Submitted by Fernanda de Souza Monteiro (f.monteiro@unesp.br) on 2018-08-15T01:29:40Z No. of bitstreams: 1 FernandaMonteiroTESE.pdf: 1707798 bytes, checksum: 6902254db3112b853eeae6f8472782b4 (MD5) / Rejected by Elza Mitiko Sato null (elzasato@ibilce.unesp.br), reason: Solicitamos que realize correções na submissão seguindo as orientações abaixo: Problema 01) Falta a FICHA CATALOGRÁFICA (Obrigatório pela ABNT NBR14724) Problema 02) Como você recebeu financiamento da CAPES, o nome dela deve constar também na FOLHA DE APROVAÇÃO. Problema 03) A ordem correta das páginas pré-textuais (capa, folha de rosto, ficha catalográfica, folha de aprovação, dedicatória, agradecimentos, epígrafe, resumo na língua vernácula, resumo em língua estrangeira, listas de ilustrações, de tabelas, de abreviaturas, de siglas e de símbolos e sumário) Problema 04) A página 65 está em branco, o arquivo não pode conter páginas em branco. Problema 05) A paginação deve ser sequencial, iniciando a contagem na folha de rosto e mostrando o número a partir da introdução, a ficha catalográfica ficará após a folha de rosto e não deverá ser contada. OBS:-Estou encaminhando via e-mail o template/modelo das páginas pré-textuais para que você possa fazer as correções, sugerimos que siga este modelo pois ele contempla as normas da ABNT Lembramos que o arquivo depositado no repositório deve ser igual ao impresso, o rigor com o padrão da Universidade se deve ao fato de que o seu trabalho passará a ser visível mundialmente. Agradecemos a compreensão. on 2018-08-15T12:18:38Z (GMT) / Submitted by Fernanda de Souza Monteiro (f.monteiro@unesp.br) on 2018-08-21T11:36:28Z No. of bitstreams: 1 FernandaMonteiroTESE.pdf: 1707798 bytes, checksum: 6902254db3112b853eeae6f8472782b4 (MD5) / Rejected by Elza Mitiko Sato null (elzasato@ibilce.unesp.br), reason: Solicitamos que realize correções na submissão seguindo as orientações abaixo: Problema 01) Falta a FICHA CATALOGRÁFICA (Obrigatório pela ABNT NBR14724) Problema 02) Como você recebeu financiamento da CAPES, o nome dela deve constar também na FOLHA DE APROVAÇÃO. Problema 03) A ordem correta das páginas pré-textuais (capa, folha de rosto, ficha catalográfica, folha de aprovação, dedicatória, agradecimentos, epígrafe, resumo na língua vernácula, resumo em língua estrangeira, listas de ilustrações, de tabelas, de abreviaturas, de siglas e de símbolos e sumário) Problema 04) A página 65 está em branco, o arquivo não pode conter páginas em branco. Problema 05) A paginação deve ser sequencial, iniciando a contagem na folha de rosto e mostrando o número a partir da introdução, a ficha catalográfica ficará após a folha de rosto e não deverá ser contada. OBS:-Estou encaminhando via e-mail o template/modelo das páginas pré-textuais para que você possa fazer as correções, sugerimos que siga este modelo pois ele contempla as normas da ABNT Lembramos que o arquivo depositado no repositório deve ser igual ao impresso, o rigor com o padrão da Universidade se deve ao fato de que o seu trabalho passará a ser visível mundialmente. Agradecemos a compreensão. on 2018-08-21T11:47:18Z (GMT) / Submitted by Fernanda de Souza Monteiro (f.monteiro@unesp.br) on 2018-08-28T15:24:56Z No. of bitstreams: 1 FernandaMonteiroTESE.pdf: 1707798 bytes, checksum: 6902254db3112b853eeae6f8472782b4 (MD5) / Rejected by Elza Mitiko Sato null (elzasato@ibilce.unesp.br), reason: Solicitamos que realize correções na submissão seguindo as orientações abaixo: Problema 01) Falta a FICHA CATALOGRÁFICA (Obrigatório pela ABNT NBR14724) Problema 02) Como você recebeu financiamento da CAPES, o nome dela deve constar também na FOLHA DE APROVAÇÃO. Problema 03) A ordem correta das páginas pré-textuais (capa, folha de rosto, ficha catalográfica, folha de aprovação, dedicatória, agradecimentos, epígrafe, resumo na língua vernácula, resumo em língua estrangeira, listas de ilustrações, de tabelas, de abreviaturas, de siglas e de símbolos e sumário) Problema 04) A página 65 está em branco, o arquivo não pode conter páginas em branco. Problema 05) A paginação deve ser sequencial, iniciando a contagem na folha de rosto e mostrando o número a partir da introdução, a ficha catalográfica ficará após a folha de rosto e não deverá ser contada. Lembramos que o arquivo depositado no repositório deve ser igual ao impresso, o rigor com o padrão da Universidade se deve ao fato de que o seu trabalho passará a ser visível mundialmente. Sua submissão será rejeitada para que você possa fazer as correções. Agradecemos a compreensão. on 2018-08-28T19:46:58Z (GMT) / Submitted by Fernanda de Souza Monteiro (f.monteiro@unesp.br) on 2018-09-25T16:14:04Z No. of bitstreams: 1 FernandaTESE correção 18.09.18.pdf: 1688049 bytes, checksum: 425632850484dc8bc0111fed0b6e427c (MD5) / Approved for entry into archive by Elza Mitiko Sato null (elzasato@ibilce.unesp.br) on 2018-09-26T13:06:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 monteiro_fs_dr_sjrp.pdf: 4717252 bytes, checksum: ba2c67ffbe5c027002b90049ebbbfe2c (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-26T13:06:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 monteiro_fs_dr_sjrp.pdf: 4717252 bytes, checksum: ba2c67ffbe5c027002b90049ebbbfe2c (MD5) Previous issue date: 2018-05-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Síndromes Mielodisplásicas (SMDs) é a denominação de um grupo de doenças neoplásicas clonais das células hematopoéticas, mais frequentemente observadas em idosos, caracterizadas por citopenias, displasia, hematopoese ineficaz e risco elevado para leucemia mielóide aguda (LMA). Citopenia(s) persistente(s), por mais de seis meses, e ausência de critérios diagnósticos para SMD, caracteriza a Citopenia Idiopática de Significado Indeterminado (ICUS). ICUS foi definida recentemente e é pouco conhecida quanto aos fatores etiológicos. Já as SMDs são consideradas protótipos de doenças epigenéticas, uma vez que distúrbios na metilação de alguns genes que regulam proliferação e diferenciação celular têm sido considerados fatores causais. O gene SOX17, por exemplo, é um supressor de tumor expresso em vários tecidos e alterações no seu padrão de metilação já foram observadas em tumores sólidos e neoplasias hematológicas, entretanto, foram pouco estudadas nas SMDs e não há descrições de estudos em ICUS. Do mesmo modo, alguns microRNAs vem sendo utilizados como marcadores moleculares para diagnóstico e prognóstico para diversas anormalidades hematológicas, mas seu papel na etiologia e desenvolvimento das SMDs também é pouco conhecido. Neste contexto, este estudo propos investigar o padrão de metilação do gene SOX17 por MSP-PCR em células da medula óssea (MO) de pacientes com SMD e ICUS ao diagnóstico, e analisar alterações no padrão de expressão de microRNAs por RT-PCR em células da MO de adultos e de crianças com SMD. Em adultos foram investigados os microRNAs miR126, miR29a, miR20a, miR181a, miR19b, miR21, miR155, miR146, miR22, miR193, miR26a e miR29b, e em crianças, os microRNAs miR193, miR29b miR22 e miR26a. O padrão de metilação do gene SOX17 foi analisado em 26 pacientes com SMD e em 15 pacientes com ICUS. A hipermetilação da região promotora do gene foi identificada em 57,7% dos indivíduos com SMD e em 53,3% daqueles com ICUS, sugerindo que o