Lisozimas são enzimas que fazem parte do mecanismo de defesa contra bactérias, no entanto lisozimas com função digestiva também são encontradas no trato digestivo de vertebrados e no intestino médio de insetos. As lisozimas digestivas de insetos são do tipo c e assim compartilham semelhanças estruturais e mecanísticas com a lisozima da clara de ovo de galinha (HEWL). Entretanto, para desempenhar sua função digestiva, as lisozimas de insetos apresentam algumas propriedades particulares entre as quais se destaca um pH ótimo mais ácido em relação às lisozimas não-digestivas. Para elucidar as bases moleculares dessa diferença no pH ótimo, duas lisozimas digestivas (lisozima 1 AAQ20048 e lisozima 2 AAQ20047) da larva de Musca domestica (mosca Diptera Cyclorrhapha), clonadas em Pichia pastoris e purificadas, foram caracterizadas estruturalmente e cineticamente com o substrato sintético (MUQ3) e natural (cápsulas de Micrococcus lysodeikticus). Foi observado que o efeito do pH na atividade das lisozimas 1 e 2 sobre o MUQ3 é uma curva com formato de sino e pH ótimo mais ácido que o da HEWL. Essas curvas foram reflexos da diminuição simultânea dos valores de pKas do nucleófilo e do doador de prótons. Estruturas cristalográficas das lisozimas digestivas de Musca domestica foram obtidas a 1,9 Å e análise comparativa com a estrutura terciária da HEWL revelou resíduos de aminoácidos no ambiente do nucleófilo (N46) e do doador de prótons (S106 e T107) que podem estar envolvidos na modulação das constantes de ionização dos resíduos essenciais à catálise. Esses resíduos foram substituídos via mutagênese sítio-dirigida por D, V e A respectivamente e três mutantes simples (N46D, S106V e T107A) e um triplo (N46DS106V- T107A) foram produzidos e purificados. Caracterização revelou que as contribuições individuais da N46, S106 e T107 foram pequenas e próximas do limite de detecção da técnica utilizada. Por outro lado, o conjunto dos 3 aminoácidos foi responsável pelo pH ótimo ácido frente ao substrato sintético, elevando os valores de pKas do nucleófilo e doador de prótons para valores muito semelhantes ao da HEWL. Diferentemente, essa tripla mutação não foi suficiente para elevar o pH ótimo da lisozima 2 sobre cápsulas de Micrococcus lysodeikticus para valores próximos àqueles de HEWL, sugerindo que as bases moleculares do pH ótimo frente ao substrato natural e sintético são diferentes. Uma comparação estrutural entre lisozima 1 e HEWL sugere que os resíduos de aminoácidos carregados na superfície dessas lisozimas sejam importantes para determinação do pH ótimo. A investigação dessa hipótese foi feita substituindo 5 aminoácidos neutros e 1 ácido, via mutagênese sítio-dirigida, por resíduos básicos. A caracterização do mutante sêxtuplo revelou um aumento significativo nos valores de pH ótimo da lisozima 1, indicando que a redução da basicidade da superfície das lisozimas digestivas é determinante para seus pHs ótimos ácidos. / Lysozymes are enzymes that are part of the defence mechanism against bacteria, however lysozymes with digestive function are also found in the digestive tract of vertebrates and in the insect midgut. The digestive lysozymes from insects are c type, so they share similar structural and mechanistic characteristics with hen egg-white lysozyme (HEWL). However, to perform their digestive function, insect lysozymes present some particular properties among them a more acidic pH optimum than that of non-digestive lysozymes. To elucidate the molecular basis of this pH optimum difference, two digestive lysozymes (lysozyme 1 AAQ20048 and lysozyme 2 AAQ20047) from Musca domestica larvae (housefly Diptera Cyclorrhapha), cloned in Pichia pastoris and purified, were structurally and kinecticly characterized with synthetic (MUQ3) and natural (lyophilized