Em invertebrados, os genes Scratch (Scrt) codificam fatores de transcrição que promovem a neurogênese durante o desenvolvimento. A função de Scrt em vertebrados é desconhecida, mas em camundongos Scrt1 e Scrt2 são especificamente expressos em neurônios pós-mitóticos no embrião e no sistema nervoso central adulto. Neste trabalho, nós clonamos a sequência codificante de Scrt2 de galinha (cScrt2) e caracterizamos seu padrão de expressão no embrião por PCR quantitativo e hibridação in situ. A sequência codificante completa foi clonada no vetor de expressão pMES-GFP e o produto previsto da tradução é uma proteína com 276 aminoácidos. A sequência de aminoácidos compartilha identidades de 70% com Scrt2 de rato e 58% com Scrt de zebrafish. Transcritos cScrt2 são detectados primeiramente na periferia do tubo neural do rombencéfalo em HH 15 e da medula espinhal em HH 17, coincidindo com os locais onde alguns dos primeiros neurônios se diferenciam durante a embriogênese. Entre HH 19-23, a expressão no domínio motor da medula espinhal se concentra progressivamente na interface entre as zonas ventricular e do manto. Além disso, a expressão de cScrt2 também é observada nos gânglios da raíz dorsal a partir de HH 22-23, principalmente no domínio dorsomedial. O campo de expressão de cScrt2 no tubo neural é complementar aos de Notch1, que é expresso em células-tronco neurais, e SCG10, marcador de neurônios diferenciados. Nossos resultados sugerem que durante a embriogênese da medula espinhal cScrt2 é especificamente expresso em neurônios pós-mitóticos indiferenciados. A construção pMES-GFP(cScrt2) possibilita futuras análises funcionais diretas por interferência gênica no embrião de galinha, que serão de grande valor para um melhor entendimento da função dos genes Scrt em vertebrados. / In invertebrates, the Scratch (Scrt) genes encode transcription factors that promote neurogenesis during development. The Scrt function in vertebrates is unknown, but in mice Scrt1 and Scrt2 are specifically expressed in post-mitotic neurons in the embryo and in the adult central nervous system. In this work, we have cloned the coding sequence of chicken Scrt2 (cScrt2) and characterized its expression pattern in the embryo with quantitative PCR and in situ hybridization. The complete coding sequence was cloned in the expression vector pMES-GFP and the predicted translation product is a 276-aminoacids protein. The aminoacid sequence shares identities of 70% with rat Scrt2 and 58% with zebrafish Scrt. cScrt2 transcripts are firstly detected in the periphery of the neural tube in the hindbrain by HH 15 and in the spinal cord by HH 17, coinciding with the places where some of the first neurons differentiate during embryogenesis. Between HH 19-23, the expression in the motor domain of the spinal cord is progressively concentrated in the interface between the ventricular and mantle zones. Furthermore, cScrt2 expression is also observed in the dorsal root ganglia after HH22-23, particularly in the dorsomedial domain. The expression pattern of cScrt2 in the neural tube is complementary to that of Notch1, which is expressed in neural stem cells, and SCG10, a marker for differentiated neurons. Our results suggest that during embryogenesis cScrt2 is specifically expressed in post-mitotic undifferentiated neurons. The construction pMES-GFP(cScrt2) makes possible future direct functional analysis by genetic interference in the chick embryo, which will be of great value for better understanding the Scrt genes function in vertebrates.

Submitted by Maria Beatriz Vieira (mbeatriz.vieira@gmail.com) on 2018-06-11T17:00:10Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) resumo_tese_gabriela_peres_moraes_de_freitas.pdf: 25733 bytes, checksum: db07dd8031202634a6a7a48362f489ff (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2018-06-11T18:28:39Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) resumo_tese_gabriela_peres_moraes_de_freitas.pdf: 25733 bytes, checksum: db07dd8031202634a6a7a48362f489ff (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-11T18:28:39Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) resumo_tese_gabriela_peres_moraes_de_freitas.pdf: 25733 bytes, checksum: db07dd8031202634a6a7a48362f489ff (MD5) Previous issue date: 2017-06-23 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul - FAPERGS / Devido a sua origem tropical, o arroz (Oryza sativa L.) é muito impactado pelo estresse causado pelas baixas temperaturas e consequentemente apresenta grandes perdas de crescimento e produtividade. É o segundo cereal mais consumido no mundo e o decremento na produção causado por eventos de temperatura extrema, pode ocasionar impactos significativos na economia mundial. A sensibilidade e os sintomas das respostas das plantas ao estresse por baixas temperaturas variam com o estádio de desenvolvimento. Observa-se que no estádio inicial ocorre um retardo e diminuição da germinação das sementes e no vegetativo, clorose foliar, baixa estatura e diminuição do perfilhamento. Já