Danos ao sistema nervoso central (SCN) resultam em perda de conexões axonais, das funções motoras e sensoriais. Uma das estratégias para seu reparo é o transplante de células-tronco mesenquimais (CTMs). Porém essa alternativa requer uma adequada via de aplicação. Nesse sentido, o uso de matrizes alinhadas pode ser usado para apoiar o crescimento e diferenciação das CTMs e, quando incorporadas com fatores de crescimento, otimizam o processo de regeneração tecidual. O objetivo desse trabalho foi avaliar a diferenciação neural das CTMs cultivadas sobre matrizes de nanofibras orientadas com o fator de crescimento epidermal (EGF) incorporado. Os scaffolds com fibras alinhadas foram produzidos por electrospinning de emulsão e avaliados conforme a sua morfologia, o diâmetro das nanofibras, a degradabilidade e a liberação do EGF. As CTMs utilizadas foram provenientes da polpa de dentes decíduos esfoliados humanos. Essas células foram cultivadas nos scaffolds e avaliadas conforme os testes biológicos: adesão, viabilidade, proliferação, citotoxicidade e diferenciação neural. Os scaffolds com fibras alinhadas controle (AC) e contendo o EGF (AE) apresentaram morfologia, diâmetro das nanofibras e tempo de degradação semelhantes. Com base no total de EGF presente na matriz AE, 90,14% foi liberado após 28 dias. O citoesqueleto e o núcleo das CTMs cultivadas nos scaffolds AC e AE estavam mais alongados e alinhados quando comparado com as CTMs cultivadas no poço de cultura (controle). As CTMs aderiram mais nas matrizes AE em relação às matrizes AC, porém a proliferação e viabilidade celular foram similares, exceto no tempo de 72 horas, o qual a viabilidade no grupo controle foi maior, em comparação aos demais grupos. Os scaffolds AC e AE não foram tóxicos para as CTMs. Em relação aos resultados da neuro-diferenciação, a expressão de nestina e neurofilamentos consideravelmente maior em todos os grupos analisados quando comparado ao grupo controle. A expressão de βIII-tubulina e GFAP foi maior em todos os grupos diferenciados quando comparada ao grupo controle. A maioria das CTMs cultivadas nas matrizes AC e AE, induzidas ou não à diferenciação neural, apresentaram correntes dependente de voltagem para sódio. O valor de condutância máxima foi maior para todos os grupos analisados quando comparado ao grupo controle onde as células não foram diferenciadas. Portanto, as matrizes com nanofibras orientadas induzem à diferenciação neural das CTMs em neurônios funcionais tanto na ausência como na presença de EGF incorporado. As matrizes AE ainda mostraram ser capazes de melhorar a adesão celular. Dessa forma, conclui-se que as matrizes de nanofibras estudadas são uma possível estratégia para otimização da regeneração de lesões neurológicas. / Damage to the central nervous system (CNS) results in loss of axonal connections and motor and sensory functions. One of the strategies for its repair is the transplantation of mesenchymal stem cells (MSCs). However, this requires a suitable application route. Accordingly, the use of scaffolds support the growth of MSCs and, when incorporated with growth factors, optimize the regeneration process. The purpose of this study was to evaluate the neural differentiation of MSCs cultured on nanofiber matrices oriented with epidermal growth factor (EGF) incorporated. Aligned scaffolds were produced by electrospinning emulsion and evaluated according to their degradation, the morphology and diameter of the nanofibers, and release of EGF from the nanofibers. MSCs used were from human exfoliated deciduous teeth (SHED). These cells were cultured on the scaffolds and evaluated according to biological tests: adhesion, viability, proliferation, cytotoxicity and neural differentiation. The aligned control scaffolds (AC) containing EGF (AE) presented similar morphology, diameter of nanofibers and degradation time. Based on the total EGF present in the scaffold AE, 90.14% was released after 28 days. The cytoskeleton and the core of the MSCs cultured on scaffolds AC and AE were more aligned and elongated when compared to the MSCs grown on plate wells (control). MSCs adhered more to matrices AE when compared to matrices AC, although proliferation and cell viability were similar, except after 72 hours. In this period, the viability of the control group was higher when compared to the rest of the groups. Scaffolds AC and AE were not toxic to MSCs. In regard to the results of neuro-differentiation, the expression of nestin and neurofilament was much higher in all groups than the control group. The expression of βIII tublin and GFAP was higher in all differentiated groups than the control group. Most of the MSCs grown in matrices AC and AE, induced or not to neural differentiation, showed voltage-dependent sodium currents. The maximum value of conductance of these groups was higher for the cells in all groupscompared to the control group, where the cells were not differentiated. Therefore, oriented nanofiber matrices induce neural differentiation of MSCs into functional neurons both in the absence and in the presence of incorporated EGF. The matrices AE also showed improved cell adhesion. Thus, these matrices are a possible strategy for optimizing the regeneration of neurologic lesions.

