O glioblastoma multiforme (GBM) é um dos tumores mais letais e a radioterapia permanece como um dos principais tratamentos. Novas estratégias são necessárias para coibir a resistência ao tratamento, como o silenciamento de fatores de transcrição (FTs). Nossa hipótese é a de que FTs associados a listas de genes diferencialmente expressos, os quais foram selecionados para linhagens de GBM irradiadas, ou comparando amostras de GBM à amostras de tecido cerebral, possam fornecer alvos moleculares que aumentariam a morte das células tumorais, quando silenciados. Foram analisadas a proliferação, morte e ciclo celular, além da formação e diferenciação de neuroesferas, utilizando, em quase todas as etapas, a citometria de fluxo. Os FTs HEB e E2F1, cujas funções principais estão relacionadas à neurogênese e proliferação celular, foram selecionados a partir das análises in silico de GBM irradiados ou não, ou de GBMs comparados a amostras de cérebro normal, respectivamente. Esses FTs encontram-se expressos em linhagens U87, astrócitos primários e neuroesferas provenientes das mesmas, analisadas por Western blot. O silenciamento de HEB e E2F1 na linhagem U87, de forma geral, reduziu a proliferação, induziu morte celular e diminuiu a porcentagem de células em G0/ G1, em pelo menos um dos tempos analisados (24, 48 e 72h) em relação ao grupo transfectado com a sequência scrambled. O silenciamento de HEB e E2F1 reduziu o número de neuroesferas quando comparadas às células transfectadas com a sequência scrambled. Possivelmente, a capacidade anti-proliferativa do silenciamento dos FTs HEB e E2F1 observada no cultivo em monocamada da U87, possam atuar na capacidade de formação de neuroesferas e, consequentemente, podem ter um papel na manutenção das células tronco do GBM. O silenciamento não alterou a radiorresistência da U87 cultivada em monocamada, com exceção dos efeitos do silenciamento de E2F1 em 24 h, em que houve radioproteção. A irradiação não reduziu o número de neuroesferas silenciadas para HEB em comparação ao grupo não irradiado, mas reduziu o número de células presentes nas neuroesferas, indicando uma possível atuação de HEB na resposta à irradiação em neuroesferas, fato este nunca antes descrito. O silenciamento de E2F1 não interferiu na resposta das neuroesferas à radiação. A expressão de CD133 avaliada oito dias após a dissociação das células silenciadas para E2F1 e HEB, cultivadas em meio de diferenciação, foram superiores ao do grupo scrambled, indicando uma possível diminuição na diferenciação celular. O silenciamento dos dois FTs não atuou na seleção positiva de CD133+ após a irradiação, como observado no grupo das neuroesferas transfectadas com a sequência scrambled e irradiadas, comparado às não irradiadas. Assim, E2F1 e HEB mostraram-se alvos interessantes no sentido de reduzir a proliferação, tanto em células U87 cultivadas em monocamada quanto em neuroesferas. / Glioblastoma multiforme (GBM) is one of the most lethal tumors, and radiation therapy remains one of the main treatments. New strategies are needed to suppress typical GBM treatment resistance and transcription factors (TFs) silencing seems to be a promising strategy. Our hypothesis is that TFs associated with lists of differentially expressed genes which were selected for irradiated compared to shamirradiated GBM cell lines, or GBM samples compared to brain tissue samples, could provide molecular targets that are supposed to increase tumor cell death when they are silenced. We analyzed proliferation, cell death and cell cycle progression, besides the formation and differentiation of neurospheres, using several analyses by flow cytometry. The TFs HEB and E2F1, whose primary functions are related to neurogenesis and cell proliferation, were selected from in silico analysis of GBM irradiated or sham-irradiated GBMs and GBM samples compared with normal brain samples, respectively. These TFs were found expressed in U87 GBM cell line, and primary astrocytes, as well as in neurospheres derivated from both, as analyzed by Western blot. Silencing of E2F1 and HEB in U87 cells, reduced proliferation, induced cell death and decreased the percentage of cells at G0/G1 (24, 48 or 72h) compared to the scrambled sequence transfected group. HEB and E2F1 silencing reduced the number of neurospheres when compared to cells transfected with scrambled sequence. Possibly, the anti-proliferative ability of silencing of HEB and E2F1 TFs observed in monolayer culture of U87, may act in neurospheres forming capacity and therefore may play a role in the maintenance of GBM stem cells. In our experiments, gene silencing did not alter the radio-resistance of U87 grown in monolayer. Irradiation did not reduce the number of neurospheres silenced for HEB compared to non-irradiated group, but reduced the number of cells present in neurospheres, indicating a possible role of HEB in response to ionizing irradiation in neurospheres, a fact that was not described yet. The silencing of E2F1 in neurospheres did not affect the response to irradiation. The expression of CD133, as assessed at eight days after the dissociation of cells silenced for E2F1 and HEB (cultured in differentiation culture media), was superior compared with the scrambled group, indicating a possible decrease in cell differentiation. The silencing of both TFs did not influence the positive selection of CD133 after irradiation, as observed in the group of neurospheres transfected with scrambled sequence, and irradiated compared to nonirradiated. Thus, E2F1 and HEB proved to be interesting targets for decreasing proliferation in both U87 cells grown as monolayer or neurospheres.

