Orientador: Zanoni Dias / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Computação / Made available in DSpace on 2018-08-17T08:10:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Baudet_Christian_D.pdf: 3490604 bytes, checksum: 7f0a8868574d06e11524e5a5de9d1fd0 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O estudo de rearranjo de genomas tem o objetivo de auxiliar o entendimento da evolução. Através da análise dos eventos de mutação como inversões, transposições, fissões, fusões, entre outros, buscamos compreender as suas influências sobre o fenômeno da diferenciação das espécies. Dentro deste contexto, esta tese ataca dois temas distintos: a Enumeração de Traces e a Identificação de Breakpoints. Os algoritmos de ordenação de permutações por reversões orientadas produzem uma única solução ótima enquanto o conjunto de soluções é imenso. A enumeração de traces de soluções para este problema oferece um modo mais compacto de representar o conjunto completo de soluções ótimas. Dessa maneira, esta técnica fornece aos biólogos a possibilidade de análise de diversos cenários evolutivos. Neste trabalho, realizamos um estudo para melhora da eficiência do algoritmo de enumeração através da adoção de uma estrutura de dados mais simples. Devido ao caráter exponencial do problema, grandes permutações não podem ser processadas em um tempo satisfatório. Assim, com o objetivo de produzir cenários evolucionários alternativos para grandes permutações, propomos e avaliamos estratégias para a enumeração parcial de traces. Os pontos de quebra (ou breakpoints) são regiões que delimitam os segmentos conservados existentes nos cromossomos e denotam a ocorrência de rearranjos evolutivos. As técnicas de identificação de breakpoints têm a função de identificar tais pontos nas sequências dos cromossomos. Nesta tese, implementamos um método de detecção e refinamento de pontos de quebra proposto na literatura e o disponibilizamos como um pacote que pode ser utilizado por outros pesquisadores. Além disso, introduzimos uma nova metodologia de identificação de breakpoints baseada na análise da cobertura de hits observada nos alinhamentos de sequências intergênicas, provenientes dos genomas das espécies comparadas / Abstract: The study of genome rearrangements helps biologists understand the evolution of species. The species differentiation phenomenon are derived by analyzing mutational events (inversions, transpositions, fissions, fusions, etc) and their effects. In this context, this work aims the study of two different subjects: Traces Enumeration and Breakpoint Identification. Algorithms that solve the problem of sorting oriented permutations through reversals output only one optimal solution, although the set of solutions can be huge. The enumeration of traces of solutions for this problem allows a compact representation of the set of all optimal solutions which sort a permutation. By using this technique, biologists can study many evolutionary scenarios. We carried out a study to improve the efficiency of the enumeration algorithm by adopting a simple data structure. Due to the exponential nature of the problem, large permutations cannot be processed at a satisfactory time. Thus, in order to produce alternative evolutionary scenarios for large permutations, we proposed and evaluated strategies for partial enumeration of traces. Breakpoints are regions that border conserved segments in the chromosomes and reflect the occurrence of evolutionary rearrangements. The techniques for breakpoint identification are meant to identify such points in the chromosome sequences. In this work, we implemented a method proposed in the literature, that performs detection and refinement of breakpoints. The implementation is available as a package to other researchers. Additionally, we introduced a new methodology for breakpoint identification based on the analysis of the hit coverage observed in the alignments of intergenic sequences / Doutorado / Ciência da Computação / Doutor em Ciência da Computação

Orientadores: Ana Maria Lima de Azeredo-Espin, Ana Claudia Lessinger / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T23:15:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_MarcosTuliode_M.pdf: 4922399 bytes, checksum: 9af5c489b44982daee534a4e0f7e937c (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: o DNA mitocondrial (DNAmt) dos metazoários possui uma série de características, tais como organização circular, simples e compacta, conteúdo gênico conservado, herança predominantemente materna e ausência ou baixa taxa de eventos de recombinação, que fazem com que este genoma seja amplamente usado em diversos estudos evolutivos. Geralmente, o DNAmt animal possui 37 genes (13 codificadores de proteínas, 22 para RNAt e 2 para RNAr) e uma principal região não-codificadora, a região-controle. O objetivo do projeto foi o seqüenciamento e a caracterização estrutural e evolutiva de regiões gênicas e do genoma mitocondrial de espécies da família Muscidae (Diptera: Calyptratae), incluindo a mosca-dos chifres, Haematobia irritans, a mosca doméstica, Mosca domestica, a mosca menor das frutas, Atherigona orientalis, "the black dump fly", Ophyra aenescens, e a mosca-dos-estábulos, Stomoxys calcitrans. A estrutura da tese foi dividida em quatro capítulos. No primeiro capítulo, a seqüência completa do gene da subunidade I da cito cromo oxidase c (COI) foi caracterizada. COI é o gene mais seqüenciado entre os insetos e tem sido usado em