no reprodutivo ocorre o aborto e esterilidade das espiguetas, exerção incompleta da panícula, anormalidades no desenvolvimento das anteras, mancha dos grãos e maturação tardia e incompleta dos mesmos. Este trabalho teve como objetivo avaliar nos estádios vegetativo e reprodutivo, os mecanismos adaptativos de resposta ao estresse por baixas temperaturas, a nível molecular, bioquímico e fisiológico. Foram analisados 22 genótipos de arroz, da coleção “mini-core” do USDA para tolerância ao frio, in vitro, através de parâmetros morfológicos. Destes 22, foram selecionados quatro genótipos (dois tolerantes e dois sensíveis), para avaliação, no estádio vegetativo, de trocas gasosas, análises bioquímicas, expressão gênica e de proteínas. As análises de trocas gasosas e expressão gênica foram repetidas durante o estádio reprodutivo. Os primeiros efeitos do estresse por baixa temperatura foram identificados na fotossíntese em todos os genótipos e em ambos os estádios. O perfil bioquímico e dos genes de proteínas de transferência de lipídeos (LTPs), OsGH3-2, OsSRO1a, OsZFP245, OsTPP1 e as proteínas LRR-RLKs, BHLH, GLYI e LTP1, no estádio vegetativo, demonstraram que, apesar dos impactos da baixa temperatura nos genótipos tolerantes, houve um ajuste rápido para que a homeostase celular fosse mantida, mostrando uma clara diferença na expressão gênica entre os genótipos. Foi visualizado também que a expressão dos genes OsLTP7, OsLTP10, fatores de transcrição e genes induzidos por baixa temperatura foram maiores nos genótipos tolerantes, em ambos os tecidos. O estresse por baixa temperatura afetou severamente os parâmetros de produção, tendo uma perda no rendimento dos grãos de 40 e 90%, nos genótipos tolerantes e sensíveis, respectivamente. Assim, este estudo identificou o genótipo Nipponbare como tolerante a baixas temperaturas em ambos os estádios. Os genes LTP, OsGH3-2, OsSRO1a, OsZFP245 e OsTPP1 e as proteínas LRR-RLKs, bHLH, GLYI e LTP1, são bons candidatos para o “screening” de tolerância a baixas temperaturas, no vegetativo, enquanto que as OsLTP7, OsLTP10, OsNAC9, OsNAC10 e OsNAP podem ser usados, com o mesmo fim, no reprodutivo. / Due to its tropical origin, rice (Oryza sativa) is very impacted by cold stress and consequently presents great losses of growth and yield. It is the second most consumed cereal in the world and the decrease in production caused by extreme temperature events can have significant impacts in the world economy. Sensitivity and symptoms of plant responses to stress due to low temperatures vary with the stage of developmental. It is observed that in the first developmental stage there is a delay and decrease of seed germination and on vegetative stage, foliar chlorosis, short stature and decrease of the profile. It is observed that in the first development stage there is a delay and decrease of the germination of the seeds and in the vegetative stage, leaf chlorosis, short stature and reduction of tillering. At reproductive stage, the abortion and sterility of the spikelets, incomplete panicle excretion, abnormalities in the development of the anthers, grain spots and late and incomplete maturation of the grain. The purposed of this study was to evaluate the adaptive mechanisms of response to stress induced by low temperatures at the molecular, biochemical and physiological levels at the vegetative and reproductive stages. Twenty-two rice genotypes from the USDA mini-core collection for cold tolerance, in vitro, were analyzed through morphological parameters. Of these 22, four genotypes (two tolerant and two sensitive) were selected for vegetative stage evaluation of photosynthetic parameters, biochemical and gene and protein expression. Analysis of photosynthetic parameters and gene expression were repeated during the reproductive stage. The first effects of low temperature stress were identified in photosynthesis in all genotypes and in both stages. Biochemical profile and genes of lipid transfer proteins (LTPs), OsGH3-2, OsSRO1a, OsZFP245, OsTPP1 and the LRR-RLKs, BHLH, GLYI and LTP1 proteins at the vegetative stage have demonstrated that, despite impacts of low temperature in the tolerant genotypes, had a fast adjustment for cellular homeostasis to be maintained, showing a clear difference in gene expression between the genotypes. It was also visualized that the expression of OsLTP7, OsLTP10, transcription factors and low temperature genes were higher in the tolerant genotypes in both tissues. Low temperature stress severely affected production parameters, with a yield loss of 40 and 90% in tolerant and sensitive genotypes, respectively. Therefore, this study identified the genotype Nipponbare as possible tolerant to low temperatures in both stages. LTP genes, OsGH3-2, OsSRO1a, OsZFP245 and OsTPP1, and the porteins LRR-RLKs, bHLH, GLYI and LTP1 are good candidates at the screening for cold tolerance at the vegetative stage, whereas OsLTP7, OsLTP10, OsNAC9, OsNAC10 and OsNAP can be used, for the same purpose, at reproductive stage.

