Ubiquitination is an important post-translational modification that maintains cellular homeostasis by regulating various biological processes. Deubiquitinases (DUBs) are enzymes that reverse the ubiquitination process by catalyzing the removal of ubiquitin from a substrate. Abnormal expression or function of DUBs is often associated with the onset and progression of various diseases, including cancer. Ubiquitin specific proteases (USPs), which constitute the largest family of DUBs in humans, have become the center of interest as potential targets in cancer therapy as many of them display increased activity or are overexpressed in a range of malignant tumors or the tumor microenvironment. Two related members of the USP family, USP28 and USP25, share high sequence identities but play diverse biological roles. USP28 regulates cell proliferation, oncogenesis, DNA damage repair and apoptosis, whereas USP25 is involved in the anti-viral response, innate immunity and ER-associated degradation in addition to carcinogenesis. USP28 and USP25 also exhibit different oligomeric states – while USP28 is a constitutively active dimer, USP25 assumes an auto-inhibited tetrameric structure. The catalytic domains of both USP28 and USP25 comprise the canonical, globular USP-domain but contain an additional, extended insertion site called USP25/28 catalytic domain inserted domain (UCID) that mediates oligomerization of the proteins. Disruption of the USP25 tetramer leads to the formation of an activated dimeric protein. However, it is still not clear what triggers its activation. Due to their role in maintaining and stabilizing numerous oncoproteins, USP28 and USP25 have emerged as interesting candidates for anti-cancer therapy. Recent advances in small-molecular inhibitor development have led to the discovery of relatively potent inhibitors of USP28 and USP25. This thesis focuses on the structural elucidation of USP28 and the biochemical characterization of USP28/USP25, both in complex with representatives of three out of the eight compound classes reported as USP28/USP25-specific inhibitors. The crystal structures of USP28 in complex with the AZ compounds, Vismodegib and FT206 reveal that all three inhibitor classes bind into the same allosteric pocket distant from the catalytic center, located between the palm and the thumb subdomains (the S1-site). Intriguingly, this binding pocket is identical to the UCID-tip binding interface in the USP25 tetramer, rendering the protein in a locked, inactive conformation. Formation of the binding pocket in USP28 requires a shift in the helix α5, which induces conformational changes and local distortion of the binding channel that typically accommodates the C-terminal tail of Ubiquitin, thus preventing catalysis and abrogating USP28 activity. The key residues of the USP28-inhibitor binding pocket are highly conserved in USP25. Mutagenesis studies of these residues accompanied by biochemical and biophysical assays confirm the proposed mechanism of inhibition and similar binding to USP25. This work provides valuable insights into the inhibition mechanism of the small molecule compounds specifically for the DUBs USP28 and USP25. The USP28-inhibitor complex structures offer a framework to develop more specific and potent inhibitors. / Ubiquitinierung ist eine wichtige posttranslationale Modifikation, die die zelluläre Homöostase aufrechterhält, indem sie verschiedene biologische Prozesse reguliert. Deubiquitinasen (DUBs) sind Enzyme, die den Ubiquitinierungsprozess umkehren, indem sie die Entfernung von Ubiquitin von einem Substrat katalysieren. Eine abnorme Expression oder Funktion von DUBs wird häufig mit dem Auftreten und Fortschreiten verschiedener Krankheiten, einschließlich Krebs, in Verbindung gebracht. Ubiquitin-spezifische Proteasen (USPs), die im Menschen die größte Familie der DUBs bilden, sind als potenzielle Ziele in der Krebstherapie von besonderem Interesse, da viele von ihnen in bösartigen Tumoren oder deren Mikroumgebung abnormal aktiv oder überexprimiert sind. Die zwei eng verwandten Mitglieder der USP-Familie, USP28 und USP25, weisen eine hohe Sequenzidentität auf, sind aber an unterschiedlichen biologischen Prozessen beteiligt. USP28 reguliert die Zellproliferation, die Onkogenese, die Reparatur von DNA-Schäden und die Apoptose, während USP25 eine Rolle bei der antiviralen Reaktion, der angeborenen Immunität, dem ER-assoziierten Abbau und der Carcinogenese spielt. USP28 und USP25 weisen auch unterschiedliche oligomere Zustände auf. Während USP28 ein konstitutiv aktives Dimer bildet, tritt