diversos estudos evolutivos e taxonômicos. Este gene mostrou-se estruturalmente semelhante aos demais dípteros, incluindo o uso de um códon de iniciação não usual, TCG (serina). O segundo capítulo descreve um novo conjunto de oligonucleotídeos iniciadores que ajudou a amplificar e seqüenciar regiões do DNAmt de vários dípteros onde há alta chance de ocorrer rearranjos e/ou duplicações (regiões de "hot spots" ou "instabilidade estrutural" no DNAmt de artrópodes, que incluem a região-controle e agrupamentos de RNAt). O terceiro capítulo descreve a seqüência completa da região-controle de H. irritans, M domestica e A. orientalis, define padrões evolutivo-estruturais para moscas da subordem Brachycera e sugere a atuação de elementos cis-regulatórios no controle da replicação e transcrição do DNAmt de insetos. Ao tentar acessar a região-controle de O. aenescens e S. calcitrans, foi evidenciado um possível evento de rearranjo e/ou duplicação no genoma mitocondrial destas espécies envolvendo os genes que flanqueiam a região-controle. O quarto capítulo descreve uma análise comparativa entre os genomas mitocondriais de H. irritans (16078bp) e S. calcitrans (18Kb). Um conjunto de estratégias, incluindo amplificação via LongPCR, construção de bibliotecas de "shotgun", montagem, anotação e análises estruturais utilizando recursos de bioinformática, foi otimizada durante este trabalho. Os genomas mitocondriais de H. irritans e S. calcitrans possuem conteúdo e organização gênicos conservados, considerando-se o modelo ancestral proposto para artrópodes, exceto pela regiãocontrole de S. calcitrans (2,5Kb), que teve 60% de sua seqüência caracterizada, suficientes para indicar a ocorrência de duplicação gênica envolvendo elementos internos da região-controle e o gene de RNAt para isoleucina (I). A duplicação de 1 no DNAmt de S. calcitrans é muito semelhante a que ocorre no DNAmt de espécies de Chrysomya (Diptera: Calliphoridae), reforçando que esta região é um "hot spot" de duplicação no genoma mitocondrial de dípteros. Uma árvore filogenética usando os genes codificadores de proteínas foi inferida para a ordem Diptera e o resultado difere da filogenia tradicional proposta para o grupo / Abstract: The mitochondrial DNA (mtDNA) of Metazoan has features, such as circular, simple and compact organization, conserved gene content, predominantly maternal inheritance, and lack or low rate of recombination, which have made this genome widely used in a range of evolutionary studies. In general, animal mtDNA presents 37 genes (13 protein-coding genes, 22 genes for tRNA and 2 for rRNA) and a major non-coding region, the control region. The aim ofthis project was the sequencing and the structural and evolutionary characterization of gene regions and the mitochondrial genome of species from family Muscidae (Diptera: Calyptratae): the horn fly, Haematobia irritans; the house fly, Musca domestica; the pepper fruitfly, Atherigona orientalis; the black dump fly, Ophyra aenescens; and the stable fly, Stomoxys calcitrans. The structure of the thesis was divided in four chapters. In the first chapter, the complete sequence of the cytochrome c oxidase subunit I (COI) gene was characterized. COI is the most sequenced gene in insects and have been used in a wide range of evolutionary and taxonomic studies. This gene in Muscidae showed a structure similar to other dipterans, including the use of an uncommon start codon, TCG (serine). The second chapter describes a new set of primers that improved the amplification and sequencing of regions from many dipterans mtDNA in which there is a high probability of rearrangements andlor duplications occur (regions involved in structural "hot spots", including the control region and tRNA clusters). The third chapter describes the complete sequence of H. irritans, M domestica and A. orientalis, defines evolutionary and structural patterns for Brachyceran flies and suggests cis-regulatory elements for the mtDNA repÍication and transcription control in insects. Trying to access the control region of O. aenescens and S. calcitrans, a possible event of rearrangement andlor duplication in the mitochondrial genome of these species was evidenced involving the control region flanking genes. The fourth chapter describes a comparative analysis of H. irritans (l6078bp) and S. calcitrans (-18Kb) mitochondrial genomes. A set of strategies, including the amplification via Long-PCR, construction of a shotgun library, assemblage, annotation and structural analysis using bioinformatic tools, was optimized in this work. The mitochondrial genomes of H. irritans and S. calcitrans showed gene content and organization conserved regarding the ancestral model proposed to arthropods, except for S. calcitrans control region (-2.5Kb), which had 60% of its sequence characterized. This characterization indicated the occurrence of duplicated regions involving control region nternal elements and the tRNAgene for isoleucine (I). The duplication of 1 is very similar to that of Chrysomya (Diptera: Calliphoridae) mtDNA, reinforcing that this region is a duplication hot spot in the mitochondrial genome of dipterans. A phylogenetic tree using the protein-coding genes was inferred for the Diptera order and the results differ from the traditional phylogeny proposed for the grou / Mestrado / Genetica Animal e Evolução / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Ana Maria Lima de Azeredo-Espin, Claudia Augusta de Moraes