Orientador: Sara Teresinha Ollala Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-04T23:41:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Luzo_AngelaCristinaMalheiros_D.pdf: 6304878 bytes, checksum: b63321671c0c64c404503f26c1bd336a (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: A reconstituição da linhagem hematopoiética é um procedimento comum no tratamento de várias doenças hematológicas e não hematológicas. A medula óssea tem sido a principal fonte de obtenção de células tronco nos últimos 50 anos. Recentemente, células tronco obtidas de sangue periférico pós-mobilização e células mononucleares de sangue de cordão umbilical humano têm sido utilizadas com sucesso. Entretanto, as células tronco parecem ter características diferentes. Vários estudos foram publicados, recentemente, analisando a expressão gênica de sub populações de células tronco de linhagem hematopoiética de medula óssea, sangue periférico e de sangue de cordão. Tendo em vista que os procedimentos de terapia celular e transplante são realizados com a infusão de sangue total, o objetivo deste trabalho foi de analisar a expressão gênica das células mononucleares totais de sangue de cordão umbilical humano, a partir da técnica de análise seriada de expressão gênica (SAGE), e compará-Ia com a biblioteca de células mononucleares de medula óssea depositada on fine no Sagemap database. A expressão das proteínas de ciclo celular foi estudada através do método de "immunobfotting': a partir de células de sangue de cordão de recém nascidos prematuros e de termo, submetidas a cultura líquida de curta duração e em cultura em meio sem i-sólido de metilcelulose, suplementados com fatores estimulantes de crescimento. As células foram analisadas de quatro em quatro horas durante 24 horas e após, a cada 24 horas até 96 horas. A leitura das culturas em metilcelulose foi realizada no 7° e no 14o. dia. A análise de expressão gênica das células mononucleares de sangue de cordão evidenciou: 44.924 tags totais (15.519 tags únicas; 7772 genes conhecidos; 3935 seqüências preditas ou anotadas e 3812 genes desconhecidos) A medula apresentou 36577 tags totais (13075 tags únicas, 6711 genes conhecidos; 3371 seqüências preditas ou anotadas e 2993 genes desconhecidos). A análise funcional foi realizada através dos programas Gene Ontofogy Consortium e David. A distribuição por categoria foi similar nas duas bibliotecas. A análise detectou 48 genes com diferença na abundância de expressão ~ 10 e :510 e classificados no programa UniGene. Trinta e cinco foram mais expressos em sangue de cordão e estavam relacionados com resposta imune, ciclo celular e migração trans endotelial (homing). A validação do SAGE foi realizada através do método de reação em cadeia da polimerase, em tempo real quantitativo (qPCR), em 11 genes diferencialmente expressos, confirmando os resultados obtidos em 10 dos 11 genes validados, apresentando uma porcentagem de confirmação de 90%. Os resultados de alfa, beta e gama globina foram comparáveis aos da ontogenia da linhagem hematopoiética. F11 receptor, CDC25B, TGFA, SMARCC2, SKP1A, e NKG7 foram mais expressos em sangue de cordão e S100-A8 na medula óssea. A análise dos ensaios clonogênicos evidenciou um aumento significativo no número de colônias no i e no 14° dia nas culturas de sangue de neonatos prematuros, com significância estatística. Houve um aparecimento precoce das colônias no sétimo dia de cultura. As características morfológicas das culturas das células dos prematuros, no sétimo dia, eram semelhantes as das culturas de termo no décimo quarto dia. As culturas de prematuros no décimo quarto dia apresentavam grande quantidade de fibroblastos e se assemelharam, em número e morfologias, às de recém nascidos de termo com vinte e um dias de cultura. A análise da expressão das proteínas de ciclo celular demonstrou aumento de expressão de p130 à partir de 4 horas, cumulativo, desaparecendo ou diminuindo a partir de 24 horas. A expressão de p107 ocorreu após as 24 horas de cultura, acumulando até 96 horas. Entretanto, as expressões de p130 e p 107 foram maiores nas células de sangue de cordão que nas da medula óssea. Estes resultados sugeriram que as células de sangue de cordão umbilical de recém nascidos prematuros poderiam apresentar uma rápida progressão em ciclo celular. Os resultados aqui obtidos abrem novas perspectivas na caracterização funcional destes genes que poderão contribuir para um maior conhecimento da biologia das células de sangue de cordão umbilical / Abstract: Haematopoietic reconstitution is a common procedure for many haematological and non-haematological diseases. Up to now, total mononuclear bone marrow cells have been the main source for this procedure. Lately, total mononuclear peripheral and cord blood cells have also been successfully used. Many studies of gene expression profile of bone marrow, peripheral or cord blood manipulated cells have been performed during the last few years but, as total mononuclear cells have usually been used in clinical practice, the present study had the aim to compare, using serial analysis of the gene expression (SAGE), cord blood mononuclear cells with the bone marrow mononuclear celllibrary already deposited in Sagemap database. The cell cycle proteins expression were analysed by immunoblotting proceeding with umbilical cord blood cells from premature and full term neonates, submitted to clonogênic assays performed with short liquid culture and semi-solid methylcellulose culture, supplemented with growth factors. The cells were collected and analysed each four hours during the first 24 hours. Then, they were collected and analysed each 24 hours till 96 hours Cord blood revealed 44.924 tags (total) representing 15.519 unique tags (7772 known genes; 3935 sequence predicted or annotated; 3812 no matches). Bone marrow showed 36577 tags (total) representing 13075 unique tags (6711 known genes; 3371 sequence predicted or annotated; 2993 no matches). Genes were annotated using Gene Ontology Consortium. Category distribution was similar in both libraries. We found 48 genes with fold change difference ~ 10 and ~ 10 and UniGene number. Thirty-five were most expressed in cord blood and were related with immune response, cell cycle and homing. SAGE validation was performed by quantitative real time polymerase chain reaction (qPCR) of 11 differentially expressed genes confirming the SAGE results in 10 genes with a confirmation rate of 90%. Alpha, beta and gamma globin results were comparable with haematopoiesis ontogeny. F11 receptor, CDC25B, TGFA, SMARCC2, SKP1A, and NKG7 were most expressed in cord blood and S100-A8 in bone marrow. Fourteen highly expressed genes were function described. The semi-solid cultures analysis demonstrated that the cells of premature neonates had an early growth of CFU-E/BFU-E, CFU-GM and CFU-GEMM on the 7thday of culture, and the number of these colonies on the 7thand 14thday of culture was higher than fuI! term neonate's cells culture with statistic significance. The morphological characteristics on ih day of culture were comparable to those from full term neonates obtained on the 14thday. The premature cells cultures on the 14thday showed even fibroblasts and were comparable to those of full term neonates on the 21st day in terms of number and morphology of the colonies. The cell cycle protein expression analysis demonstrated the expression of p130 increased after the first 4 hours and accumulated, disappearing, or diminishing after 24 hours. On the other hand the p107 expression appeared after 24 hrs and accumulated until 96 hrs. However, the p130 and p107 expression was twofold higher in premature cells compared to full term cells. These results suggest that premature cells have a rapid exit from GO/G1 to S-phase Thus, homing, cell cycle differentiation, and immune response related genes seem to be highly expressed in cord blood cells. Further studies verifying the role of these genes may contribute for greater knowledge regarding cord blood cell biology / Doutorado / Clinica Medica / Doutor em Clínica Médica

