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Etude fonctionnelle de trois facteurs de transcription impliqués dans la formation de la paroi secondaire chez le peuplier / Functional study of three transcription factors involved in secondary cell wall formation in poplarLakhal, Wassim 18 December 2013 (has links)
Les facteurs de transcription (FT) de la famille R2R3-MYB chez les plantes jouent un rôle important dans la formation de la paroi secondaire des cellules de bois, que ce soit en activant ou en réprimant leurs gènes cibles au sein d’un réseau régulationnel complexe. Dans ce travail, nous avons utilisé la transgénèse et l’immunoprécipitation de chromatine associée à un séquençage haut-débit (ChIP-SEQ) pour déterminer la fonction de 3 FT R2R3-MYB chez le peuplier. Les peupliers surexprimant MYB090 ont des rayons moins lignifiés ; les tiges présentent une réduction de croissance et de teneurs en lignines. MYB090 régule ses cibles à l’aide d’un motif très conservé, similaire au motif Gamyb. Ses cibles sont impliquées notamment dans la biosynthèse des lignines, cellulose et xylanes, constituants principaux des parois. Les plantes surexprimant MYB221-SRDX et MYB156 présentent une nette réduction de la lignification des parois de leurs fibres, associée à une réduction de croissance. MYB221 semble avoir pour cibles des gènes codant pour des enzymes du métabolisme, ainsi qu’un autre FT de type R2R3-MYB, dont la régulation passe par un motif conservé de type SMRE (Secondary wall MYB-Responsive Element). En conclusion, la combinaison des approches ChIP-SEQ et de transgénèse montre que MYB090 semble être un répresseur transcriptionnel de la lignification, notamment dans les rayons, et de la formation de la paroi secondaire. De même, MYB156 et MYB221 seraient également des répresseurs de la lignification, dans les fibres et les rayons. Cette thèse ouvre des perspectives sur l’établissement de réseaux de régulation transcriptionnelle de la formation de la paroi secondaire. / Plant R2R3-MYB transcription factors (TF) play an important role in secondary cell wall formation in wood cells, by activating or repressing their target genes within a complex regulatory network. Here, we used genetic engineering and chromatin immunoprecipitation technique, associated to next-generation sequencing (ChIP-SEQ) to determine the function of 3 R2R3-MYB TF in poplar. Plants overexpressing MYB090 had less lignified parenchyma rays. The stem growth and total lignin content were reduced. MYB090 regulates target genes through a highly conserved motif, similar to Gamyb. Its target genes are involved in lignin, cellulose and xylan biosynthesis, which are the major components of secondary cell wall. Poplars overexpressing MYB221-SRDX and MYB156 showed a decrease in fiber cell wall lignification, and a reduced growth. MYB221 have targets encoding for metabolic enzymes but also for another R2R3-MYB TF. MYB221 recognizes its target genes, most probably through SMRE (Secondary wall MYB-Responsive Element) conserved motif. In conclusion, the combination of ChIP-SEQ and genetic engineering approaches shows that MYB090 seems to be a transcriptional repressor of lignification, especially in parenchyma rays. MYB156 and MYB221 are also negative regulators of secondary cell wall lignification, in fibers and parenchyma rays. This work opens new avenues on the building of transcriptional regulatory networks involved in secondary cell wall formation.