Russo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T11:33:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Junqueira_AnaCarolinaMartins_D.pdf: 11103944 bytes, checksum: 9e7bb5e64272846641444a5fa3b833b0 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: O DNA mitocondrial (mtDNA) de três espécies da família Calliphoridae foi completamente sequenciado, apresentando 15004 pb em Chloroprocta idioidea, 16143 pb em Calliphora vomitoria e 16635 pb em Phormia regina. Os três genomas mitocondriais apresentaram a ordem gênica ancestral de Pancrustacea, contendo 13 genes codificadores de proteínas (GCPs), duas subunidades de RNA ribossomal e vinte e dois RNAs transportadores (tRNAs). No entanto, P. regina apresentou uma duplicação envolvendo a sequência completa dos genes de tRNAIle e tRNAGln, além da sequência parcial do tRNAMet. Uma duplicação similar foi previamente descrita para espécies do gênero Chrysomya na mesma localização, inserida no domínio hipervariável da região controle do mtDNA. A composição de nucleotídeos dos mtDNAs sequenciados mostrou um alto viés de bases A e T (71.7% em C. idioidea, 72.9% em C. vomitoria e 75.6% em P.regina), principalemente nas terceiras posições do códon e regiões não-codificadoras, onde o conteúdo A+T é >90%. As reconstruções filogenéticas foram conduzidas com todas as espécies de dípteros com mtDNAs completos, cosistindo no estudo mais amplo com sequências de mtDNA da ordem Diptera. O emprego de genes individuais para a reconstrução de filogenias resultou em topologias variadas com baixo suporte, enquanto o uso de sequências concatenadas de nucleotídeos e aminoácidos dos GCPs mostrou resolução para as relações internas de Diptera. A monofilia de Muscomorpha não obteve suporte nas análises apresentadas neste trabalho, assim como a de Acalyptratae. A família Calliphoridae foi recuperada como monofilética, mas as relações internas de Oestroidea recuperaram espécies de Muscoidea como um grupo irmão de Calliphoridae. As relações entre as subfamílias de Calliphoridae indicaram que Luciliinae e Calliphorinae são grupos irmãos, relacionados a Chrysomyinae. Devido à importância médica, veterinária, sanitária, econômica e forense da família Calliphoridae, o esclarecimento das relações evolutivas desta família é interessante para guiar futuros estudos acerca da evolução do parasitismo e do hábito de causar miíases, além de contribuir para o diagnóstico espécie-específico. Além disso, a caracterização de genomas mitocondriais completos também pode contribuir na resolução de filogenias da ordem Diptera e estudos em evolução molecular e divergências antigas de insetos. / Abstract: In this study, we present the complete mitochondrial DNA (mtDNA) sequence of three Calliphoridae (Diptera: Brachycera) species: Chloroprocta idioidea, Calliphora vomitoria and Phormia regina, which had 15004, 16143 and 16635 bp, respectively. Each genome was arranged in the same order described for insects and crustaceans, containing 13 protein coding genes (PCGs), two ribossomal RNA subunits (rRNA) and twenty-two transfer RNA (tRNA), with the exception of P. regina, which presented a duplication involving the complete sequences of tRNAIle and tRNAGln genes, besides a partial sequence of the tRNAMet. A similar duplication has been previously described for Chrysomya species in the same location, inserted in the hypervariable domain of the mitochondrial control region. The nucleotide composition was heavily biased toward As and Ts (71.7% for C. idioidea, 72.9% for C. vomitoria and 75.6% for P.regina), mainly when considering third codon positions and non-coding regions, where the A+T content was >90%. The phylogenetic reconstructions were conducted for all available dipteran species in GenBank, this being the most comprehensive study carried out so far with complete mitochondrial genome sequences. The use of single genes has shown that different topologies were obtained with low support, whereas the use of nucleotide and amino-acid data sets with concatenated PCGs usually provided resolution for intraordinal relationships in Diptera. The monophyly of Muscomorpha was not supported in our analyses, as well as the monophyly of Acalyptratae, which is a major clade of Schizophora. The Calliphoridae was a monophyletic family, but the superfamily Oestroidea was disrupted by the inclusion of Muscoidea species as a sister group of Calliphoridae. Within Calliphoridae, the subfamilies Luciliinae and Calliphorinae were clustered together, related to the Chrysomyinae subfamily. In view of its sanitary, medical, economic and forensic importance, knowledge of Calliphoridae relationships is of interest to guide future works on parasitism evolution of the myiasis habit and specific molecular diagnosis of species. In addition, the characterization of complete mitochondrial sequences could provide insights with regard to dipteran relationships and general molecular evolutionary studies on deep-level phylogenies of insects. / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Ana Maria Lima de Azeredo-Espin / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T14:57:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Duarte_GustavoTurqueto_M.pdf: 29004339 bytes, checksum: 8f4329468621fc63871c823f6f4664b1 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: As espécies da família Calliproridae, conhecidas como moscas varejeiras, apresentam ampla distribuição geográfica no Velho e Novo Mundo. Por serem causadores de miíases e