USP25 als auto-inhibiertes Tetramer auf. Strukturell bestehen die katalytischen Domänen sowohl von USP28 als auch von USP25 aus der kanonischen globulären USP-Domäne enthalten jedoch eine zusätzliche Insertion, die als „USP25/28 catalytic domain inserted domain (UCID)“ bezeichnet wird und die Oligomerisierung der Proteine vermittelt. Die Dissoziation des USP25 Tetramers in Dimere führt zu einem aktivierten USP25-Protein. Es ist jedoch immer noch nicht klar, was seine Aktivierung auslöst. Aufgrund ihrer Rolle bei der Aufrechterhaltung und Stabilisierung zahlreicher Onkoproteine haben sich USP28 und USP25 als interessante Kandidaten für die Entwicklung von Medikamenten in der Krebstherapie erwiesen. Jüngste Fortschritte in der Entwicklung von niedermolekularen Inhibitoren haben zur Entdeckung von relativ potenten Inhibitoren von USP28 und USP25 geführt. Diese Arbeit konzentriert sich auf die Strukturaufklärung von USP28 und die biochemische Charakterisierung von USP28/USP25, beide im Komplex mit Vertretern von drei der acht Verbindungsklassen, die als USP28/USP25-spezifische Inhibitoren bekannt sind. Die Kristallstrukturen von USP28 im Komplex mit den AZ-Verbindungen, Vismodegib und FT206 zeigen, dass alle Inhibitoren in einer ähnlichen Region an USP28 binden - einer allosterischen Tasche, die in der Nähe des katalytischen Zentrums liegt und sich zwischen der Handflächen- und der Daumen-Subdomäne befindet. Diese Bindungstasche ist identisch mit der Position, an der der „UCID-tip“ im USP25-Tetramer bindet und das Protein in eine verschränkte, inaktive Konformation versetzt. Die Bildung der Bindungstasche in USP28 erfordert eine Verschiebung der α5-Helix, die zu Konformationsänderungen und einer lokalen Verzerrung des Bindungskanalsführt, der normalerweise den C-terminus des Ubiquitin-Moleküls bindet und so die Katalyse verhindert und die Aktivität von USP28 hemmt. Die Schlüsselreste der USP28-Inhibitor-Bindungstasche sind in USP25 hoch konserviert. Mutagenese-Studien dieser Aminosäuren, begleitet von biochemischen und biophysikalischen Analysen, bestätigen den vorgeschlagenen Mechanismus der Hemmung und eine ähnliche Bindung der Inhibitoren an USP25. Diese Arbeit liefert wertvolle Einblicke in den Hemmungsmechanismus der Kleinmolekülverbindungen, die spezifisch für die DUBs USP28 und USP25 entwickelt worden sind. Die Strukturen der USP28-Inhibitor-Komplexe bieten eine Grundlage für die zukünftige Entwicklung spezifischerer und wirksamerer Inhibitoren.

Mit Aminotransferasen können chirale Amine auf biotechnologischem Weg hergestellt werden. Diese besitzen große Bedeutung als Bausteine für weitere Synthesen in der pharmazeutischen und agrochemischen Industrie. Da natürlich vorkommende Enzyme oft nicht die gewünschte Substratspezifität für bestimmte industrielle Anwendungen besitzen, ist eine Optimierung durch Mutagenese notwendig. Solche Entwicklungen sind jedoch oft mit hohem Zeit- und Kostenaufwand verbunden. Die Optimierung kann entweder ungezielt durch empirische Methoden oder gezielt unter Einbeziehung von Informationen über das Enzym erfolgen. Die notwendigen Daten können als Vorbereitung zu konkreten Produktentwicklungen durch Untersuchungen an potentiell geeigneten Enzymen gewonnen werden. Um einen solchen rationalen Ansatz bei der einer speziellen Amin-Pyruvat-Aminotransferase zu ermöglichen, war es Ziel der vorliegenden Arbeit die Grundlagen für die Veränderung der Substratspezifität dieses Enzyms zu erarbeiten. Zunächst wurden strukturelle Informationen durch ein Homologie-Modell gewonnen und später durch eine experimentell bestimmte Struktur ergänzt. Mit dieser Struktur wurden die Substrat-bindenden Reste identifiziert und zunächst der Einfluss auf die Substratbindung durch ortsgerichtete Mutagenese überprüft. Es konnte gezeigt werden, dass alle acht ausgewählten Aminosäurereste an der Substratbindung beteiligt sind. Zudem wurde unter diesen Positionen nach Mutanten gesucht, die neue Substrate umsetzen können. Eine Reihe von Mutanten wurde identifiziert, die verschiedene neue Substrate umsetzen. Für zwei Positionen konnten eine Reihe von Mutanten identifiziert werden, die neue Substrate akzeptieren. Durch die Art der Seitenketten, die Position der Aminosäuren und der chemischen Struktur der akzeptierten Substrate konnten eine Reihe von Aussagen über den Mechanismus der Substratbindung für diese Amin-Pyruvat-Aminotransferase gemacht werden. Außerdem wurde die Zweckmäßigkeit der eingesetzten theoretischen und experimentellen Methoden für die Anwendung bei Entwicklungen mit Enzymen dieser Klasse gezeigt.