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Etude de la complexité des éléments Cis-régulateurs chez les mammifères en utilisant des approches à haut débit / Study of cis-regulatory elements complexity in mammals using high-throughput approachesGriffon, Aurelien 02 June 2015 (has links)
La régulation des gènes est à l’origine de la diversité cellulaire en permettant aux cellules de se différencier et de se spécialiser. La régulation génique repose largement sur l’existence de séquences d’ADN non codantes dans le génome, appelées "éléments cis-régulateurs", qui vont permettre de recruter de nombreux facteurs de transcription afin de former d’importants complexes (nucléo)protéiques qui vont agir sur le niveau de transcription des gènes. Ce recrutement est notamment contrôlé par des modifications épigénétiques. Le développement des techniques de séquençage et des méthodes d’analyse bioinformatiques permettent d’intégrer de grandes quantités de données pour étudier le fonctionnement des éléments régulateurs. Dans un premier temps, l’intégration de l’ensemble des données ChIP-seq disponibles dans les bases de données nous a permis de créer un catalogue d’éléments régulateurs putatifs chez l’Homme. L’analyse de ce catalogue nous a alors mené à caractériser ces éléments et à mettre en évidence la complexité combinatoire des facteurs de transcription. Dans un deuxième temps, nous avons réalisé une étude basée sur l’analyse des éléments régulateurs impliqués dans la différenciation précoce des lymphocytes T chez la souris. Cette étude a permis de mettre en évidence deux niveaux de complexité impliqués dans la régulation des gènes : le premier est basé sur la combinatoire des facteurs de transcription au sein des éléments régulateurs et le second repose sur la combinatoire des éléments eux-mêmes. Finalement, nous avons développé une nouvelle technique d’analyse quantitative et à haut débit de l’activité régulatrice de régions génomiques chez les mammifères. / Gene regulation is responsible for cell diversity by allowing cell differentiation and specialisation. Gene expression regulation relies mainly on the existence of non-coding DNA sequences in the genome, called "cis-regulatory elements", which recruit numerous transcription factors to form (nucleo)protein complexes which act on the gene transcription level. This recruitment is controlled in particular by epigenetic modifications. The rapid development of sequencing technologies and bioinformatics methods makes possible the integration of large amounts of data to study regulatory elements. First, the integration of ChIP-seq data for all transcription factors available in public databases has allowed us to create an extensive catalogue of putative regulatory elements in the human genome. The overall analysis of this catalogue led us to further characterize these elements and to highlight the high level of combinatorial complexity of transcription factors in the genome. Secondly, we conducted a more specific study based on the analysis of the regulatory elements involved in the early differentiation of T-cells in mice. This study provided an opportunity to highlight two levels of complexity based on regulatory elements and involved in gene regulation: the first rests on the transcription factor combinatorial in regulatory elements and the second is based on the combinatorial of elements themselves within loci. Finally, to validate experimentally the regulatory elements, we have developed a new quantitative and high-throughput technique to assess the regulatory activity of genomic regions in mammals.
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Régulation in labo et in situ de l'expression de génomes de souches bactériennes méthylotrophes dégradant le dichlorométhane / Regulation of in labo and in situ genome expression of dichloromethane-degrading methylotrophic bacteriaMaucourt, Bruno 24 January 2019 (has links)
Le dichlorométhane (DCM ; CH2Cl2) est un polluant chloré toxique émis dans l’environnement principalement par les activités industrielles. Ce polluant peut être dégradé par des bactéries méthylotrophes qui utilisent des composés en C1 réduits comme seule source de carbone et d’énergie. La protéobactérie Methylorubrum extorquens DM4 porte quatre gènes dcm au sein du transposon catabolique dcm très conservé chez les bactéries dégradant le DCM. Le gène dcmA code la DCM déshalogénase de la famille des glutathion-S transférases essentielle à la croissance avec le DCM. Son activité est modulée par DcmR, un facteur de transcription qui régule l’expression de dcmA ainsi que son propre gène, orienté de manière divergente par rapport à dcmA. DcmR porte un domaine hélice-tour-hélice de fixation à l'ADN et un second domaine appelé methanogen / methylotroph, DcmR sensory (MEDS) potentiellement impliqué dans la fixation d’un composé hydrocarboné ligand. Les objectifs de ma thèse étaient de répondre à plusieurs questions : i) quel est le niveau d’expression des transcrits dcm et des protéines correspondantes par rapport à d’autres gènes et protéines dont l’abondance est modifiée en réponse à la croissance sur le DCM ? ii) Comment le facteur de transcription DcmR intervient-il dans la régulation des gènes dcm ? iii) Quelle est la variabilité du gène dcmR et de son environnement génétique in situ ? Des méthodes globales « -omiques » de transcriptomique et de protéomique ont permis d’inventorier les ARN et les protéines dont l’abondance