaço de laranja como substrato foram obtidas 13 U/mL em 96 horas de fermentação. A PG presente na solução enzimática bruta obtida de FSm foi mais termoestável do que aquela de FSS e mais estável em ampla faixa de pH. As exo-PGs produzidas em FSm e FSS foram purificadas até homegeneidade, com um fator de purificação de 8 e 2,5 vezes e um rendimento de 27,7% e 15,5% para FSm e FSS, respectivamente. A PG da FSm apresentou um massa molar de 38,9 kDa e a de FSS 37,1, kDa. O pH e temperatura ótimos foram de 5,5 e 4,5-5,0 e 55° e 60°C, para enzimas de FSm e FES, repectivamente. Ambas as PGs mostraram perfil de exo-PG, liberando ácido galacturônico por hidrólise de pectina com baixo grau de esterificação (DE). O km foi 590,9 e 661,6 e o Vmax de 4 e 4,9 umol min-1mg-1, para PG de FSm e FES, respectivamente. A termoestabilidade foi comprovada pela análise dos... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Thermophilic organisms produce enzymes that, in general, are more thermostable than the ones produced by mesophilic. Moreover, these enzymes generally exhibit many important characteristics under the perspective of industrial application, such as stability in a wide range of pH and more tolerance to solvents and other protein denaturating substances. The type of fermentative process can also influence the production and properties of the enzymes obtained. Numerous strains of thermophilic and pectinolytic fungi were isolated and among them, the Thermomucor indicae-seudaticae N31 was the one that presented the highest potential for polygalacturonase (PG) production using media containing agro industrial residues. In solid state fermentation (SSF) using a mixture of wheat bran and orange bagasse (1:1) as substrate, at 70% moisture, the fungus produced 14 U/mL in 48 hours and in submerged fermentation (SmF) with 1% wheat bran and 1% orange bagasse as substrate, 13 U/mL were obtained in 96 hours of fermentation. PG in the crude enzymatic extract obtained from SmF was more thermostable than the one produced in SSF and stable in a wider range of pH. The exo-PGs produced in SmF and SSF were purified to homogeneity, with a final purification of 8 and 2.5- fold and overall recovery of 27.7% and 15.5%, respectively. PG from SmF exhibited a molecular mass of 38.9 kDa and PG from SSF 37.1 kDa. Optimum pH and temperature were 5.5 and 4.5-5.0 and 55°C and 60°C for the enzymes from SmF and SSF, respectively. Both PGs exhibited exo-PG profile, releasing galacturonic acid through the hydrolysis of low esterification level pectin. Km was 590.9 and 661.6 and Vmax was 4 and 4.9 umol min-1mg-1, for PG from SmF and SSF, respectively. The thermostability was confirmed by analyzing the enzymes thermodynamic parameters with PG produced in SmF being the most thermostable exhibiting higher values... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Resumo: Para o setor industrial, o isolamento e identificação de microrganismos com habilidade em produzir biocatalisadores é de grande importância para a apresentação de novas fontes de enzimas ao mercado. O isolamento é uma das ferramentas mais utilizadas na seleção de microrganismos, proporcionando o levantamento de espécies capazes de metabolizar compostos químicos potencialmente tóxicos, sendo essenciais na biorremediação, pois atuam como medida mitigadora para os problemas decorrentes do uso irracional de agrotóxicos. Neste trabalho, foram isoladas 75 linhagens fúngicas de solo de plantação de cana de açúcar, por diferentes fontes de carbono, em diferentes épocas do cultivo e em duas áreas de coleta - solo com e sem a queima da palha - para o estudo do potencial de produção enzimática e de degradação do herbicida diuron. Dentre os isolados, encontrou-se 10 gêneros diferentes, sendo