Orientador: Fernando Ferreira Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-06T00:23:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Andrade_TiagoGomesde_D.pdf: 2136964 bytes, checksum: be76264a603d3b420701714d5a04072b (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Persistência Hereditária de Hemoglobina Fetal (PHHF) consiste num grupo heterogêneo de alterações hereditárias, sem manifestações clínicas significativas, onde ocorrem falhas na mudança perinatal normal de hemoglobina fetal para hemoglobina adulta, resultando em altos níveis de Hb F durante a vida adulta. Nos tipos delecionais ocorre normalmente aumento de ambas as cadeias, ? A e ? G, até 30%, estando associadas a deleções de seqüências de DNA dentro do grupo de genes ß. As (dß)º - talassemias também se originam a partir de deleções, em muitos casos bastante similares às que originam as formas delecionais de PHHF, entretanto com níveis de Hb F aumentados em menor proporção (5-20%), sendo acompanhadas nos heterozigotos por hipocromia e microcitose nas hemácias. Três hipóteses principais foram propostas para explicar a relação destas deleções com a ausência de supressão normal dos genes ? na fase adulta: competição entre promotores pelo LCR (Locus Control Region); justaposição de elementos acentuadores, normalmente encontrados a 3' do cluster, nas proximidades dos genes ?; remoção de elementos silenciadores, localizados entre ? A e d. Neste trabalho, realizamos estudos funcionais com uma região intergênica, aqui denominada R/PYR, potencialmente envolvida com o silenciamento de ? e a troca na síntese das cadeias de globinas. Os resultados obtidos com transfecção estável em células MEL apontam uma possível participação deste elemento na regulação dos genes de globina. Também investigamos o possível envolvimento de fatores de transcrição, construindo Bibliotecas de cDNA Subtrativas Supressivas para identificar transcritos diferencialmente expressos em reticulócitos de um sujeito com PHHF-2. A análise dos perfis diferenciais de expressão gênica em reticulócitos de PHHF-2 e normais mostram alterações em larga escala e que podem estar associadas com o fenótipo de PHHF. Estas modificações podem ser decorrentes de perturbações nas interações cromossômicas e/ou nos níveis de RNAs regulatórios não codificantes e ajudarem a melhor compreender a disposição e organização dos genes transcricionalmente ativos no genoma, e de que maneira são regulados. A presença de fatores de transcrição e remodeladores de cromatina, como ARID1B, TSPYL1 e ZHX2, dentre outros, com expressão alterada indicam fortemente que outros mecanismos genéticos estão envolvidos com o aumento da síntese de gama globina no estágio adulto, além dos modelos previamente descritos na literatura. Além disto, são candidatos potenciais a reguladores de globina que ainda não haviam sido descritos, e podem ajudar a compreender as diferenças fenotípicas encontradas entre dß-talassemia e PHHF delecional. Identificamos ainda outros genes com expressão diferencial, além de seqüências sem similaridade a genes categorizados, como ORFs, ESTs e seqüências genômicas, que podem ter papel importante na fisiologia normal das células vermelhas ou nas hemoglobinopatias hereditárias. Além disto, a observação de que os níveis de RNAm de alfa globina estão diminuídos em PHHF-2 e dß-Talassemia Siciliana sugere um mecanismo de regulação pós-transcripcional compensatório para as cadeias de globina ou de regulação gênica por interação física direta entre os cromossomos 11 e 16. Ao nosso conhecimento, esta é a primeira descrição demonstrando as implicações na expressão gênica em larga escala em células contendo alterações no DNA como as deleções apresentada / Abstract: The genetic mechanisms underlying the continued expression of the ?-globin genes during the adult stage in deletional hereditary persistence of fetal hemoglobin (HPFH) and dß-thalassemias are not completely understood. For deletional HPFH, three main hypotheses were proposed to explain the relationship between these deletions and the non-suppression of ? -genes in the adult; 1- the removal of competitive regions that interact with the LCR; 2- the juxtaposition of enhancer elements located downstream from the breakpoint region; and 3- the removal of gene silencer elements. Herein, we studied a region, called R/PYR, that lies 1-3 Kb upstream from the d gene. This region has been implicated in ? globin repression and globin gene switching. Stable transfections in MEL cells suggest a possible involvement of R/PYR in globin regulation. We also investigated the possible involvement of transcription factors, using the SSH method to identify differentially expressed transcripts in reticulocytes from a normal and a HPFH-2 subject. Some of the detectable transcripts may participate in globin gene regulation. Quantitative RT-PCR experiments confirmed the downregulation of ZHX2, a transcriptional repressor, in two HPFH-2 subjects and in a carrier of the Sicilian dß-thalassemia trait. The chromatin remodeling factors ARID1B and TSPYL1 had a very similar pattern of expression with an incremental increase in HPFH and decreased expression in dß-thalassemia. These differences suggest a mechanism to explain the heterocellular and pancellular distribution of F cells in dß-thalassemia and deletional HPFH, respectively. Interestingly, a-globin mRNA levels were decreased, similar to ß-globin in all reticulocyte samples analyzed, which may be the result of a common regulatory process affecting a-like and ß-like globin synthesis. Part of the altered gene expression detected within the subtracted libraries may be an indirect effect due to the increased concentration of HbF in the cells. However, genetic alterations similar to those presented in this work may be implicated in the perturbation of chromosome interactions and/or disruption of the expression of regulatory non-coding transcripts with functional consequences for cellular gene expression. Additionally, other genes may have modifications of their expression, but were not detected in our experiments. To our knowledge, this is the first description of wide-ranging gene expression alterations in cells containing deletional HPFH and thalassemia. Finally, the dissection of the differential expression data presented in this study may help elucidate important pathways of erythroid differentiation and maintenance of red cells in peripheral circulation, as well as aid in the understanding of genetic mechanisms involved in erythrocyte pathologies such as sickle cell disease and thalassemias / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