Danos ao sistema nervoso central (SCN) resultam em perda de conexões axonais, das funções motoras e sensoriais. Uma das estratégias para seu reparo é o transplante de células-tronco mesenquimais (CTMs). Porém essa alternativa requer uma adequada via de aplicação. Nesse sentido, o uso de matrizes alinhadas pode ser usado para apoiar o crescimento e diferenciação das CTMs e, quando incorporadas com fatores de crescimento, otimizam o processo de regeneração tecidual. O objetivo desse trabalho foi avaliar a diferenciação neural das CTMs cultivadas sobre matrizes de nanofibras orientadas com o fator de crescimento epidermal (EGF) incorporado. Os scaffolds com fibras alinhadas foram produzidos por electrospinning de emulsão e avaliados conforme a sua morfologia, o diâmetro das nanofibras, a degradabilidade e a liberação do EGF. As CTMs utilizadas foram provenientes da polpa de dentes decíduos esfoliados humanos. Essas células foram cultivadas nos scaffolds e avaliadas conforme os testes biológicos: adesão, viabilidade, proliferação, citotoxicidade e diferenciação neural. Os scaffolds com fibras alinhadas controle (AC) e contendo o EGF (AE) apresentaram morfologia, diâmetro das nanofibras e tempo de degradação semelhantes. Com base no total de EGF presente na matriz AE, 90,14% foi liberado após 28 dias. O citoesqueleto e o núcleo das CTMs cultivadas nos scaffolds AC e AE estavam mais alongados e alinhados quando comparado com as CTMs cultivadas no poço de cultura (controle). As CTMs aderiram mais nas matrizes AE em relação às matrizes AC, porém a proliferação e viabilidade celular foram similares, exceto no tempo de 72 horas, o qual a viabilidade no grupo controle foi maior, em comparação aos demais grupos. Os scaffolds AC e AE não foram tóxicos para as CTMs. Em relação aos resultados da neuro-diferenciação, a expressão de nestina e neurofilamentos consideravelmente maior em todos os grupos analisados quando comparado ao grupo controle. A expressão de βIII-tubulina e GFAP foi maior em todos os grupos diferenciados quando comparada ao grupo controle. A maioria das CTMs cultivadas nas matrizes AC e AE, induzidas ou não à diferenciação neural, apresentaram correntes dependente de voltagem para sódio. O valor de condutância máxima foi maior para todos os grupos analisados quando comparado ao grupo controle onde as células não foram diferenciadas. Portanto, as matrizes com nanofibras orientadas induzem à diferenciação neural das CTMs em neurônios funcionais tanto na ausência como na presença de EGF incorporado. As matrizes AE ainda mostraram ser capazes de melhorar a adesão celular. Dessa forma, conclui-se que as matrizes de nanofibras estudadas são uma possível estratégia para otimização da regeneração de lesões neurológicas. / Damage to the central nervous system (CNS) results in loss of axonal connections and motor and sensory functions. One of the strategies for its repair is the transplantation of mesenchymal stem cells (MSCs). However, this requires a suitable application route. Accordingly, the use of scaffolds support the growth of MSCs and, when incorporated with growth factors, optimize the regeneration process. The purpose of this study was to evaluate the neural differentiation of MSCs cultured on nanofiber matrices oriented with epidermal growth factor (EGF) incorporated. Aligned scaffolds were produced by electrospinning emulsion and evaluated according to their degradation, the morphology and diameter of the nanofibers, and release of EGF from the nanofibers. MSCs used were from human exfoliated deciduous teeth (SHED). These cells were cultured on the scaffolds and evaluated according to biological tests: adhesion, viability, proliferation, cytotoxicity and neural differentiation. The aligned control scaffolds (AC) containing EGF (AE) presented similar morphology, diameter of nanofibers and degradation time. Based on the total EGF present in the scaffold AE, 90.14% was released after 28 days. The cytoskeleton and the core of the MSCs cultured on scaffolds AC and AE were more aligned and elongated when compared to the MSCs grown on plate wells (control). MSCs adhered more to matrices AE when compared to matrices AC, although proliferation and cell viability were similar, except after 72 hours. In this period, the viability of the control group was higher when compared to the rest of the groups. Scaffolds AC and AE were not toxic to MSCs. In regard to the results of neuro-differentiation, the expression of nestin and neurofilament was much higher in all groups than the control group. The expression of βIII tublin and GFAP was higher in all differentiated groups than the control group. Most of the MSCs grown in matrices AC and AE, induced or not to neural differentiation, showed voltage-dependent sodium currents. The maximum value of conductance of these groups was higher for the cells in all groupscompared to the control group, where the cells were not differentiated. Therefore, oriented nanofiber matrices induce neural differentiation of MSCs into functional neurons both in the absence and in the presence of incorporated EGF. The matrices AE also showed improved cell adhesion. Thus, these matrices are a possible strategy for optimizing the regeneration of neurologic lesions.