Submitted by Ubirajara Cruz (ubirajara.cruz@gmail.com) on 2016-09-27T13:58:03Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) dissertacao_pedro_silveira.pdf: 618469 bytes, checksum: 2d5be3b5e8360e244f71d3c147be68af (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2016-09-28T17:04:11Z (GMT) No. of bitstreams: 2 dissertacao_pedro_silveira.pdf: 618469 bytes, checksum: 2d5be3b5e8360e244f71d3c147be68af (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-28T17:04:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 dissertacao_pedro_silveira.pdf: 618469 bytes, checksum: 2d5be3b5e8360e244f71d3c147be68af (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2014-02-14 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Marcadores moleculares, cada vez mais, vem sendo utilizados em programas de melhoramento genético de bovinos leiteiros, incluindo várias características produtivas e sanitárias. Por outro lado, a reduzida atividade da paraoxonase (PON1) na circulação dos animais está associada com maior ocorrência de doenças nestes indivíduos, sendo que há pouca informação quanto a influência do gene da PON1 neste processo. O objetivo deste estudo foi caracterizar a ocorrência de polimorfismos na região promotora do gene da PON1, bem como avaliar a sua relação com a atividade sérica desta proteína no periparto de vacas leiteiras da raça Holandês. Foram utilizadas 28 vacas da raça Holandês, das quais coletou-se sangue para análise da atividade sérica da PON1. Estas avaliações foram feitas nos dias -21, -7, 0, 3, 6, 9, e 23 (dia 0 = dia do parto). Foi realizada a extração de DNA dos leucócitos circulantes e a partir daí foi feito o PCR dessas amostras, visando a amplificação de um fragmento de DNA contendo 828 pb no promotor da PON1. Após a eletroforese em gel de agarose, as amostras foram purificadas e sequenciadas para identificação dos polimorfismos. Foram encontrados seis SNPs no promotor do gene da PON1, localizados nas posições -22, -105, -221, -392, -611 e -676. Destes, os SNPs -105, -221 e -611 foram correlacionados com a atividade sérica da PON1 no período avaliado (p<0,05), sendo que os genótipos PON1-105(AA), PON1-221(AA) e PON1-611(CC) apresentaram os maiores níveis de PON1 (p<0,05). Além disto, os SNPs -105 e -221 apresentaram diferenças nos níveis de PON1 durante o pré-parto(p<0,05). Em conclusão, foram identificados 6 SNPs na região do promotor do gene da PON1, dos quais três estão associados com a atividade da enzima. / Molecular markers, increasingly are being used in breeding programs of dairy cattle, including several production and health characteristics. On the other hand, the reduced activity of paraoxonase (PON1) in the circulation of animals is associated with increased occurrence of diseases in these individuals, there is little information regarding the influence of the PON1 gene in this process. The aim of this study was to characterize the occurrence of polymorphisms in the promoter region of the PON1 gene and to evaluate its relationship with serum PON1 activity in peripartum dairy Holstein cows. For that blood was collected from 28 Holstein cows for analysis of serum activity of paraoxonase (PON1). The sampling was performed on days -21, -7, 0, 3, 6, 9 and 23 (day 0 = day of calving). DNA extraction was performed in circulating leukocytes and PCR of these samples was performed, targeting the amplification of a DNA fragment containing 828 bp in the PON1 promoter. After agarose gel electrophoresis, the samples were purified and sequenced to identify the polymorphisms. Six SNPs were found in the promoter of the PON1 gene, located at positions -22, -105, -221, -392, -611 and -676. From these, SNPs -105, -221 and -611 were associated with serum PON1 activity during the study period (p < 0.05), whereas the PON1-105(AA), PON1-221(AA) and PON1 -611(CC) genotypes had higher levels of PON1 (p < 0.05). Moreover, SNPs -105 and -221 had differences in the levels of PON1 already during the prepartum period (p < 0.05). In conclusion, 6 SNPs were identified in the promoter of the PON1 gene, three of which are associated with the activity of the enzyme.