Orientadores : Maricilda Palandi de Mello, Laura Maria Mariscal Ottoboni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T06:32:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Macedo_MariaLucilaHernandez_D.pdf: 8964545 bytes, checksum: 16383686e34d10c2bbb189472bbbc21f (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Ceriporiopsis subvermispora é um basidiomiceto classificado como white-rot, que apresenta alta seletividade de degradação da lignina quando crescido em madeira. De maneira geral, existem três tipos de enzimas lignolíticas: manganês peroxidases (MnP), lignina peroxidases (LiP) e lacases. Estas enzimas atuam degradando estruturas fenólicas e não fenólicas da lignina. Até o momento, acredita-se que o sistema ligninolítico do fungo C. subvermispora seja composto por isoenzimas da família MnP e de lacases, pelo fato da atividade de LiPs não ter sido identificada, embora possua genes desta classe de enzimas. Diferentes estudos têm sido conduzidos como sistemas modelo de ligninólise, com diferentes linhagens de C. subvermispora e outros fungos white-rot visando uma possível aplicação da ligninólise biológica na biopolpação e na indústria de papel. Apesar da importância promissora do fungo C. subvermispora na aplicação industrial, o metabolismo celular e o sistema extracelular que esse organismo utiliza para decompor a madeira ainda não estão bem esclarecidos. Embora os estudos de atividades de enzimas extracelulares e de seus produtos gerem muitas informações a respeito dos mecanismos de ação de fungos lignolíticos, há necessidade de se integrar a estas informações resultados de expressão gênica durante o processo de biodegradação. Com isto este trabalho tem como objetivo contribuir com estudos moleculares do fungo durante a decomposição das madeiras de Pinus taeda e Eucalyptus grandis em pontos selecionados durante o período de 5 a 60 dias de crescimento. Para a caracterização de genes, foram obtidos rnRNAs de cada estágio de crescimento e submetidos às técnicas de RT-PCR e Display Diferencial. Foram utilizados dois primers ancoradores T12NC e T12NG, assim como três primers aleatórios (OPJ01, OPJ04, OPJ1O). Noventa e um fragmentos diferenciais foram visualizados em autorradiografias de géis de onde foram isolados, clonados e seqüenciados. As seqüências obtidas foram submetidas à analise por comparação de homologias em bancos de dados utilizando o programa BLASTX versão 2.2.14 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)Para a confirmação da expressão diferencial das seqüências com similaridade a proteínas envolvidas na degradação da madeira, foi utilizada a metodologia de PCR em tempo real. Três genes relacionados no processo de biodegradação foram encontrados, oxalato oxidase, celobioidrolase e manganês super oxido desmutase. Oxalato esta envolvido na produção de peróxido de hidrogênio que é utilizado como co-substrato para a ação de MnP. O radical superóxido desmutase reduz Mn+2, também originando peróxido de hidrogênio que atua na formação de Mn +3 capaz de oxidar compostos fenólicos e não fenólicos dos componentes da lignina. Já a celobioidrolase esta envolvida na cIivagem da cadéia terminal de polissacarídeos que compõem a celulose. O padrão de expressão observada por RT-PCR quantitativo mostrou que os genes de oxalato e superóxido desmutase foram altamente expressos durante os primeiros 15 dias de cultivo na madeira de P. taeda e nos períodos de 40 a 60 dias em E. grandis. Já a celobioidrolase apresentou maior expressão no décimo dia de cultivo nas duas madeiras. De modo geral estes resultados correlacionam-se a análise da atividade enzimática dos extratos de cultura do fungo em P. taeda e E. grandis / Abstract: Lignin is a heterogeneous and highly cross-linked macromolecule that is particularly resistant to biological degradation but some specialized fungi developed the ability to degrade this complex molecule. Most of these fungi belong to the basidiomycetes and are responsible for the white-rot decay processo One of them, Ceriporiopsis subvermispora, has been extensively studied due to its potential applicability in industrial processes. Ceriporiopsis subvermispora is a white-rot fungus that shows high selectivity towards lignin degradation through a mechanism composed mainly by maganese-dependent peroxidase (MnP) and lacase. Both activities are secreted as isoenzyme farnilies, with isoelectrofocusing patterns that vary according to the composition of the growth media. Although the industrial applicability of this fungus has been recognized, its biochemical and rnolecular lignolytic processes are not completely understood. The present study provides additional data for evaluating the molecular processes involving the first steps of wood biodegradation by C. subvermispora cultivated in Pinus taeda and Eucalyptus grandis for periods ranging from 5 to 60 days. U sing the differential display reverse transcription PCR technique (DDRT-PCR), a total of 91 differentially expressed cDNA fragments were identified by comparing band intensities among fingerprints obtained with rnRNA from cultivated mycelia. Sixty-one differential fragments were sequenced and identified by alignment analysis with GenBank sequences using the BLASTX function. Three . genes oxalate oxidas e, manganese superoxide desrnutase and cellobiohydrolase, derivates ITom biodegradation by C. subvermispora on Pinus taeda wood chips culture, were analysed and compared the expression in Eucalyptus grandis culture. Oxalate and superoxide dismutase genes were expressed during the first growth period (to 15 days) in P. taeda cuIture and 40-60 days in E. grandis wood. On the other hand cellobiohydrolase gene showed high expression at 10 day culture in both wood. This results are correlate with C. subvermispora enzymatic activities during biopulping of P. taeda e E. grandis / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Jaime Aparecido Cury / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-15T16:16:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CcahuanaVasquez_RenzoAlberto_D.pdf: 3034196 bytes, checksum: 00640a6cb63bb31d61a9ad6b5692b87c (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Modelos in vitro e in situ tem sido desenvolvidos para o estudo do biofilme dental. Protocolos que simulem episódios de "fartura-miséria" quando açúcares da dieta estão presentes na cavidade bucal e permitam avaliação