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2017-09-04T19:51:03Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Paula Lima Magalhães - 2017.pdf: 3829811 bytes, checksum: fc13a75154ee6a0c6c19e4be5ff0208a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-09-15T14:46:40Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Paula Lima Magalhães - 2017.pdf: 3829811 bytes, checksum: fc13a75154ee6a0c6c19e4be5ff0208a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-15T14:46:40Z (GMT). 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The aim of this study was to study canine cutaneous SCC in the light of different histomorphological patterns of the neoplasia, evaluating its immunophenotype response to EGFR and c-erbB2 epidermal growth factor receptors. For that, the cases of canine SCC were analyzed from the archive of the Animal Pathology Sector of the EVZ / UFG from 2006 to 2015. For the epidemiological study, registration information was considered, including breed, sex, age and anatomical location. Regarding the histomorphological evaluation and malignancy criteria, the lesions were classified according to the system recommended by the Müller e Kirk’s. Anti-EGFR (HER1) and anti-c-erbB-2 (HER2) antibodies were used for the immunohistochemical study to better understand the role of these proteins in the mechanisms involved in the genesis, proliferation and evolution of SCC in dogs. Considering the histomorphological and immunophenotypic analyzes, the correlation between its variables was tested, and a correlation was verified between the EGFR immunostaining and the degree of SCC differentiation (r = 0.26, p = 0.02). On the other hand, there was no correlation between c-erbB2 immunostaining and histomorphological differentiation (r = 0.02; p = 0.83). When the correlation between EGFR and c-erbB2 immunoblots was tested, a positive correlation was also observed, but not statistically significant (r = 0.21, p = 0.06). It is concluded that there is a propensity that the increase in EGFR immunoexpression is directly proportional to the degree of SCC differentiation, and that it does not occur with c-erbB2 immunostaining. Also, SCCs in dogs seems to exhibit simultaneous increase of EGF receptor immunostaining. / O carcinoma de células escamosas (CCE) é um dos tumores cutâneos malignos mais comuns em todas as espécies animais, assim como na espécie humana, podendo acometer desde animais jovens a idosos. Tem desenvolvimento associado a fatores ambientais como exposição prolongada aos raios solares e hipopigmentação epidermal. Os estudos revelam que, 80% das neoplasias malignas têm origem em estímulos ambientais, em decorrência a exposição a carcinógenos. Apesar da etiologia multifatorial, a busca pelo esclarecimento das causas e dos mecanismos de evolução do câncer deve ser incessante, pois inúmeras neoplasias podem ser prevenidas, especialmente quando induzidas por fatores exógenos. Assim, este trabalho teve por objetivo estudar o CCE cutâneo canino à luz dos diferentes padrões histomorfológicos da neoplasia, avaliando o seu imunofenótipo quanto aos receptores do fator de crescimento epidérmico EGFR e c-erbB2. Para tal, foram avaliadas os casos de CCE canino provenientes do arquivo do Setor de Patologia Animal da EVZ/UFG no período de 2006 a 2015. Para o estudo epidemiológico foram consideradas as informações de registro, incluindo raça, sexo, idade e localização anatômica. Quanto à avaliação histomorfológica e critérios de malignidade, as lesões foram classificadas de acordo com o sistema preconizado por Müller e Kirk’s. Para o estudo imunoistoquímico foram utilizados os anticorpos anti-EGFR (HER1) e anti-c-erbB-2 (HER2), com o intuito de melhor compreender a participação dessas proteínas nos mecanismos envolvidos na gênese, proliferação e evolução do CCE em cães. Considerando as análises histomorfológica e imunofenotípica foi testada a correlação entre suas variáveis, sendo constatada correlação entre a imunomarcação para EGFR e o grau de diferenciação do CCE (r=0,26; p=0,02). Por outro lado, não houve correlação entre a imunomarcação de c-erbB2 e a diferenciação histomorfológica (r=0,02; p=0,83). Quando testada a correlação entre as imunomarcações de EGFR e c-erbB2, também foi observada correlação positiva, porém sem significância estatística (r=0,21; p=0,06). Conclui-se que há propensão de que o aumento na imunoexpressão de EGFR seja diretamente proporcional ao grau de diferenciação do CCE, sendo que o mesmo não ocorre com a imunomarcação de c-erbB2. Também, os CCE em cães parecem apresentar aumento simultâneo da imunomarcação dos receptores de EGF.

O Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico (do inglês, EGFR) é uma proteína de membrana celular que consiste em um domínio extracelular para o acoplamento do ligante e em um domínio intracelular apresentando sítio catalítico de tirosinoquinase. Em ~40% dos GBMs primários é observada a amplificação de EGFR resultando na sua hiperexpressão, o que raramente ocorre em GBM secundário. Mais da metade dos casos de GBM com amplificação do receptor está associado com rearranjo do gene, uma forma deletada de EGFR (EGFRvIII). Adicionalmente, o receptor de interleucina 13 alfa-2 (IL-13R 2), apresenta-se abundante e especificamente hiperexpresso em gliomas de alto grau, em particular, GBM. O objetivo do presente estudo é analisar a expressão, amplificação, e deleção de EGFR em astrocitomas, bem como a coexpressão entre esse gene e o da IL-13R 2. Foram analisadas 145 astrocitomas (22 astrocitomas pilocíticos (AP); 22 astrocitomas grau II (AGII); 17 astrocitomas anaplásico (AA); e 84 GBM) e 17 tecidos cerebrais não tumorais provenientes de cirurgia de epilepsia. A deleção EGFRvIII foi analisada por RT-PCR, e confirmada por PCR em tempo real (RQ-PCR). A expressão relativa de EGFR e IL-13R 2 foi estudada por RQ-PCR utilizando-se o método SYBR Green, comparado ao tecido não tumoral, e normalizado para os genes de referência endógena, HPRT e Gus- . A amplificação de EGFR foi também determinada por RQ-PCR com relação ao gene da beta-hemoglobina, descrito como um gene de cópia única. Foi realizada imunohistoquímica para analisar a expressão da proteína EGFR. A deleção EGFRvIII foi somente encontrada em GBM (19/84, 23%), demonstrando a exclusividade dessa alteração num grau tumoral de maior malignidade e uma diminuição da sobrevida desses pacientes (p = 0,030). A hiperexpressão de EGFR foi encontrada em 88 casos (61%), correspondendo a 50% de GBM, 88% de AA, e interessantemente em 77% de AGII e 64% de AP. Da mesma maneira, a hiperexpressão de IL-13R 2 foi encontrada em 62 casos (43%), correspondendo a 48% de GBM, 29% de AA, 18% de AGII e, surpreendentemente em 59% de AP. Embora tenha havido um aumento de expressão de ambos os genes em todos os graus de astrocitomas, não houve coexpressão dos mesmos. A amplificação de EGFR foi observada em 29 casos (20%) correspondendo a 31% de GBM e ainda um caso para cada um dos demais graus de astrocitomas, sendo que dos 29 casos amplificados, 21 pacientes eram mais velhos que 45 anos (p < 0,001) e 50% dos casos de GBM com amplificação de EGFR, apresentaram simultaneamente EGFRvIII. Adicionalmente, o acúmulo citoplasmático da proteína foi detectado em 74 casos (51%), correspondendo a 55% de GBM, 47% de AA, 54,5% de AGII e 37% de AP, além de um acúmulo nuclear detectado em 15% dos casos de astrocitomas difusamente infiltrativos. Assim, a alta freqüência de hiperexpressão dos genes estudados em todos os graus de astrocitomas, principalmente a amplificação de EGFR e a presença da deleção EGFRvIII foram observados entre os astrocitomas de alto grau, especialmente em GBM. Os resultados apresentados contribuem para um melhor direcionamento no futuro em métodos terapêuticos específicos, salientando a importância da análise de expressão molecular, protéica e das alterações mutacionais que envolvem genes candidatos, em particular, EGFR e IL-13R 2 / Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR is a transmembrane protein consisting of an extracellular EGF-binding domain and an intracellular domain with ligand-activated tyrosine kinase activity. In ~40% of primary GBM is observed amplification leading to overexpression of EGFR, but rarely in secondary GBM. Over the half of primary GBM with EGFR amplification is associated to gene rearrangement, a deleted form of EGFR (EGFRvIII). Additionally, the interleukin-13 alpha 2 receptor (IL13R 2) is abundant and specifically overexpressed in high-grade gliomas, particularly in GBM. The aim of the present study is to analyze the EGFR expression, amplification, and deletion in astrocytomas as well as its coexpression with IL13R 2. We have analyzed 145 surgical astrocytoma samples (22 pilocytic astrocytomas (PA); 22 low-grade astrocytomas (LGA); 17 anaplastic astrocytomas (AA); and 84 GBM) and 17 non-neoplastic brain tissue from epilepsy surgery. EGFRvIII deletion was analyzed by RT-PCR, and also confirmed by real time PCR (RQ-PCR). The relative EGFR and IL-13R 2 expression was studied by RQ-PCR using SYBR Green method, compared to non-neoplastic tissue, normalized for HPRT and Gus- genes. The EGFR amplification was also determined by RQ-PCR relative to the hemoglobin beta gene, described as a single copy gene. Immunohistochemistry was performed to analyze the protein expression in tumor samples. The EGFRvIII deletion was found only in GBM cases (19/84, 