A homeostasia glicêmica requer uma estreita regulação quantitativa e temporal do fluxo de glicose em diferentes órgãos. O fluxo de glicose no fígado e no rim depende de um transportador específico, o GLUT2. Neste estudo demonstramos que em rim, o GLUT2 está aumentado no diabetes e que os fatores transcricionais HNF-1<font face=\"Symbol\">a, HNF-3<font face=\"Symbol\">b e HNF-4<font face=\"Symbol\">a são importantes reguladores do GLUT2, uma vez que apresentaram aumento de expressão e da atividade de ligação no promotor do SLC2A2 (gene do GLUT2). Esses efeitos foram revertidos pelo tratamento com insulina durante 6 dias. No fígado, o diabetes induziu aumento da expressão do GLUT2, HNF-1<font face=\"Symbol\">a, 3<font face=\"Symbol\">b e 4<font face=\"Symbol\">a, assim como aumento na atividade de ligação destes fatores transcricionais no promotor do SLC2A2. Estes resultados evidenciam os HNF- 1<font face=\"Symbol\">a, 3<font face=\"Symbol\">b e 4<font face=\"Symbol\">a como reguladores da expressão do GLUT2 também em fígado de animais diabéticos. No fígado, a insulina reverteu estas alterações aos 4 e 6 dias de tratamento. Os fatores transcricionais SREBP-1c e C/EBP-<font face=\"Symbol\">b não foram alterados em fígado e rim de ratos diabéticos, tratados ou não com insulina. / The glucose homeostasis requires a close temporal and quantitative regulation of the flow of glucose into various organs. The flow of glucose in the liver and kidney depends on a specific transporter, the GLUT2. This study demonstrated that in kidney, GLUT2 is increased in diabetes and that the transcriptional factors HNF-1<font face=\"Symbol\">a , HNF-3<font face=\"Symbol\">b and HNF-4<font face=\"Symbol\">a are important regulators of GLUT2, as it showed increased expression and binding activity in promoter of the SLC2A2 (GLUT2 gene). These effects were reversed by insulin treatment for 6 days. In the liver, diabetes induced increased expression of GLUT2, HNF-1<font face=\"Symbol\">a, 3<font face=\"Symbol\">b, and 4<font face=\"Symbol\">a, as well as increased binding activity of these transcription factors in the promoter of SLC2A2. These results demonstrate the HNF-1<font face=\"Symbol\">a, 3<font face=\"Symbol\">b, and 4<font face=\"Symbol\">a as regulators of the expression of GLUT2 also in liver of diabetic animals. In the liver, insulin reversed these changes at 4 and 6 days of treatment. The transcription factors SREBP-1c and C/EBP-<font face=\"Symbol\">b were not altered in liver and kidney of diabetic rats, treated or not with insulin.

Orientador: Michel Georges Albert Vincentz / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T14:21:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Viana_AmericoJoseCarvalho_D.pdf: 5804951 bytes, checksum: a3c65fa34ad298641a9b177952050af3 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O fator de transcrição do tipo basic leucine leucine zipper (bZIP) de Arabidopsis thaliana AtbZIP63 faz parte da via de resposta a carência energética coordenada pelas quinases KIN10/11, integradoras centrais dos sinais relacionados ao estado de privação de energia. O mutante de inserção de T-DNA atbzip63-2 apresenta uma redução do crescimento e desenvolvimento das folhas assim como um atraso do florescimento em comparação ao tipo selvagem (TS, acesso Ws) quando cultivado em fotoperíodo de dia curto (10 h/14 h). Condições de fotoperíodo de dia longo ou luz contínua promoveram uma reversão parcial ou completa, respectivamente, do fenótipo mutante para o tipo selvagem, levantando a possibilidade de que este fenótipo seja o resultado de uma carência energética. Plantas silenciadas para expressão de AtbZIP63 por RNAi apresentaram características similares a do mutante atbzip63-2 confirmando o envolvimento deste fator de transcrição no crescimento. O perfil de expressão gênica e os níveis de alguns metabólitos do mutante atbzip63-2 indicaram que AtbZIP63 participa do controle da degradação do amido, pois a expressão de alguns genes centrais na degradação deste carboidrato de reserva está desregulada neste mutante. Mostramos que as oscilações no nível do transcrito AtbZIP63 são reguladas pelo relógio circadiano e a fase da oscilação do AtbZIP63 é aparentemente influenciada pela disponibilidade de carboidratos na célula. Além de estar sob o controle do relógio, AtbZIP63 também atua como um ativador direto da expressão de PRR7, que codifica um dos componentes chave do oscilador central do relógio. Portanto, evidenciamos uma interação recíproca entre o relógio e AtbZIP63 que possivelmente está impactando o processo de degradação do amido à noite. Este conjunto de evidências revela novos aspectos do ajuste do relógio circadiano pelo status de açúcar na célula que estão de acordo com trabalhos recentes mostrando que os açúcares afetam diretamente o funcionamento do relógio. Nossa hipótese é que o AtbZIP63 está agindo como um mediador entre a disponibilidade de viii açúcar e o mecanismo oscilatório do relógio circadiano de A. thaliana. Adicionalmente, verificamos que o perfil de transcritos no final do dia no mutante atbzip63-2 é diferente do observado no final da noite, sugerindo a participação do AtbZIP63 na regulação de genes envolvidos em redes regulatórias distintas em função do período do dia. Dentre os genes desregulados no atbzip63-2 no final do dia, observamos um enriquecimento para genes relacionados com metabolismo secundário e síntese de trealose, o que sugere a participação do AtbZIP63 na regulação da síntese destes compostos durante o dia, e possivelmente reflete a ocorrência de stress no mutante / Abstract: he Arabidopsis thaliana basic leucine zipper domain (bZIP) AtbZIP63 transcription factor is part of the response pathway to energy shortage coordinated by kinases KIN10/11. The T-DNA insertion mutant atbzip63-2 shows a reduction in the growth and development of leaves, as well as a delay in flowering compared to wild type (WT; ecotype Ws), when grown in short-day conditions. Long day or continuous light conditions promoted a partial or complete reversion, respectively, of the mutant to wild-type phenotype, raising the possibility that this phenotype is the result of an energy shortage. Plants silenced for AtbZIP63 showed similar characteristics to the atbzip63-2 mutant, confirming the involvement of this transcription factor in the growth. The gene expression profile and the