de cárie dental são necessários. Por outro lado, poucos estudos da expressão gênica de biofilmes formados in situ foram realizados. Assim, este trabalho teve como objetivos: Desenvolver e validar um modelo de formação de biofilme de S. mutans que simule episódios de "fartura-miséria" e permita avaliar mudanças no biofilme, e desmineralização do esmalte dental. Também, avaliar o efeito da sacarose na expressão de genes gtfB, gtfC, gtfD e dexA de biofilme dental formado in vitro e in situ. Para os primeros objetivos, biofilmes de S. mutans UA159 cresceram durante 5 dias sobre blocos de esmalte bovino a 37oC, 10% CO2, em meio de cultura ultrapurificado, sendo avaliado: o efeito de concentração (1 a 20%) de sacarose e da freqüência (0 a 8x/dia) de exposição à sacarose. O efeito da clorexidina (0, 012 a 0,12%) 2x/dia e de NaF 0,05% foram testados para validar o modelo. Foram determinadas: viabilidade bacteriana, acidogenicidade do biofilme, biomassa e polissacarídeos; e a desmineralização do esmalte. Para o último objetivo, no estudo in vitro biofilmes de S. mutans UA159 cresceram nas mesmas condições acima citadas e foram expostos à sacarose 1% constante (controle) ou sacarose 10% 8x/dia (grupo intermitente) e após 48, 72 e 120 h os biofilmes foram coletados para análise gênica de gtfB, gtfC, gtfD e dexA. No experimento in situ, um estudo cruzado de 2 fases experimentais de 7 dias foi realizado, com 9 voluntários que usaram um dispositivo palatino contendo 12 blocos de dentina que foram submetidos 8x/dia a soluções de sacarose de 1, 5, 10 e 20%. No final, os biofilmes foram coletados para análise microbiológica, bioquímica e de expressão gênica de gtfB, gtfC, gtfD e dexA. Os resultados de padronização mostraram que as concentrações de sacarose de 10% e 20% e a frequência 8x/dia provocam mudanças no biofilme e na demineralização similares ao controle. Clorexidina mostrou efeito dose resposta, diminuindo biomassa, viabilidade bacteriana, acidogenicidade do biofilme e demineralização do esmalte, NaF 0,05% não mostrou atividade antimicrobiana, mas apresentou similar efeito a clorexidina 0,12% na redução da desmineralização. Para o último objetivo, os resultados in vitro do grupo intermitente mostraram que a expressão de genes analisados parece ser constante enquanto que no controle a expressão desses genes incrementou-se em função ao tempo. No estudo in situ, o incremento da concentração de sacarose aumentou os valores de peso úmido do biofilme, lactobacilos e polissacarídeos extracelulares do biofilme. Quanto a expressão gênica, só foi possível quantificar o gtfB e não apresentou diferenças entre os grupos. Em conclusão, o modelo in vitro apresenta potencial para avaliar o efeito antimicrobiano de substâncias sobre biofilmes e desmineralização dental. A quantificação da expressão de genes gtfB, gtfC, gtfD e dexA foi possível in vitro, mas in situ somente a expressão de gtfB foi determinada e não parece ser regulada pela concentração de sacarose. / Abstract: In vitro and in situ models have been developed to study dental biofilms. Protocols, that simulate the alternations of "feast or famine" episodes that happen in oral environment in the presence of dietary carbohydrates and allowing dental caries evaluation, are necessaries. On the other hand, few studies about gene expression of dental biofilm formed in situ were performed. Thus, the objectives of this research were: To develop and to validate a model of S. mutans biofilm formation simulating 'feast-famine' episodes that allows biofilms and dental demineralization changes assessment. Also, to evaluate the effect of sucrose exposure on expression of gtfB, gtfC, gtfD and dexA of in vitro and in situ dental biofilms. For the first objectives, S. mutans UA159 biofilms were grown during 5 days on bovine enamel slabs at 37oC, 10% CO2 in ultra-purified culture media. To develop the model, the effect of sucrose concentration (1 - 20%) 8x/day and frequency (0 - 8x/day) exposure were evaluated and to validate the model, chlorhexidine (CHX) effect (0.012- 0.12%) 2x/day was tested. Bacterial viability, biofilm acidogenicity, biomass and polysaccharides were determined, and enamel demineralization was evaluated by surface hardness loss. To the last objective, for in vitro study, S. mutans UA159 biofilms were grown in the same conditions of previous experiments and were exposed to 1% sucrose constantly (control) or 10% sucrose 8x/day (intermittent group) and after 48, 72 and 120 h the biofilms were collected for analysis. For in situ experiment, a crossover study was conducted in two phases of 7 days each, with nine volunteers that wore intraoral palatal appliances containing 12 dental dentin slabs, which were extra orally submitted 8 times/day to sucrose solutions of 1%, 5%, 10% and 20% . On the 7th day, biofilms were collected for analysis. RNA from the in vitro and in situ biofilms were extracted and purified. Gene expression of gtfB, gtfC, gtfD and dexA were evaluated by real time PCR. In vitro development and validation results showed that 10% and 20% sucrose concentrations and frequency 8x/day provoked biofilm and enamel demineralization changes similar to control group. CHX showed dose-response effect decreasing biomass, bacterial viability and enamel demineralization (p<0.05). Also, 0.05% NaF did not show antimicrobial effect but had similar effect than 0.12% CHX decreasing enamel demineralization (p<0.05). With regard to gene expression of in vitro experiment, gene expression of intermittent group was constant along the time. In situ results showed that biofilm wet weight, lactobacillus, extracellular polysaccharides values of the biofilm increased according to the increase of sucrose exposure. No differences for gtfB gene expression between the groups were observed (p<0.05) and no levels of gtfC, gtfD and dexA were detected. In conclusion, the model developed and validated has potential to assess substances with antimicrobial effect on biofilm and dental demineralization. Quantification of gtfB, gtfC, gtfD and dexA gene expression levels were possible for S. mutans biofilms in vitro study but only gtfB gene expression of in situ study can be determined and was not regulated by sucrose concentration. / Doutorado / Cariologia / Doutor em Odontologia