varie chez la souche sauvage DM4 cultivée soit avec le DCM ou le méthanol, le substrat de référence de la méthylotrophie. Les gènes dcm sont parmi les plus exprimés en présence de DCM, ce qui confirme leur régulation en présence de DCM. Deux approches complémentaires ciblant la détermination des sites d’initiation de la transcription (TSS-Seq) et de la traduction (N-terminome) ont permis la recherche de motifs de régulation dans les régions 5’UTR (5’-untranslated terminal region) et les promoteurs de gènes régulés en réponse à la croissance avec le DCM. Le rôle régulateur de dcmR a été étudié en comparant les phénotypes de croissance, l’activité promotrice par fusion transcriptionnelle, la quantification des ARN et des protéines des gènes dcm chez la souche sauvage par rapport à des mutants du gène dcmR seul ou combiné à d’autres gènes dcm mutés. Ces travaux ont permis de confirmer qu’en absence de DCM, DcmR inhibe la transcription de son propre gène ainsi que celle de dcmA. Outre DcmR, la répression nécessite aussi l’expression d’au moins un des autres gènes dcm et ceci par un mécanisme indépendant des boîtes de 12 pb conservées dans les promoteurs des gènes dcmR et dcmA. Lors de la croissance en condition DCM, l’absence du gène dcmR confère une vitesse de croissance ralentie, qui ne résulte pas d’une différence de production des ARN et des protéines codées par le transposon dcm. Pour que l’expression du gène dcmA soit activée, l’ensemble de la région intergénique entre dcmR et dcmA doit être présente, ce qui suggère la présence de sites de régulation pour la fixation d’un facteur de transcription indépendant de DcmR. L’ensemble de ces résultats a permis de proposer un nouveau modèle de régulation des gènes dcm. Alors que le gène dcmR a été détecté en quantité similaire à celle du gène dcmA par qPCR dans des échantillons de sites contaminés par le DCM, une analyse bioinformatique à partir des données de séquences indique que des gènes dcmR-like sont trouvés dans d’autres contextes génétiques que celui du transposon catabolique dcm. Ainsi, DcmR pourrait exercer un rôle de régulateur dans d’autres contextes ouvrant de nouvelles pistes pour l’identification des ligands du domaine MEDS. / Dichloromethane (DCM; CH2Cl2) is a toxic chlorinated pollutant mainly emitted in the environment through industrial activities. Some methylotrophic bacteria that utilize reduced one carbon compounds as sole source of carbon and energy can degrade DCM. The four dcm genes found in the catabolic dcm transposon are highly conserved among DCM-degrading bacteria, including in the Proteobacterium Methylorubrum extorquens DM4. The dcmA gene encodes a DCM dehalogenase of the glutathione-S transferase family which is essential for growth with DCM. The transcriptional factor DcmR regulates the expression of dcmA and its own gene, two genes which are divergently oriented. DcmR consists of a helix-turn-helix domain for DNA fixation and of a domain, called MEDS for ‘methanogen / methylotroph, DcmR sensory’, proposed to bind a hydrocarbon ligand. The aim of my PhD was to address the following questions: i) What is the expression level of dcm transcripts and their corresponding proteins compared to other genes and proteins whose abundance is modulated in response to growth with DCM? ii) How does DcmR regulate the expression of the dcm genes? iii) How variable is dcmR and its genetic environment in situ? Global transcriptomic and proteomic approaches were followed to inventory transcripts and proteins whose abundance varied in the wild-type DM4 strain grown with DCM compared to with methanol, the reference substrate for methylotrophy. The dcm genes were among the most expressed in cultures grown with DCM, confirming their regulation in response to DCM. The identification of transcription start sites (TSS-Seq) and translation starts (N-terminome) allowed the subsequent search for regulation motifs in the promoter and 5’-untranslated terminal regions (5’UTR) of regulated genes in response to DCM utilization. The role of dcmR was studied using growth phenotypes, promoter activities in transcription fusion assays, dcm transcript and corresponding protein product quantification, comparing the wild-type strain with strains mutated only in dcmR, or also in other dcm genes. In absence of DCM, DcmR inhibited the transcription of its own gene and of dcmA. In addition to DcmR, repression requires the expression of one of the other dcm genes by a mechanism that does not involve previously predicted DcmR-binding sites (a 12 bp conserved box shared by dcmR and dcmA promoters). Mutants with impaired dcmR show slower growth with DCM, although no difference in transcript or protein abundance encoded by the dcm transposon was observed. The complete dcmR-dcmA intergenic region was shown to be required to activate dcmA expression. This suggests that regulatory sites present in the intergenic region may be involved in DcmR-independent transcription activation. Taken together, these data allowed to propose a new model of dcm gene regulation. The dcmR gene was detected and quantified in similar amounts as dcmA in DCM-contaminated environmental samples, despite the fact that bioinformatics analysis of sequence databases suggests that dcmR-like genes are not necessary associated with the catabolic dcm transposon. Thus, DcmR may play a role in other contexts. This may provide new leads for future investigations of potential ligands of the MEDS domain.