Macromolecular complexes, also termed molecular machines, facilitate a large spectrum of biological reactions and tasks crucial to the survival of cells. These complexes are composed of either protein only, or proteins bound to nucleic acids (DNA or RNA). Prominent examples for each class are the proteosome, the nucleosome and the ribosome. How such units are assembled within the context of a living cell is a central question in molecular biology. Earlier studies had indicated that even very large complexes such as ribosomes could be reconstituted from purified constituents in vitro. The structural information required for the formation of macromolecular complexes, hence, lies within the subunits itself and, thus, allow for self- assembly. However, increasing evidence suggests that in vivo many macromolecular complexes do not form spontaneously but require assisting factors (“assembly chaperones”) for their maturation. In this thesis the assembly of RNA-protein (RNP) complexes has been studied by a combination of biochemical and structural approaches. A resourceful model system to study this process is the biogenesis pathway of the uridine-rich small nuclear ribonucleoproteins (U snRNPs) of the spliceosome. This molecular machine catalyzes pre-mRNA splicing, i.e. the removal of non-coding introns and the joining of coding exons to functional mRNA. The composition and architecture of U snRNPs is well defined, also, the nucleo-cytoplasmic transport events enabling the formation of these particles in vivo have been analyzed in some detail. Furthermore, recent studies suggest that the formation of U snRNPs in vivo is mediated by an elaborate assembly machinery consisting of protein arginine methyltransferase (PRMT5)- and survival motor neuron (SMN)-complexes. The elucidation of the reaction mechanism of cellular U snRNP assembly would serve as a paradigm for our understanding of how RNA-protein complexes are formed in the cellular environment. The following key findings were obtained as part of this study: 1) Efforts were made to establish a full inventory of the subunits of the SMN-complex. This was achieved by the biochemical definition and characterization of an atypical component of this complex, the unrip protein. This protein is associated with the SMN-complex exclusively in the cytoplasm and influences its subcellular localization. 2) With a full inventory of the components in hand, the architecture of the SMN-complex was defined on the basis of an interaction map of all subunits. This study elucidated that the proteins SMN, Gemin7 and Gemin8 form a backbone, onto which the remaining subunits adhere in a modular manner. 3) The two studies mentioned above formed the basis to elucidate the reaction mechanism of cellular U snRNP assembly. Initially, an early phase in the SMN-assisted formation of U snRNPs was analyzed. Two subunits of the U7 snRNP (LSm10 and 11) were found to interact with the PRMT5-complex, without being methylated. This report suggests that the stimulatory role of the PRMT5-complex is independent of its methylation activity. 4) Key reaction intermediates in U snRNP assembly were found and characterized by a combination of biochemistry and structural studies. Initially, a precursor to U snRNPs with a sedimentation coefficient of 6S is formed by the pICln subunit of the PRMT5-complex and Sm proteins. This intermediate was shown to constitute a kinetic trap in the U snRNP assembly reaction. Progression towards the assembled U snRNP depends on the activity of the SMN-complex, which acts as a catalyst. The formation of U snRNPs is shown to be structurally similar to the way clamps are deposited onto DNA to tether poorly processive polymerases. 5) The human SMN-complex is composed of several subunits. However, it is unknown whether all subunits of this entity are essential for U snRNP assembly. A combination of bioinformatics and biochemistry was applied to tackle this question. By mining databases containing whole-genome assemblies, the SMN-Gemin2 heterodimer is recognized as the most ancestral form of the SMN-complex. Biochemical purification of the Drosophila melanogaster SMN-complex reveals that this complex is composed of the same two subunits. Furthermore, evidence is provided that the SMN-Gemin2 heterodimer is necessary and sufficient to promote faithful U snRNP assembly. Future studies will adress further details in the reaction mechanism of cellular U snRNP assembly. The results