Orientador: Marcelo Palma Sircili / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T01:00:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Culler_HebertFabricio_D.pdf: 4509234 bytes, checksum: 996664e9d72f80df8f43076b618a7f73 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: As Escherichia coli enteropatogênicas atípicas são capazes de formar biofilme em superfícies abióticas e bióticas. Diversos mecanismos em E. coli são regulados por Quorum Sensing, incluindo a expressão de fatores de virulência e formação de biofilme. Quorum Sensing é um sistema de sinalização que confere às bactérias a habilidade de responder à moléculas químicas denominadas autoindutores (AI). SdiA e QseC são receptores de quorum sensing encontrados em diversas bactérias, entre elas EPECa. SdiA detecta moléculas autoindutoras do tipo 1 (AI-1) denominadas N-acil homoserina lactonas (AHLs). Entretanto as Escherichia coli não possuem a sintase para estas moléculas e, deste modo, SdiA detecta AHLs produzidas por outras bactérias. O receptor QseC detecta moléculas autoindutoras do tipo 3, além dos hormônios humanos adrenalina e noradrenalina. Neste estudo verificamos a influência da deleção de sdiA e qseC na formação e arquitetura do biofilme, formação de película, anel e também na transcrição de alguns dos genes envolvidos nestes fenótipos (bcsA, csgA, csgD, fliC, fimA e rpoS) em duas amostras de EPECa, sendo uma do sorotipo O55:H7 e outra do sorotipo ONT:H25. Os resultados das análises nas duas amostras de EPECa foram distintos, confirmando a grande heterogeneidade reportada em outros estudos em amostras deste patótipo. A amostra ONT:H25?sdiA formou espesso biofilme em placas de 96 poços e espessa estrutura (em anel) como anéis na parede do tubo de ensaio em relação às amostras selvagem e complementada. Além disso, o mutante sdiA desta amostra foi capaz de formar película na superfície do meio enquanto as amostras selvagem e complementada foram negativas. A amostra O55:H7?sdiA não apresentou diferença significativa na formação (das estruturas analisadas) destas estruturas em relação às amostras selvagem e complementada. Análises de qRT-PCR demonstraram (maiores níveis de transcrição de) um aumento na transcrição de csgA, csgD e fimA na amostra ONT:H25 deletada em sdiA, possivelmente indicando que o aumento na formação de biofilme por esta amostra esteja relacionado ao aumento da expressão das fímbrias tipo 1 e curli. A adição de AHLs à amostra selvagem ONT:H25 diminuiu a formação de biofilme e os níveis transcricionais de csgD e fimA, enquanto na amostra deletada não houve diferença, indicando que sdiA participa da regulação da formação de biofilme em EPECa e que as AHLs aumentam os efeitos repressores deste receptor nos genes relacionados à formação de biofilme. Quanto às amostras deletadas em qseC foi possível verificar uma diminuição da formação de biofilme em relação às amostras selvagens e complementadas, mas não houve diferença na formação de película na interface ar-líquido e também na formação de anel na parede dos tubos. A amostra ONT:H25?qseC foi negativa para expressão de fímbria curli em placas contendo vermelho congo e apresentou aumento da transcrição de bcsA e fimA, enquanto teve a transcrição de csgA, csgD e fliC diminuída em relação à amostra selvagem. A adição de adrenalina aumentou a formação de biofilme e motilidade nas duas amostras mutantes indicando a possível presença de outro receptor em EPECa responsável pela detecção destes hormônios na ausência de QseC. Portanto, conclui-se que estes dois receptores de quorum sensing estão relacionados, direta ou indiretamente, à formação de biofilme em EPECa / Abstract: Atypical enteropathogenic Escherichia coli are capable to form biofilm on biotic and abiotic surfaces. Several E. coli mechanisms are regulated by Quorum Sensing, including expression of virulence factors and biofilm formation. Quorum Sensing is a signaling system that confers bacteria the ability to respond to chemical molecules known as autoinducers. SdiA and QseC are Quorum Sensing receptors found in several bacteria, including aEPEC. SdiA detects type 1 autoinducer molecules (AI-1) known as N-acil homoserin lactones. However, Escherichia coli do not produce this kind of molecules and SdiA detects AHLs produced by other bacteria. QseC receptor detects type 3 autoinducer molecules and the human hormones adrenalin and noradrenaline. In this study the influence of the sdiA and qseC deletion in the biofilm formation and architecture, pellicle and ring-like structure formation and transcription of some genes (bcsA, csgA, csgD, fliC, fimA and rpoS) in two strains of aEPEC (O55:H7 and ONT:H25) was verified. The results of the analysis of the two aEPEC strains were distinct, confirming the heterogeneity reported by other studies in the same patotypes. The strain ONT:H25?sdiA formed a thick biofilm in 96-well plates and thick ring-like structure on the tube wall compared with the wild type and complemented strains. Furthermore, the sdiA mutant strain was capable to form pellicle on both surfaces, while the wild type and complemented strains were negative. The strain O55:H7?sdiA did not show a significant difference on the formation of these structures compared to the wild type and complemented strains. qRT-PCR analysis demonstrated an enhance on the transcription of csgA, csgD and fimA in the deleted sdiA ONT:H25 strain, suggesting that a relative increase of biofilm formation in ONT:H25 strain could be related to the increase of the expression of type 1 and curli fimbriae. The addition of AHLs to the wild type strain ONT:H25 decreased the biofilm formation and the transcriptional levels of csgD and fimA, but not in the