levels of some metabolites of the atbzip63-2 indicated that AtbZIP63 takes part in the control of starch degradation, regulating the expression of some key genes in starch degradation. Diurnal AtbZIP63 mRNA level fluctuation is regulated by the circadian clock, and the phase oscillation is influenced by the availability of carbohydrates. In addition, to be controlled by the circadian clock, AtbZIP63 directly regulates the expression of PRR7 which encodes one of the key regulators of the core clock. We have therefore identified a reciprocal interaction between the clock and AtbZIP63 which is probably affecting the starch degradation process. This set of evidence reveals new aspects of the entrainment of the circadian clock by sugars, and is consistent with recent studies showing that sugars directly regulate the circadian clock. Our hypothesis is that AtbZIP63 is acting as a mediator between the energy status (availability of sugar) and the oscillatory mechanism of the A. thaliana circadian clock. Additionally, we found that the profile of transcripts at the end of the day in atbzip63-2 mutant is different from that observed in the end of the night, suggesting the involvement of AtbZIP63 in the regulation of genes involved in distinct regulatory networks according to the period of day. Among the genes deregulated in atbzip63-2 at the end of the x day, an enrichment for genes related to secondary metabolism and trehalose biosynthesis was observed. Suggesting the involvement of AtbZIP63 in regulating the synthesis of these compounds during the day, and probably reflects the occurrence of stress in the mutant / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Kleber Gomes Franchini / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T03:46:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_AnaHelenaMacedo_D.pdf: 4791935 bytes, checksum: 1afe275f0fa4f53003b18816bc5c27cb (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Os fatores MEF2 (Myocyte Enhancer Factor 2) pertencem à família MADS Box (MCM1-Agamous-Deficiens-Serum response factor) e foram descritos pela primeira vez como fatores de transcrição que se ligam a sequencias de DNA ricas em A/T nos promotores de vários genes músculo específicos. Existem 4 genes da família MEF2 que foram identificados em vertebrados: MEF2A, B, C e D que são expressos de forma distinta durante a embriogênese e nos tecidos adultos. Estudos anteriores do nosso laboratório demonstraram que o fator de transcrição MEF2 é ativado por estiramento mecânico e influencia a expressão de genes relacionados à hipertrofia cardíaca. Utilizando a tecnologia de siRNA para MEF2C (siRNAMEF2C) demonstramos a atenuação da hipertrofia cardíaca induzida por coarctação da aorta nos animais que receberam o siRNAMEF2C. Por outro lado trabalhos demonstraram que animais transgênicos com a superexpressão de MEF2A ou de MEF2C e submetidos à sobrecarga de pressão por coarctação da aorta, não apresentam hipertrofia cardíaca compensatória. Nesses animais a superexpressão de MEF2A ou de MEF2C no coração está associada à deterioração cardíaca funcional e estrutural e o desenvolvimento de cardiomiopatia dilatada. Contudo, a caracterização fenotípica e os mecanismos moleculares envolvidos na superexpressão de MEF2C em miócitos cardíacos ainda são desconhecidos. Da mesma forma não é conhecido o papel do fator de transcrição MEF2C na resposta hipertrófica do miócito cardíaco após coarctação da aorta. No presente trabalho foi demonstrado que a superexpressão de MEF2C em miócitos cardíacos de ratos neonatos (NRMV), com o uso de partículas adenovirais, induziu a desdiferenciação celular e a ativação de mecanismos envolvidos na progressão do ciclo celular. Esses resultados foram obtidos por meio de experimentos de microarranjo de DNA, proteoma, PCR em tempo real e western blotting. A análise do fenótipo celular por microscopias de luz, confocal e eletrônica de transmissão demonstra que NRMV possuem aumento na binucleação e desorganização sarcomérica, alterações coerentes com o quadro de desdiferenciação celular e ativação da progressão do ciclo celular. Por meio da técnica de incorporação de iodeto de propídeo e citometria de fluxo confirmamos o aumento de células em ciclo celular. Para confirmar os achados nos cardiomiócitos neonatos passamos a investigar o efeito da superexpressão de MEF2C em cardiomiócitos de ratos adultos. Para isso padronizamos a técnica de isolamento destas células e tratamos com AdMEF2C. Sendo assim o tratamento com AdMEF2C em miócitos cardíacos de ratos adultos resultou em aumento da expressão de MEF2C após 48 horas de tratamento. O efeito observado foi semelhante ao encontrado em cardiomiócitos neonatos, sendo que os adultos apresentaram aumento da expressão de genes relacionados ao ciclo celular e diminuição dos genes estruturais. O nível ultraestrutural observado por microscopia eletrônica de transmissão no tempo de 48 horas de tratamento não observamos diferenças na estrutura sarcomérica das células tratadas com AdMEF2C. Por fim demonstramos que o silenciamento de MEF2C pela injeção de lentivírus no coração demonstrou ser capaz de impedir o desenvolvimento da hipertrofia cardíaca em camundongos coarctados por 15 dias. A hipertrofia do coração foi avaliada por meio da espessura da parede posterior do ventrículo esquerdo e gravimetria do ventrículo esquerdo e dos pulmões. O conjunto de dados demonstra que a superexpressão de MEF2C leva a alterações estruturais no miócito cardíaco compatíveis com quadro de deterioração e insuficiência cardíaca e que o silenciamento de MEF2C no coração impede o desenvolvimento da hipertrofia cardíaca decorrente da coarctação da aorta / Abstract: The factors MEF2 (myocyte enhancer factor 2) belong to the family MADS box (MCM1-Agamous-deficiens-Serum response factor) and were first described as transcription factors that bind DNA sequences rich in A / T in the promoters of multiple muscle-specific genes. There are four MEF2 family genes that were identified in vertebrates MEF2A, B, C and D are expressed differently during embryogenesis and in adult tissues. Previous studies from our laboratory demonstrated that the transcription factor MEF2 is activated by mechanical stretch and influences the expression of genes related to cardiac hypertrophy. Using siRNA technology to MEF2C (siRNAMEF2C) demonstrated attenuation of cardiac hypertrophy