cells of Micrococcus lysodeikticus) substrates. It was observed that the pH effect on the activity of lysozymes 1 and 2 upon MUQ3 is a bell shaped curve exhibiting a more acidic pH optimum than that of HEWL. These curves result from simultaneous decrease of pKas values of the nucleophile and proton donor. Crystallographic structures of these digestive lysozymes from Musca domestica were obtained at 1.9 Å and comparative analysis with the terciary structure of HEWL revealed amino acid residues in the catalytic nucleophile (N46) and proton donor environment (S106 and T107) that may be involved in the modulation of ionization constants of those catalytic residues. N46, S106, and T107 were replaced via site-directed mutagenesis by D, V and A respectively and three simple (N46D, S106V and T107A) and one triple (N46D-S106V-T107A) mutants were produced and purified. Their characterization revealed that the individual contributions of N46, S106 and T107 were small and close to the detection borderline of the technique utilized. On the other hand, a set of these 3 amino acids was responsible by acidic pH optimum upon synthetic substrate, increasing the pKas values of nucleophile and proton donor to similar values to that of the HEWL. Differently, this triple mutation was not enough to increase the pH optimum of lysozyme 2 upon lyophilized cells of Micrococcus lysodeikticus to values close to those of HEWL, suggesting that the molecular bases of pH optimum upon natural and synthetic substrates are different. A structural comparison between lysozyme 1 and HEWL suggests that the charged amino acid residues on the surface of these lysozymes are important for pH optimum determination. The investigation of this hypothesis was done replacing 5 neutral and 1 acidic amino acids, via site-directed mutagenesis, by basic residues. The characterization of this mutant revealed a significant increase in the pH optimum values of lysozyme 1, suggesting that the reduction of basicity on the surface of the digestive lysozymes is a important factor in the determination of their acidic pH optimum.

Mapeamento dos subsítios de α-amilase de Xanthomonas axonopodis pv. Citri envolvidos na interação com o substrato A família das enzimas α-amilases é um modelo experimental interessante para o estudo das interações entre os aminoácidos e seus ligantes, já que estas enzimas apresentam especificidade variável, são frequentemente alvos de estudos por mutagênese e há estruturas cristalinas disponíveis para alguns membros da família. A proposta deste trabalho foi o mapear subsítios da α-amilase de Xanthomonas axonopodis pv. citri (AXA) envolvidos na interação com substratos, através de comparações estruturais, mutagêneses sítio-dirigidas, análises de parâmetros cinéticos sobre amido e do padrão de clivagem sobre p-nitrofenil malto-oligossacarideos (PNPG7, PNPG5, PNPG4). Foi criado um modelo estrutural para AXA a partir da estrutura tridimensional da α-amilase de Alteromonas haloplanctis (Aghajari et al., 1998). O modelo de AXA foi sobreposto na estrutura da α-amilase pancreática de porco (Qian et al., 1994) e 11 resíduos foram selecionados e mutados para alanina. As α-amilases recombinantes mutantes e selvagem foram secretadas pela levedura Pichia pastoris GS115, apresentando uma massa molecular aparente de 45 kDa. Todos os mutantes analisados reduziram em maior ou menor grau a atividade catalítica da enzima sobre amido e p-nitrofenil maltooligossacarideos. Mutações dos resíduos H88, F136, D196, E223, D295 e N299, deletaram a atividade enzimática, indicando que suas cadeias laterais são essenciais para o desempenho catalítico da enzima. As análises cinéticas e estruturais sugerem fortemente que D196, E223 e D295 são os resíduos catalíticos. Substituições das cadeias laterais