Orientador: Laura Maria Mariscal Ottoboni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T18:11:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bergamo_RogerioFaria_D.pdf: 5816487 bytes, checksum: c55c4aa07d6b8202428bd0d045c5779f (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Acidithiobacillus ferrooxidans é uma bactéria não patogênica, Gram-negativa, que obtém a energia necessária para o seu crescimento pela oxidação de compostos inorgânicos. Essa bactéria tem despertado interesse por fazer parte de um consórcio de microrganismos envolvidos na biolixiviação de metais. O processo de biolixiviação é influenciado por vários fatores, dentre eles o pH. Apesar desse fator ser importante no crescimento e sobrevivência da bactéria, existem poucas informações sobre os mecanismos moleculares acionados pela bactéria para suportar mudanças envolvendo este parâmetro. Assim sendo, nesse trabalho foram realizados experimentos de respirometria e curvas de crescimento para analisar-se o comportamento da linhagem brasileira de A. ferrooxidans LR em situações que envolviam alterações no pH ideal de cultivo. Com esses experimentos, observou-se que, na presença de pHs acima (2,5 e 3,0) e abaixo (1,5 e 1,2) de 1,8, tanto a respiração quanto o crescimento de A. ferrooxidans LR são afetados. Os pHs dos experimentos de respirometria e curvas de crescimento foram utilizados para obtenção de células de A. ferrooxidans para o isolamento do RNA que foi analisado por RAP-PCR com os primers arbitrários OPF01, OPF03, OPF04, OPF08, OPJ04, OPJ14. Como controle, foi utilizado RNA isolado de células obtidas em pH ideal de cultivo da bactéria. Os cDNAs isolados tiveram a expressão diferencial confirmada por slot blot e foram, a seguir, clonados e seqüenciados. As seqüências obtidas foram comparadas em bancos de dados. As seqüências deduzidas de aminoácidos de quatro cDNAs com expressão induzida em pHs acima ou abaixo de 1,8 apresentaram similaridade com as seguintes proteínas: proteína hipotética, proteína small heat shock, L-2-haloalkanoic acid dehalogenase e ResB. As seqüências deduzidas de aminoácidos de quatro cDNAs com expressão reprimida em pHs acima ou abaixo de 1,8 apresentaram similaridade com as proteínas fructose/tagatose biphosphate aldolase, DedA, proteina ribosomal e DNA helicase dependente de ATP. Esses resultados sugerem que alterações no pH ideal de cultivo de A. ferrooxidans resultam em alterações da expressão de genes que codificam para proteínas pertencentes a diferentes categorias funcionais / Abstract: Acidithiobacillus ferrooxidans are non pathogenic, Gram-negative bacteria that obtain energy for growth from the oxidation of inorganic compounds. These bacteria are part of a consortium of microorganisms involved in the bioleaching of metals. Among others, pH alterations can affect bioleaching. The pH is very important in the survival and growth of the bacteria, but very little is known about the molecular mechanisms used by the bacteria to bare pH alterations. This way, in this work respirometric experiments and growth curves were conducted to analyze the behavior of the A. ferrooxidans Brazilian strain LR in situations involving changes in the bacteria ideal pH. In pHs above (2.5 and 3.0) and below (1.5 and 1.2) 1.8 both oxygen consumption and growth were affected. The pHs used in the respirometric experiments and growth curves were selected to grow A. ferrooxidans cells to isolate the RNA that was used in the RAP-PCR experiments with the arbitrary primers OPF01, OPF03, OPF04, OPF08, OPJ04 and OPJ14. The differential expression of the isolated cDNAs was validated by slot blot. The cDNAs were cloned, sequenced and the obtained sequences were compared to the ones present In GenBank. The deduced amino acids sequences of four cDNAS up-regulated in pHs above and below 1.8 presented similarity with the following proteins: hypothetical protein, small heat shock, L-2-haloalkanoic acid dehalogenase and ResB. The deduced amino acids sequences of four cDNAS down-regulated in pHs above and below 1.8 presented similarity with the proteins: fructose/tagatose biphosphate aldolase, DedA, ribosomal protein and ATP-dependent DNA helicase. These results suggest that alterations in the A. ferrooxidans ideal pH change the expression of genes that encode proteins from different functional categories / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientadore: Laura Maria Mariscal Ottoboni, Fernanda de Castro Reis / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T13:23:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Madureira_DanielleJannuzzi_M.pdf: 2040876 bytes, checksum: f7135c29454428e52c585317e3d024c4 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Acidithiobacillus ferrooxidans e Acidithiobacillus thiooxidans são espécies bacterianas acidofilicas, quimiolitotróficas e mesofilicas, encontradas em ambientes de biolixiviação. A. ferrooxidans utiliza íons ferrosos e compostos que contém enxofte como doadores de elétrons enquanto que A. thiooxidans utiliza apenas enxofte e compostos contendo enxofte. Ambas as espécies utilizam principalmente o oxigênio como receptor final de elétrons, contudo, podem também crescer em ambientes de anaerobiose. A. thiooxidans possui maior resistência ao pH podendo ser encontrada em ambientes com pH variando de 0,5 a 5,0, enquanto que A.ferrooxidans é encontrada em pHs que variam de 1,0 a 2,5. Devido a essas características e devido a capacidade dessas bactérias de solubilizar metais, A. ferrooxidans e A. thiooxidans vem sendo utilizadas em experimentos de biolixiviação. Este processo é utilizado na indústria para recuperação de cobre devido às vantagens oferecidas. Entretanto, pouco se sabe sobre a resposta gênica destas bactériaS a presença de sulfetos metálicos e dos metais pesados em solução proveniente do processo de oxidação. Na primeira parte deste trabalho foi analisada a resposta gênica da estirpe de A. ferrooxidans LR na presença e na ausência de covelita (CuS) por 24 horas através da técnica de RAP-PCR (Random Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction). Foram obtidos 19 cDNAs com expressão diferencial, dos quais 12 foram confirmados como sendo diferencialmente expressos. Dentre estes, foram isolados sete genes que codificam: proteínas de transporte (AFE 0123, AFE ,0989, AFE 0990, AFE 0580, AFE 0671, AFE 2248 e AFE 1149), a proteína diguanilato ciclase, uma proteína de membrana, uma metiltnmsferase e uma ATPase, todas induzidas na presença da covelita. Apenas o gene infC, que codifica um fator de iniciação de tradução tipo 3, teve sua expressão reprimida na presença de covelita. Como sete dos genes diferencialmente expressos pertenciam à classe de transportadores, foram investigadas às modificações químicas presentes no meio de cultura após 24 horas. Análises de absorção atômica mostraram que a quantidade de' co1?rê em solução inicialmente zero passava para aproximadamente 1,13 g/L e medidas de pH mostraram que após este período de tempo houve mudanças de 1,8 para 4,0. Pode-se sugerir que essas alterações químicas sejam responsáveis, pelo menos em parte, pela indução dos genes que codificam proteínas de transporte. Uma análise in silico da interação entre proteínas (PPI) relacionadas com transporte, cujos genes foram diferencialmente expressos na presença de covelita e de proteínas pertencentes à mesma categoria funcional, codificadas por genes que estavam fisicamente localizados nas proximidades dos genes diferencialmente expressos, mostraram que os genes de transporte podem estar envolvidos em diferentes etapas da resposta bacteriana à presença de covelita. A segunda parte deste trabalho teve como objetivo estudar a expressão diferencial, por PCR em tempo real, de duas proteínas do tipo ABC (AFE 0123 e AFE 0125) e uma proteína