silenciamento do SOX17 pode ser um evento frequente e participar do curso inicial destas doenças. A análise dos microRNAs foi realizada em 55 pacientes adultos com SMD e em oito controles saudáveis. Dos 12 microRNAs testados, sete apresentaram padrão de expressão anormal em relação ao grupo controle, e dos quatro micros investigados em 28 pacientes com SMD infantil, os micros, miR193, miR29b apresentaram expressão diminuída em relação ao grupo controle em aproximadamente 70% dos pacientes analisados e a expressão do miR22 foi maior em mais da metade das amostras analisadas, enquanto uma expressão diminuída do miR26a foi observada em 28 (100%) dos pacientes analisados. Considerando-se que os microRNAs estudados podem atuar como reguladores da hematopoese, os dados revelam a importância dos microRNAS na etiologia das SMDs, sugerindo esses como possíveis biomarcadores diagnósticos para a SMD adulto e infantil. / Myelodysplastic syndromes (MDS) denominates a group of neoplastic diseases of the hematopoietic cells, most commonly observed in elderly patients, characterized by cytopenias, dysplasia, ineffective hematopoiesis and high risk of acute myeloid leukemia (AML). Persistent cytopenia (s), for more than six months, and absence of diagnostic criteria for MDS, characterizes Idiopathic Cytopenia of Undetermined Significance (ICUS). ICUS has been recently defined, and little is known about its etiological factors. The MDSs are considered as prototypes of epigenetic diseases, due to the fact that methylation disorders of some genes that regulate cell proliferation and differentiation have been considered as causal factors. The SOX17 gene, for example, is a tumor suppressor expressed in several tissues and changes in its methylation pattern have already been observed in solid tumors and hematological malignancy, however, these changes have been little studied in MDS and there are no descriptions of studies in ICUS. Similarly, some microRNAs are being used as molecular markers for diagnosis and prognosis for various hematological abnormalities, but its role in the etiology and development of MDS is also poorly understood. In this context, this study aimed to investigate the methylation pattern of the SOX17 gene by MSP-PCR in bone marrow (BM) cells of patients diagnosed with MDS and ICUS, and to analyze changes in the expression pattern of microRNAs by RT-PCR in cells of BM for adults and children with MDS. In adults, the microRNAs miR29a, miR20a, miR181a, miR19b, miR21, miR155, miR146, miR22, miR193, miR26a and miR29b were tested, and in children, microRNAs miR193, miR29b miR22 and miR26a. The methylation pattern of the SOX17 gene was analyzed in 26 patients with MDS and in 15 patients with ICUS. The hypermethylation of the SOX17 promoter region was identified in 57.7% of the individuals with MDS and in 53.3% of those with ICUS, suggesting that the silencing of SOX17 can be a frequent event and participate in the initial course of these diseases. MicroRNAs were analyzed in 55 adult MDS patients and in 8 healthy controls. Among the 12 microRNAs tested in MDS adults, seven presented an abnormal expression pattern in relation to the control group, and of the four microRNAs investigated in 28 children with MDS, miR193 and miR29b presented decreased expression in relation to the control group in approximately 70% of the analyzed patients and miR22 expression was higher in more than half of the analyzed samples, whereas diminished expression of miR26a was observed in 28 (100%) of the patients analyzed. Considering that the studied microRNAs may act as regulators of hematopoese, the data reveal the importance of microRNAS in the etiology of MDS, suggesting these as possible diagnostic biomarkers and prognostic of adult and infant MDS. / 88881.132788/2016-01

Os hormônios da tireóide (HT) têm sido descritos agindo em sítios nucleares e extranucleares, induzindo respostas celulares através de diversos mecanismos. Também tem sido reportado que as proteínas do citoesqueleto são alvos para os HT durante o desenvolvimento do testículo e do sistema nervoso. Os efeitos dos HT durante o desenvolvimento são mediados principalmente por receptores nucleares modulando a expressão gênica. Entretanto, há diversas evidências de mecanismos não genômicos dos HT associados a vias de sinalização ativadas por Ca2+ e proteínas quinases. Nesse contexto, nosso estudo investigou as ações genômicas e não genômicas dos HT em células testiculares e neurais durante o desenvolvimento. Nós inicialmente demonstramos o envolvimento de mecanismos mediados por Ca2+ na fosforilação da vimentina induzida por T3 em testículos de ratos imaturos através de mecanismos independentes da síntese de proteínas. Também observamos um acúmulo de vimentina fosforilada em testículos de ratos hipertireoideos, podendo ser conseqüência da ativação da ERK regulando o citoesqueleto. Nós ainda demonstramos um aumento no metabolismo basal através da medida do consumo de O2 e dos níveis de TBARS. Além disso, as defesas antioxidantes enzimáticas e não enzimáticas modificaram-se aparentemente de acordo com o aumento no consumo de O2. E Esses resultados corroboram com a idéia de que um aumento na geração de ROS induz estresse oxidativo e pode ser responsável pelas alterações bioquímicas envolvidas no aumento da capacidade metabólica em testículos de ratos hipertireoideos. Além disso, o hipotireoidismo inibiu a atividade das NTPDases em culturas de células de Sertoli sem alterar a expressão das NTPDases 1, 2 e 3. Os HT modificaram a atividade NTPDásica, provavelmente através de mecanismos não genômicos e, consequentemente, podem influenciar a função reprodutiva durante o desenvolvimento. Considerando-se os efeitos dos HT em células neurais, nós primeiramente demonstramos que T3 e T4 estimularam a fosforilação dos filamentos intermediários (FI) através de mecanismos GABAérgicos via PKA e PKCaMII em córtex cerebral de ratos de 10 dias de idade. A dependência de PKA, PKC e canais de Ca2+ tipo-L e -T também foi evidenciada no efeito dos HT sobre a captação de 45Ca2+. Surpreendentemente, em córtex cerebral de ratos de 15 dias de idade, apenas o T4 estimulou a fosforilação dos FIs. Os mecanismos envolvidos na ação do T4 sobre o citoesqueleto dependem da ativação de um receptor acoplado a proteínas Gi, além da participação da PLC, PKC, MAPK, PKCaMII e níveis intracelulares de Ca2+. Estes dados demonstram que o T4 tem importantes funções fisiológicas modulando o citoesqueleto de células neurais durante o desenvolvimento. Nós também demonstramos a reorganização e a fosforilação do citoesqueleto induzidas por HT em células de glioma C6 e astrócitos, e a participação da via de sinalização da RhoA mediando a ação hormonal. Concluindo, nossos resultados evidenciaram ações genômicas e não genômicas dos HT promovendo a fosforilação dos FI, reorganização do citoesqueleto, influxo de Ca2+ e modulação da atividade das NTPDases via mecanismos mediados por Ca2+ e proteínas quinases. Estes resultados podem contribuir para o melhor entendimento dos mecanismos envolvidos nas desordens observadas no hipo e hipertireoidismo durante o desenvolvimento e maturação do cérebro e do testículo. / Thyroid hormones (TH) have been shown to act at nuclear