de C157, H200, G227, T230 e H294 reduziram a eficiência catalítica (kcat/Km) da α-amilase sobre o substrato amido para, respectivamente, 28%, 41%, 84%, 81% e 51%. As mutações em G227 e T230 foram menos importantes para a atividade da enzima e afinidade pelo amido, entretanto, estes resíduos mostraram-se importantes para a estabilização de complexos com substratos curtos (pNPG4). Os resultados indicam que o sítio ativo de AXA é formado por, no mínimo, seis subsítios. As interações dos anéis de glicose com os subsítios +2 e -2 são favorecidas em relação às interações nos subsítios -3 e +3, respectivamente, e a interação do anel de glicose no subsítio -3 é favorecida em relação à interação no subsítio +3. A enzima selvagem diva preferencialmente a terceira ligação glicosídica de p-nitrofenil maltooligossacarideos. Como produtos de hidrólise a enzima libera maltopentaose, maltotetraose, maltotriose, maltose e glicose. / The α-amylase family is an interesting group for structure/function relationship investigation, as this family exhibits a variable deavage patterm, several crystal structures are available, and its members were studied by mutagenesis. The aim of this study was the mapping of Xanthomonas axonopodis pv. Citri α-amylase (AXA) subsites involved in substrate binding, using structural comparison, site-directed mutagenesis and lcinetics analyses. A structural model for AXA was created from the three-dimensional structure of the α-amylase from Alteromonas haloplanctis (Aghajari et al., 1998). This model was superimposed on the structure ofthe pig pancreatic α-amylase, PPA (Qian et. al., 1994), and 11 residues were selected and changed to alanine. Wild type and mutant AXA were secreted by Pichia pastoris strain GS115 cells and showed apparent molecular mass of 45 kDa. All mutants have reduced α-amylase activity on starch and 4-nitrophenyl maltooligosaccharides (pNPG7, PNPG5 and PNPG4) at different levels. Mutation of residues H88, F136, D196, E223, D295 and N299 indicate their essential role by complete loss of activity. Kinetic and structural analyses strongly suggested that D196, E223 and D295 are the catalytic residues. The substitution of the side chain of C157, H200, G227, T230 and H294 reduced the catalytic efficiency (kcat/Km) of α-amylase on starch to respectively 28%, 41%, 84%, 81% and 51%. Although G227 and T230 were not much important for activity and binding on starch, these residues were important for stabilization of complexes with short substrates (PNPG4). The results indicate that AXA\'s active site is composed of at least six sugar binding subsites. The binding of the glucoses at subsites +2 and -2 are favored against binding at subsites -3 and +3, respectively. The binding of glucose at subsite -3 is favored against binding at subsite +3. The wild type enzyme primarily hydrolyzes the third glucosidic bond in PNPG7, PNPG5 and PNPG4 and the products of hydrolysis were maltopentaose, maltotetraose, maltotriose, maltose and glucose.

El present treball de recerca s'emmarca en un projecte Europeu anomenat E.D.E.N. (Enzyme Discovery in hybrid aspen for fibre ENgineering, QLK5-CT-2001-00443), l'objectiu del qual és la identificació de nous enzims vegetals per entendre amb major profunditat els processos de formació i modificació de les fibres vegetals per abordar en el futur la millora dels paràmetres de qualitat d'aquestes fibres, mitjançant la generació de línies transgèniques de plantes. En el present projecte es pretén aprofundir en el coneixement de les xiloglucà endotransglicosilases (XET), enzims claus en la construcció i modificació controlada de la xarxa de xiloglucà cel·lulosa, estudiant el seu mecanisme d'acció i la seva especificitat per substrat. En aquest treball s'estudia una XET de Populus tremula x