23%) demonstrating the exclusivity of this alteration in higher tumor grade and survival was decreased in these patients (p = 0.030). EGFR overexpression was found in 88 cases (61%), corresponding to 50% of GBM, 88% of AA, and interestingly in 77% of LGA and 64% of PA. In the same way, the overexpression of IL-13R 2 was found in 62 cases (43%), corresponding to 48% of GBM, 29% of AA, 18% of LGA and, surprising in 59% of PA. Although increased expression of both genes was demonstrated in all astrocytoma grades, it was no coexpression of the genes. The amplification was observed in 29 cases (20%) corresponding to 31% of GBM and only one case each of PA, LGA and AA. Among 29 cases with EGFR amplification, 21 patients were older than 45 years (p < 0.001) and 50% of GBM with EGFR amplification presented simultaneously the EGFRvIII. Moreover, the EGFR cytoplasmic accumulation was detected in 74 cases (51%), corresponding to 55% of GBM, 47% of AA, 54.5% of LGA and 37% of PA, and nuclear accumulation was detected in 15% of diffusely infiltrative astrocytomas. Thus, the high overexpression frequency of the genes studied in all grades of astrocytomas, mainly the EGFR amplification and presence of EGFRvIII deletion were observed among high-grade astrocytomas, mainly in GBM. The present results contribute to better tailoring specific future therapeutical approach in patients with astrocytomas, pointing out the importance of the molecular, protein expressions and mutational analyses of candidates genes, in particular, EGFR and IL-13R 2

Introdução: O Erlotinibe é um inibidor oral da tirosina quinase localizada no domínio intracelular do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR). É uma droga ativa contra o carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (CECCP) que apresenta alta expressão deste receptor, demonstrando desta forma possível sinergismo com a quimioterapia e a radioterapia. Objetivo: Avaliar a expressão do EGFR e da proteína Akt fosforilada por imuno-histoquímica como fator preditivo a resposta terapêutica ao Erlotinibe em um estudo fase II que incluiu 32 pacientes com CECCP localmente avançado; também foram analisados mutações do gene EGFR nos éxons 18,19,20 e 21. Pacientes e métodos: Neste estudo pacientes portadores de CECCP localmente avançado foram tratados com uma combinação de Cisplatina 100mg/m2 intravenoso, administrada nos dias 8, 29 e 50 do tratamento; e radioterapia na dose de 70 Gy administrada em 39 frações a partir do dia 8. O Erlotinibe foi iniciado uma semana antes da radioterapia e mantido até o último dia da radioterapia. Biópsias pré-tratamento, extraídas dos blocos de parafina, foram analisadas por imunohistoquímica para avaliar a expressão do EGFR e da Akt fosforilada. O resultado dessas amostras foi quantificado por um programa de análise digital de imagem. O status mutacional do gene EGFR (nos éxons 18, 19,20 e 21) foi analisado utilizando PCR convencional e sequenciamento. Resultados: A resposta completa ao tratamento ocorreu em vinte pacientes (62,5%), sendo que dois foram tratados com Laringectomia de resgate e ficaram sem evidência de doença. A análise de sobrevida com relação ao estadiamento e com o sítio anatômico evidenciou diferença estatisticamente significativa (p= 0.05). A análise das proteínas EGFR e p-Akt por imuno-histoquímica, quando os sítios estavam agrupados não apresentou valor preditivo de resposta ao tratamento; no entanto ao avaliarmos os sítios anatômicos separadamente, apenas a quantificação de EGFR em hipofaringe foi uma variável preditiva de resposta ao tratamento com erlotinibe (p=0.05). Em relação às análises moleculares nenhuma mutação foi detectada no seqüenciamento dos éxons estudados da proteína EGFR. Conclusão: A expressão do EGFR parece ser um fator preditivo à reposta terapêutica, no entanto outros estudos com identificação de outros biomarcadores e amostras maiores são necessários para elucidar quais pacientes com CECCP podem ser beneficiados com este tratamento / Purpose: Erlotinib, an oral tyrosine-kinase inhibitor, is active against squamous cell carcinoma of the head and neck (HNSCC) and possibly has a synergistic interaction with chemotherapy and radiotherapy. We investigated the expression of EGFR and phosphorylated AKT by immunohistochemistry as predictors of response to Erlotinib in a cohort of 32 locally advanced HNSCC, enrolled in a Phase II trial. In addition, we assessed mutation on hotspots of EGFR gene (exons18,19,20,21). Patients and Methods: This study was conducted in a Phase I/II trial of cisplatin 100 mg/m2 on days 8, 29 and 50; and radiotherapy 70 Gy starting on day 8. Erlotinib was started orally 1 week before chemo radiation and continued daily just to the last day of chemo radiation. Pretreatment archival tumor specimens were