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Rôle de l’activation chronique de la voie NF-kB induite par l’oncoprotéine Tax du virus HTLV-1 dans la régulation de l’épissage alternatif / The Impact of the NF-kB chronic activation mediated by the HTLV-1 Tax oncoprotein on alternative splicing regulationBen Ameur, Lamya 13 September 2019 (has links)
La voie de signalisation NF-kB (nuclear factor kB) régule la transcription de gènes impliqués dans la réponse immune et l’inflammation. L’activation chronique de cette voie est fréquemment retrouvée associée à des désordres inflammatoires et des cancers. Les impacts fonctionnels de l’activation de la voie NF-kB ont été jusqu’à présent étudiés à l’échelle des promoteurs. Néanmoins, les études récentes de la distribution chromatinienne de NF-kB indiquent que la sous-unité NF-kB RelA se localise majoritairement dans les régions intragéniques, incluant des exons et des introns, où ses fonctions restent inconnues. Mes travaux ont consisté à adresser cette question dans le contexte de l’infection par le virus HTLV-1, un activateur chronique de la voie NF-kB, responsable de la leucémie T de l’adulte. Mes données montrent que l’activation de la voie NF-kB par l’oncogène viral Tax de HTLV-1 s’accompagne de modifications de l’épissage alternatif d’exons riches en GC qui coïncident avec le recrutement chromatinien de RelA à proximité de ces exons régulés. Les analyses intégratives des profils d’épissage et du remodelage de la chromatine, combinées à des essais de ciblage expérimental de la chromatine (TALE), démontrent que la fixation intragénique de RelA permet de recruter le régulateur d'épissage DDX17 pour moduler l’épissage alternatif de l’exon via son activité hélicase. Ces données révèlent que, outre ses fonctions transcriptionnelles, le facteur NF-kB RelA agit comme une ancre chromatinienne pour le facteur d’épissage DDX17 et fournit une spécificité de régulation d’épissage alternatif. Ces données revisitent nos connaissances des mécanismes physiopathologiques des maladies associées à HTLV-1 ainsi que d'autres désordres reliés à l’activation chronique de la voie NF-kB / The NF-kB (nuclear factor kB) signaling pathway regulates gene transcription of genes involved in immune response and inflammation. Chronic activation of NF-kB frequently associated with inflammatory disorders and cancer. The functional impacts of NF-kB have long been studied at the promoter level. Nevertheless, recent studies of the chromatin distribution of RelA indicate that this NF-kB subunit is predominantly localized in intragenic regions, including exons and introns, where its functions remain unknown. My work has addressed this question in the context of HTLV-1 infection, which is a constitutive activator of NF-kB, and the causative agent of the Adult T-cell Leukemia. The results show that the activation of NF-kB by the viral oncoprotein Tax results in changes in alternative splicing regulations of GC-rich exons that coincide with the chromatin recruitment of RelA in the vicinity of these exons. Integrative analysis of RNA splicing and chromatin occupancy, combined with experimental chromatin tethering assays (TALE) demonstrate that the intragenic binding of RelA leads to the recruitment of the splicing regulator DDX17, which modulates the inclusion rate of exon thanks to its helicase activity. Altogether, these data reveal that, besides its transcriptional role, NF-kB RelA acts as a chromatin anchor for the splicing factor DDX17 and provides alternative splicing specificity. These data revisit our knowledge of the physiopathologic mechanisms of HTLV-1 associated diseases , as well as other disorders related to the chronic activation of the NF-kB pathway
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Conditionnement ischémique à distance : Rôles du facteur de transcription induit par l’hypoxie-1α et de l’apolipoprotéine A1 / Remote ischemic conditioning : roles of hypoxia-inducible factor-1α and apolipoprotein A1Kalakech, Hussein 26 November 2014 (has links)