tremuloides, concretament la XET16A (Ptt-XET16A). Es dissenya i es valida un nou assaig enzimàtic mitjançant electroforesis capil·lar (HPCE), que permet l'estudi cinètic de les XET, emprant oligosacàrids de baix pes molecular de xiloglucà amb una estructura coneguda. Aquest substrats han estat sintetitzats en el present treball i també per l'equip del Dr. Driguez en el CERMAV-CNRS. Es determina que el màxim d'activitat de la Ptt-XET16A es dóna entre pH 5 i 5.5 i entre 30 i 40 ºC. Es demostra que aquest enzim actua mitjançant un mecanisme cinètic bi-bi ping-pong, en el que l'acceptor actua com a inhibidor competitiu del donador unint-se a l'enzim lliure i en el que, depenent del donador emprat, aquest també poc actuar com a inhibidor competitiu de l'acceptor, unint-se als subsetis positius de l'intermedi glicosil-enzim i donant diferent reaccions secundàries com són la polimerització del donador o l'elongació del producte, només en el cas que el donador presenti un grup glucosil en l'extrem no reductor. S'avalua un llibreria de xilogluco-oligosacàrids sintetitzada per l'equip del Dr. Driguez al CERMAV-CNRS com a donadors de la Ptt-XET16A. D'aquesta forma s'aprofundeix en el coneixement de l'activitat de les XTH, en el coneixement de la seva especificitat per substrat i es realitza un mapeig del centre actiu, obtenint la contribució dels diferents subsetis de la Ptt-XET16A en l'estabilització de l'estat de transició de la reacció de transglicosidació catalitzada per l'enzim estudiat. Finalment, s'ha dissenyat un substrat bifluorogènic derivat del tetradecasacàrid emprat com a substrat estàndard en el present treball, per mesurar les activitats hidrolasa i transglicosilasa de les XETs mitjançant fluorescence resonance energy transfer (FRET). El substrat bifluorogènic ha estat obtingut i caracteritzat, tanmateix, no s'ha pogut demostrar si aquest substrat és adequat per mesurar les activitats hidrolasa i transglicosilasa de les XETs ja que les propietats fluorescents del marcador s'han perdut en el procés de síntesis del substrat. / El presente trabajo de investigación se enmarca en un proyecto Europeo llamado E.D.E.N. (Enzyme Discovery in hybrid aspen for fibre ENgineering, QLK5-CT-2001-00443), el objetivo del cual es la identificación de nuevos enzimas vegetales para entender con mayor profundidad los procesos de formación y modificación de las fibras vegetales para abordar en el futuro la mejora de los parámetros de calidad de estas fibras, mediante la generación de líneas transgénicas de plantas. En el presente proyecto se pretende profundizar en el conocimiento de las xiloglucano endotransglicosilasas (XET), enzimas claves en la construcción y modificación controlada de la red de xiloglucano-celulosa, estudiando su mecanismo de acción y su especificidad por sustrato. En este trabajo se estudia una XET de Populus tremula x tremuloides, concretamente la XET16A (Ptt-XET16A). Se diseña y se valida un nuevo ensayo enzimático mediante electroforesis capilar (HPCE), que permite el estudio cinético de las XET, utilizando oligosacáridos de xiloglucano de bajo peso molecular y de estructura conocida como sustratos. Estos sustratos han estado sintetizados en el presente trabajo y también por el equipo del Dr. Driguez en el CERMAV-CNRS. Se determina que el máximo de actividad de la Ptt-XET16A se da entre pH 5 y 5.5 y entre 30 y 40 ºC. Se demuestra que este enzima actúa mediante un mecanismo cinético bi-bi ping-pong, en el que el aceptor actúa como inhibidor competitivo del dador uniéndose al enzima libre y en el que, dependiendo del dador utilizado , éste también puede actuar como inhibidor competitivo del aceptor uniéndose en los subsitios positivos del intermedio glicosilo-enzima y dando diferentes reacciones secundarias como son la polimerización del