and extra nuclear sites, inducing cell responses by several mechanisms. It has also been reported that cytoskeletal proteins are a target for TH during hormone-induced differentiation and development of nervous system and testicular cells. The developmental effects of TH are mainly mediated by nuclear receptors regulating gene expression. However, there are increasing evidences of nongenomic mechanisms of TH associated with kinase- and Ca2+-activated signaling pathways. In this context, our study investigated the genomic and nongenomic actions of TH on testicular and neural cells from developing rats. We first described the involvement of Ca2+-mediated mechanisms on vimentin phosphorylation induced by T3 in immature rat testis. This effect was demonstrated to be independent of protein synthesis. Furthermore, we observed an accumulation of phosphorylated vimentin in hyperthyroid rat testes, which could be a consequence of the extracellular-regulated kinase (ERK) activation regulating the cytoskeleton. We also demonstrate increased basal metabolic rate, measured by tissue oxygen consumption, as well as, increased TBARS levels. Moreover, the enzymatic and non-enzymatic antioxidant defences were modified apparently to respond according to the augmented oxygen consumption. These results support the idea that an increase in mitochondrial ROS generation, underlying cellular oxidative damage, is a side effect of hyperthyroid-induced biochemical changes by which rat testis increase their metabolic capacity. In addition, hypothyroidism inhibited NTPDase activity in Sertoli cell cultures from young rats without alter the expression of NTPDase 1, 2 and 3. Our findings also demonstrate that TH modifies the NTPDase activities, probably via non-genomic mechanisms and consequently may influence the reproductive function throughout development. Concerning the effect of TH on neural cells, we first demonstrate that T3 and T4 stimulate the intermediate filament (IF) phosphorylation through PKA, PKCaMII and GABAergic mechanisms in cerebral cortex of 10 day-old rats. The dependence of PKA, PKC, L- and T-type Ca2+ channels were also evidenced on the effect of TH on 45Ca2+ uptake. Surprisingly, in cerebral cortex of 15 day-old rats, only T4 stimulate IF phosphorylation. The mechanisms underlying the action of T4 involve the activation of a Gi-protein coupled receptor. Moreover, we showed the participation of PLC, PKC, MAPK, PKCaMII and intracellular Ca2+ levels mediating the effects of T4 on the cytoskeleton. These findings demonstrate that T4 have important physiological roles modulating the cytoskeleton of neural cells during development. We further demonstrate that TH induce cytoskeleton reorganization and phosphorylation in C6 glioma cells and astrocytes and the participation of RhoA signaling pathway mediating this action. In conclusion, our results evidence genomic and nongenomic actions of TH promoting IF phosphorylation, cytoskeletal reorganization, Ca2+ influx and modulation of NTPDase activity by Ca2+- and kinase-mediated mechanisms. These results may contribute to a better knowledge of the mechanisms involved in the disorders observed in hyper and hypothyroidism during brain and testis maturation and development.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Departamento de Botânica, Programa de Pós-Graduação em Botânica, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2014-06-25T15:48:04Z No. of bitstreams: 1 2013_JulianeLanerToledo.pdf: 2609389 bytes, checksum: d5b19dc989390a2ba9b048c1b3ae0dd9 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-07-01T20:31:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_JulianeLanerToledo.pdf: 2609389 bytes, checksum: d5b19dc989390a2ba9b048c1b3ae0dd9 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-07-01T20:31:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_JulianeLanerToledo.pdf: 2609389 bytes, checksum: d5b19dc989390a2ba9b048c1b3ae0dd9 (MD5) / Alguns genes estão sempre expressos nas células, como é o caso dos genes constitutivos, outros estão sujeitos à regulação e são ativados somente quando a célula requisita seus produtos. A introdução de genes em plantas ou células vegetais permite a alteração dos níveis de expressão de genes envolvidos nas rotas metabólicas que se deseja estudar. Além disso, as alterações nos níveis de expressão gênica permitem estudar funcionalidade de genes, bem como obter um maior entendimento das vias biossintéticas em seus aspectos regulatórios. Assim, o presente trabalho teve como objetivo superexpressar e estudar a associação dos genes da geranil geranil difosfato sintase (GGPS), responsável pela síntese do precursor de terpenóides, com compostos alelopáticos em Arabidopsis thaliana L. Os terpenóides constituem umas das classes mais diversificadas de metabólitos secundários e desempenham funções na planta como reguladores do crescimento e desenvolvimento vegetal, além de estarem associados em interações da planta com o ambiente. Adicionalmente, os terpenos também têm sido encontrados em compostos alelopáticos. Em arabidopsis, o gene GGPS possui múltiplas cópias, entre elas, GGR, GGPS2 e GGPS6. Neste estudo, os vetores foram adquiridos através de um banco de genes de A. thaliana. Esses plasmídeos foram transferidos para Agrobacterium tumefaciens, e subsequentemente os genes da GGPS introduzidos em arabidopsis. Plantas de arabidopsis transgênicas foram selecionadas em meio MS com gentamicina. Foi possível selecionar plantas transgênicas apenas do gene GGR, cuja confirmação nessas plantas foi feita através de uma qPCR com primers específicos. Os efeitos da superexpressão do gene GGR no crescimento e desenvolvimento de plântulas de gergelim (Sesamum indicum L.), utilizada como planta alvo, foram analisados através de bioensaios com extrato aquoso de plantas de arabidopsis transgênicos e selvagens. Os resultados mostraram que o extrato de A. thaliana selvagem inibiu significativamente o crescimento de plântulas de gergelim. Além disso, os testes também mostraram que as plantas contendo o transgene GGR apresentaram efeito fitotóxico aproximadamente duas vezes maior que aquelas não transformadas. As análises de PCR em tempo foram utilizadas para comparar o número de cópias do gene GGR entre o DNA plasmidial e plantas transgênicas. Adicionalmente, o fato das plantas transgênicas terem apresentado toxicidade mais elevada do que aquelas não transformadas, foi possível estabelecer uma associação direta entre a síntese de terpenos e os compostos alelopáticos. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Some genes are expressed at all times; others are subject to regulation and activated only when the cells require their products. The introduction of genes into plants or plant cells allows the modification of expression levels of genes involved in metabolic pathways that have been targeted to be studied. In addition, changes in gene expression levels allow to investigate gene functionality, as well as to obtain a better understanding of regulatory aspects of biosynthetic routes. Thus, this work aimed to overexpress and study the association between geranyl geranyl diphosphate synthase genes (GGPS), which are responsible for the synthesis of terpenoid precursors, and allelopathic compounds in Arabidopsis thaliana L. Terpenoids are one of the most diverse classes of secondary metabolites in plants and perform several roles such as growth regulators, as well as have been associated with plant/environment interactions. Moreover, terpenes have also been found as components of allelopathic compounds. In arabidopsis, GGPS gene has multiple copies: among which are GGR, GGPS2 and GGPS6. For this study, the vectors containing each of these genes were acquired from an arabidopsis gene bank. These genes were transferred to Agrobacterium tumefaciens and subsequently introduced in arabidopsis plants. Transgenic arabidopsis plants were selected in MS medium with gentamicin. The only transgenic arabidopsis plants selected contained the GGR gene, whose presence was confirmed by a qPCR with specific primers. The effects of GGR overexpression on the growth and development of sesame seedlings (Sesamum indicum L.) were analyzed through bioassays with aqueous leaf extracts of arabidopsis transgenic plants in comparison with WT plants. The results showed that wild type (WT) arabidopsis inhibited the growth of sesame seedlings. Moreover, plants with GGR transgene showed twice the inhibition observed with WT. Real-time PCR analysis compared the number of GGR copies in plasmidial DNA with transformed plants. Moreover, as arabidopsis plants containing GGR transgene showed higher phytotoxicity than those non-transformed, a direct association between terpene syntheses and allelopathic compounds has been established.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, 2010. / Submitted by Elna Araújo (elna@bce.unb.br) on 2011-06-13T18:57:55Z No. of bitstreams: 1 2010_MariaLainePenhaTinoco.pdf: 5054232 bytes, checksum: 30658ac8cfaf7157c5a40d4216ab99ed (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2011-06-20T13:58:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_MariaLainePenhaTinoco.pdf: 5054232 bytes, checksum: 30658ac8cfaf7157c5a40d4216ab99ed (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-20T13:58:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_MariaLainePenhaTinoco.pdf: 5054232 bytes, checksum: 30658ac8cfaf7157c5a40d4216ab99ed (MD5) / Transcritos de RNA auto complementar formam um RNA dupla fita (dsRNA) que aciona uma degradação de uma seqüência específica de RNA mensageiro (mRNA), em um processo conhecido como RNA (RNAi) interferente levando ao silenciamento gênico. Em plantas vasculares, o tráfico de moléculas de RNAi ocorre entre células e sistemicamente por toda a planta. Sinais de RNAi pode espalhar sistematicamente ao longo de uma planta, mesmo em enxertos transgênicos sobre cavalos não-transgênicos. Há também um grande interesse na aplicação do RNAi para fungos patogênicos. A inibição específica da expressão gênica por RNAi tem se mostrado adequado para uma grande variedade de fungos filamentosos fitopatogênicos, no entanto, o silenciamento por dsRNA / siRNA não foi observado in vivo. Este estudo demonstra pela primeira vez o fenômeno de interferência in vivo no fungo patogênico Fusarium verticillioides, em que a expressão de um transgene foi especificamente silenciado pela inoculação de células do micélio em plantas transgênicas de fumo transformadas geneticamente para expressar pequenos RNAs de interferência (siRNA) a partir de um dsRNA correspondente ao transgene. Estas resultados fornecem uma poderosa ferramenta para estudos sobre a interação molecular plantapatógenos, e interações simbióticas. Do ponto de vista biotecnológico, silenciamento de genes de fungos por geração de siRNAs no hospedeiro fornece uma nova ferrameta para o desenvolvimento de estratégias de resistência de fungos nas plantas e outros organismos. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Self-complementary RNA transcripts form a double-stranded RNA (dsRNA) that triggers a sequence-specific mRNA degradation, in a process known as RNAinterference (RNAi), leading to gene silencing. In vascular plants, RNAi molecules trafficking occur between cells and systemically throughout the plant. RNAi signals can spread systemically throughout a plant, even across graft junctions from transgenic to non-transgenic stocks. There is also a great interest in applying RNAi to pathogenic fungi. Specific inhibition of gene expression by RNAi has been shown to be suitable for a multitude of phytopathogenic filamentous fungi; however, dsRNA/siRNA silencing effect has not been observed in vivo. This study demonstrates for the first time the in vivo interference phenomenon in the pathogenic fungus Fusarium verticillioides, in which expression of an individual fungal transgene was specifically abolished by inoculating mycelial cells in transgenic tobacco plants engineered to express small interfering RNAs (siRNA) from a dsRNA corresponding to the particular transgene. The results provide a powerful tool for further studies on molecular plant-microbe and symbiotic interactions. From a biotechnological perspective, silencing of fungal genes by generating siRNAs in the host provides a novel strategy for the development of broad fungi-resistance strategies in plants and other organisms.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2011. / Submitted by Max Lee da Silva (bruce1415@hotmail.com) on 2011-06-28T14:32:38Z No. of bitstreams: 1 2011_LucianaRamalhoDeFarias.pdf: 2230097 bytes, checksum: ad0589346d3e4e161f07d665eb227f60 (MD5) / Approved for entry into archive by Elna Araújo(elna@bce.unb.br) on 2011-07-04T19:52:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_LucianaRamalhoDeFarias.pdf: 2230097 bytes, checksum: ad0589346d3e4e161f07d665eb227f60 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-07-04T19:52:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_LucianaRamalhoDeFarias.pdf: 2230097 bytes, checksum: ad0589346d3e4e161f07d665eb227f60 (MD5) / O percevejo-marrom Euschistus heros é uma praga que reduz consideravelmente a produtividade nacional de culturas agrícolas de grande importância econômica, dentre elas a soja. Visando subsidiar o desenvolvimento de ferramentas biotecnológicas alternativas para auxílio no controle dessa praga, o presente trabalho realizou o estudo da expressão de genes relacionados à olfação e análise do perfil e sítios de expressão utilizando as técnicas de qPCR em Tempo Real e hibridização in situ, respectivamente. A prospecção foi realizada através da construção de uma biblioteca de cDNA a partir do RNA total extraído das antenas utilizando o kit Smart cDNA Library Construction (Clontech®). Mil clones foram sequenciados e, através de bioinformática, foram identificadas duas sequências de 477 e 294 pares bases pertencentes a genes da família das proteínas ligantes de odorantes (Odorant Binding Protein - OBP) que foram denominados EherOBP1 e EherOBP2, respectivamente. O EherOBP1 possui sequência deduzida de aminoácidos de 16 kDa e pI 5,18, peptídio sinal na extremidade N-terminal, domínio de ligação a feromônio (Pheromone Binding Protein – PBP) e seis resíduos de cisteína em posições conservadas, todas características esperadas para proteínas integrantes da família OBP. Embora parcial, a sequência deduzida de aminoácidos de EherOBP2 já pode também ser atribuída a função hipotética de proteína ligante a odor devido a presença do domínio PBP e cinco resíduos de cisteína em posições conservadas. A análise da expressão diferencial através de RT-PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) indicou que as antenas representam o principal sítio de produção da EherOBP1 em ambos os sexos, sendo a expressão nas antenas de macho cerca de três vezes maior que nas antenas de fêmeas. Em relação a EherOBP2, foi observada uma predominância da expressão nas antenas e abdômen de machos, sendo esta cerca de cinco vezes maior em relação à expressão observada nas antenas de fêmeas. A partir dos resultados obtidos com a localização da hibridização in situ nas antenas foi possível inferir que os mRNAs das EherOBPs são localizados especificamente na base dos órgãos olfativos (sensilas), havendo diferenças na expressão ao longo da antena entre machos e fêmeas. Neste trabalho foram identificados dois transcritos gênicos relacionados à olfação que codificam duas proteínas com provável função de ligação a odorantes. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / In Brazil, the stink bug Euschistus heros represents an important agricultural plague responsible for economic damages on several cultures, including the soy. Aiming the development of alternatives biotechnological tools, the present work conducted the study of the expression of genes related to olfaction through the construction of a cDNA library from transcripts (mRNA) isolated from the antennae and analysis of the profile and sites of expression using the techniques of real-time qPCR and in situ hybridization, respectively. cDNA library was successfully constructed from total RNA extract from adults antenna using the Smart cDNA Library Construction Kit (Clontech®). A total of 1000 cDNA clones were randomly selected and submitted to sequencing. Two transcripts encoding OBPs were identified by bioinformatics approaches. The E. heros OBPs nucleotide sequences showed 477 and 294 pb and were named as EherOBP1 and EherOBP2, respectively. The deduced amino acid sequence of EherOBP1 has16kDa and pI 5.18, signal peptide at the N-terminal, PBP domain and six cysteine residues in conserved positions, all the expected features for members of OBP protein family. Although partial, the deduced amino acid sequence of EherOBP2 can be assigned as a hypothetical Odorant Binding Protein due the presence of PBP domain and five cysteine residues in conserved positions. Analysis of differential expression by quantitative real time PCR indicated that antenna are the main production site of EherOBP1 in both sexes, and the expression in male antennae is about three times higher than in female antennae. Regarding to EherOBP2, there was a predominance of expression in the antennae and abdomen of males, which is about six times greater than the expression observed in the antennae of females. In situ hybridization results showed that EherOBPs mRNAs are specifically expressed on the base of the antenna olfactory organs (sensilas) with differences in the localization of the expression along the antenna of male and female. In this work were identified two transcripts related to olfaction encoding proteins with hypothetical function odorant binding.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Departamento de Nutrição, Programa de Pós-Graduação em Nutrição Humana, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-08-20T13:00:12Z No. of bitstreams: 1 2013_MarcelaSaBarretoCunha.pdf: 4969946 bytes, checksum: 5b0526cfc940c1401fbab3a6b3b01699 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-08-21T13:04:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_MarcelaSaBarretoCunha.pdf: 4969946 bytes, checksum: 5b0526cfc940c1401fbab3a6b3b01699 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-21T13:04:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_MarcelaSaBarretoCunha.pdf: 4969946 bytes, checksum: 5b0526cfc940c1401fbab3a6b3b01699 (MD5) / Introdução A vitamina A em suas diferentes formas, os retinoides, regulam a expressão de diversos genes, incluindo genes relacionados à diferenciação celular e à resposta anti-inflamatória. Além disso, os metabolismos da vitamina A e do ferro estão relacionados por um mecanismo ainda não esclarecido, mas sugere-se que a vitamina A module os níveis de mRNA de Hamp, que codifica o hormônio hepcidina, peptídeo central na regulação sistêmica de ferro. Considerando que a expressão de hepcidina é regulada por diversos fatores, incluindo o status de ferro, a eritropoiese e a inflamação e que a vitamina A pode modular o estado inflamatório e o metabolismo de ferro, o presente estudo investigou o efeito da deficiência de vitamina A nos biomarcadores moleculares do metabolismo de ferro e da resposta inflamatória e a expressão dos genes envolvidos nestes sistemas. Métodos Trinta ratos Wistar machos foram tratados por 59 dias com uma das seguintes dietas: dieta Controle; dieta deficiente em vitamina A (VAD); dieta deficiente em ferro (FeD); dieta deficiente em vitamina A e ferro (VAFeD) e dieta todo-trans ácido retinoico (atRA). O fígado, o baço, o intestino, o coração e o rim foram removidos para determinação dos níveis de mRNA de: hepcidina e supressor da sinalização de citocinas 3, no fígado; de heme oxigenase-1, interleucina-6 (IL-6) e interleucina-1β (IL-1β) no fígado e no baço; de eritropoietina no rim e de ferroportina no baço, por sistema de reação da polimerase em cadeia em tempo-real (qPCR). A concentração de ferro nos cinco tecidos estudados foi determinada por espectroscopia de emissão atômica e os parâmetros de ferro sérico foram determinados utilizando kits comerciais. A concentração sérica de IL-6 e IL-1β foi determinada por ELISA e a atividade específica de heme oxigenase-1 foi avaliada por espectrofotometria. As comparações entre os grupos de tratamento foram realizadas utilizando teste t-student para amostras independentes e o valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente diferente. Resultados A deficiência de vitamina A (VAD) causou diminuição dos parâmetros séricos de ferro; aumentou a concentração de ferro no baço, os níveis de mRNA de IL-6 no fígado e a concentração sérica de IL-6 e IL-1β; observou-se também redução dos níveis de mRNA de hepcidina hepática e de eritropoietina renal, aumento dos níveis de mRNA de ferroportina no baço e de heme-oxigenase 1 no fígado e no baço, enquanto observou-se redução na atividade específica de heme oxigenase-1, comparado aos ratos Controle. Os ratos deficientes em ferro (FeD) apresentaram redução dos parâmetros séricos de ferro com concomitante redução da concentração de ferro nos cinco tecidos estudados; também apresentaram aumento dos níveis de mRNA de IL-6 no fígado e da concentração sérica de proteína de IL-6 e IL-1β, enquanto apresentaram diminuição dos níveis de mRNA de hepcidina, em relação ao grupo Controle. A associação das deficiências de vitamina A e ferro (VAFeD) também reduziu os parâmetros séricos de ferro e a concentração de ferro nos tecidos, comparado ao Controle, enquanto provocou aumento da concentração sérica de proteína IL-6, diminuição dos níveis de mRNA de hepcidina hepática. A utilização do todo-trans ácido retinoico (atRA) como fonte de vitamina A resultou na diminução de