mutant strain, indicating that sdiA plays a role in the regulation of biofilm formation in aEPEC. AHLs also increased the repressor efects of this receptor in biofilm related genes. The mutant qseC strains showed a decrease in biofilm formation when compared to wild type and complemented strains, but there was no difference in the pellicle formation in the air-liquid interface, as in the ring-like structure formation in the tube wall. The ONT:H25?qseC strain was negative to curli fimbriae expression in congo red plates and displayed an increase in the transcription of bcsA and fimA genes, while a decrease was verified in the csgA, csgD and fliC genes compared to the wild type strain. The addition of adrenalin increased the biofilm formation and motility in both mutant strains, possibly indicating the presence of other receptor in aEPEC involved in the detection of these hormones in the absence of QseC. In conclusion, these two Quorum Sensing receptors are related with biofilm formation in aEPEC / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Os projetos genoma têm fornecido uma grande quantidade de informação sobre a arquitetura gênica e sobre a configuração física de suas respectivas regiões flanqueadoras (RF). Estas RF contêm informações com o potencial de auxiliar na elucidação de vários processos biológicos, como os mecanismos de expressão gênica e de sua regulação. Estes mecanismos são de extrema importância para a compreensão do correto funcionamento dos organismos e das patologias que os afetam. Uma parte significativa dos mecanismos de controle de expressão gênica atuam na fase transcricional. Na base destes mecanismos está o recrutamento de proteínas que se ligam às regiões promotoras da transcrição, as quais são segmentos específicos de DNA que podem estar localizados tanto próximos à região de início da transcrição (TSS) quanto a centenas ou até a milhares de pares de bases dela. Essas proteínas compõem a maquinaria transcricional e podem ativar ou inibir o processo de transcrição. Experimentalmente, os segmentos regulatórios podem ser identificadas utilizando métodos complexos de biologia molecular, tais como SELEX, ChiP-ChiP, ChIP-Seq, dentre outros. Uma estratégia alternativa aos métodos experimentais é a utilização de metodologias computacionais. Análises computacionais tendem a ser mais rápidas, baratas e flexíveis do que protocolos experimentais, além de poderem ser utilizadas em larga escala. Atualmente, os métodos computacionais disponíveis necessitam de informações experimentais para a definição de padrões globais de preferências de sequências de DNA para a ligação de fatores de transcrição (TFBS, em inglês transcription factor binding sites). Entretanto, esses métodos apresentam uma elevada taxa de falso positivos e, por vezes, apresentam também taxas significativas de falso negativos, além de serem limitados ao estudo de fatores de transcrição de espécies bem conhecidas, o que diminui a área de aplicação dos mesmos. Diante deste cenário, o uso de métodos computacionais que não necessitem da informação referente aos sítios de ligação, bem como os que utilizem parâmetros mais robustos de detecção dos resultados, em detrimento dos escores de pontuação provindos de alinhamentos, podem acrescentar uma sensível melhoria ao processos de predição de regiões regulatórias. Neste projeto, foi desenvolvido um novo modelo computacional (TFBSAnalyzer) para análise e identificação de TFBS em elementos regulatórios, que utiliza técnicas de modelagem molecular para a construção de complexos entre um fator de transcrição ancorado a estruturas de DNA com sequências variáveis de bases e, através de cálculos termodinâmicos de entalpia de ligação, determina uma função de pontuação baseada na energia de ligação e realiza a predição de sítios de ligação ao DNA para o fator de transcrição em análise. Esta abordagem foi testada com três fatores de transcrição como sistemas-modelo, pertencentes à família dos receptores nucleares, a saber: o receptor de estrógeno ER-alfa (Estrogen Receptor Alpha), o receptor de ácido retinoico RAR-beta (Retinoid Acid Receptor Beta) e o receptor X retinóico RXR (Retinoid X Receptor). Os modelos previstos computacionalmente foram comparados aos dados experimentais disponíveis para estes receptores nucleares, os quais apresentaram as seguintes taxas de FP/FN: 10%/0 para RAR-beta e RXR, 21%/6% para ER-alfa. Também simulamos um experimento de ChIP-seq do ER-alfa no genoma humano, cujos genes selecionados foram submetidos a uma análise de enriquecimento de fatores de transcrição curados experimentalmente, que fazem sua regulação, revelando que o receptor de estrógeno está realmente envolvido no processo. Para mostrar a aplicabilidade geral de nosso método, nós modelamos a distribuição de energia de ligação para o receptor NHR-28 isoforma a de Caenorhabditis elegans com DNA . Obtivemos distribuições de energia semelhantes àquelas encontradas para os NRs modelos, portanto seria possível aplicar o método para buscar possíveis TFBSs para este receptor no genoma de C. elegans. Os dados gerados e as metodologias desenvolvidas neste projeto devem acrescentar uma sensível melhoria aos processos de predição de regiões regulatórias e consequentemente auxiliar no entendimento dos mecanismos envolvidos no processo de expressão gênica e de sua regulação. / The genome projects have provided a lot of information about the genetic architecture, as well as on the physical configuration of their flanking regions (FR). These FR have the potential to aid in the elucidation of many biological processes, such as the mechanisms involved in gene expression and its regulation. These mechanisms are extremely important for