induced by aortic coarctation in animals that received siRNAMEF2C. On the other hand studies have demonstrated that transgenic mice with overexpression of MEF2A or MEF2C and subjected to pressure overload by aortic coarctation show no compensatory cardiac hypertrophy. In these animals the overexpression of MEF2A or MEF2C in the heart is associated with structural and functional cardiac deterioration and development of dilated cardiomyopathy. However, the phenotypic and molecular mechanisms involved in the overexpression of MEF2C in cardiac myocytes are still unknown. Likewise, there is known the role of the transcription factor MEF2C in cardiac myocyte hypertrophic response after aortic coarctation. In the present study it was shown that overexpression of MEF2C in neonatal rat cardiac myocytes (NRMV) with the use of adenoviral particles, and cellular dedifferentiation induced activation mechanisms involved in cell cycle progression. These results were obtained by DNA microarray experiments, proteomics, real time PCR and western blotting. The analysis of cell phenotype by light microscopy, confocal and transmission electron shows that NRMV have increased binucleation and sarcomeric disorganization, changes consistent with the framework of cellular dedifferentiation and activation of cell cycle progression. By means of the propidium iodide incorporation technique and flow cytometry, confirmed increasing cells in the cell cycle. To confirm the findings in neonatal cardiomyocytes we investigate the effect of overexpression of MEF2C in cardiomyocytes of adult rats. For this standardized technique and isolation of these cells treated with AdMEF2C. Thus treatment with AdMEF2C in adult rat cardiac myocytes resulted in increased expression of MEF2C after 48 hours of treatment. The observed effect was similar to that found in cardiomyocytes neonates, adults who showed increased expression of genes related to cell cycle and decreased structural genes. The ultrastructural level observed by transmission electron microscopy in the time of 48 hours of treatment showed no difference in sarcomeric structure of cells treated with AdMEF2C. Finally we show that MEF2C silencing by lentivirus injection in the heart has been shown to prevent the development of cardiac hypertrophy in mice after 15 days of pressure overload. The heart hypertrophy was evaluated by the thickness of the posterior wall of the left ventricle and the left ventricle gravity and lungs. The data set shows that overexpression of MEF2C leads to structural changes in the cardiac myocyte compatible framework of deterioration and failure, and MEF2C silencing of the heart prevents the development of cardiac hypertrophy due to aortic coarctation / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutora em Ciências

Orientador: Michel Georges Albert Vincentz / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T07:49:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Matiolli_CleversonCarlos_D.pdf: 11712676 bytes, checksum: dd78e2f749da48afd1fc31207bc95b06 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A manutenção do balanço energético em plantas é de crucial importância para a otimização de seu crescimento e desenvolvimento em resposta às condições sempre flutuantes do meio. A energia obtida através da fotossíntese deve ser utilizada parcimoniosamente e dividida entre crescimento, desenvolvimento, armazenamento e respostas a estresses bióticos e abióticos. Entender como a energia é canalizada para cada um destes processos e como os diversos sinais ambientais e metabólicos são integrados é de vital importância para a compreensão dos mecanismos que permitem o sucesso reprodutivo das plantas mesmo frente a condições ambientais adversas. Os fatores reguladores de transcrição desempenham um papel importante como pontos de convergência de vias de sinalização distintas e regulam a expressão dos conjuntos de genes mais adequados para cada combinação de sinais, permitindo uma resposta equilibrada diante de desafios muitas vezes concomitantes. Neste trabalho, mostramos que o fator de transcrição de Arabidopsis thaliana AtbZIP63, o qual pertence a família bZIP e é um mediador das respostas a carência energética induzidas pela quinase KIN10, é reprimido a curto prazo (2h e 4h) pela hexose glicose e o hormônio ácido abscíssico (ABA). A repressão da expressão de AtbZIP63 por 2% de glicose é independente da atividade sensora de glicose da enzima Hexokinase 1 (HXK1) e não envolve mudanças nos níveis endógenos de ABA, um mediador das respostas a glicose. No entanto, o ABA é capaz de modular a amplitude da resposta de AtbZIP63 a glicose. ABA e glicose interagem de maneira sinérgica para repressão da expressão de AtbZIP63 e esta interação envolve mecanismos de regulação pós-transcricionais. Análises em escala genômica de diferenças de perfis transcricionais entre mutantes para AtbZIP63 e seus respectivos genótipos selvagens foram desenvolvidas para identificar os genes alvos de AtbZIP63 e definir a rede de regulação da qual AtbZIP63 participa. A classificação funcional dos 280 e 348 genes desregulados nos mutantes por inserção de T-DNA atbzip63-1 e atbzip63-2, respectivamente, sugere que AtbZIP63 está envolvido na regulação de genes relacionados as respostas à carência energética, síntese e resposta a hormônios, estresses abióticos e bióticos e ciclo circadiano, provavelmente modulando o uso equilibrado de energia em resposta aos desafios ambientais. Baseado na observação de que os mutantes para AtbZIP63 apresentam diversos genes relacionados a respostas contra estresses bióticos, avaliamos a resposta dos mutantes atbzip63-1 e atbzip63-2 a patógenos usando o patossistema Arabidopsis-Pseudomonas O mutante atbzip63-1 é mais resistente a infecção com o fitopatógeno Pseudomonas syringae pv tomato DC3000, mostrando seu envolvimento nas respostas a estresse biótico. O mutante atbzip63-2 apresenta atraso de crescimento quando cultivado em condições limitantes de energia, sugerindo sua participação também no crescimento/desenvolvimento de Arabidopsis nestas condições. A busca de proteínas interatoras de AtbZIP63 utilizando o sistema de duplo híbrido em levedura (Y2H) revelou genes relacionados a degradação de proteínas sugerindo que controle da estabilidade da proteína de AtbZIP63. Em conjunto, os resultados apresentados neste trabalho sugerem que AtbZIP63 é um nó