vetores de doenças, muitas espécies possuem hábito sinantrópico, importância econômica, médico-sanitária e forense. Enquanto algumas espécies são pragas da pecuária e acarretam grande prejuízo econômico devido às infestações, outras são importantes para a entomologia forense, auxiliando na investigação de crimes e questões médico-legais. Neste contexto, os marcadores moleculares têm sido de grande valia para estudos genéticos relacionados à família Calliphoridae, sendo utilizados em estudos populacionais, evolutivos e biogeográficos, complementando análises ecológicas e sistemáticas. Dentre os marcadores moleculares, o DNA mitocondrial (DNAmt) tem mostrado potencial para estudos evolutivos relacionados à família Calliphoridae, devido a várias características, tais como: possuir uma estrutura genética simples, geralmente não apresentando íntrons, DNA repetitivo, elementos transponíveis e pseudogenes; exibir uma forma de transmissão predominantemente linear (herança materna); grande número de cópias e, finalmente, por apresentar maior taxa de substituição nucleotídica, quando comparada ao DNA nuclear. Na maioria das espécies animais, o DNAmt possui cerca de 16-20kb e apresenta 37 genes, dos quais 13 são codificadores de proteínas, 2 de subunidades ribossomais (rRNAs) e 22 de tRNAs. Neste genoma, a maior porção não codificadora é chamada região controle (RC), ou A+T em insetos, por ser rica nesses dois nucleotídeos. Bridências experimentais com insetos, crustáceos e vertebrados sugerem que essa região esteja relacionada à replicação e transcrição do genoma mitocondrial. Eventos de rearranjos gênicos envolvendo a região controle e os tRNAs adjacentes são relativamente freqüentes em insetos. Recentemente uma duplicação do gene para tRNA de isoleucina (tRNAIle) foi descrita em três espécies do gênero Chrysomya, não sendo encontrada nas demais espécies de Calliphoridae estudadas até então, sugerindo que a duplicação poderia ter se originado num evento evolutivo anterior à diversificação desse gênero e que seria um marcador molecular eficiente para sua identificação. Dessa forma, com o intuito de caracterizar a região controle do DNAmt m família Calliphoridae bem como a duplicação do tRNAIle, 15 espécies pertencentes a sete gêneros desta família foram analisadas. Nos califorídeos estudados, a região controle apresentou-se dividida em dois domínios com característica distintas: um conservado, devido à presença de blocos de seqüê ncia conservados além de estruturas conservadas em vários grupos de insetos, que podem estar relacionadas à replicação e transcrição do DNAmt; e um domínio variável, tanto em tamanho quanto em seqüência. Enquanto o domínio conservado apresentou potencial para estudos filogenéticos, o domínio variável apresentou características interessantes para estudos com estrutura de populações. A caracterização da RC de califorídeos também permitiu a identificação da duplicação do tRNAIle em outras duas espécies de Chrysomya, além de uma espécie do gênero Calliphora. Um segundo tipo de duplicação, envolvendo os tRNAIle e tRNAGln, foi identificada na espécie do gênero Phormia. Os dados sugerem que o domínio variável da região controle possa atuar como um "hot spot" para eventos de rearranjo. Para a avaliação do potencial para estudos filogenéticos do domínio conservado, foram analisadas as seqüências desse domínio da região controle de 26 indivíduos pertencentes a 18 espécies de califorídeos. Os resultados dão suporte à monofilia dás três subfamílias estudadas (Chrysomyinae, Luciliinae e Calliphorinae) corroborando estudos morfológicos e moleculares realizados previamente em Calliphoridae. Além disso, o domínio conservado da região controle mostrou-se um marcador eficiente para a identificação de espécies de califorídeos, mesmo quando espécies semelhantes morfologicamente foram comparadas. Os resultados obtidos indicam um potencial dessa região do genoma mitocondrial tanto para estudo com taxa com divergência recente como para o diagnóstico de espéciés de importância forense / Abstract: The species of family Calliphoridae, known as blowflies, present wide geographic distribution throughout Old and New World and many have synantropic habit, being of economic, medical, sanitary and forensic importance for causing myiasis and for being vectors of diseases. While some species are parasites of livestock and causes great economic prejudices, others are important for forensic entomology, helping in legal investigations. Molecular markers are providing valuable results on genetic-evolutive studies related to the family Calliphoridae, been used in population structure, evolutive and biogeographic studies, complementing ecological md systematic analyses. Among the molecular markers, the mitochondrial DNA have shown a great potential for evolutive studies related to family Calliphoridae, being many the features that make it a rich source of genotypic characters: simple genetic structure, which usually lacks introns, transposable elements and pseudogenes; its predominant1y maternal inheritance; high copy number and its higher rate of nucleotide substitution compared to nuclear DNA. In most animal species, mtDNA is a circular, double-stranded 16-20 kb molecule that generally contains 37 genes, being 13 protein-coding genes, two genes for subunits of ribosomal RNA (rRNA) and 22 transfer RNA (tRNA) genes. Within this genome, the major non-coding region is known as control region, or A+T region in insects for being