undeerstanfind the correct functioning of organisms as well as the pathologies that affect them. A significant part of the control mechanisms of gene expression act during transcription. On the basis of this mechanisms is the recruitment of proteins that bind to promoter regions of transcription, which are specific segments of DNA that can be located either near the transcription start site or at hundreds or even thousands of base pairs away. These proteins form the transcription machinery, which can activate or inhibit the transcription process. The regulatory segments can be identified experimentally using complex methods of molecular biology, such as SELEX, ChIP-chip, ChIP-seq, among others. An alternative strategy to these experimental methods is the use of computational methodologies for predicting regulatory regions. Computational analysis tend to be faster, cheaper and more flexible than the experimental protocols, and can be used on a larger scale. Currently, the available computational methods require information previously obtained from experiments in order to define global standards of preference of DNA-Binding sequences for transcription factors (TFBS - Transcription Factor Binding Sites). However, these methods have a high rate of false positives and sometimes also have significant rates of false negatives, besides being limited to the study of transcription factors of well-known species, which decreases their application area. In this scenario, the use of computational methods that do not require previous information concerning the binding sites and use more robust parameters of results detection, instead of alignment scores, may add significant improvement to the processes of predicting regulatory regions. In this project, we developed a new computational model TFBSAnalyzer) for analysis and identification of regulatory elements using molecular modeling techniques for the construction of complexes between a transcription factor bound to specific DNA structures with variable sequences of bases and, by means of thermodynamic calculations of bond enthalpy, provides a scoring function based on the binding energy and predicts the DNA binding sites for the transcription factor in analysis. This approach was tested initially with three transcription factors as models, belonging to the nuclear receptor family, namely estrogen receptor ER-alpha (Estrogen Receptor Alpha), the retinoic acid receptor RAR-beta (Retinoid Acid Receptor Beta) and the retinoic X receptor RXR (Retinoid X Receptor). The computationally predicted models were compared to experimental data available for these nuclear receptors, and presented the following rates of FP/FN: 10%/0 for RAR-beta and RXR, 21%/6% for ER-alpha. We also simulated an experiment of ChIP-seq with ER-alpha with the human genome, where the selected genes were subjected to a transcription factor enrichment analysis, with curated information, revealing that the estrogen receptor is indeed involved in their regulation. To show that our method has a general applicability, we modeled the binding energy distribution for the NHR-28 receptor, isoform a, from Caenorhabditis elegans. The energy distributions obtained were similar to the ones obtained for the model NR, so it would be possible to use the method and search for possible TFBS in the C. elegans genome. The data generated and the methodologies developed in this project should add a significant improvement to the prediction processes of regulatory regions and, consequently, help to understand the mechanisms involved in the gene expression process and its regulation.

O colágeno XVIII é um componente das membranas basais com diversos domínios funcionais, como a endostatina e o domínio frizzled, que têm importante papel em processos celulares como proliferação e diferenciação. COL18A1 possui dois promotores alternativos: o promotor 1, que regula a síntese da variante NC11-303, e o promotor 2 responsável pelas variantes NC11- 728 e NC11-493, expressas por hepatócitos. Existe uma variação interindividual da endostatina circulante e da expressão do colágeno XVIII no fígado. A expressão do colágeno XVIII/endostatina foi correlacionada com a progressão tanto do hepatocarcinoma (HCC), quanto da fibrose/cirrose hepática. Elucidar a regulação da expressão de COL18A1 pode auxiliar na compreensão dessa variação interindividual e da progressão dessas doenças. Neste trabalho demos início a caracterização do promotor 2 do COL18A1. Identificamos na seqüência predita como promotora cinco regiões conservadas entre humanos e camundongos. A análise in silico e funcional dessas regiões revelou que os fatores de transcrição, Sp1, Sp3, YY1, Oct-1, C/EBP&#945; e C/EBP&#946;, interagem com as mesmas. Demonstramos que C/EBP&#946;&#61472;aumenta a taxa de transcrição do promotor 2 em hepatócitos, e que existe uma correlação positiva da expressão de NC11-493 com C/EBP&#945;&#61472;e C/EBP&#946;&#61472;em tecido hepático cirrótico e tumoral. As expressões de C/EBP&#945;&#61472;em tecido hepático cirrótico e tumoral estão diretamente correlacionadas, enquanto que os níveis de NC11-493 nos tumores estão inversamente correlacionados com o tamanho dos mesmos. Mostramos a existência de diversos SNPs no promotor 2. O SNP-700T/G, funcional in vitro, afeta a interação de Sp3 e YY1 com essa região regulatória. A deleção da região do SNP indicou que ela possui elementos importantes para a transcrição em hepatócitos, apesar deste SNP não estar relacionado com o nível de expressão do colágeno XVIII em fígado fibrótico ou com susceptibilidade a HCC. O SNP- 700T/G está em desequilíbrio de ligação com o SNPc.1135C/T, no domínio frizzled do colágeno XVIII. Não foi possível elucidar