obtained in this thesis suggest that the SMN and Gemin2 subunits are sufficient to promote U snRNP formation. What then is the function of the remaining subunits of the SMN-complex? The reconstitution schemes established in this thesis will be instrumental to address this question. Furthermore, additional mechanistic insights into the U snRNP assembly reaction will require the elucidation of structures of the assembly machinery trapped at various states. The prerequisite for these structural studies, the capability to generate homogenous complexes in sufficient amounts, has been accomplished in this thesis. / Makromolekulare Komplexe, auch molekulare Maschinen genannt, ermöglichen eine grosse Vielfalt biologischer Reaktionen und Aufgaben, die für das Überleben von Organismen kritisch sind. Diese Komplexe bestehen entweder nur aus Protein, oder setzen sich aus Protein und Nukleinsäure (DNA oder RNA) zusammen. Prominente Beispiele für diese Klassen molekularer Maschinen sind das Proteosom, das Nukleosom oder das Ribosom. Wie sich solche Einheiten innerhalb einer Zelle zusammenlagern ist eine grundlegende Frage der Molekularbiologie. Frühere Studien hatten angeduetet, dass es möglich ist sogar sehr grosse Komplexe wie das Ribosom in vitro aus gereinigten Bestandteilen zu einem aktiven Partikel zu rekonstruieren. Die Strukturinformation, die für die Bildung von makromolekularen Komplexen erforderlich ist, liegt also in den Untereinheiten selbst. Im Gegensatz dazu mehren sich heute die Hinweise dafür, dass sich viele makromolekulare Komplexe nicht spontan zusammenlagern, sondern die Aktivität assistierender Faktoren („Assembly Chaperone“) für ihre Reifung benötigen. In dieser Arbeit wurde der Zusammenbau von RNA-Protein (RNP) Partikeln durch eine Kombination aus Biochemie und Strukturbiologie untersucht. Ein ergiebiges System, um diesen Prozess zu studieren, ist die Biogenese der RNPs (U snRNPs) des Spleissosoms. Aufgabe dieser molekularen Maschine ist das Herausschneiden nicht-kodierender Introns und das Zusammenfügen kodiereneder Exons um so funktionelle mRNA zu bilden. Die Zusammensetzung und Architektur von U snRNPs sind gut definiert. Auch ist der Kern- Zytoplasma Transport, der für die Reifung dieser Partikel notwendig sind, detailliert beschrieben worden. Außerdem weisen neueste Studien darauf hin, dass die Bildung von U snRNPs in vivo durch eine komplexe Maschinerie, die aus den Protein-Arginin- Methyltransferase 5 (PRMT5)- und Survival-Motor-Neuron (SMN)- Komplexen besteht, vermittelt wird. Die Entschlüsselung des Reaktionsmechanismus des zellulärem U snRNP Zusammenbaus würde als Musterbeispiel für unser Verständnis dienen, wie RNPs in einer Zelle gebildet werden. Folgende Erkenntnisse wurden in dieser Arbeit gewonnen: 1) Es wurde zunächst versucht eine komplette Bestandsliste der Untereinheiten des SMN-Komplexes zu erstellen. Dies wurde durch die biochemische Definition und Charakterisierung einer atypischen Komponente dieses Komplexes, des Unrip Proteins, erreicht. Dieses Protein bindet ausschliesslich im Zytoplasma an den SMN-Komplex und beeinflusst dessen subzelluläre Lokalisation. 2) Die komplette Inventarisierung des SMN-Komplexes ermöglichte die Untersuchung der Wechselwirkung aller Untereinheiten und somit die Untersuchung seiner Architektur. Diese Studie zeigte, dass die Proteine SMN, Gemin7 und Gemin8 das Rückgrat des SMN-Komplexes bilden auf dem die restlichen Untereinheiten modular angeordnet werden. 3) Die zwei oben erwähnten Studien bildeten die Grundlage, den Reaktionsmechanismus zellulärer U snRNP Zusammenlagerung zu entschlüsseln. Zunächst wurde eine frühe Phase im SMN-vermittelten U snRNP Zusammenbau analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass zwei Untereinheiten des U7 snRNP (LSm10 und 11) mit dem PRMT5-Komplex wechselwirken, ohne methyliert zu werden. Dies deutet darauf hin, dass die unterstützende Rolle des PRMT5-Komplexes von seiner Methylierungsaktivität unabhängig ist. 4) Schlüsselintermediate im Zusammenschluss von U snRNPs wurden identifiziert und durch eine Kombination von Biochemie und Strukturbiologie charakterisiert. In einer ersten Stufe bildet sich ein Vorgänger von U snRNPs mit einem Sedimentationskoeffizienten von 6S aus. Dieses Intermediat, bestehend aus pICln (einer Untereinheit des PRMT5-Komplexes) und Sm Proteinen, stellt eine kinetische Falle in der U snRNP Zusammenlagerung dar. Das Voranschreiten zum maturen U snRNP hängt von der Aktivität des SMN-Komplexes ab, der als Katalysator wirkt. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Ausbildung von U snRNPs strukturell ähnlich zu der Reaktion verläuft, die Polymerasen mit geringer Prozessivität an der DNA verankert und die als „clamp-loading“ bezeichnet wird. 5) Der menschliche SMN-Komplex setzt sich aus mehreren Untereinheiten zusammen. Es ist jedoch unbekannt, ob alle Teile des Komplexes für die Zusammenlagerung von U snRNPs notwendig sind. Diese Frage wurde durch eine Kombination aus Bioinformatik und Biochemie adressiert. Durch Datenbanksuchen in komplett sequenzierten Genomen wurde festgestellt, dass die evolutionär ursprüngliche Form des SMN-Komplexes aus den zwei Proteinen SMN und Gemin2 besteht. Die biochemische Reinigung des Komplexes der Taufliege Drosophila melanogaster offenbarte, dass er auch in diesem Organismus aus denselben zwei Untereinheiten zusammengebaut ist. Außerdem wurde der Beweis erbracht, dass das SMN-Gemin2 heterodimer notwendig und hinreichend ist, um U snRNPs akkurat zusammenzulagern. Zukünftige Studien werden weitere detaillierte Ansichten des Reaktionsmechanismus in der zellulären Zusammenlagerung von U snRNPs liefern. Die Ergebnisse, die in der vorliegenden Arbeit erhalten wurden, deuten darauf hin, dass die Untereinheiten SMN und Gemin2 des SMN-Komplexes für den Zusammenbau von U snRNPs hinreichend sind. Was also ist die Funktion der weiteren Untereinheiten des SMN-Komplexes? Die Rekonstitutionsschemata, die in dieser Arbeit etabliert wurden, werden essentiell für die Beantwortung dieser Frage sein. Darüberhinaus werden weitere mechanistische Einsichten in die Zusammenlagerung von U snRNPs von der Ermittlung von Strukturen der Assembly-Maschinerie in verschiedenen Zuständen abhängen. Die Voraussetzung für diese strukturbiologische Untersuchungen, die Möglichkeit ausreichende Mengen homogener Komplexe herzustellen, ist ebenfalls in dieser Arbeit geschaffen worden.

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung des Einflusses von ausgewählten Cyclodextrinen (alpha-, HP-alpha-, beta-, HP-beta, gamma- und HP-gamma-Cyclodextrin) als Hilfsstoffe in Ophthalmika auf die enzymatische Esterspaltung von Dipivefrin im Corneaepithel. Dazu waren neben der Betrachtung der enzymatischen Spaltung von Dipivefrin durch corneale Enzyme von Rinderaugen und dem Reinenzym Butyrylcholinesterase Untersuchungen zu den Wechselwirkungen von Dipivefrin mit den verwendeten Cyclodextrinen und dem cornealem Gewebe notwendig. Zur Charakterisierung der Dipivefrin/Cyclodextrin-Wechselwirkungen in wässriger Lösung wurden die Ultrafiltration, die Hochleistungs-Flüssigchromatographie und die UV- bzw. H-NMR-Spektroskopie eingesetzt. Die Ermittlung der Dipivefrin- bzw. Cyclodextrin-Wechselwirkung mit dem cornealen Gewebe erfolgte mittels Thermoanalytik und Elektronenmikroskopie. Der Einfluss ausgewählter Cyclodextrine auf die in-vitro-Permeation von Dipivefrin durch die Schweinecornea und auf die dabei im Corneaepithel stattfindende enzymatische Freisetzung von Epinephrin wurde untersucht. Mit Hilfe einer Druckpermeationszelle wurde der Einfluss von Dipivefrin bzw. in Kombination mit alpha- und beta-Cyclodextrin auf die forcierte Permeation von Wasser durch die Cornea von endothelial nach epithelial untersucht und die Modelldaten auf den physiologischen Druck des Auges umgerechnet. / The aim of the present work was to study the influence of different (cyclodextrins alpha-, HP-alpha-, beta-, HP-beta-, gamma- und HP-gamma-cyclodextrin) as components of eye drops on the enzymatic hydrolysis of dipivefrine in the corneal epithelium. Therefor, enzymatic degradation of dipivefrine by corneal enzymes of bovine eyes and by the purified enzyme butyryl cholinesterase was investigated. The interaction of dipivefrine with cyclodextrins was tested in aqueous solution by the use of ultrafiltration, high performance liquid chromatography, UV- and H-NMR-spectroscopy. The interaction of dipivefrine with corneal tissue was tested by the use of thermal analysis and electron microscopy. The influence of some cyclodextrins on the in-vitro permeation of dipivefrine through porcine cornea and the simultaneous enzymatic release of epinephrine in the corneal epithelium was investigated. The forced permeation of water through cornea from the endothelial to epithelial site was tested with help of a pressurized permeation device and the modell data were calculated to meet the physiological pressure in the eye.