de integração entre diferentes vias de sinalização para modular o crescimento e desenvolvimento de Arabidopsis de acordo com diversos sinais ambientais / Abstract: The maintenance of energy balance in plants is crucial to optimize their growth and development in response to ever changing environment. The energy obtained through photosynthesis must be used sparingly and divided between growth, development, storage, and responses to biotic and abiotic stresses. Understand how energy is channeled to each of these processes and how the environmental and metabolic signals are integrated have a vital importance to understanding the mechanisms by which plants reach the reproductive success even in adverse environmental conditions. Transcription factors play an important role as convergence points of several signaling pathways and regulate the expression of sets of genes most appropriate for each signal combination. We show that the transcription factor AtbZIP63 from Arabidopsis thaliana, which belongs to the bZIP family and mediates partially the response to energy deprivation induced by kinase KIN10, is repressed in short-term treatments (2h and 4h) with glucose and hormone absicisic acid (ABA). The repression of AtbZIP63 by 2% glucose is independent of the glucose sensing activity of the enzyme Hexokinase 1 (HXK1) and does not involve changes in endogenous ABA levels, a mediator of glucose responses. However, ABA modulates the amplitude of AtbZIP63 responses to glucose. ABA and glucose interact synergistically to repress AtbZIP63 mRNA accumulation and that this interaction involves post-transcriptional mechanisms. Genomic scale transcriptional profile comparison between AtbZIP63 mutants and their respective wild-type genotypes have been developed to identify target genes and the regulatory context which AtbZIP63 is involved. The functional classification of 280 and 348 misregulated genes in T-DNA insertion mutants atbzip63-1 and atbzip63-2, respectively, suggests that AtbZIP63 regulates genes involved in responses to energy starvation, synthesis and hormone response, biotic and abiotic stress, and circadian clock, probably by modulating the energy usage in response to environmental challenges. Based on the observation that the AtbZIP63 mutants have several misregulated genes related to responses to biotic stress, we evaluated the response of atbzip63-1 and atbzip63-2 to pathogens using the Arabidopsis-Pseudomonas pathosystem. The atbzip63-1 mutant is more resistant to infection with the pathogen Pseudomonas syringae pv tomato DC3000, showing their involvement in responses to biotic stress. The atbzip63-2 mutant has arrested growth in energy-limiting conditions, also suggesting its participation in the growth / development of Arabidopsis under these conditions. A searching for interacting proteins of AtbZIP63 using Yeast Two-Hybrid (Y2H) system revealed proteins related to protein degradation and suggests stability control of AtbZIP63 protein. Together, the results presented here suggest that AtbZIP63 is an integration node of different signaling pathways and modulates growth and development of Arabidopsis under different environmental conditions / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Submitted by Gabriela Lopes (gmachadolopesufpel@gmail.com) on 2016-09-14T16:53:36Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) analise_transcriptoma_arroz_estresse_frio.pdf: 1983607 bytes, checksum: 89744effdc48619cef6643fb7d1e353c (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2016-09-14T18:17:57Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) analise_transcriptoma_arroz_estresse_frio.pdf: 1983607 bytes, checksum: 89744effdc48619cef6643fb7d1e353c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-14T18:17:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) analise_transcriptoma_arroz_estresse_frio.pdf: 1983607 bytes, checksum: 89744effdc48619cef6643fb7d1e353c (MD5) Previous issue date: 2014-03-06 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / O estresse por frio pode trazer prejuízos econômicos significativos em diversas fases do ciclo da cultura do arroz. Em arroz (Oryza sativa L.), há grande variabilidade genética para tolerância ao frio sendo a subespécie japonica considerada tolerante e a subespécie indica considerada sensível. Foi realizado sequenciamento de RNA (RNA-Seq) visando identificar genes diferencialmente expressos entre os genótipos BRS Atalanta (indica) (A), Nipponbare (japonica) (N) e bulks formados por RILs (Linhas endogâmicas recombinantes) provenientes do cruzamento entre elas. Bulks (B) com as 15 RILs mais próximas a cada genitor (BA e BN) foram formados com base em dados de genotipagem. As plântulas, tanto da condição tratamento quanto da condição controle, permaneceram por 7d a 28°C. Para análise do transcritoma, as plântulas da condição tratamento (T) foram expostas ao frio numa temperatura de 13°C por 24h e as plantas da condição controle (C) permaneceram mais 24h a 28°C. Após este período foi realizada a coleta das plântulas, extração de RNA total, síntese de cDNA e preparo das bibliotecas para sequenciamento (RNA-Seq). Este foi realizado em sequenciador HiSeq 2000, sendo as reads de 100b single-end. Diversas combinações foram analisadas para obter o número de genes diferencialmente expressos envolvendo as condições BRS Atalanta (controle e tratamento), Nipponbare (controle e tratamento), bulk de RILs mais próximos a cultivar BRS Atalanta (controle e tratamento) e bulk de RILs mais próximos ao genótipo Nipponbare (controle e tratamento). Um número significativo de genes mostra-se diferencialmente expressos em cada condição, sendo de modo geral mais genes estão subexpressos do que superexpressos, exceto para as condições AC x BAC, AT x BAT e NT x BNT. Um dendrograma usando as distâncias de Jensen-Shannon mostra a formação de dois ramos sendo que num deles está a cultivar BRS Atalanta e os bulks formados por sua semelhança genotípica com esta cultivar. No outro ramo estão o genótipo Nipponbare e os bulks formados pela semelhança com o genitor. Genes pertencentes a diversas famílias de fatores de transcrição estão diferencialmente expressos nas diferentes combinações, sendo que para grande parte destas famílias já foi demonstrada sua participação na resposta ao estresse por frio. As conclusões deste trabalho indicam que o número de genes