do tipo RND (AFE 0993) na estirpe de A. thiooxidans FGOl na presença de calcopirita (CuFeS2), covelita e pirita (FeS2) por 24 horas. Para tal, a estirpe foi crescida na presença de enxofte e depois mantida na presença dos sulfetos metálicos por 24 horas. A expressão dos três genes foi induzida na presença de covelita e inalterada na presença de calcopirita. Na presença de pirita, a expressão de dois genes foi reprimida e do gene AFE 0993, permaneceu inalterada. Estes resultados podem ser explicados, pelo menos em parte, pelas quantidades de cobre encontradas em solução na presença de covelita (l g/L) e na presença de calcopirita (0,07 g/L). Na presença de covelita e calcopirita a medida de pH também softeu aumento de 1,8 para 4,0 e 2,5, respectivamente. Para investigar se a alteração de pH ou a presença de íons de cobre eram os responsáveis pela indução da expressão desses genes, a bactéria foi mantida na presença de sulfato de cobre (16 mM) e pH 4,0 por 24 horas. Os resultados mostraram que a presença de cobre em solução induz a expressão destes genes, enquanto que a alteração do pH não / Abstract: Acidithiobacillus ferrooxidans and Acidithiobacillus thiooxidans are acidophilic, chemolitotrophic and mesophilic bacteria found in bioleaching environments. A. ferrooxidans uses ferrous iron and sulphur compounds as an e1ectron donor and A. thiooxidans uses on1y sulphur and sulphur compounds. Both species are aerobic using oxygen as final e1ectron acceptor. However, these bacteria are also able to grow in anaerobic environments. A. thiooxidans is able to survive in pHs ranging from 0.5 to 5.0 while A. ferrooxidans grows in pHs from 1.0 to 2.5. Due to these characteristics and the ability of these bacteria to solubilize metal sulphides, A. ferrooxidans and A. thiooxidans are used in bioleaching. This process has several advantages over the traditional methods and has been used with success in industrial operations to recover main1y copper. However, little is known about the genetic response of these bacteria to the presence of metal sulphides and heavy metal in solution. Therefore, in the first part of this study the A. ferrooxidans LR 'response to covellite was investigated. This bacterium was maintained in contact with covellite for 24 hours and the differentially expressed cDNAs were identified by RAP-PCR (Random Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction) technique. Nineteen cDNAs showed a differential expression and twe1ve had their differential expression confirmed by real time PCR. Among these cDNAs, seven codified for transporter proteins (AFE 0123, AFE 0989, AFE 0990, AFE 0580, AFE 0671, AFE 2248 and AFE 1149), one codified for a putative diguanylate cyc1ase, one for a membrane. protein, one for a methyltransferase and one for an A TPase. With the exception of infC whose expression was down regulated, all the oDNAs had their expression up regulated in the presence of covellite. Since most of the differentially expressed genes are involved in transport, chemical modifications on the culture medium after 24 hours were investigated. The atomic absorption analysis showed that the copper amount in solution was 1.13 g/L and pH changed from 1.8 to 4.0 suggesting that these changes are responsible, at least in part, for the induction,"?f1he expression of transport gene. An in si/ico ana1ysis of protein-protein interaction (PPI) between the transport proteins codified by the genes differentially expressed in the presence of covellite and those codified by genes that were physically located around the differentially expressed ones showed that these transport proteins could be involved in different steps of the bacterial response to covellite. The goal of the second part of this study was to analyse the differential expression, by real time PCR, of two ABC proteins (AFE 0123 andAFE 0125) and one RND protein (AFE 0993) inA. thiooxidans FGOl in the presence of chalcopyrite, covellite and pyrite for 24 hours. This strain was maintained in contact with the metal sulphides for 24 hours. The expression ofthe three genes was up regulated in the presence of covellite and unchanged in the presence of chalcopyrite. In the presence of pyrite two genes hOO their expression down regulated and in one (AFE 0993) the expression was unchanged. These results can be explained, at least in part, by the quantities of copper found in solution in covellite (1 g/L) and in chalcopyrite (0.07 g/L). In the presence of covellite and chalcopyrite the pH changed from l'.8 to 4.0 and 2.5, respectively. To investigate if the changes in pH or the presence of copper ions in solution were responsible for the induction of the gene expressions, the bacteria were maintained in the presence of copper sulphate (16 mM) and pH 4.0 for 24 hours. The results showed that the presence of copper in solution was the responsible for the up regulation ofthese genes / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-07-31T15:51:32Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Diego S. Moreira.pdf: 1728287 bytes, checksum: ecbc52e7d1d381ff5278e92b6e8031b2 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-08-01T13:14:15Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Diego S. Moreira.pdf: 1728287 bytes, checksum: ecbc52e7d1d381ff5278e92b6e8031b2 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-08-01T13:14:32Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Diego S. Moreira.pdf: 1728287 bytes, checksum: ecbc52e7d1d381ff5278e92b6e8031b2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-01T13:14:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Diego S. Moreira.pdf: 1728287 bytes, checksum: ecbc52e7d1d381ff5278e92b6e8031b2 (MD5) Previous issue date: 2016-02-22 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / The interest in genetic manipulation tools increase production of heterologous proteins for biotechnological purposes, especially therapeutic proteins, industrial enzymes and significantly increased worldwide. For the production of heterologous proteins choice of expression vector & host system is essential. For the construction of a library of adjustable and promoters functional in E. coli, two-deoxy oligonucleotides degenerate regions were produced by random chemical synthesis of DNA. To obtain the double-stranded promoters, Lac operator sequences were looped and submitted by treatment with Klenow enzyme. For cloning and analysis of the functionality of the novel promoters, the edges of the double-stranded deoxy-oligonucleotide and vector were digested with Bam HI and Hind III and following were purified. Synthetic promoters were then linked to the promoter vector pKK232-8 hunting so stay in proper position for expressing the CAT reporter gene. The recombinant plasmids were then introduced into E. coli DH5α F'Iq and transformants cells were obtained and classified according to the size of the colony on Petri plates containing different concentrations of chloramphenicol in the presence and absence of the inducer IPTG. After analysis of the colonies were chosen 42 recombinant clones, their DNA extracted plamidiais and the sequences of the promoters completely certain. 