<p>In conventional viscose manufacturing, a large amount of carbondisulfide is consumed. This amount has to be decreased to keep the production cost down and to reduce the environmental impact. The purpose with this work was to show if an enzyme treatment of a dissolving pulp could increase the degree of substitution in the viscose so that the amount of carbon disulfide consumed in the process could be decreased. Previous investigations by Kvarnlöf (2007), Engström et.al. (2006) and Henriksson et.al. (2005) has shown that the reactivity of a dissolving pulp (the cellulose raw material) increased when it was pre-treated with endoglucanase (enzyme). Kvarnlöf (2007) also showed that the amount of carbon disulfide that is needed to produce an ordinary viscose (in this work a more viscous viscose has been investigated) could be reduced with one third because of the enzyme treatment.</p><p> </p><p>In this thesis, viscose has been manufactured in a laboratory where the process has been adapted to look like the industrial as far as possible. Analyses were done on the viscose viscosity and degree of substitution. A reference curve was made with the percentage carbon disulfide load versus the viscose gamma number (degree of substitution). Then it was investigated how an enzyme treatment of the dissolving pulp affected the viscose. After the enzyme treatment, the manufacturing process for viscose was done in the exact same way as when the reference tests were done. The enzyme used in this thesis was Carezyme which contents endoglucanase. Then the results from the analyses of the viscose manufactured from enzyme treated dissolving pulp and the reference curve was compared. A positive result would have been that viscose manufactured with enzyme treatment gets a higher gamma number than viscose, with the same load of carbon disulfide, manufactured in the regular way.</p><p> </p><p>The results showed that the degree of substitution had no effect at all; the viscose that has been manufactured from enzyme treated dissolving pulp resulted in gamma numbers on or very close to the reference curve. The only effect that could be shown was a decrease in viscosity, which unfortunately was an unwanted effect. The enzyme treatment has also hampered the process, where shorter fibres among other things have given poorer dewatering properties. Analyses on the viscose manufactured in the laboratory showed that it didn't have the same characteristics as viscose manufactured in a plant.</p> / <p>I den konventionella tillverkningsprocessen för viskos förbrukas stora mängder koldisulfid. Denna mängd behöver minskas, både för att hålla nere produktionskostnaderna men också för att minska miljöpåverkan. Syftet med arbetet var att undersöka om en enzymbehandling av en dissolvingmassa kunde öka substitutionsgraden så att koldisulfid-förbrukningen skulle kunna minskas. Det har i flera tidigare undersökningar av Kvarnlöf (2007), Engström m.fl. (2006) och Henriksson m.fl. (2005) visats att reaktiviteten hos en dissolvingmassa (råvaran i viskosprocessen) ökar när den förbehandlats med endoglukanas (enzym). Kvarnlöf (2007) visade dessutom att mängden koldisulfid som behövdes för att tillverka spinnviskos (i detta examensarbete har en viskösare viskos undersökts) kunde minskas med en tredjedel tack vare enzymbehandlingen.</p><p> </p><p>I detta examensarbete har viskos tillverkats i laboratoriet där processen har anpassats så att den liknar den industriella så mycket som möjligt. Analyser gjordes på viskosens viskositet och substitutionsgrad. En referenskurva tillverkades där den procentuella koldisulfid-satsningen plottades mot viskosens gammatal (substitutionsgraden). Därefter undersöktes hur en enzymbehandling av dissolvingmassan påverkade den färdiga viskosen. Efter enzymbehandlingen av dissolvingmassan utfördes tillverkningsprocessen precis som vanligt för att man skulle kunna se effekterna av enzymet. Enzymet som användes i arbetet var enzympreparationen Carezyme som innehåller endoglukanas. Sedan jämfördes resultaten från analyserna av viskosen tillverkad från enzymbehandlad dissolvingmassa med referensvärdena. Ett positivt resultat hade varit att enzymbehandlad viskos hade ett högre gammatal än viskos tillverkad på vanligt sätt utan enzymförbehandling men med samma koldisulfidsats.</p><p> </p><p>Resultaten visar att substitutionsgraden inte har påverkats alls, dvs. den viskos som tillverkats från enzymbehandlad dissolvingmassa fick gammatal som låg på eller mycket nära referenskurvan. Den enda effekt av enzymet som kunde visas var en viskositetssänkning, vilket inte var något som eftersträvades. Processen har dessutom försvårats av enzymsteget, där kortare fibrer bl.a. gav sämre avvattningsegenskaper. Viskosanalyser har visat att viskosen som tillverkats på laboratoriet inte har samma egenskaper som viskos tillverkad på fabrik.</p>