evaluated for EGFR and phosphorylated-Akt (p-Akt) by immunohistochemistry. These immunostains were quantified by digital image analysis. EGFR gene mutational status was also assessed using conventional PCR and sequencing. Results: Complete response to treatment occurred in twenty patients (62.5%), and two were treated with salvage laryngectomy and were without evidence of disease. Survival analysis in relation to the staging and the tumor site showed a statistically significant difference (p = 0.05). Analysis of EGFR protein and p-Akt by immunohistochemistry, when sites were grouped showed no predictive value for treatment response, however when evaluating the anatomical sites separately, only the quantification of EGFR in the hypopharynx was a significant predictor of response to treatment with erlotinib (p = 0.05). Regarding the molecular analysis no mutations were detected in the sequencing of the exons studied EGFR protein. Conclusion: The expression of EGFR seems to be a predictive factor for response to therapy, although other studies with identification of other biomarkers and larger samples are needed to elucidate which patients may benefit HNSCC with this treatment

Non-small-cell lung cancer (NSCLC) accounts for 80–85% of all lung cancers and is associated with significant mortality. As epidermal-growth-factor receptor (EGFR) is over-expressed in 80-90% of NSCLC, its inhibition via EGFR-Tyrosine Kinase inhibitors (EGFR-TKIs) is a main therapeutic strategy. However, patients with mutations in KRAS are resistant to EGFR-TKIs. A study in mutant KRAS-driven lung cancer in transgenic mice showed that tumor growth was dependent on the activity of focal adhesion kinase (FAK). Therefore, we hypothesized that KRAS-mutant NSCLC will be sensitive to FAK-TKIs and, given known FAK-EGFR cross-talk, FAK inhibition will sensitize KRAS-mutant NSCLC to EGFR-TKIs. We performed cell viability assays of WT versus mutant KRAS NSCLC cell lines following treatment with FAK-TKI alone or in combination with a clinically relevant EGFR-TKI. We found that KRAS-mutant cells were more sensitive to FAK-TKI than KRAS-WT NSCLC. In addition, we found that the combination treatment including FAK and EGFR TKIs resulted in reduced tumor cell viability as compared to treatment with either drug alone. This enhanced anti-tumor response could be due to FAK-TKI’s ability to down-regulate EGFR downstream targets. Our preliminary data suggests that in KRAS-mutant cells the drug combination appears to more effectively inhibit Akt activity than single drug treatment alone. This suggests an enhanced ability to impair cell survival following treatment with the drug combination. We also found that treatment with FAK TKI in KRAS mutant NSCLC cells resulted in increased activation of EGFR which was due in part to modulation of EGFR recycling and production of endogenous EGFR ligands. Thus, the combination of FAK- and EGFR-TKIs may be more effective in KRAS mutant NSCLC as treatment with EGFR-TKI overcomes the unexpected ‘side effect’ of treatment with FAK-TKI, namely activation of the EGFR pathway by this drug. The findings of our study are novel and have uncovered previously unrecognized outcomes of FAK inhibition on EGFR activity. Moreover, our data support the notion that the combination of FAK- and EGFR-TKIs could be an effective treatment for KRAS mutant NSCLC patients.

No description available.

Overall survival of the metastatic forms of epithelial derived cancers, especially head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC), has not significantly improved even with the application of aggressive combined modality approaches incorporating radiation and chemotherapy. Cumulative evidence implicates the epidermal growth factor receptor (EGFR) as an important therapeutic target in HNSCC. We have previously demonstrated that the combination of lovastatin, a potent inhibitor of the mevalonate pathway, with EGFR tyrosine kinase inhibitors induced robust synergistic cytotoxicity. However, the use of high dose statins in our clinical trial was associated with significant toxicities including higher than anticipated rate of muscle pathologies. Our goal was to uncover novel downstream targets of the mevalonate pathway that may enhance the efficacy or limit toxicities of this novel combination therapeutic approach. In this study we have demonstrated that GGTI-298, an inhibitor of protein geranylgeranylation, through its ability to disrupt the actin cytoskeleton, inhibits EGFR dimerization and cellular trafficking. This novel mechanism targeting the EGFR has clinical implications as GGTI-298 in combination with tarceva, a clinically relevant EGFR inhibitor, showed enhanced cytotoxicity and inhibitory effects on EGFR activation and its downstream signaling.