rich in these nucleotides. Experimental evidences with insects, crustaceans and vertebrates suggest that this region is related to the replication and transcription of the mitochondrial genome. Rearrangements events involving the control region and its flanking tRNAs may be frequent in insects. In recent works, an isoleucine tRNA gene (tRNAIle) duplication was reported for three Chrysomya species, not been identified in the other calliphorids species studied so far, suggesting that the duplication may have occurred before the diversification of this genus and that it would be an efficient marker for its identification. Therefore, intending to characterize the control region of mitochondrial DNA in family Calliphoridae just as the tRNAIle duplication, 15 species belonging to seven genera of this family were analyzed. In the studied calliphorids, two domains were recognized in the control region: a conserved domain with conserved sequence blocks and conserved structures also identified in other insect groups, which relates the control region to the replication and transcription of mitochondrial DNA; and a variable domain that varies markedly in sequence and length Whereas the conserved domain has shown a potential for phylogenetic stud ies, the variable domain has interesting features for population studies. The characterization of the control region in various calliphorids species also showed the presence of the duplication of the tRNAIle in two other species of Chrysomya and in a species of genus Calliphora. A different duplication, involving the tRNAIle and tRNAGln, was identified in the species of genus Phormia. The present data suggests that the variable domain of the contraI region may act as a hot spot for rearrangement events. For evaluating the potential of the conserved domain for . phylogenetic studies, sequences of this domain were analyzed for 26 specimens belonging to 18 calliphorid species. The results supports the monophyly of the three subfamilies studied (Chrysomyinae, Luciliinae and Calliphorinae), corroborating previous morphologic and molecular studies. Moreover, the cohserved domain of control region showed to be I useful for calliphorids species identification, even when morphologic similar species were compared. The data reveals a potential of this region of the mitochondrial genome for studies with recent diverged taxa and also for the diagnosis of species with forensic importance / Mestrado / Genetica Animal e Evolução / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Os microRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não codificadores de proteínas presentes na maioria dos eucariotos. Esses RNAs regulam a expressão gênica em nível pós-transcricional através do silenciamento de mRNAs-alvo que possuem sítios complementares às suas sequências, atuando em praticamente todos os processos celulares. Embora a estrutura e função dos miRNAs estejam bem caracterizadas, aspectos relacionados à sua organização genômica, evolução e atuação em doenças são tópicos que apresentam enormes lacunas. Nesta tese, utilizamos abordagens computacionais para investigar estes temas em três trabalhos. No primeiro, processamos e integramos um vasto volume de dados publicamente disponíveis referentes aos miRNAs e genes codificadores de proteínas para cinco espécies de vertebrados. Com isso, construimos uma ferramenta web que permite a fácil inspeção da organização genômica dos miRNAs em regiões inter e intragênicas, o acesso a dados de expressão de miRNAs e de genes codificadores de proteínas (classificados em genes hospedeiros e não hospedeiros de miRNAs), além de outras informações pertinentes. Verificamos que a ferramenta tem sido amplamente utilizada pela comunidade científica e acreditamos que ela possa facilitar a geração de hipóteses associadas à regulação dos miRNAs, principalmente quando estão inseridos em genes hospedeiros. No segundo estudo, buscamos compreender como o contexto genômico e a origem evolutiva dos genes hospedeiros influenciam a expressão e evolução dos miRNAs humanos. Nossos achados mostraram que os miRNAs intragênicos surgem preferencialmente em genes antigos (origem anterior à divergência de vertebrados). Observamos que os miRNAs inseridos em genes antigos têm maior abrangência de expressão do que os inseridos em genes novos. Surpreendentemente, miRNAs jovens localizados em genes antigos são expressos em um maior número de tecidos do que os intergênicos de mesma idade, sugerindo uma vantagem adaptativa inicial que pode estar relacionada com o controle da expressão dos genes hospedeiros, e como consequência, expondo-os a contextos celulares e conjuntos de alvos diversos. Na evolução a longo prazo, vimos que genes antigos conferem maior restrição nos padrões de expressão (menor divergência de expressão) para miRNAs intragênicos, quando comparados aos intergênicos. Também mostramos possíveis associações funcionais relacionadas ao contexto genômico, tais como o enriquecimento da expressão de miRNAs intergênicos em testículo e dos intragênicos em tecidos neurais. Propomos que o contexto genômico e a idade dos genes hospedeiros são fatores-chave para a evolução e expressão dos miRNAs. Por fim, buscamos estabelecer associações entre a expressão diferencial de miRNAs e a quimioresistência em câncer colorretal utilizando linhagens celulares sensíveis e resistentes às drogas 5-Fluoruracil e Oxaliplatina. Dentre os miRNAs identificados, o miR-342 apresentou níveis elevados