diferencialmente expressos (log2-fold-change ≥ |1.5|) varia grandemente entre as combinações, apresentando como limite superior 1481 genes subexpressos na combinação BNC x BAC e 1017 genes superexpressos em NT x AT, e seis genes subexpressos na combinação NT x BNT e cinco genes superexpressos na combinação NC x BNC. As combinações analisadas mostram a expressão diferencial de um grande número de famílias de fatores de transcrição, muitas delas já descritas como responsivas ao estresse por frio, que apresentam um padrão difuso de expressão entre as subespécies indica e japonica. / Chilling stress can cause significant economic losses in different phases of the cycle of rice. There are a wide of genetic variability for cold tolerance in rice (Oryza sativa L.), japonica subspecies is considered tolerant and subspecies indica is considered sensitive. RNA sequencing (RNA-Seq) was performed to identify differentially expressed genes among the cultivar BRS Atalanta (indica) (A), Nipponbare (japonica) (N) and bulks composed by RILs from crosses between them. Bulks (B) with the 15 closest RILs to each parent (BA and BN) RILs were composed based on SNPs-genotyping data. To analyze the transcriptome, plants of the treatment condition (T), 7d after imbibition were exposed to a chilling temperature of 13°C per 24h and plants of the control condition (C) remained 24h more at 28°C. After this time was performed the collection of seedlings, total RNA extraction, cDNA synthesis and preparation of libraries for sequencing (RNA-Seq) in a HiSeq 2000 sequencer, with 100bp single-end reads. Several combinations were analyzed to obtain the number of differentially expressed genes involving BRS Atalanta conditions (control and treatment), Nipponbare (control and treatment), bulk of RILs closest to BRS Atalanta – BA (control and treatment) and bulks of RILs closest to the cultivar Nipponbare - BN (control and treatment). A significant number of differentially expressed genes are shown in each condition, being generally founded more downregulated than up-regulated genes, except for the combinations AC x AT x NT x BAT and BAC x BNT. A dendrogram using the Jensen-Shannon distance shows the formation of two branches of which one is composed by BRS Atlanta cultivar and the bulks composed by the genotypic similarity with this cultivar. In the other branch is the cultivar Nipponbare and the bulks composed by similarity with the parent. Several differentially expressed genes from transcription factors families are present in different combinations, and for many of these families has been demonstrated its involvement in the response to chilling stress. The conclusions of this study indicate that the number of differentially expressed genes (log2 fold-change ≥ |1.5|) greatly changed between combinations, with an upper limit of 1481 down-regulated genes in the combination BAC x BNC and 1017 up-regulated genes in the combination NT x AT, six genes are up-regulate in the combination NT x BNT and five genes are upregulated in NC x BNC combination. The combinations analyzed showed differential expression of a large number of families of transcription factors, many of which have been described as responsive to cold stress, showing a diffuse pattern of expression between indica and japonica groups.

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Orientador: Marcelo Carnier Dornelas / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T11:23:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Goncalves_ConradodeCampos_M.pdf: 3557566 bytes, checksum: bbf1eb36c2f2344648bff12f25b9d075 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A corona floral é uma estrutura típica das flores da família Passifloraceae. A elucidação dos mecanismos responsáveis pela formação da corona é de extrema importância para a compreensão dos processos evolutivos que permitiram a diversificação das interações com polinizadores nas espécies desta família. Este trabalho teve por objetivo identificar e caracterizar fatores de transcrição (FT) preferencialmente expressos na corona em Passiflora spp. Para tal, o banco de etiquetas de genes expressos (ESTs) PASSIOMA foi investigado e 139 cDNAs foram identificados: 69 derivados de bibliotecas florais de P. edulis, 68 de P. suberosa e 2 de P. pohlii. No intuito de atribuir identidades às sequências realizou-se uma análise de parcimônia, com a obtenção de cladogramas que permitiram a identificação de membros de 31 famílias gênicas de fatores de transcrição em Passiflora spp. Experimentos de macroarranjo mostraram que 9 genes putativos, codificadores de fatores de transcrição, apresentaram expressão nos filamentos da corona. Para a caracterização mais completa desses fatores de transcrição, foram realizados experimentos de RT-PCR em 5 destes 9 genes e hibridização in situ com dois dos 5 genes analisados por RT-PCR. Os resultados obtidos com RT-PCR indicaram que estes genes são expressos nos tecidos da corona mas também em folhas e outros órgãos florais. Os resultados da hibridização in situ confirmaram que os genes encontrados não são especificamente expressos na corona / Abstract: The corona is a floral structure typical from the Passifloraceae family. The elucidation of the mechanisms responsible for the formation of the corona is of great importance to the comprehension of the evolutionary processes that allowed the diversification of the interactions with pollinators among the species of this family. This work aimed the identification and characterization of transcription factors (FT) preferentially expressed in the corona of Passiflora spp. For that, the expressed sequence tags (ESTs) database PASSIOMA was investigated and 139 cDNAs were identified: 69 derived from P. edulis flower libraries, 68 from P. suberosa and 2 from P. pohlii. Aiming to attribute identities to the sequences, a parsimony analysis was performed, with the obtaining of cladograms that allowed the identification of members belonging to 31 different transcription factor gene families in Passiflora spp. Macroarray experiments indicated that 9 putative genes coding for transcription factors showed expression in corona filaments. Further characterization of these transcription factors included RT-PCR experiments involving 5 out of the 9 genes and in situ hybridization with 2 out of the 5 genes that were previously analyzed with RT-PCR. The RT-PCR results indicated that these genes are expressed in corona tissues, but also in leaves and other floral organs. The in situ hybridization results confirmed that the genes studied are not specifically expressed in the corona / Mestrado / Biologia Vegetal / Mestre em Biologia Vegetal