ferro sérico e concentração de transferrina; aumento da concentração de ferro no fígado, diminuição dos níveis de ferro no baço e no intestino, aumento dos níveis séricos de proteína de IL-6 e IL-1β e diminuição do mRNA de hepcidina hepática, em relação ao grupo Controle. Conclusão Os resultados sugerem que a deficiência de vitamina A causa uma eritropoiese ineficaz, pela diminuição dos níveis de mRNA de eritropoietina renal, levando a má-formação de eritrócitos e consequente acúmulo de grupo heme no baço desses ratos. O grupo heme retido no baço e no fígado leva a uma deficiência sistêmica de ferro nos organismos deficiente em vitamina A. Portanto a deficiência de vitamina A modula indiretamente a homeostase sistêmica de ferro por aumentar a fagocitose de eritrócitos indiferenciados. ___________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Introduction The vitamin A in its various forms, the retinoids, regulate the expression of various genes, including genes related to cell differentiation and anti-inflammatory response. Furthermore, the metabolism of iron and vitamin A are interconected by a mechanism that remains not elucidated, but it is suggested that vitamin A modulates Hamp mRNA levels, which encodes the hormone hepcidin, peptide that is central in the systemic regulation of iron metabolism. Whereas the expression of hepcidin is regulated by several factors, including iron status, erythropoiesis and inflammation and that vitamin A may modulate the inflammatory status and iron metabolism, the present study investigated the effect of vitamin A deficiency in molecular biomarkers of iron metabolism and inflammatory response and the expression of the genes involved in these systems. Methods Thirty male Wistar rats were treated for 59 days with one of the following diets: Control diet; vitamin A deficient diet (VAD); iron deficient diet (FeD); vitamin A and iron deficient diet (VAFeD) and the all-trans retinoic acid diet (atRA). The liver, spleen, gut, heart and kidney were excised to determine the mRNA levels of hepcidin and suppressor of cytokine signaling 3 in liver; heme oxigenase-1, interleukin-6 (IL-6) and interleukin-1β (IL-1β) mRNA levels in liver and spleen; mRNA levels of erythropoietin in kidney and ferroportin in spleen, by reverse transcription- polymerase chain reaction analysis (qPCR). Total iron concentration in the five studied tissues was determined by atomic emission spectrometer and serum iron parameters were determined using commercial kits. The serum concentration of IL-6 and IL-1β was quantified by ELISA assay, and heme oxygenase-1 specific activity was assessed by a colorimetric test. Comparisons among the test groups were done using independent sample test t-test and in all tests, a value of p < 0.05 was considered statistically significant. Results The vitamin A deficiency (VAD) reduced serum iron parameters, increased the iron concentration of in the spleen, the levels of IL-6 mRNA in liver and serum concentration of IL-6 and IL-1β; it was also observed a reduction in the mRNA levels of hepatic hepcidin and renal erythropoietin, an increase of mRNA levels of ferroportin in spleen, heme oxygenase-1 in liver and spleen, whereas there was a decrease in the specific activity of heme oxygenase-1 compared to Control rats. The rats iron deficient (FeD) showed decreased serum iron parameters with concomitant reduction of the iron concentration in the five tissues studied; it was observed an increase of IL-6 mRNA levels in liver and serum protein concentration of IL-6 and IL-1β, while showed decreased levels of hepcidin mRNA compared to Control group. The combination of vitamin A and iron deficiencies (VAFeD) also reduced the serum iron and its concentration in tissues, while caused an increase in serum IL-6 protein and decreased of hepatic hepcidin mRNA levels, compared to Control. The utilzation of all-trans retinoic acid (atRA) as a source of vitamin A resulted in a decrease in serum iron and transferrin concentration, an increase of iron concentration in the liver, reduction iron levels in the spleen and gut, an increase of IL-6 and IL-1β serum levels and a reduction of hepatic hepcidin mRNA, compared to Control group. Conclusion In summary, these results suggest that vitamin A deficiency leads to an ineffective erythropoiesis by the down-regulation of renal erythropoietin expression in kidney, resulting in erythrocytes malformation and consequent accumulation of heme group in the spleen. The heme group arrested in spleen and liver leads to a systemic iron deficiency in vitamin A deficient organism. In conclusion, vitamin A deficiency indirectly modulates systemic iron homeostasis by enhancing erythrophagocytosis of undifferentiated erythrocytes.

A doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) compreende um amplo espectro morfológico de doenças com potencial de progressão em pacientes sem história de etilismo. Pode evoluir para esteatohepatite não alcoólica (EHNA), fibrose, cirrose e carcinoma hepatocelular. Com intuito de investigar as diferenças genéticas entre tecido hepático normal e cirrose secundária a EHNA, utilizamos microarranjos de oligonucleotídeos (CodeLink Uniset Human Whole Genome Bioarray System GE Healthcare - Bio-Sciences, Chalfont St. Giles, UK) para caracterizar os perfis de expressão nas duas condições. Analisamos 3 amostras de cirrose secundária a EHNA e 3 amostras de fígado normal provenientes de doadores durante o transplante hepático. Para a análise dos dados utilizamos o programa GenesifterTM analysis (VizX Labs LLC, Seattle, WA, USA; http://www.genesifter.net) para identificar os genes diferencialmente expressos e também as vias biológicas moduladas de acordo com a ontologia gênica. Posteriormente, para avaliarmos a expressão imunohistoquímica utilizamos a técnica de microarranjo tecidual em amostras de fígado normal (n=12), cirrose secundária a EHNA (n=10) e cirroses de outras etiologias (n=37). Identificamos 244 genes significativamente alterados em pelo menos 2 vezes. Destes, 138 genes apresentavam-se com expressão aumentada e 106 genes com expressão diminuída na cirrose secundária a EHNA comparados ao fígado normal. Foram selecionadas 9 vias metabólicas significativamente desreguladas. Dentre estas vias identificadas na cirrose secundária a EHNA, selecionamos a via de sinalização do mTOR e seu efetor 4EBP-1 para a análise da expressão protéica. Houve aumento significativo na expressão de 4EBP-1 no fígado normal comparado às outras cirroses, assim como na cirrose secundária a EHNA versus outras cirroses. Quanto à forma fosforilada houve apenas diferença na expressão entre fígado normal e cirroses de outras etiologias. A expressão de mTOR mostrou aumento significativo entre cirroses de outras etiologias quando comparadas ao fígado normal e cirrose secundária a EHNA. A expressão de mTOR fosforilado foi maior na cirrose secundária a EHNA quando comparada às cirroses de outras etiologias e fígado normal. Estudos recentes têm sugerido o papel do mTOR na DHGNA e o presente estudo corrobora a participação desta via também na cirrose secundária a EHNA. A avaliação imunohistoquímica de 4EBP-1 e mTOR fosforilado pode ser útil clinicamente para o diagnóstico diferencial entre