La restauration rapide du flux sanguin est essentielle pour limiter l’étendue de l’infarctus myocardique mais elle est à l’origine de lésions irréversibles. Le préconditionnement ischémique à distance (RIPC) qui désigne l’application non invasive de brèves séquences d’ischémie/reperfusion au niveau d’un organe à distance du cœur peut prévenir la survenue de ces lésions de reperfusion. De nombreuses études suggèrent une implication de facteurs de transcription et de facteurs humoraux dans la cardioprotection induite par le RIPC, mais leurs identités restent inconnues. Dans la première partie du travail, nous avons donc étudié le rôle potentiel du facteur de transcription induit par l’hypoxie (HIF-1α) dans la phase précoce du RIPC. Nous avons ainsi démontré, en utilisant deux modèles expérimentaux : les souris transgéniques déficientes en HIF-1α et les rats traités par un inhibiteur pharmacologique de HIF-1α, que HIF-1α n’est pas indispensable pour cette phase du RIPC. Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons essayé d’identifier, de façon directe cette fois, le ou les facteurs humoraux responsables de l’effet protecteur du RIPC. En se basant sur les résultats des études protéomiques démontrant une augmentation des concentrations plasmatiques d’apolipoprotéine A1 (Apo A1) suite au RIPC, nous avons alors cherché à mettre en évidence si cette protéine pourrait être un facteur circulant du RIPC. L’Apo A1, injectée directement avant la réalisation de l’infarctus chez le rat, était capable de reproduire l’effet cardioprotecteur et d’activer les mêmes voies de signalisation du RIPC. L’Apo A1 pourrait donc être un facteur humoral du RIPC. / Although early restoration of blood flow to the ischemic heart is essential to reduce the extent of myocardial infarction, reperfusion per se may cause irreversible tissue injury. Remote ischemic preconditioning (RIPC), the phenomenon whereby brief episodes of I/R are applied in distant tissues or organs, can protect the myocardium against reperfusion injuries. Several studies suggest that transcription factors and humoral mediators may be involved in RIPC mechanisms ; however the actual identity of these factors remains unknown. Therefore, in the first part of the study, we aimed to identify the role of hypoxia inducible factor (HIF-1α) in the acute phase of RIPC. We have thus demonstrated, using two animal models: partially HIF-1α-deficient mice and rats pretreated with a pharmacological inhibitor of HIF-1α, that HIF-1α is not crucial for this phase of RIPC. In the second part of the study, we have used a more direct approach and attempted to identify one or more humoral mediators of RIPC. Based on the results of proteomic studies showing an increase in plasmatic apolipoprotein A1 (Apo A1) levels following RIPC, we thus sought to determine if Apo A1 may constitute a blood-borne factor involved in RIPC’s protective effects. Our findings indicated that Apo A1 injected before myocardial infarction in rats acutely protected the heart, recapitulating RIPC-induced cardioprotection and that Apo A1 share some common signaling pathways with RIPC. Apo A1 may then be a humoral mediator of RIPC.
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Développement de méthodes bio-informatiques pour la découverte de variants codants et non codants dans le cadre des traits sanguinsMéric de Bellefon, Sébastian 04 1900 (has links)
La santé cardiovasculaire, la fonction immunitaire, l'hémostase et la réponse à d'autres maladies dépendent de l'abondance et des caractéristiques spécifiques des cellules sanguines. Au fil des années, un effort considérable a été fait pour trouver les variants génétiques, les gènes et les mécanismes de régulation impliqués dans la création de ces cellules.
L'inactivation d'un allèle, appelée "perte de fonction" (LoF), est un type de variant codant que nous aimerions associer aux phénotypes sanguins. Comme ces mutations ne peuvent pas être artificiellement induites chez l'humain, pour des raisons éthiques évidentes, nous observons les occurences naturelles de ces pertes de fonction et espérons que la taille des cohortes sera suffisante pour trouver des associations statistiquement significatives.
L'inactivation des deux allèles, appelée "knockout" (KO), peut avoir des conséquences plus fortes qu'une simple perte de fonction. Nous espérons également trouver des KO d'origine naturelle grâce à la taille des cohortes. La combinaison de deux variants LoF différents sur les deux allèles est appelée knockout hétérozygote composé.
Nous nous intéressons également aux variants non codants qui affectent l'expression des gènes impliqués dans l'hématopoïèse. Certains de ces variants créent ou perturbent des sites de liaison des facteurs de transcription (TF), ces protéines qui se lient à des séquences d'ADN spécifiques et régulent l'expression des gènes. Les sites de liaison (TFBS) des facteurs de transcription se trouvent dans les promoteurs des gènes et dans les amplificateurs spécifiques au type cellulaire.
Alors que certaines de ces mutations peuvent être bénignes ou même bénéfiques, la présence d'un LoF ou d'un KO peut être trop nuisible à la survie de l'individu. Les résultats de cette étude sont limités par le biais de survie.