de expressão nas linhagens sensíveis à Oxaliplatina. Com base na análise dos alvos preditos, detectamos uma significativa associação de miR-342 com a apoptose. A superexpressão de miR-342 na linhagem resistente SW620 evidenciou alterações na expressão de genes da via apoptótica, notavelmente a diminuição da expressão do fator de crescimento PDGFB, um alvo predito possivelmente sujeito à regulação direta pelo miR-342. / MicroRNAs (miRNAs) are short non-coding RNAs found in most eukaryotic species. These RNAs regulate gene expression at post-transcriptional level by silencing target mRNAs through base-pairing of complementary sequences, thus acting on virtually all cellular processes. Although the structure and function of miRNAs are well understood, several aspects related to their genomic organization, evolution and involvement with diseases are largely underexplored. In this thesis, we employed computational methods to investigate such issues in three different studies. In the first one, we have processed and integrated a large amount of public data related to miRNAs and coding genes for five vertebrate species. Then, we developed a webtool to allow the analysis of the miRNA genomic context in inter and intragenic regions, the access of miRNA and gene expression data (classified as host and non-host genes), as well as other relevant information. We noticed that the webtool has been largely used by the scientific community, and we believe that it can facilitate hypothesis generation related to miRNA regulation, especially when they are within host genes. In the following study, we sought to understand how the genomic context and the evolutionary origin of host genes can affect the expression and evolution of human miRNAs. Our findings showed that intragenic miRNAs are preferentially embedded within old host genes (originated before the split of vertebrates). We observed that miRNAs within old genes are more broadly expressed than those within young genes. Surprisingly, young miRNAs within old genes were expressed in more tissues than their intergenic counterparts, suggesting an initial adaptive advantage which might be related to their hosts expression control, and as a consequence, exposing them to a more diverse cellular contexts and target genes. In the long run, we found that old host genes lead to expression constraints (lower expression divergence) between species for intragenic miRNAs, in respect to intergenic ones. We also showed possible functional associations related to miRNA genomic context, such as the enrichment of young intergenic miRNAs in testis, while young intragenic miRNAs were enriched in neural tissues. Thus, we propose that the genomic context and the age of the host genes are key factors in shaping the expression and evolution of miRNAs. Finally, we sought to establish associations between differential expression of miRNAs and chemoresistance in colorectal cancer using resistant and sensitive cell lines to 5-Fluoruracil and Oxaliplatin. Among differentially expressed miRNAs, miR-342 was highly expressed in sensitive cell lines to Oxaliplatin. Based on target prediction analysis, miR-342 is likely associated with apoptosis. The induced overexpression of miR-342 in SW620, a cell line resistant to Oxaliplatin, changed the expression levels of genes linked to the apoptosis pathway, notably the downregulation of PDGFB growth factor, which is a predicted target possibly subjected to direct regulation by miR-342.

O presente trabalho visa compreender o processo de degradação da parede celular vegetal de hospedeiros de fitopatógenos da família Xanthomonadaceae. Criamos e aperfeiçoamos uma técnica de enumeração dos genes relacionados ao metabolismo de polissacarídeos, com enfoque na distinção entre aqueles que agem sobre os componentes da parede celular vegetal e sobre outros polissacarídeos. A história evolutiva desse conjunto de enzimas foi delineada através de inferências sobre as relações de homologia entre os genes enumerados, sua presença ou ausência nos diversos genomas abordados e comparação das taxas de mutação entre grupos de homólogos. Além disso, procuramos também, com essa etapa de bioinformática e a etapa seguinte, incrementar a anotação desses genes, muitos descritos como hipotéticos ou com vaga definição de sua função. Na segunda parte do desenvolvimento do projeto foram feitos experimentos de expressão heteróloga e verificação da atividade enzimática para validação da anotação de alguns dos genes identificados. / This study aims to understand the process of degradation of host plant cell walls by plant pathogens of the Xanthomonadaceae family. We created and perfected a technique for enumeration of genes related to the metabolism of polysaccharides, focusing on the distinction between those who act on components of plant cell wall and on other polysaccharides. The evolutionary history of this group of enzymes has been outlined through inferences about the relations of homology between the genes listed, their presence or absence in different genomes and comparison of mutation rates between groups of homologues. Moreover, we also attempted with this bioinformatics step and the next step, to enhance the annotation of these genes, many described as hypothetical or vague in the determination of its function. In the second part of the project development heterologous expression and enzymatic activity assays were made to validate the annotation of some of the genes identified.