6 The following recombinant plasmids were reintroduced into E. coli DH5α F'Iq and clones selected on chloramphenicol, with or without IPTG. Of these six clones, 4 were selected to examine the growth in liquid medium with chloramphenicol in the presence and absence of the inducer IPTG. All recombinant clones in E. coli demonstrated ability to grow in liquid medium, 3 of them grew better with IPTG, indicating that their promoters are regulated. The other clone did not have their growth affected by the inductor, confirmed by deficiency following the Lac operator. The results show that the methodology used to generate and clone novel promoters running and new promoters have the potential of being used for the development of new, powerful and regulated expression vectors. / O interesse por ferramentas de manipulação genética que aumentem a produção de proteínas heterólogas para fins biotecnológicos, especialmente proteínas terapêuticas e enzimas industriais, aumentou significativamente em nível mundial. Para a produção de proteínas heterólogas a escolha do sistema hospedeiro & vetor de expressão é fundamental. Para a construção de uma biblioteca de promotores reguláveis e funcionais em E. coli, dois desoxi-oligonucleotídeos com regiões degeneradas foram produzidos por meio de síntese química randômica de DNA. Para a obtenção dos promotores dupla-fita, as sequências do operador Lac foram aneladas e submetidas por tratamento com a enzima Klenow. Para a clonagem e análise da funcionalidade dos novos promotores, as bordas dos desoxi-oligonucleotídeos dupla-fita e do vetor foram digeridas com BamHI e HindIII e após foram purificados. Os promotores sintéticos foram a seguir ligados ao vetor caça-promotores pKK232-8 de forma que ficassem em posição adequada para expressar o gene repórter CAT. Os plasmídeos recombinantes foram então introduzidos em E. coli DH5α F’Iq e as células transformantes foram obtidas e classificadas de acordo com o tamanho da colônia em placas de Petri contendo diferentes concentrações de cloranfenicol na presença e ausência do indutor IPTG. Após as análises das colônias foram escolhidos 42 clones recombinantes, seus DNAs plamidiais extraídos e as sequências dos seus promotores determinadas completamente. A seguir 6 plasmídeos recombinantes foram reintroduzidos em E. coli DH5α F’Iq e os clones selecionados em cloranfenicol, com ou sem IPTG. Destes 6 clones, 4 foram escolhidos para analisar o crescimento em meio líquido com cloranfenicol na presença e ausência do indutor IPTG. Todos os clones recombinantes em E. coli demonstraram capacidade de crescer em meio líquido, sendo que 3 deles cresceram melhor com IPTG indicando que seus promotores estão sendo regulados. O outro clone não teve seu crescimento afetado pelo indutor, confirmado pela deficiência da sequência do operador Lac. Os resultados mostram que a metodologia utilizada para gerar e clonar novos promotores funciona e que os novos promotores têm potencialidade de serem utilizados para o desenvolvimento de novos, potentes e regulados vetores de expressão.

A desinfecção de dentaduras promove o controle do biofilme microbiano e previne doenças, como a estomatite por uso de dentadura, associada à presença de Candida albicans. A expressão dos genes HWP1, ALS1, ALS3 deste fungo está relacionada à adesão das células fúngicas às do hospedeiro. O objetivo deste estudo foi detectar e quantificar a expressão desses genes em células planctônicas e biofilme de Candida albicans, desenvolvidos sobre superfícies de resina acrílica, após tratamento com dois métodos de desinfecção. Corpos de prova de resina acrílica, previamente tratados por hipoclorito de sódio 1%, microondas, e um grupo não tratado, foram inoculados com Candida albicans para desenvolvimento de biofilme. O biofilme e as células planctônicas foram coletados em três tempos distintos, correspondentes às etapas de desenvolvimento do biofilme: inicial (6h), intermediária (12h) e madura (48h) e a expressão gênica foi quantificada pelo ensaio de RT-PCR em tempo real. Os dados obtidos foram submetidos ao teste estatístico ANOVA two-way e pós-teste de Bonferroni; valores de p<0,05, p<0,01 e p<0,001 foram considerados significantes. Os três genes avaliados foram detectados e quantificados por RT-PCR em tempo real, em biofilmes e células planctônicas, independente do grupo de tratamento ou tempo de desenvolvimento do biofilme. A expressão dos genes ALS1 e ALS3 variou de acordo com o tempo de desenvolvimento do biofilme e, e com o tratamento da superfície. Ocorreu diferença significativa (p<0,001) entre a expressão desses genes nas superfícies tratadas por hipoclorito de sódio e microondas, além de diferenças significativas (p<0,001) na expressão gênica entre células planctônicas e biofilme, para os tratamentos avaliados. Concluiu-se que os tratamentos de desinfecção alteram o padrão da expressão dos genes ALS1 e ALS3 em biofilmes desenvolvidos sobre superfície de resina acrílica e em células planctônicas e este padrão foi diferente entre os tratamentos de desinfecção. / Complete dentures disinfection promotes biofilm control and prevents diseases such as denture stomatitis associated with the presence of Candida albicans infection. The expression of the genes HWP1, ALS1, ALS3 in this fungus is related to the adhesion of fungal cells to the host tissues. Therefore, the aim of this study was to detect and quantify the expression of these genes in planktonic cells and biofilms of Candida albicans, developed on acrylic resin surfaces, after treatment with two disinfection methods. Specimens of acrylic resin, previously treated by 1% sodium hypochlorite or microwave, and an untreated group were inoculated with Candida albicans for biofilm development. Biofilm and planktonic cells were collected at three different time points corresponding to biofilm development stages: initial (6 h), intermediate (12h) and mature (48h). The total RNA of these samples was obtained and the gene expression for mRNA of HWP1, ALS1 and ALS3 were quantified by Real-Time RT-PCR assay. The data obtained were assessed throught two-way ANOVA and Bonferroni post-test. Significant levels were determined for p values at <0.05. The three genes were detected and quantified in both biofilms and planktonic cells regardless of treatment condition or time of biofilm development. ALS1 and ALS3 expression varied according to the time point, and surface treatment. Significant differences (p <0.001) were showed between gene expression on surfaces treated with sodium hypochlorite and microwave, and significant differences (p <0.001) were showed in gene expression between planktonic and biofilm cells. It can be concluded that the disinfection procedures affect the ALS1 and ALS3 expression patterns in Candida albicans denture biofilms and planktonic cells. Additionaly, differential gene expression patterns were observed among the disinfection treatments.