a maioria referente ao gênero Trichoderma (40%), seguido de Fusarium (15%), Cunninghamella (13%) e Aspergillus (12%). Da quantidade total de fungos isolados, 56% foram oriundos do solo de queimada e 44% do solo sem queima. Os gêneros Aspergillus, Cunninghamella, Fusarium e Trichoderma foram os gêneros encontrados em todos os meios de isolamento, como também os mais constantes, sendo os dois últimos, os únicos a serem encontrados em todas as coletas. Os isolados foram submetidos à fermentação do estado sólido, contendo bagaço de cana e farelo de trigo como substratos, para estudo da produção de xilanase, CMCase e lacase. A atividade das enzimas pelos isolados fermentados foi bastante variada, com produção de xilanase atingindo valores máximos de 64,0 U/mL (Aspergillus) e 63,7 U/mL (Aspergillus), a produção de CMCase foi de 5,5 U/mL (Fusarium) e 4,2 U/mL (Aspergillus) e lacase de 0,50 U/mL (Verticillium) e 0,27 U/mL (Fusarium). Dos 74 isolados, 23 foram... (resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The isolation and identification of microorganisms with ability to produce biocatalysts is a great method for the presentation of new sources of enzymes to the industry. Isolation is one of the most used tools in the selection of microorganisms, providing a survey of species able to metabolize potentially toxic chemical compounds In this study, 75 fungal strains were isolated from soil of plant sugar cane from different carbon sources, at different times of cultivation and collecting in two areas - soil with and without straw burning - to study the enzyme activity and degradation of the herbicide diuron. Among the isolates, were found 10 different genres, mostly related to the genus Trichoderma (40%), followed by Fusarium (15%), Cunninghamella (13%) and Aspergillus (12%). Of the total isolates, 56% came from the soil of burned and 44% of the ground without burning. The genera Aspergillus, Cunninghamella, Fusarium and Trichoderma were the genera found in all media of isolation, and the last two were the only ones to be found in all samples. The isolates were subjected to solid-state fermentation, containing sugar cane bagasse and wheat bran as substrates to study the production of xylanase, CMCase and laccase. The activity of enzymes by the fungus fermentation was quite varied, with xylanase production reached maximum values of 64.0 U/mL (Aspergillus) and 63.7 U/mL (Aspergillus), the production of CMCase was 5.5 U/mL (Fusarium) and 4.2 U/mL (Aspergillus) and laccase from 0.50 U/mL (Verticillium) and 0.27 U/mL (Fusarium). Of the 74 isolates, 23 were selected for verification of the potential degradation of the herbicide diuron. All selected microorganisms showed higher degradation of the herbicide in question, and the genus Aspergillus had the most promising degradation (47.7% for peak product and 67.1 per concentration) in the period studied / Orientador: Eleni Gomes / Coorientador: André Rodrigues / Banca: Eliana Gertrudes Macedo Lemos / Banca: Eduardo Alves de Almeida / Mestre

Orientador: Gustavo Vitti Môro / Coorientador: Sonia Marli Zingaretti / Banca: Rinaldo Cesar de Paula / Banca: Everlon Cid Rigobelo / Banca: Ivana Marino Bárbaro / Banca: Marcelo Marchi Costa / Resumo: O trabalho foi realizado com o objetivo de verificar em quatro genótipos de milho o efeito da inoculação com Azospirillum brasilense na resposta germinativa das sementes e crescimento de plântulas, no teor de nitrogênio e índice de conteúdo de clorofila foliar e, na expressão quantitativa relativa de ESTs chaves no metabolismo do nitrogênio. Em um primeiro ensaio avaliou-se a qualidade fisiológica de sementes de dois híbridos simples comerciais (AG7098 e 2B707) e duas variedades sintéticas experimentais (V2 e V4) inoculados com