a funcionalidade do SNPs c.1135C/T in vitro, mas os haplótipos formados por esses dois SNPs têm diferentes frequências entre descendentes de europeus e de africanos. Nosso trabalho traz importantes contribuições e abre novas perspectivas para a compreensão da regulação do colágeno XVIII em fígado humano, tanto em situações fisiológicas, quanto em processos fibrogênicos e tumorigênicos¶ / Collagen XVIII is a basal membrane component with several funcional domains, such as endostatin and frizzled domains, which have important roles in cellular processes such as proliferation and differentiation. COL18A1 has two promoter regions: promoter 1, that regulates the synthesis of NC11-303 isoform, and promoter 2, localized in intron 2, responsible for NC11-728 and NC11-493 isoforms expressed by hepatocytes. There is a large interindividual variation in circulating endostatin and in collagen XVIII liver expression. Collagen XVIII/endostatin levels were correlated with hepatocellular carcinoma (HCC) progression, as well as liver fibrosis/cirrhosis, conditions that precede HCC. Elucidating the mechanisms that regulate COL18A1 expression in hepatocytes may help understanding its variation among individuals and liver disease stages, as well as contribute to new treatment strategies. In this work we began to characterize COL18A1 promoter region 2. We identified in the predicted promoter sequence five conserved regions between human and mouse. The in silico and functional analysis of these regions revealed that transcription factors Sp1, Sp3, YY1, Oct-1, C/EBP&#945; and C/EBP&#946; interact with them. We have demonstrated that C/EBP&#946; increases promoter 2 transcription rate in hepatocytes, and that there is a positive correlation of NC11-493 expression with that of C/EBP&#945; and C/EBP&#946; in cirrhotic and tumor liver samples. Non-tumor and tumor C/EBP&#945; expressions positively correlate between themselves, while NC11-493 tumor expression inversely correlates with tumor size. We also showed that there are several SNPs in COL18A1 promoter 2 region. SNP-700T/G, functional in vitro, affects Sp3 and YY1 interaction with the promoter 2 region and deletion of the SNP region indicated that this sequence has important hepatocyte regulatory elements. Our results suggest that this SNP does not significantly affects COL18A1 expression in fibrotic/cirrhotic liver and is not associated with HCC susceptibility. SNP-700T/G is in linkage disequilibrium with SNPc.1135C/T, at collagen XVIII frizzled domain. We could not elucidate SNPc.1135C/T functionality in vitro, but the haplotypes formed by these two SNPs have different frequencies in European and African descendants. In conclusion, our work brings important contributions and opens new perspectives for the comprehension of collagen XVIII regulation in human liver in physiological situations, as well as in fibrotic/cirrhotic and tumorigenic process.

Estudos em modelos animais transgênicos possibilitaram o conhecimento de parte dos genes envolvidos na embriogênese hipofisária e da etiologia genética do hipopituitarismo em humanos. Entretanto, a etiologia da maior parte dos casos de hipopituitarismo congênito, principalmente os associados à neuro-hipófise ectópica (NE), ainda é pouco definida. Mutações no gene PROP1 são a causa genética mais comum de hipopituitarismo descritas até o momento, mas estão sempre associadas à neuro-hipófise tópica. Estudos destinados a esclarecer o mecanismo molecular da mutação do gene Prop1 em camundongos demonstraram a participação da via de sinalização Notch e de seus componentes, dentre eles, o gene Hes1. O HES1 é um gene que codifica um fator de transcrição que participa de estágios precoces do desenvolvimento hipofisário e está envolvido com a morfogênese da neuro-hipófise. A avaliação do camundongo com nocaute em homozigose deste gene acarreta uma hipoplasia da adeno-hipófise e ausência da neuro-hipófise; e sua expressão constitutiva está associada ao hipopituitarismo. Como a NE é um achado comum no hipopituitarismo congênito e o gene HES1 pode estar relacionado a sua fisiopatologia, a região codificadora do gene HES1 foi avaliada em 192 pacientes com hipopituitarismo congênito. A variante alélica c.578G > A (p.G193D) em heterozigose foi encontrada em um paciente com hipopituitarismo congênito associado à NE. A avaliação da predição in silico do efeito funcional da variante pela ferramenta MutationTaster sugere que a troca do aminoácido glicina, altamente conservado entre os mamíferos, por ácido aspártico, seja deletéria. No estudo da segregação familiar, quatro irmãos aparentemente normais apresentam a mesma variante, sendo que dois deles possuem alterações discretas na imagem da hipófise. Em conclusão, esta é uma nova variante alélica descrita no gene HES1, ausente em grandes bancos de dados e controles saudáveis da população brasileira, mas presente em irmãos não afetados. Estudos funcionais in vitro são necessários para esclarecer o efeito biológico desta variante. Um padrão de herança complexo com penetrância incompleta é possível e já descrito em outros genes associados ao hipopituitarismo. Na tentativa de elucidar a causa genética do hipopituitarismo neste caso, o material genético deste paciente e de seus familiares foram submetidos ao sequenciamento do exoma, mas os resultados estão inconclusivos até o momento / Studies of transgenic animal models have allowed for the discovery of genes involved in human pituitary embryogenesis and the genetic etiology of hypopituitarism. However, the genetic causes of most cases of congenital hypopituitarism, especially those associated with an ectopic posterior pituitary, remain poorly defined. Mutations in the gene