Orientador: Luis Otavio Zanatta Sarian / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-28T02:45:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Baptista_MauricioZuccolotto_D.pdf: 4237946 bytes, checksum: b677fee05d5d510e473e6b4c4c856a53 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Introdução: A via de sinalização intracelular PTEN, mTOR, PI3K, IGF-1R e EGFR exerce papel prognóstico importante no câncer de mama. Embora muitos estudos tenham analisado a correlação entre as alterações gênicas de PTEN, mTOR, PI3K, IGF-1R e EGFR e o mau prognóstico em câncer de mama, há uma lacuna na literatura com relação ao valor prognóstico dessas proteínas na adjuvância do câncer de mama. Apesar de existirem fatores prognósticos e preditivos conhecidos, como os receptores hormonais e o HER-2, no campo imunológico, o câncer de mama é um dos tumores menos imunogênicos. As proteínas PD-L1 e PD-L2 fazem parte de uma importante resposta imune antitumoral. Em câncer de mama, o valor prognóstico de PD-L1 e PD-L2 ainda não está definido. Objetivos: Investigar a expressão das proteínas PTEN, mTOR, PI3K, IGF-1R e EGFR e das proteínas PD-L1 e PD-L2, e a correlação com as características clínicas e patológicas do câncer de mama, sobrevida livre de doença e sobrevida global. Métodos: Foi realizada uma coorte que avaliou 192 casos de câncer de mama, estadios I, II e III, tratadas entre 1994 e 2014 no Hospital da Mulher (CAISM) da UNICAMP. Os dados clínicos e de sobrevida foram retirados de prontuários. Blocos de parafina foram utilizados para construção do microarranjo de tecidos (TMA). No TMA foi utilizada a técnica de imunohistoquímica (IHQ) para estudo da expressão dessas proteínas. A terapia adjuvante foi administrada de acordo com o protocolo de tratamento institucional. Resultados: A expressão de PTEN foi encontrada em 40.6% (77/190); mTOR em 47.4% (90/190); PI3K em 29.8% (57/191); IGF-1R em 35.8% (68/190) e EGFR em 25.7% (49/191). Nas células do câncer de mama, a expressão de PTEN ocorreu no citoplasma e na região nuclear; a expressão de mTOR foi constatada de modo intenso na região nuclear e também no citoplasma. A expressão de PI3K foi mais intensa na membrana celular e menos intensa no citoplasma. A expressão de IGF-1R foi detectada na membrana celular das células tumorais. A expressão de todas essas proteínas foi significativamente associada à presença de linfonodos positivos. A idade mais jovem ao diagnóstico foi associada à expressão de PTEN e PI3K. A presença de tumores maiores foi associada à expressão de PTEN. Os receptores de progesterona negativos foram associados à expressão de PI3K. Receptores de estrógeno negativos e recorrência à distância foram ambos associados à expressão de EGFR. As expressões de PTEN, PI3K e EGFR foram fortemente associadas a características clínicas e patológicas de pior prognóstico. A expressão de PI3K foi significativamente associada à pior sobrevida livre de progressão (p=0.04) e pior sobrevida global (p=0.04). A expressão de EGFR foi também significativamente associada à pior sobrevida livre de progressão (p=0.03) e pior sobrevida global (p=0.04). A expressão de PTEN não foi associada à sobrevida. A expressão de PD-L1 foi identificada em 56.7% (107/189) e a de PD-L2 em 50.8% (97/192). Enquanto a expressão de PD-L1 foi detectada na membrana celular e no citoplasma das células do câncer de mama, a expressão de PD-L2 ocorreu no citoplasma e na região nuclear. Idade mais jovem ao diagnóstico, linfonodos positivos, receptor de estrógeno negativo e recorrência à distância foram associados tanto à expressão de PD-L1 quanto à de PD-L2. A presença de tumores maiores e de alto grau histológico foi associada à expressão de PD-L1. A expressão de PD-L1 foi significativamente associada à melhor sobrevida global (p=0.04). Conclusão: A expressão de PTEN, PI3K e EGFR pode representar um tipo de câncer de mama mais agressivo. A expressão de PI3K e EGFR pode ser considerada um marcador de mau prognóstico em câncer de mama. A expressão de PD-L1, apesar de ser associada a características clínicas e patológicas de pior evolução, pode ser considerada um marcador de bom prognóstico em câncer de mama / Abstract: Introduction: The PTEN, mTOR, PI3K, IGF-1R and EGFR signaling pathway plays an important role in prognosis of breast cancer. Although many studies have analyzed the correlation between PTEN, mTOR, PI3K, IGF-1R, and EGFR genes alterations with poor prognosis in breast cancer, there is still a gap in the literature concerning the prognostic value of these proteins in the adjuvant setting. Despite there were some well-known predictive and prognostic factors, such as hormone receptors and HER-2, in the immune field, breast cancer is one of the less immunogenic tumors. PD-L1 and PD-L2 constitute an important antitumor immune response. In breast cancer, the prognostic value of PD-L1 and PD-L2 is still to be defined. Objectives: This study investigates PTEN, mTOR, PI3K, IGF-1R and EGFR proteins expression and