Comparée à une étude d'association pangénomique, cette étude se concentre sur un plus petit nombre de variants génétiques pour augmenter la puissance statistique et offrir une interprétation pour les résultats statistiquement significatifs.
Le programme Trans-Omics for Precision Medicine (TOPMed) recueille et garantit la qualité des 45 000 séquences du génome entier que nous avons utilisées dans cette étude, ainsi que les bilans sanguins correspondants. Grâce à ces données, nous avons pu trouver plusieurs associations connues et nouvelles entre des variants rares et des phénotypes sanguins. / Cardiovascular health, immune function, hemostasis and the response to other illnesses depend on the abundance and specific features of blood cells. Over the years, a considerable effort has been made to find which genetic variants, genes and regulatory mechanisms are involved in the creation of these cells.
The inactivation of an allele, called a loss-of-function (LoF), is a type of coding variant we would like to associate with blood phenotypes. For obvious ethical reasons, these mutations cannot be artificially induced in human, so we fall back on natural occurrences and hope that large cohorts will provide enough samples to find statistically significant associations.
The inactivation of both alleles, called a knockout (KO), may have stronger consequences than a simple loss-of-function. We also hope to find naturally occurring knockouts thanks to the size of a large cohort. The combination of two different LoF variants is called a compound heterozygote knockout.
We are also interested in non-coding variants that affect the expression of genes that are involved in hematopoiesis. Some of these variants create or disrupt the binding sites of transcription factors (TF), the proteins that bind to specific DNA sequences and regulate gene expression. Transcription factors binding sites (TFBS) are found in gene promoters and cell type specific enhancers.
While some of these mutations can be benign or even beneficial, the presence of a LoF or KO may be too detrimental for the individual to survive. The results of this study are limited by survival bias.
Compared to a genome-wide association study, this study focuses on a smaller number of genetic variants to increase statistical power and give an interpretation to the statistically significant findings.
The Trans-Omics for Precision Medicine (TOPMed) program collects and ensures the quality of the 45,000 whole-genome sequences we used in this study, as well as the corresponding complete blood counts. Thanks to this raw data, we were able to find several known and novel associations between rare variants and blood phenotypes.
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Globin Gene Expression: Role of Transcription FactorsFotouhi Ghiam, Alireza 08 1900 (has links)
No description available.
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Etude d’une enzyme de déubiquitination comme cible thérapeutique dans le Médulloblastome avec une activation de la voie Sonic Hedgehog / A Deubiquitinating Enzyme as a Therapeutic Target in Sonic Hedgehog MedulloblastomaCigna, Sara Maria 14 September 2016 (has links)
Le médulloblastome (MB) représente la tumeur maligne la plus fréquente du système nerveux chez l'enfant. Dans le laboratoire nous nous intéressons au sous-groupe avec une activation de la voie Sonic Hedgehog (SHH). Dans ce sous-groupe, l’induction de la dégradation du facteur de transcription Atoh1 par le protéasome empêche la prolifération des cellules de médulloblastome in vivo, ce qui fait d’Atoh1 une cible thérapeutique potentielle dans le cadre du MB SHH. Dans ce contexte, en utilisant une approche de purification d’Atoh1 suivie d’analyse des complexes protéiques par MudPit (Multidimensional Protein identification technology), nous avons découvert un nouveau partenaire d’Atoh1, une enzyme faisant partie du système ubiquitine-protéasome (UPS). Il s’agit d’une déubiquitinylase capable de cliver les chaines d’ubiquitine attachées sur ses substrats et ainsi d’inhiber la dégradation induite via le protéasome. Au cours de ma thèse j’ai tout d’abord confirmé l’interaction physique et fonctionnelle entre Atoh1 et l’enzyme identifié par MudPit. De plus, dans le but d’approfondir le rôle de cet enzyme dans la maintenance tumorale, nous avons validé que son inactivation in vivo permet (i) d’induire la dégradation d’Atoh1 et (ii) de bloquer la croissance des tumeurs. Parallèlement, nos résultats montrent que son inhibition pharmacologique déclenche la dégradation d’Atoh1, suivie d’un arrêt de la prolifération des cellules cancéreuses in vitro, et la regression tumorale in vivo.En conclusion, l’ensemble de ce travail a permis d’identifier un nouveau mécanisme moléculaire qui pourrait permettre de manipuler l’expression d’Atoh1 dans un but thérapeutique dans le cadre du MB SHH. / Medulloblastoma (MB) is the most common malignant tumor of the nervous system in children. Among the four molecular subgroups of MB, we focus on the one characterized by the activation of the Sonic Hedgehog pathway (SHH). In this subgroup, the degradation of the transcription factor Atoh1 through the proteasome prevents proliferation of medulloblastoma cells in vivo, which makes Atoh1 a potential therapeutic target in the SHH MB subgroup. In this context, using an Atoh1 purification approach followed by Mudpit (Multidimensional Protein Identification Technology) analysis, we discovered a new Atoh1 partner belonging to the ubiquitin-proteasome system (UPS). This protein is a deubiquitinating enzyme (DUB) that cleaves the polyubiquitin chains from its substrates and thus inhibits their degradation via the proteasome.During my PhD, I first confirmed the physical and functional interaction between Atoh1 and the DUB enzyme. In addition, in order to investigate its role in SHH MB, we validated that its knockdown induces Atoh1 degradation and tumor growth arrest in vivo. In parallel, our results show that its pharmacological inhibition triggers Atoh1 degradation in vitro, followed by an inhibition of MB proliferation, and regulates negatively tumor progression in vivo.Altogether, this present work allowed the identification of a new molecular mechanism that defines the transcription factor Atoh1 as new therapeutic strategy to treat SHH MB patients.