A. brasilense, por meio de testes de porcentagem de germinação e emergência, índice de velocidade de emergência, massa de matéria seca de parte aérea e raiz. O segundo ensaio foi conduzido em casa de vegetação onde foram cultivados os mesmos quatro genótipos sob diferentes formas de inoculação com A. brasilense e fornecimento de N sendo avaliados teor de nitrogênio e clorofila foliar e a expressão de duas ESTs que codificam enzimas chaves da rota metabólica do N, a nitrato redutase (ZmNR) e a glutamina sintetase (ZmGln1-3) por meio da técnica de PCR quantitativa em tempo real. Os genótipos diferem em relação à inoculação com A. brasilense. Os híbridos foram responsivos à inoculação com A. brasilense para massa de matéria seca de raiz. A variedade V2 apresentou comportamento inferior quanto à massa de matéria seca de raiz, mas respondeu positivamente a massa de matéria seca de parte aérea, e V4 não apresentou diferenças significativas quando inoculada. Os resultados de índice de conteúdo de clorofila não foram significativos. Para teor de nitrogênio foliar cada genótip respondeu de maneira particular. Em relação a expressão das ESTs verificou-se que a inoculação proporcionou incrementos na expressão de ZmNR para os híbridos AG7098 e 2B707. A variedade V2 não respondeu a inoculação e V4 apresentou maior nível de ... / Abstract: The objective was to evaluate in maize genotypes the effect of inoculation with Azospirillum brasilense in seed germination response and seedling growth, the nitrogen and chlorophyll leaf content the relative quantitative expression of ESTs keys on nitrogen metabolism. In a first experiment was evaluated the physiological quality of seeds from two single cross hybrids (AG7098 and 2B707) and two synthetic varieties experimental (V2 and V4) inoculated with A. brasilense , by germination and emergence percentage, emergence rate tests, dry weight of shoot and root The second experiment was conducted in a greenhouse where the same genotypes were grown under different forms of inoculation with A. brasilense and supplying nitrogen being evaluated nitrogen and chlorophyll leaf content and the expression of two ESTs encoding key enzymes of metabolic pathway for N, nitrate reductase (ZmNR) and glutamine synthetase (ZmGln1-3) using the technique of quantitative real -time PCR. The genotypes differ with respect to inoculation with A. brasilense. Hybrids were responsive to inoculation with A. brasilense for dry root matter. The V2 variety showed lower performance as the dry weight of root, but responded positively to dry mass of shoots and V4 showed no significant differences when inoculated. The results of chlorophyll content were not significant. To the N content each genotype evaluated responded in a particular way. Regarding the expression of ESTs were found that inoculation promoted increases in expression ZmNR for AG7098 and 2B707 hybrids. A variety V2 did not respond to inoculation and V4 showed higher expression level when received only nitrogen application. In general, the varieties responded negatively or did not respond to inoculation with A. brasilense , when comparing the genotypes within treatments , and V2 showed lower expression values ZmRN for all forms of inoculation and fertilizer ... / Doutor