cirrose secundária a EHNA versus cirroses de outras etiologias, quando a etiologia é desconhecida / Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) encompasses the whole spectrum of steatosis, non-alcoholic steatohepatitis (NASH), and NASH-related cirrhosis (NASH/Cir). NASH/Cir can progress to hepatocellular carcinoma and reoccur post transplantation. Although molecular advances have been made in this field, the patogenesis of NAFLD is not completely understood. In an effort to investigate genetic differences between normal liver and NASH/Cir, first we used cDNA microarray (CodeLink Uniset Human Whole Genome Bioarray System GE Healthcare - Bio-Sciences, Chalfont St. Giles, UK) in normal liver from donor liver wedge biopsies taken at transplantation (n=3) and confirmed NASH/Cir tissues (n=3) and GenesifterTM analysis (VizX Labs LLC, Seattle, WA, USA; http://www.genesifter.net) to identify differentially expressed genes and biological pathways according to gene ontology (GO). Second, tissue microarray was used to determine immunohistochemical expression in normal liver samples (n=12), NASH/Cir (n=10) and in cirrhosis of other etiologies (n=37). Analysis of microarray data resulted in 244 genes changed in at least 2-fold with statistically significant ratio: 138 and 106 genes were, respectively, up and downregulated in NASH/Cir in comparison to normal liver. GO analysis by GeneSifterTM software identified nine statistically significant pathways containing differentially expressed genes. Among the 9 pathways identified as significantly modulated in NASH/Cir, we selected mTOR pathway and its downstream effector for immunohistochemical analysis. There was a significant increase in the expression of 4EBP-1 in normal liver compared to the other cirrhosis, as well as to NASH/Cir versus other cirrhosis. The phosphorylated 4EBP-1 showed only difference in expression between normal liver and cirrhosis of other etiologies. The expression of mTOR showed a significant increase in other cirrhosis when compared with normal liver and NASH/Cir. The expression of phosphorylated mTOR was higher in NASH/Cir when compared to other cirrhosis and normal liver. Recent findings have suggested a role for the cellular nutrient sensor mTOR in NAFLD and the present study corroborates the participation of this pathway in NASH/Cir. 4EBP-1 and phospho-mTOR evaluation might be of clinical utility as differential diagnostic of NASH/Cir from other cirrhosis, without knowing etiology

INTRODUÇÃO: Os mecanismos moleculares que levam ao desenvolvimento do hiperparatireoidismo primário (pHPT) ainda são desconhecidos. No entanto, alguns genes parecem ter seu papel definido na oncogênese das paratireóides, como os genes PRAD1 e MEN-1 que apresentam expressão aumentada em adenomas de pacientes com pHPT em relação ao tecido normal. Outro achado importante é a expressão aumentada do gene HRPT2 em carcinomas de paratireóide familiares ou não. A distinção entre hiperplasia, adenoma e carcinoma é difícil pelas limitações técnicas dos exames histo-patológicos atuais. Assim, este estudo tem como objetivo central identificar genes que possam servir como marcadores diferenciais entre hiperplasia, adenoma e carcinoma em pacientes com pHPT, com o intuito utilizá-los de forma auxiliar no diagnóstico diferencial destas condições. MÉTODOS: Foram empregadas três metodologias: 1) utilização de clones obtidos no Projeto Genoma Humano do Câncer (HCGP) que foram fixados em membrana e hibridizados com sonda ora de adenomas (n = 2) ora de carcinoma (n = 1). 2) utilização de membranas comerciais (Atlas© cDNA Expression Array Human Oncogene/Tumor Suppressor, Human Cancer 1.2. BD Biosciences Clontech. Palo Alto, USA) contendo respectivamente 190 e 1176 genes conhecidos, utilizadas como substrato para hibridização com sondas de adenoma e carcinoma. 3) desenvolvimento da técnica de RDA (Representational Difference Analysis) para obtenção de fragmentos de cDNA diferencialmente expressos que foram clonados e seqüenciados para posterior análise. Os genes diferencialmente expressos, entre adenoma e carcinoma obtidos nas três metodologias tiveram sua expressão confirmada por RT-PCR em tecidos de paratireóide de pacientes portadores de pHPT, entre eles: hiperplasias, adenomas e carcinomas. RESULTADOS: foram escolhidos para confirmação por PCR os genes: IRF-1, RAF, TIMP-3, NOTCH-2 e bFGF, cuja expressão nas membranas mostrou-se aumentada nos adenomas e os genes IGF-1-R, PTK7 e RET, cuja expressão mostrou-se elevada nos carcinomas. Dois genes tiveram sua expressão diferencial confirmada. O gene IRF-1, apresenta expressão diminuída nas três condições estudadas (hiperplasia, adenoma e carcinoma) quando comparada à expressão do tecido normal. O gene PTK7, confirmou sua expressão aumentada nas amostras de carcinomas quando comparadas às hiperplasias e aos adenomas. DISCUSSÃO: Os dois genes que apresentaram sua expressão diferencial confirmada, IRF-1 e PTK7, não foram , até o momento, descritos como coadjuvantes no aparecimento e progressão tumoral nas paratireóides. Nossos achados associaram o gene supressor tumoral IRF-1 ao aparecimento de alterações morfológicas e funcionais nas paratireóides, uma vez que sua expressão nos tecidos acometidos por hiperplasia, adenoma ou carcinoma é sensivelmente menor que aquela encontrada nos tecidos normais, sugerindo que este gene tenha importante papel nos eventos iniciais de tumorigênese desta glândula. Por outro lado, expressão aumentada de PTK7 já foi descrita em tumores malignos de diversos tecidos. Embora seus mecanismos de ativação e ação permaneçam desconhecidos, nossos achados corroboram os da literatura e sugerem que este gene participe dos mecanismos moleculares de transformação celular nas paratireóides / INTRODUCTION: The molecular mechanisms to the development of primary hyperparathyroidism (pHPT) are still unknown. Otherwise, several genes as PRAD1 and MEN-1 seem to play a role in parathyroid oncogenesis and are highly expressed in adenomas of pHPT patients when compared to normal glands. Another important data is the increased expression of HRPT2 in familiar and non-familiar parathyroid carcinomas. The distinction among hyperplasia, adenoma and carcinoma is a difficult task because there are limits in histopathologic parathyroid analysis in our days. This study has as main goal to identify genes that might help to distinguish hyperplasias from adenomas and both from carcinomas in pHPT patients. METHODS: Three techniques were employed: 1) clones from Human Cancer Genome Project (HCGP) fixed in membranes and hybridized with adenomas or carcinoma probes; 2) commercially available membranes (Atlas© cDNA Expression Array Human Oncogene/Tumor Suppressor, Human Cancer 1.2. BD Biosciences Clontech. Palo Alto, USA) which contain 190 and 1176 identified genes that were employed as substrate to hybridization with adenomas (n = 2) and carcinoma (n = 1) probes; 3) RDA technique (Representational Difference Analysis) in order to obtain differentially expressed cDNA fragments what in other steps were cloned and sequenced for further analysis. The genes, obtained from the three methods, that were differentially expressed between adenomas and carcinomas had their expression evaluated