Orientador: Claudia Marcia Aparecida Carareto / Banca: Cristina Vieira / Banca: Douglas Silva Domingues / Resumo: Três modelos têm sido propostos para explicar o modo de expansão dos elementos de transposição nos genomas - master gene, transposon e intermediário. O modelo master gene aplica-se à situação em que existe apenas uma única sequência ativa, de uma subfamília particular, que dá origem às demais sequências, as quais não apresentam capacidade de mobilização, enquanto o modelo transposon assume que todas as sequências de uma subfamília são ativas. Por outro lado, o modelo intermediário, considera que algumas cópias apresentam capacidade de mobilização e outras permanecem inativas. Os modelos propostos podem ser relacionados aos mecanismos de transposição, copy-and-paste e cut-and-paste, característicos das classes de elementos transponíveis I e II, respectivamente. Contudo, os estudos de dispersão intragenômica se concentram em elementos da classe I sem LTRs. Com o objetivo de ampliar o entendimento da dinâmica de dispersão genômica dos elementos de transposição e buscando verificar se os modelos propostos para a dispersão dos retroposons ajustam-se aos transposons e aos retrotransposons, foram analisados o transposon Bari e o retrotransposon 412 no genoma das espécies do grupo melanogaster de Drosophila e em populações naturais de D. melanogaster e D. simulans. Assim, buscas por seqüência similares a ambos os elementos selecionados foram realizadas nos genomas seqüenciados de seis espécies do grupo melanogaster; bem como, foram amplificadas, clonadas e sequenciadas cópias presentes nas populações naturais de ambas as espécies. Foram reconstruídas as relações evolutivas entre as sequências dos genomas, como também entre aquelas das populações naturais por meio do programa Network, utilizando o algoritmo Median Joining. Nossos resultados indicam a ausência de um modelo único de dispersão para ambos os elementos... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Three models have been proposed to explain the expansion of transposable elements within genomes - master gene, transposon and intermediate. The master gene model applies to situations in which there is only one active sequence of a particular subfamily, which gives rise to other sequences which have no capacity for mobilization, while the transposon model assumes that all sequences of a subfamily are active. On the other hand, the intermediate model considers that some copies have the capacity for mobilization and others remain inactive. The proposed models can be related to mechanisms of transposition, copy-and-paste and cut-and-paste, characteristic of class I and II of transposable elements, respectively. However, studies of intragenomic dispersion concentrate on elements of the class I without LTRs. Aiming at enhancing the understanding of the transposable elements genomic dynamics of dispersion and trying to verify whether the proposed models for dispersion of retroposons fit to transposons and retrotransposons, we analyzed the retrotransposon 412 and Bari transposon in the genome of the species melanogaster group of Drosophila and in natural populations of D. melanogaster and D. simulans. Thus, searches for sequences similar to both elements were done in the sequenced genomes of six species of the melanogaster group; as well as copies present in natural populations of both species were amplified, cloned and sequenced. We reconstructed the evolutionary relationships between the sequences of the genomes, as well as those amplified from samples of wild populations through the Network program, using the Median Joining algorithm. Our results indicate the absence of a single model of dispersion for both transposable elements, Bari and 412, in the different species analyzed, as well as in the populations of both species... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A recombinação durante a transcrição reversa é um fator importante no aumento da diversidade genética e adaptação do HIV-1, permitindo que mutações vantajosas presentes em diferentes linhagens sejam combinadas em um mesmo genoma. No Brasil, vários recombinantes foram descritos e seis formas recombinantes circulantes (CRFs) já foram identificados, demonstrando a relevância destes recombinantes na epidemia brasileira. Portanto, um dos objetivos desta tese foi analisar os dados gerados pela Rede de Diversidade Genética Viral (VGDN) (sequências parciais de gag, pol e env), a fim de identificar recombinantes inter-subtipos de HIV-1 e avaliar a frequência e distribuição geográfica destes vírus. Utilizando diferentes técnicas foram identificados 152/1083 pacientes portadores de recombinantes BF. A frequência destes recombinantes foi maior em cidades como São Vicente (30%) e Sorocaba (22,6%), sendo que os recombinantes circulantes em São Vicente foram geralmente relacionados às CRF28 e CRF29, enquanto que os vírus presentes na região de Sorocaba comumente apresentam um envelope subtipo F1, independente do subtipo nos demais genes. Além disso, o gene da integrase de 159 pacientes foi amplificado e sequenciado. A análise deste gene revelou mais 10 pacientes infectados com recombinantes BF e nenhuma mutação de resistência primária aos inibidores da integrase foi encontrada. O segundo objetivo foi isolar e caracterizar recombinantes BF in vitro. O isolamento viral foi realizado por co-cultivo e ao final foram obtidos 10 isolados primários. O sequenciamento do genoma quase completo desses dez isolados primários revelou que três isolados primários pertencem ao grupo da CRF28_BF, três ao grupo da CRF29_BF e quatro foram classificados como formas recombinantes únicas (URFs). Ainda, o uso de correceptores desses isolados foi avaliado in vitro em ensaios com as células GHOST(3), e revelou três duplo-trópicos (X4/R5) vírus, quatro CXCR4 (X4) e três isolados utilizaram apenas CCR5 (R5). Em suma, uma alta frequência de URFs foi encontrada em algumas cidades do Estado de São Paulo, e também foi desenvolvido e caracterizado um painel de isolados primários representando as CRF28_BF, CRF29_BF e algumas URFs. / Recombination during reverse transcription is an important factor promoting HIV-1 diversity and adaptive change, allowing advantageous mutations arising on different genomes to undergo linkage in the same progeny recombinant genome more frequently than what would be expected under random mutation alone. In Brazil, several recombinant viruses were reported, and six circulating recombinant forms (CRFs) have already been identified. Therefore, the first objective of this Thesis was to analyze the data generated by the Viral Genetic Diversity Network (VGDN) (gag, pol and env partial sequences), in order to identify HIV-1 intersubtype recombinants and evaluate the frequency and geographical distribution of these viruses. Using different techniques we identified 152/1083 patients harboring BF recombinants. The frequency of these recombinants was higher in cities like São Vicente (30%) and Sorocaba (22.6 %). The recombinant viruses circulating in São Vicente were generally related to CRF28 and CRF29, while those viruses circulating in Sorocaba commonly presented an envelope region of subtype F1, irrespective the subtype composition on the remaining genes. Additionally, the integrase gene of HIV-1 from 159 patients was further amplified and sequenced. The analysis of this viral gene revealed ten more patients infected with BF recombinants and no primary mutations related to integrase inhibitor resistance were found. The second objective was to isolate and characterize BF recombinants in vitro, which resulted in ten primary HIV-1 isolates. The near full-length genomes of these ten primary isolates revealed that three were related to CRF28_BF, three to CRF29_BF and four were unique recombinant forms (URFs), according to their breakpoints profile determined with the jpHMM program. Additionally, the coreceptor usage of these isolate was investigated in vitro using GHOST assays, which revealed three dual-tropic (X4/R5) viruses, four CXCR4 (X4) viruses and three CCR5 (R5) viruses. In sum, we report a high frequency of URFs in some cities of São Paulo State, and also developed a well-characterized panel of viruses representing CRF28_BF, CRF29_BF and URFs.

O Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus é usado como agente de controle biológico da lagarta-da-soja (Anticarsia gemmatalis), e representa o bioinseticida viral mais amplamente utilizado no mundo. Sabendo-se que as populações selvagens de baculovírus são geneticamente heterogêneas, este trabalho avaliou a diversidade genômica de 17 isolados selvagens de AgMNPV, coletados no Brasil, Argentina e Uruguai, entre 1980 e 1990. Os genótipos reconstruídos evidenciam a conservação da colinearidade genômica durante a evolução de AgMNPV, porém, deleções e inserções de uma ou mais bases foram comuns. Um novo gene com possível origem em lepidóptero foi identificado em dois genótipos; e o gene bro-a está ausente em muitos isolados. Análises de diversidade genética apontaram que a maioria dos genes de AgMNPV é pouco variável, e os genes mais diversos estão em loci variáveis específicos. Os resultados obtidos reforçam a percepção de que grandes vírus de DNA evoluem principalmente sob baixas taxas de substituição, e por meio de duplicações, ganhos e perdas gênicas. / The Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus is employed as a biological control agent against velvetbean caterpillar (Anticarsia gemmatalis), and represents the most widely used viral bioinseticide in the world. Since baculovirus wild populations are genetically heterogeneous, this work evaluated the genomic diversity of 17 AgMNPV geographic isolates obtained from 1980 to 1990, in the Brazil, Argentina and Uruguay. The genotypes reconstructed evidenced the highly genomic colinearity conservation during AgMNPV evolutionary history, however, deletions and insertions of one or more bases were common. A new gene with possible lepidopteran origin was identified in two genotypes; and the gene bro-a is absence in many isolates. Genetic diversity analyses pointed that most AgMNPV genes shows little variation, and the highly diverse genes are in specific variable loci. The obtained results reinforce the perception that large DNA virus evolve mainly under low rates of substitution, and through gene duplications, gain and loss.

Os vírus Influenza A infectam um largo espectro de hospedeiros e causam epidemias anuais. São vírus com alta variabilidade genética e RNA segmentado, que podem sofrer rearranjos entre os genes de diferentes vírus. Em 2006, foram analisadas 521 amostras de crianças menores de 5 anos atendidas no HU-USP e 25 foram positivas para Influenza A, sendo H3N2 o mais prevalente (68%). Cinco genes de 18 amostras foram seqüenciados e obtivemos 13 sequencias de HA, 12 da NP, 12 de NA, 14 da M e 10 da NS. Verificou-se a presença de várias mutações, especialmente na HA e NA, que favoreceram a substituição da cepa vacinal naquele ano. Todas as amostras H3N2 apresentaram sítios de resistências aos inibidores da M2. Diferentes linhagens circularam no mesmo ano, tanto de H1 como de H3, favorecendo rearranjos entre elas. Foram verificados, também rearranjos envolvendo os genes da HA e NP, indicando o complexo mecanismo de evolução desses vírus e enfatizando a necessidade de monitoramento da circulação e caracterização de seus genes. / Influenza A virus infects a wide range of hosts and cause annual outbreaks. RNA segmented virus has high genetic variability and may have rearrangements between the genes of different viruses. In 2006, 521 samples of children younger than 5 years were analyzed and 25 tested positive for Influenza A virus, of which the subtype H3N2 is the most prevalent (68%). Five genes of 18 samples were sequenced and 13 sequences of HA, 12 of NP, 14 of M and 10 of NS obtained were. The presence of this several mutations, especially in the HA and NA genes probably helped the replacement of the vaccine strain in that year. All H3N2 subtype samples showed points of resistance to M2 inhibitors. The phylogenetic analysis revealed the circulation of different lineages in the same year, for both H1 and H3, and the presence of two rearrangements involving the HA and NP genes. These results indicate the influence of rearrangements in the evolution of the virus and emphasize the need for monitoring of circulation and characterization of genes.