Orientador: Flávio Dutra de Resende / Coorientador: Eleni Gomes / Banca: Ricardo Andrade Reis / Banca: Daniela Alonso Bocchini Martins / Resumo: Objetivou-se produzir enzimas fibrolíticas por fermentação em estado sólido com os fungos Trichoderma reesei e Thermoascus aurantiacus e avaliar a ensilagem do milho com adição de doses dos extratos enzimáticos produzidos (0; 143,4; 286,8 e 573,6 U CMCase/Kg de matéria natural e 0; 1800,9; 3601,8 e 7203,6 U CMCase//Kg de matéria natural, respectivamente), em delineamento interamente casualizado, com quatro repetições para cada tratamento. Avaliou-se o valor nutritivo da forragem antes da ensilagem e após a abertura dos silos. Após 168h de fermentação, em substrato contendo bagaço de cana-de-açúcar e farelo de trigo (1:1), foi retirado cada extrato enzimático bruto. O extrato do fungo T. reesei continha 14,34 U/mL de CMCase, 1,03 U/mL de β- glicosidase, 74,60 U/mL de Xilanase e 0,48 U/mL de β-xilosidase e do T. aurantiacus continha 180,91 U/mL de CMCase, 6,02 U/mL de β-glicosidase, 719,98 U/mL de Xilanase e 0,17 U/mL de β-xilosidase. A adição dos extrato enzimáticos dos fungos T. reesei e T. aurantiacus, possibilitou queda na recuperação de matéria seca, com Y=96,02-0,1205x (R²=0,48) e Y=95,625- 0,1262x (R²=0,56), aumento nas perdas por gás com Y=23,27+0,0843x (R²=0,29) e Y=19,983+0,2863x (R²=0,39) e queda no teor de N-NH3/NT com Y=3,9243- 0,0434x (R2=0,54) e Y=3,355-0,141x+0,0028x2 (R2=0,56) respectivamente. Também se observou menor recuperação de FDN com Y=72,611-0,1247x (R²=0,52) e Y=74,819-0,1683x (R²=0,50) e FDA com Y=89,841-0,2642x (R²=0,53) e Y=97,181-0,3717x (R²=0,72) para os fungos T. reesei e T. aurantiacus, respectivamente. Como conseqüência propiciou menores valores de DIVMS com Y=75,364-0,1034x (R²=0,51) para o T. aurantiacus. Esses valores podem ser atribuídos pela atuação das enzimas presentes no extrato, removendo barreiras estruturais, com um maior aproveitamento do conteúdo celular pelas bactérias fermentadoras no material ensilado / Abstract: The aim of this research is to product fibrolitic enzymes by solid state fermentation with Trichoderma reesei and Thermoascus aurantiacus fungi and to analyze the corn ensiling with crescent concentrations of enzymatic extracts produced (0; 143,4; 286,8 e 573,6 U CMCase/Kg of wet material and 0; 1800,9; 3601,8 e 7203,6 U CMCase//Kg of wet material, respectively), in delineation completely casualized, with four replications for each treatment. We evaluated the nutritional value of forage was measured before and after opening silos. After 168h of fermentation using sugar cane bagasse and wheat bran (1:1) as substrate it was collected each crude enzymatic extract. The T. reesei crude extract contained 14,34U/ml of CMCase, 1,03 U/mL of β-glycosidase, 74,60 U/mL of Xylanase and 0,48 U/mL de β-xylosidase. The T. aurantiacus crude extract contained 180,91 U/mL of CMCase, 6,02 U/mL of β-glycosidase, 719,98 U/mL de Xylanase and 0,17 U/mL de β-xylosidase. The addiction of fungus enzymatic extract of T. reesei and T. aurantiacus enabled the overthrow in the recuperation of dry matter, with Y=96,02-0,1205x (R²=0,48) and Y=95,625- 0,1262x (R²=0,56), increase in waste by gas with Y=23,27+0,0843x (R²=0,29) and Y=19,983+0,2863x (R²=0,39) and downfall in the N-NH3/NT content with Y=3,9243-0,0434x (R2=0,54) and Y=3,355-0,141x+0,0028x2 (R2=0,56) respectively. Furthermore, it was observed less recuperation of NDF with Y=72,611-0,1247x (R²=0,52) and Y=74,819-0,1683x (R²=0,50) and ADF with Y=89,841-0,2642x (R²=0,53) and Y=97,181-0,3717x (R²=0,72) for T. reesei and T. aurantiacus, respectively. As a consequence, it propitiated lower values of DIVMS with Y=75,364-0,1034x (R²=0,51) for T. aurantiacus. These values may be attributed by the action of the enzymes present in crude extract, removing structural barriers, with a major use of the cellular content by bacteria in the silage material / Mestre