In conventional viscose manufacturing, a large amount of carbondisulfide is consumed. This amount has to be decreased to keep the production cost down and to reduce the environmental impact. The purpose with this work was to show if an enzyme treatment of a dissolving pulp could increase the degree of substitution in the viscose so that the amount of carbon disulfide consumed in the process could be decreased. Previous investigations by Kvarnlöf (2007), Engström et.al. (2006) and Henriksson et.al. (2005) has shown that the reactivity of a dissolving pulp (the cellulose raw material) increased when it was pre-treated with endoglucanase (enzyme). Kvarnlöf (2007) also showed that the amount of carbon disulfide that is needed to produce an ordinary viscose (in this work a more viscous viscose has been investigated) could be reduced with one third because of the enzyme treatment.   In this thesis, viscose has been manufactured in a laboratory where the process has been adapted to look like the industrial as far as possible. Analyses were done on the viscose viscosity and degree of substitution. A reference curve was made with the percentage carbon disulfide load versus the viscose gamma number (degree of substitution). Then it was investigated how an enzyme treatment of the dissolving pulp affected the viscose. After the enzyme treatment, the manufacturing process for viscose was done in the exact same way as when the reference tests were done. The enzyme used in this thesis was Carezyme which contents endoglucanase. Then the results from the analyses of the viscose manufactured from enzyme treated dissolving pulp and the reference curve was compared. A positive result would have been that viscose manufactured with enzyme treatment gets a higher gamma number than viscose, with the same load of carbon disulfide, manufactured in the regular way.   The results showed that the degree of substitution had no effect at all; the viscose that has been manufactured from enzyme treated dissolving pulp resulted in gamma numbers on or very close to the reference curve. The only effect that could be shown was a decrease in viscosity, which unfortunately was an unwanted effect. The enzyme treatment has also hampered the process, where shorter fibres among other things have given poorer dewatering properties. Analyses on the viscose manufactured in the laboratory showed that it didn't have the same characteristics as viscose manufactured in a plant. / I den konventionella tillverkningsprocessen för viskos förbrukas stora mängder koldisulfid. Denna mängd behöver minskas, både för att hålla nere produktionskostnaderna men också för att minska miljöpåverkan. Syftet med arbetet var att undersöka om en enzymbehandling av en dissolvingmassa kunde öka substitutionsgraden så att koldisulfid-förbrukningen skulle kunna minskas. Det har i flera tidigare undersökningar av Kvarnlöf (2007), Engström m.fl. (2006) och Henriksson m.fl. (2005) visats att reaktiviteten hos en dissolvingmassa (råvaran i viskosprocessen) ökar när den förbehandlats med endoglukanas (enzym). Kvarnlöf (2007) visade dessutom att mängden koldisulfid som behövdes för att tillverka spinnviskos (i detta examensarbete har en viskösare viskos undersökts) kunde minskas med en tredjedel tack vare enzymbehandlingen.   I detta examensarbete har viskos tillverkats i laboratoriet där processen har anpassats så att den liknar den industriella så mycket som möjligt. Analyser gjordes på viskosens viskositet och substitutionsgrad. En referenskurva tillverkades där den procentuella koldisulfid-satsningen plottades mot viskosens gammatal (substitutionsgraden). Därefter undersöktes hur en enzymbehandling av dissolvingmassan påverkade den färdiga viskosen. Efter enzymbehandlingen av dissolvingmassan utfördes tillverkningsprocessen precis som vanligt för att man skulle kunna se effekterna av enzymet. Enzymet som användes i arbetet var enzympreparationen Carezyme som innehåller endoglukanas. Sedan jämfördes resultaten från analyserna av viskosen tillverkad från enzymbehandlad dissolvingmassa med referensvärdena. Ett positivt resultat hade varit att enzymbehandlad viskos hade ett högre gammatal än viskos tillverkad på vanligt sätt utan enzymförbehandling men med samma koldisulfidsats.   Resultaten visar att substitutionsgraden inte har påverkats alls, dvs. den viskos som tillverkats från enzymbehandlad dissolvingmassa fick gammatal som låg på eller mycket nära referenskurvan. Den enda effekt av enzymet som kunde visas var en viskositetssänkning, vilket inte var något som eftersträvades. Processen har dessutom försvårats av enzymsteget, där kortare fibrer bl.a. gav sämre avvattningsegenskaper. Viskosanalyser har visat att viskosen som tillverkats på laboratoriet inte har samma egenskaper som viskos tillverkad på fabrik.