Orientador: Marcelo Carnier Dornelas / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T10:11:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_NataliaMoraes_M.pdf: 14412553 bytes, checksum: 83a1ebe6dc3d2e46bf9a80d37d909bf9 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A família TCP de fatores de transcrição é específica de plantas; os genes dessa família são caracterizados pela presença do domínio TCP, responsável pela ligação ao DNA, e são divididos em duas classes (Classe I e Classe II) com atuação presumidamente antagônica no controle da proliferação celular. TCP20 é um gene da classe I, que pode atuar conjuntamente com TCP8 e TCP9 no controle do ciclo celular e no crescimento da planta. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar fenotipicamente o desenvolvimento reprodutivo dos mutantes simples e duplos para esses genes e determinar o padrão de expressão de TCP20 durante o desenvolvimento floral em Arabidopsis thaliana. Com experimentos de RT-PCR foi possível detectar a presença de transcritos de TCP8, TCP9 e TCP20 em raiz, folhas, inflorescências, flores e frutos de A. thaliana. A análise temporal e espacial da expressão do gene TCP20, mostrou a presença desses transcritos de forma concentrada nos meristemas florais e domos dos primórdios de órgãos florais. A expressão tornou-se mais apical em sépalas e pétalas ao longo do desenvolvimento, e nos órgãos férteis tornou-se mais concentrada na região de formação dos grãos de pólen e óvulos, e na papila estigmática. Foram feitos experimentos de hibridização in situ com os genes TCP8 e TCP9, e estes apresentaram padrão de expressão temporal parecido com TCP20, desligando-se quase completamente ao final da maturação floral. TCP8 apresentou expressão concentrada em algumas células e ausente em outras da mesma região, indicando um padrão de expressão `salt-and-pepper¿ principalmente no início do desenvolvimento dos órgãos florais. A análise de morfometria geométrica indicou algumas variações nas flores de indivíduos mutantes, que incluem principalmente modificações no eixo radial e em porções apicais de sépalas, pétalas e pistilos. A análise de morfometria linear apontou que as sépalas do duplo mutante tcp9tcp20 foram estatisticamente menores que as do genótipo selvagem (p<0,05). O gineceu dos mutantes simples para os três genes, mostraram ovários menores do que os de genótipo selvagem (p<0,05). As análises de áreas celulares da epiderme das pétalas mostraram que não existem modificações nas áreas dessas células nos indivíduos mutantes. A análise das giant cells em sépalas mostrou que não existem diferenças entre as áreas médias dessas células em sépalas de indivíduos mutantes, porém os mutantes tcp8 e duplo tcp8tcp20 mostraram área de cobertura total dessas células menor do que em sépalas de flores selvagens. Os resultados obtidos indicam que esses genes atuam em conjunto controlando os processos responsáveis pela formação e desenvolvimento dos órgãos florais, através do controle dos ciclos de divisão e endoreduplicação / Abstract: The TCP transcription factor family is plant-specific. Genes of this family are characterized by the TCP domain, responsible for the interaction with DNA, and are divided in two classes (Class I and Class II) with antagonist activity in the control of cell proliferation. TCP20 is a class I gene, and act as a complex with TCP8 and TCP9 in controlling cell cycle and plant growth. The main goal of this work was to characterize the phenotype of single and double mutants of these genes during reproductive development and to determine the expression pattern of TCP20 during flower development in Arabdopsis thaliana. Using RT-PCR it was possible to detect transcription of TCP8, TCP9 and TCP20 in roots, leaves, inflorescences, flowers and fruits of A. thaliana. Spatial and temporal analysis of expression, using in situ hybridization, showed a concentration of TCP20 transcripts in floral meristems and in floral organ primordia. The expression became more apical in sepals and petals later in development and in fertile organs it accumulated in pollen, ovules and in the stigmatic papillae. In situ hybridization experiments were also performed with TCP8 and TCP9 genes. These genes showed expression patterns very similar to those of TCP20, and were down-regulated at the end of the maturation process. TCP8 expression accumulated in some cells and was absent in other close cells from the same tissue region, indicating a `salt-and-pepper¿ expression pattern, especially at the beginning of floral organ development. Geometric morphometry analysis indicated some variations in the phenotype of mutant flowers, which were mainly modifications on the radial axis and at the apical portions of sepals, petals and pistil. Linear morphometry analysis pointed out that tcp9tcp20 double mutant sepals were statistically smaller than those of the wild type (p<0.05). The gynoecium of single mutants had smaller ovaries than those of the wild type (p<0.05). The analysis of the epidermic cells showed no modifications in the area of these cells among mutant individuals. The analysis of giant cells in sepals showed that the mean giant cell areas of mutated plants were statistically equal to the wild type. However analysis of total area coverage showed that tcp8 single mutant and tcp8tcp20 double mutant had a smaller area covered by giant cells, indicating a role of these genes in endorreduplication processes. Together, these results indicate that these genes act in complexes controlling processes responsible for flower organ formation and development, through the control of the cycles of cell division and endoreduplication / Mestrado / Biologia Vegetal / Mestra em Biologia Vegetal