dador o la elongación del producto, solamente si el dador presenta un grupo glucosilo en el extremo no reductor. Se evalúa una librería de xilogluco-oligosacáridos sintetizada por el equipo del Dr. Driguez en el CERMAV-CNRS como dadores de la Ptt-XET16A. De esta forma se profundiza en el conocimiento de la actividad de las XTHs, en el conocimiento de su especificidad por sustrato y se realiza un mapeo del centro activo del enzima, obteniéndose la contribución de los diferentes subsitios de la Ptt-XET16A en la estabilización del estado de transición de la reacción de transglicosidación catalizada por el enzima estudiado. Finalmente, se ha diseñado un sustrato bifuorogénico derivado del tetradecasacárido utilizado como sustrato estándar en el presente trabajo para medir las actividades hidrolasa y transglicosilasa de las XETs mediante fluorescence resonance energy transfer (FRET). El sustrato biofluorogénico ha sido obtenido y caracterizado, sin embargo no se ha podido demostrar si este sustrato es adecuado para medir las actividades hidrolasa y transglicosilasas de las XETs, ya que las propiedades fluorescentes del marcador se han perdido durante la síntesis del sustrato. / The present work is part of an European project named E.D.E.N. (Enzyme Discovery in hybrid aspen for fibre ENgineering, QLK5-CT-2001-00443). The general objective of the project is to identify novel plant enzymes for deeper understanding of the process of fiber formation and modification for future improvement of the quality parameters of wood fibers. The present project pretends to increase the knowledge about xyloglucan endotransglycosylases (XET), which are thought to be key enzymes in the construction and controlled modification of the xyloglucan¬cellulose network. It is pretended to study the mechanism of action and the substrate specificity of a XET from Populus tremula x tremuloides, concretely XET16A (Ptt-XET16A). A new enzymatic assay based on capillary electrophoresis is designed and validated. This assay allows the kinetic study of XETs using as substrates, low molecular mass xyloglucan oligosaccharides with defined structures. These substrates have been synthesized in the present work and also in collaboration with Dr. Driguez team from CERMAV-CNRS. It is concluded that the maximum of activity of Ptt-XET16A is between pH 5 and 5.5 and 30 and 40 ºC. It is demonstrated that Ptt-XET16A follows a bi-bi ping-pong kinetic mechanism, in which the acceptor acts as competitive inhibitor of the donor binding to the free enzyme and depending on the donor used, this one can act also as competitive inhibitor of the acceptor binding to the acceptor subsites of the glycosyl-enzyme intermediate giving rise to side reaction such as donor polymerization and product elongation only in case that the donor shows a glucosyl residue in the non reducing end. A library of xylogluco-oligosaccharides, synthesized in CERMAV-CNRS by Dr. Driguez team, is evaluated as Ptt-XET16A donors. With this studies we are able to deeper understand the activity of XETs, their substrate specificity and a subsite maping of the binding cleft is done, obtaining the contribution of different subsites of Ptt-XET16A to the stabilization of the transition state of the transglycosylation reaction catalyzed by the studied enzyme. Finally, a bifluorogenic substrate derived from the tetradecasacharide used as standard substrate in this project has been designed to measure hydrolase and transferase activities of XET enzymes by fluorescense resonance energy transfer (FRET). The bifluorogenic substrate was obtained, however, it could not be demonstrated if it is an adequate substrate to measure hydrolase and transferase activities because the fluorescent properties of the label were lost during substrate synthesis.