Orientador: Eleni Gomes / Coorientador: Sebastião Taboga / Banca: Fernando Carlos Pagnocca / Banca: Adalberto Pessoa / Banca: André Luis Ferraz / Banca: Gustavo Orlando Bonilla Rodriguez / Resumo: No presente estudo, o fungo termofílico Myceliophthora thermophila M.7.7, foi cultivado em fermentação em estado sólido (FES), usando como fonte de carbono misturas de bagaço de cana, palha de cana e palha de milho, com farelo de trigo (w/w 1:1). As fontes de nutrientes minerais avaliadas foram substâncias químicas analíticas e fertilizantes agrícolas. Os efeitos das condições de fermentação, tais como temperatura, pH e umidade sobre a produção de xilanase, endoglucanase e β-glucosidase foram estudados. Além disso, foi realizado o prétratamento do bagaço e da palha de cana submetidos a 2 min de irradiação em micro-ondas com glicerol 70% em solução ácida, alcalina e água destilada. As frações sólidas resultantes do pré-tratamento foram utilizadas nas análises de fibras, TGA, DTG, DSC, FTIR e microscopia eletrônica de transmissão e as frações líquidas, para análises de açúcares e fenóis. Amostras de bagaço e de palha tratados e não tratados (controle) foram submetidas à hidrólise enzimática por 24 e 72 horas, a 55 °C, usando as soluções enzimáticas obtidas do cultivo de M. thermophila M.7.7. e comercial (Celluloclast 1.5L) com atividade de endoglucanase padronizadas a 60 U/g de substrato seco ou com relação à quantidade total de proteínas das soluções (5 mg/g de substrato seco). Ao extrato de M. thermophila M.7.7 foi feita uma suplementação com enzima β-glicosidase comercial, de modo a atingir a mesma atividade presente na enzima Celluloclast. As atividades máximas de xilanase (446,9 U/mL), endoglucanase (94,7 U/mL) e β-glicosidase (2,8 U/mL) foram obtidas no cultivo por FES com 70% de umidade, a 40 ºC, usando palha de milho e farelo de trigo e solução nutriente composta por fertilizantes agrícolas, com pH ajustado para 5,0. Os espectros de infravermelho e as análises térmicas mostraram que o prétratamento agiu principalmente sobre a lignina e a hemicelulose do bagaço de cana, ... / Abstract: This study investigated the effect of non expensive carbon and nitrogen sources on enzyme production by Myceliophthora thermophila M.7.7 in solid-state fermentation. Three kinds of lignocellulosic waste (corn straw, sugarcane bagasse and sugarcane straw) and six nitrogen sources (urea, calcium nitrate, analytical ammonium sulphate, yeast extract, agricultural fertilizer NPK 20-05-20 and fertilizing grade ammonium sulphate) were tested. Some physical-chemical parameters of the fermentation, such as temperature, initial pH and moisture content of the substrate on enzyme production were evaluated. Furthermore, the pre-treatment of bagasse and sugar cane straw with microwave radiation in presence of glycerol diluted in water, sulphuric acid and sodium hydroxide on the chemical composition, fiber structure and the efficiency of subsequent enzymatic hydrolysis was investigated. Bagasse and cane straw were subjected to 2 min of irradiation and the solid fractions resulting were used in the analysis of fibers, TGA, DTG, DSC, FTIR, X-ray and transmission electron microscopy and liquid fractions used to detemine sugar and phenol contents. Samples of bagasse, treated cane straw and untreated cane straw (control) were submitted to enzyme hydrolysis for 24 to 72 h at 55 °C with enzymatic solutions obtained by the cultivation of M. thermophila M.7.7. and Celluloclast 1.5L based on 60 U of endoglucanase activity per g of dry substrate or on the total amount of protein solutions (5 mg protein/g of dry substrate). The enzyme solution from M. thermophila M.7.7 was supplemented with a commercial β-glucosidase in order to achieve the same activity present in Celluclast. The maximum xylanase activity (446.9 U/ml), endoglucanase (94.7 U/ml) and β-glucosidase (2.8 U/mL) were obtained in the cultivation by SSF with 70% humidity, 40 °C using corn stover and wheat bran and nutrient solution composed of agricultural fertilizers, with pH adjusted to 5.0. ... / Doutor