Orientador: Lucia Elvira Alvares / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T08:30:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mantovani_CarolinaStefano_M.pdf: 7530088 bytes, checksum: 5c8cf5e001032d6962337caaccfcbcd8 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A Miostatina (MSTN) é uma proteína que regula negativamente a formação de musculatura esquelética, e sua estrutura e função são conservadas em diversas espécies, incluindo humanos. O nocaute de seu gene causa hiperplasia e hipertrofia das fibras musculares, o que despertou grande interesse médico e agropecuário desde a descoberta deste gene. Trabalhos anteriores descrevem a função da proteína, mas ainda faltam dados sobre a regulação da sua expressão gênica. Recentemente, o promotor do gene da Mstn foi identificado e caracterizado pelo nosso grupo de pesquisa, a partir de uma abordagem filogenética. Entretanto, além do promotor, também existem outros elementos cis-reguladores que podem atuar como estimuladores ou silenciadores do processo de transcrição gênica. Em conjunto com o promotor gênico, esses elementos controlam a taxa de transcrição e conferem especificidade espacial e temporal para sua expressão. Sendo assim, a proposta deste trabalho foi identificar e caracterizar possíveis elementos cis-reguladores da Mstn a fim de ampliar o conhecimento sobre a sua regulação transcricional. Para tal, análises de genômica comparativa, semelhantes àquelas empregadas na identificação do promotor gênico da Mstn, foram realizadas para localizar regiões evolutivamente conservadas (ECRs) adjacentes ao lócus da Mstn de humano, camundongo e galinha, bem como para identificar potenciais sítios de ligação para fatores transcricionais conservados nessas regiões. Além disso, foi realizada uma análise da evolução desses possíveis elementos cis-reguladores, a fim de identificar polimorfismos que tenham o potencial de afetar a atividade transcricional da Mstn. Nossos resultados revelaram a existência de um arcabouço regulatório ancestral composto por sítios de ligação conservados em várias das ECRs analisadas, o qual tem sido mantido entre 310 e 430 milhões de anos. Além disto, foram identificados polimorfismos, bem como sítios de ligação grupo-específicos, os quais podem estar envolvidos na regulação diferencial da atividade da Mstn e, portanto, na geração de diferentes fenótipos musculares entre os animais. Dentre as oito ECRs estudadas, duas possuem maior potencial de estarem envolvidas na miogênese, uma vez que nelas foram identificados sítios de ligação para importantes fatores relacionados a este processo. Análises funcionais das ECRs 2 e 5/6 em células C2C12 em diferenciação confirmaram o potencial dessas ECRs de humano e camundongo de atuarem como elementos cis-reguladores, uma vez que mostraram que eles são capazes de modificar a expressão do gene repórter EGFP em comparação ao controle. As ECRs de galinha, por outro lado, não geraram resultados significativos, reforçando a hipótese de que as diferenças nos TFBS encontradas no grupo das aves geram alterações funcionais nas ECRs. O desenrolar de novos estudos a partir dos resultados obtidos neste trabalho permitirão estabelecer o papel específico das ECRs identificadas, bem como determinar a importância das variações de sequências destes elementos reguladores em diferentes animais. No longo prazo, nossas pesquisas poderão subsidiar o desenvolvimento de estratégias que possibilitem a modulação da atividade da Mstn em patologias humanas que afetam a musculatura esquelética / Abstract: The Myostatin protein (MSTN) is an important regulator of skeletal muscle deposition in vertebrates, and its structure and function are conserved in several species, including humans. The knockout of this gene causes hyperplasia and hypertrophy of muscle fibers, which has aroused great medical and agricultural interest since its discovery. Previous studies have described the function of this protein, but data on the regulation of Mstn gene expression are still scarce. Recently, the Mstn gene promoter has been identified and characterized by our research group from a phylogenetic approach. However, in addition to the promoter, there are also other cis-regulatory elements that can act as enhancers or silencers of gene transcription process. Along with the gene promoter, these elements control the transcription rate and provide spatial and temporal specificity for its expression. Thus, the purpose of this study was to identify and characterize potential Mstn cis-regulatory elements in order to increase knowledge of the transcriptional regulation of this gene. For this purpose, comparative genomic analysis similar to those employed in the identification of the Mstn promoter were performed to locate evolutionary conserved regions (ECRs) adjacent to the locus of the Mstn gene in human, mouse and chicken, as well as to identify potential transcription factors binding sites (TFBS) conserved in these regions. Furthermore, an evolutionary analysis of the putative cis-regulatory elements has been performed in order to identify polymorphisms that have the potential to affect the transcriptional activity of Mstn. Our results indicate the existence of an ancestral regulatory framework that comprises conserved TFBS in almost all of the ECRs analyzed, which has been maintained between 310 and 430 million years. Furthermore, polymorphisms were identified, as well as group-specific binding sites, which may be involved in the differential regulation of Mstn activity and, therefore, in the generation of different muscle phenotypes in animals. Among the eight ECRs studied, two of them have great potential to be involved in myogenesis, given that binding sites for important factors related to this processes were identified. Functional analyses of ECRs 2 and 5/6 in differentiating C2C12 cells confirmed the potential of the human and mouse ECRs as cis-regulatory elements, once they have shown that they are able to enhance the expression of the EGFP reporter gene, when compared to the control. The chicken ECRs, on the other hand, did not generate significant results, supporting the hypothesis that the differences found in the TFBS pattern in birds generate functional modifications in the ECRs. The development of new studies from the results obtained here may help to establish the specific role of the ECRs identified, as well as determine the importance of the variation in the sequence of these regulatory elements in different animals. In the long run, our research may lay the foundation to the development of strategies that allow the modulation of Mstn activity in human pathologies affecting skeletal muscle / Mestrado / Biologia Tecidual / Mestra em Biologia Celular e Estrutural