by RT-PCR in parathyroid tissues from patients bearing pHPT caused by hyperplasias, adenomas or carcinomas. RESULTS: genes chosen for PCR analysis: IRF-1, RAF, TIMP-3, NOTCH-2 and bFGF, whose expressions in the membrane were increased in adenomas and the genes IGF-1-R, PTK7 and RET, whose expression in the membrane were increased in carcinomas. Two genes had their differential expression confirmed. The IRF-1 had a decreased expression in the three situations of pHPT (hyperplasia, adenoma and carcinoma) when compared to its expression in the normal gland. The gene PTK7 confirmed its increased expression in samples obtained from carcinomas when compared to hyperplasias or to adenomas. DISCUSSION: The two genes whose differential expressions were confirmed, IRF-1 and PTK7, have not been described till this moment as coadjutants in the beginning or progression of parathyroid tumors. Our results associate the tumor suppressor gene IRF-1 to the origin of morphological and functional disturbs in parathyroid, because its expression in hyperplasia, adenoma or carcinoma of this gland were clearly lower in these conditions when compared to normal tissues, thus suggesting an important role of this gene in early steps of parathyroid oncogenesis. On the other hand, increased expression of PTK7 has already been described in malignant tumors of several tissues. Although their mechanisms of activation and action remain unknown, our results reinforce the literature data and suggest that this gene shares the molecular mechanisms of cell transformation in parathyroids

CONTEXTO: A secreção de prolactina (PRL) e a expressão de seu gene são inibidas pela dopamina. Prolactinomas são os adenomas hipofisários funcionantes mais freqüentes, sendo que os agonistas dopaminérgicos são a primeira escolha para seu tratamento. No entanto, uma porcentagem dos pacientes é resistente aos agonistas dopaminérgicos. OBJETIVO: Como os mecanismos envolvidos na resistência aos agonistas dopaminérgicos não são totalmente compreendidos, o objetivo deste estudo foi obter mais informações no que diz respeito às alterações moleculares entre os prolactinomas sensíveis e resistentes aos agonistas dopaminérgicos. PACIENTES: O tecido tumoral de 22 pacientes com prolactinomas foram coletados e classificados como sensíveis ou resistentes (incluindo aqueles com crescimento tumoral) de acordo com sua resposta clínica e laboratorial aos agonistas dopaminérgicos. MÉTODOS: A expressão de 7 genes foi avaliada por Real Time polymerase chain reaction: gene do receptor de dopamina tipo 2 (DRD2), do fator de crescimento neural beta (NGF?) e de seu receptor (NGFR), dos receptores de estrógeno alfa (ESR1) e beta (ESR2), do pituitary tumor transforming gene (PTTG) e da metalotioneína 3 (MT3). RESULTADOS: A expressão mediana de DRD2 e de NGFR nos pacientes sensíveis foi significativamente maior quando comparada aos resistentes (p= 0.016 e p= 0.009, respectivamente). Além disso, ambas expressões estiveram significativamente correlacionadas positivamente com a redução da PRL durante o tratamento (r= ?0.66; p= 0.002 e r= 0.57; p= 0.017; respectivamente). Uma correlação positiva foi encontrada entre a mediana de expressão do NGF? e do DRD2 (r=0.53; p=0.023) e entre a mediana de expressão do PTTG e do ESR2 (r=0.66; p=0.008). também houve correlação entre a os valores de PRL sérica antes do tratamento e a mediana de expressão do gene do ESR2 (r=0.53, p=0.04). Não foi encontrada nenhuma correlação entre a expressão do gene da MT3 e a sensibilidade ou resistência aos agonistas dopaminérgicos. CONCLUSÕES: A expressão do gene do DRD2 e do NGFR estão relacionadas com a sensibilidade dos prolactinomas aos agonistas dopaminérgicos, enquanto a expressão do gene do PTTG e do ESR2 podem ter alguma relação com a agressividade tumoral. A resposta dos prolactinomas aos agonistas dopaminérgicos deve ser vista como um espectro variando do tumor mais sensível ao mais resistente com crescimento / CONTEXT: Prolactin (PRL) secretion and its gene expression are inhibited by dopamine. Prolactinomas are the most common secreting pituitary adenomas, with dopamine agonists being the first choice for their treatment. However, a subset of patients is resistant to dopamine agonists. OBJECTIVE: As the mechanisms involved in dopamine agonists resistance are not fully understood, the aim of this study was to get new insights regarding the molecular differences between prolactinomas responsive and resistant to dopamine agonists. PATIENTS: Tumor tissue of 22 patients harboring prolactinomas were collected and classified as responsive or resistant (including the ones with tumor growth) according to their clinical and laboratorial response to dopamine agonists. METHODS: The expression of 7 genes was evaluated by Real Time polymerase chain reaction: dopamine receptor type 2 (DRD2), nerve growth factor beta (NGF?) and its receptor (NGFR), estrogen receptor alpha (ESR1), beta (ESR2), pituitary tumor transforming gene (PTTG) and metallothionein 3 (MT3). RESULTS: Median DRD2 and NGFR expressions of responsive patients were significantly higher compared to the resistant ones (p= 0.016 and p= 0.009, respectively). Moreover, both expressions were positively correlated with PRL decrease during treatment (r= ?0.66; p= 0.002 and r= 0.57; p= 0.017; respectively). A positive correlation was found between NGFB and DRD2 (r= 0.53; p= 0.023) and PTTG and ESR2 expressions (r= 0.66; p= 0.008). There was also a correlation between serum PRL levels before treatment and ESR2 expression (r= 0.53, p= 0.04). It was not observed correlation between MT3 and responsiveness or resistance to dopamine agonists. CONCLUSIONS: DRD2 and NGFR expressions are related to prolactinoma responsiveness to dopamine agonists whereas PTTG and ESR2 may have a role in tumor aggressiveness. The response of prolactinomas to dopamine agonists should be view as a spectrum ranging from responsive to resistant with tumor growth

Neste trabalho desenvolvemos um novo algoritmo para clustering para dados de expressão gênica. As abordagens tradicionais utilizam um conjunto de dados na forma de uma tabela de duas dimensões, onde as linhas são os genes e as colunas são as condições experimentais. Nós utilizamos uma estrutura de três dimensões, acrescentando fatias de tempo. Implementamos nosso algoritmo e testamos com conjuntos de dados sintéticos e dados reais, usando índices de validação para comparar os resultados obtidos pelo nosso algoritmo com os resultados produzidos pelo algoritmo TriCluster. Os resultados mostraram que o nosso algoritmo é bom para dados de expressão gênica em três dimensões e pode ser aplicado a dados de outros domínios / In this study we developed a new clustring algorithm for gene expression data. Previous solutions use a dataset in the form of a table, where the rows are the genes and the columns are the experimental conditions. We used a three-dimensional structure adding time-slices. We implemented this algorithm and tested it with synthetic and real data, using validation index to compare our results with the results obtained by the TriCluster algotithm. Results show that our solution is good for three dimensional gene expression data and can be employed to other domains