Xylella fastidiosa (Xf) é o agente etiológico causador de doenças em uma grande variedade de cultivos de grande importância econômica, causando a c1orose variegada dos citros, uma das doenças mais danosas à indústria de citros no Brasil. Os genomas de algumas cepas deste fitopatógeno foram completamente seqüenciados promovendo assim estudos funcionais do genoma em larga escala. Neste trabalho nós nos propusemos a investigar o perfil de transcrição de Xf através da técnica microarranjos (no título da dissertação microarrays, mas a partir de agora usaremos microaarranjos) de DNA usando todo o genoma do fitopatógeno e cultivando-a sob meio definido variando a concentração de glicose. O objetivo inicial deste trabalho era observar se Xf comportava-se da mesma forma que Xac, que tem a expressão de goma aumentada devido ao aumento da concentração de glicose do meio. Nossas análises revelaram que enquanto os transcritos relacionados à goma não se mostraram afetados com a concentração de glicose, genes que codificam para análogos a Colicina-V e precursores de fimbria foram induzidos em alta concentração de glicose. Baseados nestes resultados, nós propusemos um modelo de mecanismo de produção e defesa contra a Colicina em Xf. / Abstract not available.

As proteases FtsHs, encontradas em eubactérias e eucariotos, pertencem à família das proteínas AAA (ATPases associadas a diferentes atividades celulares) e são classificadas no grupo das metaloproteases. A proteína FtsH foi primeiro identificada em Escherichia coli em mutantes ftsH (filamentation temperature sensitive) como uma protease que age facilitando a degradação de proteínas intermembrânicas e citosólicas. Ortólogas a FtsH já foram encontradas em leveduras, metazoários e plantas. Nestas últimas, a FtsH pode estar localizada nos plastídeos, como uma proteína integral da membrana dos tilacóides ou na membrana interna das mitocôndrias, como em leveduras. Estudos sobre as isoformas plastidiais são abundantes e indicam a participação dessas proteases na renovação da proteína D1, componente do fotossistema II, na resposta hipersensível e na biogênese das membranas do tilacóide. Os estudos sobre as isoformas mitocôndriais são escassos e resumem-se a informações sobre o direcionamento subcelular dessas proteases e evidências de seu envolvimento no acúmulo da subunidade 9 da ATP-sintase na membrana interna. Com o objetivo de caracterizar a função da FtsH-m1 em plantas, foi realizada a transformação genética de Nicotiana tabacum via Agrobacterium tumefaciens contendo um plasmídeo em que o cDNA da FtsHm1 de cana-de-açúcar encontra-se sob o controle de um promotor transcricional constitutivo. Esse plasmídeo apresenta o gene seletivo nptII, que confere resistência à canamicina. As plantas regeneradas in vitro, 17 no total, foram aclimatadas e transferidas para a casa de vegetação até a produção de sementes. As plantas regeneradas foram testadas quanto à presença do cDNA da FtsH-m1 de cana-de-açúcar por meio da técnica de PCR. A seleção de plantas da geração T1 que possuíam o transgene de interesse foi conduzida em ensaios in vitro e em casa de vegetação baseados na resistência dessas plantas à canamicina. A presença do transgene foi confirmada por meio da técnica de PCR. A análise da expressão heteróloga foi realizada via RT-PCR e revelou níveis elevados de RNA mensageiro nas plantas transformadas. Ao todo, foram obtidas dez plantas de fumo em que a presença do transgene de interesse foi confirmada. Não foram observadas alterações fenotípicas marcantes nas plantas das gerações T0 e T1 que pudessem ser relacionadas à expressão heteróloga da FtsH-m1 de cana-de-açúcar. Devem ser realizadas análises mais finas, que podem incluir ensaios para a investigação de possíveis alterações na função mitocondrial, no metabolismo respiratório ou na ultraestrutura das mitocôndrias em plantas a partir da geração T2. / FtsH proteases of eubacteria and eucaryotes belong to the AAA protein family (ATPases associated with different celular activities) and are included among the metaloproteases. The FtsH protein was first described in ftsh (filamentation temperature sensitive) mutant of Escherichia coli as a protease involved in the degradation of transmembrane and cytosolic proteins. FtsH-ortologous proteins have been described in yeast, metazoa and plants. In the latter, FtsHs are localized to plastids, as an integral membrane protein of thylakoid or, as in yeast, to the inner mitochondrial membrane. The various studies on the plastid isoforms point to their involvement in the turnover of D1 protein, a member of the photosystem II, in hypersensitive response, and in thylakoid membrane biogenesis. On the other hand, data on the mitochondrial isoforms are scarce and restricted to their subcellular localization, and involvement in the accumulation of ATP-synthase subunit 9 in the inner membrane. With the aim of disclosing the function of FtsH-m1 in plants, Nicotiana tabacum plants were transformed by Agrobacterium tumefaciens carrying a designed plasmid containing the sugar-cane FtsH-m1 cDNA under the control of a constitutive-transcription promoter. This plasmid also contained the selectable kanamycin-resistance gene nptII. The seventeen plants obtained in vitro were acclimatized and kept in a greenhouse until seeding. These plants were then tested by PCR for the presence of the sugar-cane FtsH-m1 cDNA. Selection of T1 plants for the presence of the transgene of interest was carried out both in vitro and in the greenhouse, based on kanamycin resistance. The transgene carrier status of the selected plants was confirmed by PCR. Higher levels of FtsH-m1 messenger RNA were detected by RT-PCR in transformed T1 plants. A total of ten tobacco plants carrying the sugar-cane FtsH-m1 cDNA were obtained. T0 and T1 plants did not show conspicuous phenotype alterations which could be related to the heterologous gene expression. Refined analyses are needed in plants from T2 generation on, including the evaluation of mitochondrial structural abnormalities and disfunction, as well as respiratory alterations.