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Etude de la voie d’action intracrine et nucléaire du Fibroblast Growth Factor 1 dans des cellules de type neuronal / Characterization of Fibroblast Growth Factor 1 intracrine and nuclear pathway in neuronal cellsPirou, Caroline 25 November 2016 (has links)
Le FGF1 est un facteur de croissancenon sécrété, localisé dans le cytosol et le noyau.Il induit la prolifération, la différenciation et lasurvie cellulaires. Il est également impliqué dansla progression tumorale et peut conférer unechimiorésistance aux tumeurs qui lesurexpriment.Notre équipe s’intéresse depuis plusieursannées aux activités intracrines du FGF1 en tantque régulateur de la différenciation et de lasurvie cellulaires. L’équipe a ainsi montré que leFGF1 intracellulaire a une activité antiapoptotiquedans plusieurs modèles cellulaires :cellules REtsAF (fibroblastes de rat), PC12(phéochromocytome de rat), SH-SY5Y(neuroblastome humain) suite à l’induction del’apoptose dépendante de p53 via un stressgénotoxique. Dans les cellules PC12, un modèled’étude de la différenciation neuronale, le FGF1possède également une activité neurotrophique.À l’aide de différentes formes mutantes duFGF1, nous avons cherché à mieux caractériserles mécanismes régulant son activité antiapoptotiquedans les cellules PC12 et SH-SY5Y,ainsi que son activité neurotrophique dans lescellules PC12. Nous avons pu montrer que ledomaine C-terminal du FGF1 ainsi que sesmodifications post-traductionnelles sontimportants pour la régulation de ses activitésintracellulaires ; et que la phosphorylation duFGF1 inhibe son activité anti-apoptotique dansles cellules PC12 et SH-SY5Y mais ne régule passon activité de différenciation dans les cellulesPC12.Nos résultats montrent donc pour lapremière fois le rôle de la phosphorylation dansla régulation des activités du FGF1 et ce dansdeux modèles cellulaires de rat et humain. / .FGF1 is a non-secreted cytosolic andnuclear growth factor, inducing cell proliferation,differentiation and survival. FGF1 is also involvedin tumor progression and can inducechemoresistance in FGF1 overexpressing tumors.Our team has focused for several years onthe FGF1 intracrine neurotrophic and survivalactivities. The team has shown that intracellularFGF1 is an anti-apoptotic factor in several celllines : REtsAF (rat fibroblasts), PC12 (derivedfrom a rat pheochromocytoma) and SH-SY5Ycells (derived from a human neuroblastoma)following the induction of p53-dependentapoptosis via a genotoxic stress. In PC12 cells, amodel of neuronal differentiation, FGF1 is also aneurotrophic factor.We aimed to better characterize themechanisms regulating the anti-apoptoticactivity of FGF1 by expressing various mutantforms of FGF1 in PC12 and SH-SY5Y cell lines. Wehave shown that FGF1 C-terminal domain and itspost-translational modifications are importantfor the regulation of its intracellular activities ;and that FGF1 phosphorylation inhibits its antiapoptoticactivities in both PC12 and SH-SY5Ycell lines, but does not affect its differentiationactivity in PC12 cells.Thus, our results showed for the first time thecrucial role of FGF1 phosphorylation in theregulation of its intracrine anti-apoptotic activityin both rat and human cellular models.