Regioselektive Halogenasen sind Enzyme, die für die Biosynthese verschiedener halogenierter Metaboliten verantwortlich sind. Der Stamm Streptomyces rugosporus produziert die bioaktive halogenierte Verbindung Pyrroindomycin B. In dieser Arbeit wurde ein Gen einer Tryptophan-5-Halogenase aus dem Pyrroindomycinproduzenten Streptomyces rugosporus isoliert. Durch gezielte Mutation des Gens konnte die Beteiligung der Halogenase an der Biosynthese von Pyrroindomycin B nachgewiesen werden. Das Tryptophan-5-Halogenase-Gen wurde heterolog exprimiert. In einem spezifischen Enzymtest konnte die Aktivität der Tryptophan-5-Halogenase gezeigt werden. Tryptophan wurde im Enzymtest durch dieses Enzym monobromiert und monochloriert. Das Protein konnte über Nickelaffinitäts-Chromatographie gereinigt werden. / Regioselectively acting halogenases are enzymes which are responsible for the biosynthesis of a large variety of halogenated secondary metabolites. In many cases the biological activity of these metabolites is influenced by the halogen substituents. Isolation and characterization of the genes of specific halogenases and understanding the biochemistry of these enzymes are prerequisites for genetic engineering aiming at the production of novel halogenated compounds by combinatorial biosynthesis. In the work presented here a halogenase with novel regioselectivity was isolated. It is one of only three specific halogenases for which the enzymatic activity and the involvement in the biosynthesis of a halogenated metabolite could be shown. The availability of this specific tryptophan 5-halogenase is expected to open up novel possibilities for combinatorial biosynthesis and the enzymatic production of halogenated compounds.

Grewia optiva är en utav många outnyttjade stjälkfibrer som skulle kunna bidra till ökandet utav de naturliga fiberalternativen. Fibern har idag inte så många användningsområden på grund utav dess hårda och styva uppbyggnad, vilket gör den svår att spinna till garn. På uppdrag av organisationen Bhartiya Gramotthan Sanstha (BGS) har i detta projekt en redan befintlig metod utvecklats för att förädla fibern. Vad som främst eftersöktes var nedbrytandet av pektin som är en av de faktorer som bidrar till fiberns hårda och styva struktur. I metoden användes biologiskt nedbrytbara enzym som katalysatorer. En fungerande metod skulle kunna öka användningsområdet hos stjälkfibrer generellt och öka möjligheten till användandet utav fler naturliga fibrer. Enzymet som har använts i metoden är ett pektatlyas EC 4.2.2.2 som katalyserar reaktionen som sker då pektinmolekyler klyvs. För att effektivisera processen adderades en komplexbildare, EDTA, som tidigare visat goda resultat för lin. Efter enzymbehandlingen skedde en viktreduktion av fibrerna samt förändring av deras utseende. I svepelektronmikroskop observerades förändring av ytstruktur samt separation mellan fiberbuntarna. Dessa parametrar är viktiga och har stor inverkan på spinnbarheten hos fibrer. I projektet har försök att spinna fibern gjorts men inte lyckats helt. Förändringen på ytstruktur och separation mellan fibrerna tyder dock på att behandlingen är ett steg i rätt riktning. / Grewia optiva is one of many unused bast fibres that could contribute to an increase of natural textile fibres on the industrial market. This fibre has to-day not as many applications due to its stiff and hard structure that makes the fibre difficult to spin into yarn. On behalf of the organisation Bhartiya Gramotthan Sanstha (BGS) has an existing method been developed to process the Grewia optiva fibre. The method is developed to break down substances like pectin that is responsi-ble for the hard and stiff structure of the fibre. Degradable biological en-zymes were used as catalyser in the method. With a functioning method like this the applications of bast fibres could increase and contribute to the use of more natural fibres. The enzyme used to catalyse the chemical reaction and the cleavage of pec-tin molecules in this method was a pectate lyase EC 4.2.2.2. In this method EDTA was used as a chelator to efficient the chemical process. EDTA has been used as a chelator in earlier reports and showed good results. After the enzymatic treatment a weight reduction of the fibre was notable. In SEM-analysis separation between fibres and changes on the fibre surfaces was observed. These parameters are important and affect the spinning capability of the fibre. To test the spinning capability of the enzyme treated fibre they were spun in a ring spinning system, unfortunately not successfully. The surface changes and the separation shows that the enzymatic treatment had occurred and indicates that the method has developed in the right direction.

Context: Beta-site alpha-amyloid protein cleaving enzyme1 (BACE1) plays a key role in the pathogenesis of Alzheimer’s disease. Additional to its moderate expression in the brain, high levels of BACE1 mRNA were found in the pancreas. Murine Bace1 has been immunohistochemicaly detected at the apical pole of acinar cells within the exocrine pancreas of mice and Bace1 activity was observed in pancreatic juice. In vitro experiments revealed enteropeptidase as a putative substrate for Bace1 suggesting a role in acute pancreatitis.

Zugl.: Dortmund, Universiẗat, Diss.