Mapeamento dos subsítios de α-amilase de Xanthomonas axonopodis pv. Citri envolvidos na interação com o substrato A família das enzimas α-amilases é um modelo experimental interessante para o estudo das interações entre os aminoácidos e seus ligantes, já que estas enzimas apresentam especificidade variável, são frequentemente alvos de estudos por mutagênese e há estruturas cristalinas disponíveis para alguns membros da família. A proposta deste trabalho foi o mapear subsítios da α-amilase de Xanthomonas axonopodis pv. citri (AXA) envolvidos na interação com substratos, através de comparações estruturais, mutagêneses sítio-dirigidas, análises de parâmetros cinéticos sobre amido e do padrão de clivagem sobre p-nitrofenil malto-oligossacarideos (PNPG7, PNPG5, PNPG4). Foi criado um modelo estrutural para AXA a partir da estrutura tridimensional da α-amilase de Alteromonas haloplanctis (Aghajari et al., 1998). O modelo de AXA foi sobreposto na estrutura da α-amilase pancreática de porco (Qian et al., 1994) e 11 resíduos foram selecionados e mutados para alanina. As α-amilases recombinantes mutantes e selvagem foram secretadas pela levedura Pichia pastoris GS115, apresentando uma massa molecular aparente de 45 kDa. Todos os mutantes analisados reduziram em maior ou menor grau a atividade catalítica da enzima sobre amido e p-nitrofenil maltooligossacarideos. Mutações dos resíduos H88, F136, D196, E223, D295 e N299, deletaram a atividade enzimática, indicando que suas cadeias laterais são essenciais para o desempenho catalítico da enzima. As análises cinéticas e estruturais sugerem fortemente que D196, E223 e D295 são os resíduos catalíticos. Substituições das cadeias laterais de C157, H200, G227, T230 e H294 reduziram a eficiência catalítica (kcat/Km) da α-amilase sobre o substrato amido para, respectivamente, 28%, 41%, 84%, 81% e 51%. As mutações em G227 e T230 foram menos importantes para a atividade da enzima e afinidade pelo amido, entretanto, estes resíduos mostraram-se importantes para a estabilização de complexos com substratos curtos (pNPG4). Os resultados indicam que o sítio ativo de AXA é formado por, no mínimo, seis subsítios. As interações dos anéis de glicose com os subsítios +2 e -2 são favorecidas em relação às interações nos subsítios -3 e +3, respectivamente, e a interação do anel de glicose no subsítio -3 é favorecida em relação à interação no subsítio +3. A enzima selvagem diva preferencialmente a terceira ligação glicosídica de p-nitrofenil maltooligossacarideos. Como produtos de hidrólise a enzima libera maltopentaose, maltotetraose, maltotriose, maltose e glicose. / The α-amylase family is an interesting group for structure/function relationship investigation, as this family exhibits a variable deavage patterm, several crystal structures are available, and its members were studied by mutagenesis. The aim of this study was the mapping of Xanthomonas axonopodis pv. Citri α-amylase (AXA) subsites involved in substrate binding, using structural comparison, site-directed mutagenesis and lcinetics analyses. A structural model for AXA was created from the three-dimensional structure of the α-amylase from Alteromonas haloplanctis (Aghajari et al., 1998). This model was superimposed on the structure ofthe pig pancreatic α-amylase, PPA (Qian et. al., 1994), and 11 residues were selected and changed to alanine. Wild type and mutant AXA were secreted by Pichia pastoris strain GS115 cells and showed apparent molecular mass of 45 kDa. All mutants have reduced α-amylase activity on starch and 4-nitrophenyl maltooligosaccharides (pNPG7, PNPG5 and PNPG4) at different levels. Mutation of residues H88, F136, D196, E223, D295 and N299 indicate their essential role by complete loss of activity. Kinetic and structural analyses strongly suggested that D196, E223 and D295 are the catalytic residues. The substitution of the side chain of C157, H200, G227, T230 and H294 reduced the catalytic efficiency (kcat/Km) of α-amylase on starch to respectively 28%, 41%, 84%, 81% and 51%. Although G227 and T230 were not much important for activity and binding on starch, these residues were important for stabilization of complexes with short substrates (PNPG4). The results indicate that AXA\'s active site is composed of at least six sugar binding subsites. The binding of the glucoses at subsites +2 and -2 are favored against binding at subsites -3 and +3, respectively. The binding of glucose at subsite -3 is favored against binding at subsite +3. The wild type enzyme primarily hydrolyzes the third glucosidic bond in PNPG7, PNPG5 and PNPG4 and the products of hydrolysis were maltopentaose, maltotetraose, maltotriose, maltose and glucose.