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Rôle du domaine POZ de MIZ-1 dans la régulation de l’activité oncogénique de c-MYC dans les lymphocytes BGabrielli Tabarez, Lucia Paola 07 1900 (has links)
c-MYC est un proto-oncogène surexprimé dans les lymphomes de Burkitt et une cible importante pour le traitement de ces maladies. La protéine à domaine BTB/POZ MIZ-1 est un partenaire direct de la protéine c-MYC. En effet, c-MYC via son structure hélice-boucle-hélice se lie précisément à la séquence entre le 12e et 13e doigt de zinc de MIZ-1. Notre groupe a démontré que l’expression de la protéine MIZ-1 tronquée de son domaine POZ (MIZ-1ΔPOZ) peut ralentir la lymphomagenèse. Pourtant, l’interaction directe entre c-MYC et MIZ-1 n’est pas affectée par la délétion du domaine POZ de MIZ-1. Ceci suggère que MIZ-1 est important pour l’activité oncogénique de c-MYC. Il a été observé que l’expression de MIZ-1ΔPOZ diminue le nombre de cellules B pré-tumorales dans les modèles murins de lymphomes Eμ-Myc et Igλ-Myc. De plus, les niveaux protéiques très élevés de c-MYC dans les cellules B Eμ-Myc sont diminués lorsque MIZ-1ΔPOZ est exprimé. Toutefois, l’activité du protéasome ne semble pas être responsable de la diminution de c-MYC. Une analyse des interactions protéiques de MIZ-1 par BioID effectuée par notre groupe a montré que MIZ-1 et MIZ-1ΔPOZ interagissent avec PP1ɣ, TOX4 et PNUTS, trois protéines du complexe PTW/PP1 qui est un complexe transcriptionnel dont c-MYC fait partie. Des résultats de co-IP confirment cette interaction ce qui suggère que MIZ-1 pourrait influencer l’activité de ce complexe. De plus, une lignée cellulaire dans laquelle MIZ-1ΔPOZ est exprimé a été établie ce qui permettra d’approfondir l’étude des interactions protéiques de MIZ-1 avec le complexe PTW/PP1 et d’étudier l’effet de MIZ-1ΔPOZ sur l’activité transcriptionelle de ce complexe. Une meilleure compréhension du mécanisme d’action de MIZ-1 sur c-MYC permettra de mieux comprendre son rôle dans un contexte pathologique, ce qui pourrait permettre le design de nouvelles approches thérapeutiques. / c-MYC is a proto-oncogene overexpressed in Burkitt's lymphoma and an important target for the treatment of these diseases. The BTB/POZ domain protein MIZ-1 is direct a partner of c- MYC. Indeed, c-MYC via its helix-loop-helix structure binds precisely to the sequence between the 12th and 13th zinc finger of MIZ-1. We demonstrated that expression of MIZ-1 that lacks its POZ domain (MIZ-1ΔPOZ) can impair lymphomagenesis. However, the direct interaction between c-MYC and MIZ-1 is not affected by the deletion of the MIZ-1 POZ domain. This suggests that MIZ-1 is important for the oncogenic activity of c-MYC. We observed that expression of MIZ-1ΔPOZ decreases the number of pre-tumor B cells in lymphomas mouse models such as Eμ-Myc and Igλ-Myc. The high c-MYC protein levels observed in Eμ-Myc B cells are decreased when MIZ-1ΔPOZ is expressed. However, proteasome activity does not seem to be responsible for the decrease of c-MYC. After the analysis of MIZ-1 protein interactions by BioID, our group found that MIZ-1 and MIZ-1ΔPOZ interact with PP1ɣ, TOX4 and PNUTS, three proteins of the PTW/PP1 complex which also interact with c-MYC. Co-IP results confirmed these interactions suggesting that MIZ-1 could influence the activity of this complex. In addition, a MIZ- 1ΔPOZ cell line was established which will allow further studies of MIZ-1ΔPOZ protein interactions with the PTW/PP1 complex as well as its effect on the transcriptional activity of this complex. A better characterization of the mechanism of action of MIZ-1 on c-MYC will lead to a better understanding of its role in a pathological context, which could be the basis of new therapeutic approaches.
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