PD-L1 and PD-L2 proteins expression, and their correlation with clinicopathological features, disease-free survival and overall survival. Methods: In order to assess these proteins expression, we conducted an immunohistochemistry study using a tissue microarray encompassing 192 breast cancer cases, stage I, II and III, treated between 1994 and 2014 at the Women¿s Hospital (CAISM) from UNICAMP. All clinical and outcome data were retrieved from medical charts. Adjuvant therapy was administered according to the institution¿s treatment protocol. Results: PTEN expression was found in 40.6% (77/190); mTOR expression in 47.4% (90/190); PI3K expression in 29.8% (57/191); IGF-1R expression in 35.8% (68/190); and EGFR expression in 25.7% (49/191). In breast cancer cells PTEN expression showed cytoplasmic and nuclear immunoreactivity, and mTOR expression revealed strong nuclear and cytoplasmic staining. Tumors harboring PI3K expression presented strong immunoreactivity at cell membrane and weak cytoplasmic staining. IGF-1R expression was detected in breast cancer cell membrane. All proteins expression was significantly associated with lymph node positivity. Younger age at diagnosis was related to PTEN and PI3K expression. The presence of larger tumors was associated with PTEN expression. Negative progesterone receptor was correlated to PI3K expression. Estrogen receptor negativity and recurrence at distant sites were associated with EGFR expression. The expression of PTEN, PI3K, and EGFR were strongly associated with clinical and pathological features of poor prognosis. In our cohort, PI3K expression was associated with significantly worse disease-free survival (p=0.04) and overall survival (p=0.04), and EGFR expression was also significantly associated with worse disease-free survival (p=0.03) and overall survival (p=0.04). PD-L1 expression was present in 56.7% (107/189), and PD-L2 expression was identified in 50.8% (97/192). In breast cancer cells PD-L1 expression revealed strong immunoreactivity at cell membrane and cytoplasmic staining, and PD-L2 expression showed cytoplasmic and nuclear immunoreactivity. Younger age at diagnosis, lymph node positivity, estrogen negative receptor, and recurrence at distant sites were all associated with both PD-L1 and PD-L2 expression. The presence of larger tumors and higher histological grade were both associated with PD-L1 expression. PD-L1 expression was significantly associated with better overall survival (p=0.04) in breast cancer patients. Conclusion: The expression of PTEN, PI3K, and EGFR can represent a more aggressive type of breast cancer. PI3K and EGFR expressions emerge as poor prognostic markers in breast cancer. Despite its association with poor clinical and pathological features, PD-L1 expression seems to be a good prognostic marker in breast cancer / Doutorado / Oncologia Ginecológica e Mamária / Doutor em Ciências da Saúde

A amplificação gênica mais freqüente em câncer de mama é a do oncogene ERBB-2, observada em aproximadamente 30% dos tumores de mama e que está relacionada com menor intervalo livre de doença e sobrevida total das pacientes com câncer de mama. O ERBB-2 ativa importantes vias de sinalização celular, incluindo as vias MAPK e PI3K. Utilizando PCR em tempo real analisou-se o efeito do EGF e da HRG na regulação da expressão dos genes ANP32B, MATR3, ATAD4, NDRG1, ACTN1, SPARC, TPM1 e CENPH, nas células HB4a, C5.2 e SKBr3, que expressam diferentes níveis de ERBB2. Avaliou-se também o perfil de expressão destes transcritos após a supressão do ERBB2 pela técnica de siRNA nas células C5.2. O tratamento com EGF modulou de forma diferente a expressão dos genes estudados nas células HB4a, C5.2 e SKBr3. Nas células HB4a e SKBr3 a HRG também regulou a expressão dos genes acima. Após a transfecção das células C5.2 com siERBB2 houve alteração na expressão dos genes ATAD4, NDRG1, ACTN1, SPARC, MATR3, CENPH e TPM1. / The more frequent genic amplification observed in breast cancer is that of the ERBB2 oncogene, which occurs in approximately 30% of the breast cancers, and is associated with lower disease-free interval and survival of all patients with breast cancer. The ERBB-2 protein activates important cell signaling pathways such as MAPK and PI3K. Using real time PCR, it was investigated the effect of EGF and HRG on ANP32B, MATR3, ATAD4, NDRG1, ACTN1, SPARC, TPM1 and CENPH transcripts regulation in the HB4a, C5.2 and SKBr3 cell, that express different levels of ERBB2. It was also evaluated the expression profile of these transcripts in the C5.2 cell line after the suppression of ERBB2 expression by the siRNA technique. The treatments with EGF modulate differently the expression of the analysed transcripts in HB4a, C5.2 and SKBr3 cells. In HB4a and SKBr3 cells the treatments with HRG also modulate the expression of the transcripts above. The C5.2 cells transfected with siERBB2 showed alteration in the expression of ATAD4, NDRG1, ACTN1, SPARC, MATR3, CENPH and TPM1 transcripts.