PROP1 are the most common genetic causes of hypopituitarism described to date, and are always associated with an ectopic posterior pituitary. Studies to elucidate the molecular mechanisms of Prop1 mutations in mice have demonstrated the involvement of the Notch signaling pathway, including its downstream target Hes1. The HES1 gene encodes a transcription factor that participates in early stages of pituitary development and is involved in posterior pituitary morphogenesis. Hes1 knockout mice exhibit a hypoplastic anterior pituitary and absence of a posterior pituitary. Conversely, constitutive expression of Hes1 is associated with hypopituitarism. Since an ectopic posterior pituitary is commonly found in congenital hypopituitarism and the HES1 gene may be related to its pathophysiology, the coding region of gene HES1 was screened in 192 patients with congenital hypopituitarism. A heterozygous allelic variant c.578G >A (p.G193D) was identified in a patient with congenital hypopituitarism associated with an ectopic posterior pituitary. Assessment by MutationTaster, a bioinformatic tool for in silico prediction of functional effect of missense variants, suggests that substitution of glycine (a highly conserved amino acid in this position among mammals) for aspartic acid is deleterious. In the genetic study of family members, we identified four apparently normal siblings with the same variant, two of which have discrete changes in their pituitary MRI. In conclusion, we described a new allelic variant in the gene HES1, absent in large databases and healthy Brazilian controls, but present in the unaffected siblings. In vitro functional studies are needed to clarify the biological effect of this variant. A complex pattern of inheritance with incomplete penetrance is possible in this case, as it has already been described in other genes associated with hypopituitarism. In an attempt to elucidate the genetic cause of hypopituitarism in the family described, DNA samples of this patient and his family were submitted to exome sequencing, but results are inconclusive at this time

A expressão de Smads e de membros da família AP1/ jun-fos podem refletir alterações da via de TGFb, uma via importante para o câncer epidermóide de cabeça e pescoço (HNSCC). Encontramos expressão aumentada dos mRNAs das Smads1-8 em HNSCC em comparação com tecido normal adjacente, por RPA. Além disso, as curvas de sobrevida de Kaplan Meier e a análise multivariada mostraram que a Smad6+ parece ser um fator determinante de bom prognóstico em HNSCC. Quanto a família AP-1, mensurado por Northern blot, somente Fra-1 mostrou-se aumentado no tumor e associado à presença de linfonodos comprometidos. Nossos dados sugerem que a positividade de Smad6 possa ser marcador de bom prognóstico em HNSCC / Smad and AP1 messenger RNA expression may underlie disruptions affecting TGFb signaling in head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC). Analysis of Smads1-8 mRNA expression by RPA has shown Smad expression is globally increased in tumor as compared to adjacent normal tissue. Kaplan Meier survival curves and multivariate analysis revealed that Smad6 positivity in tumor was an independent good prognostic factor in HNSCC. In relation to AP-1, as measured by Northern blot, only Fra-1 was overexpressed in tumor and directly related to the presence of lymph node involvement. Our data suggest that Smad6 may be a marker of good prognosis in HNSCC

Estudos em modelos animais transgênicos possibilitaram o conhecimento de parte dos genes envolvidos na embriogênese hipofisária e da etiologia genética do hipopituitarismo em humanos. Entretanto, a etiologia da maior parte dos casos de hipopituitarismo congênito, principalmente os associados à neuro-hipófise ectópica (NE), ainda é pouco definida. Mutações no gene PROP1 são a causa genética mais comum de hipopituitarismo descritas até o momento, mas estão sempre associadas à neuro-hipófise tópica. Estudos destinados a esclarecer o mecanismo molecular da mutação do gene Prop1 em camundongos demonstraram a participação da via de sinalização Notch e de seus componentes, dentre eles, o gene Hes1. O HES1 é um gene que codifica um fator de transcrição que participa de estágios precoces do desenvolvimento hipofisário e está envolvido com a morfogênese da neuro-hipófise. A avaliação do camundongo com nocaute em homozigose deste gene acarreta uma hipoplasia da adeno-hipófise e ausência da neuro-hipófise; e sua expressão constitutiva está associada ao hipopituitarismo. Como a NE é um achado comum no hipopituitarismo congênito e o gene HES1 pode estar relacionado a sua fisiopatologia, a região codificadora do gene HES1 foi avaliada em 192 pacientes com hipopituitarismo congênito. A variante alélica c.578G > A (p.G193D) em heterozigose foi encontrada em um paciente com hipopituitarismo congênito associado à NE. A avaliação da predição in silico do efeito funcional da variante pela ferramenta MutationTaster sugere que a troca do aminoácido glicina, altamente conservado entre os mamíferos, por ácido aspártico, seja deletéria. No estudo da segregação familiar, quatro irmãos aparentemente normais apresentam a mesma variante, sendo que dois deles possuem alterações discretas na imagem da hipófise. Em conclusão, esta é uma nova variante alélica descrita no gene HES1, ausente em grandes bancos de dados e controles saudáveis da população brasileira, mas presente em irmãos não afetados. Estudos funcionais in vitro são necessários para esclarecer o efeito biológico desta variante. Um padrão de herança complexo com penetrância incompleta é possível e já descrito em outros genes associados ao hipopituitarismo. Na tentativa de elucidar a causa genética do hipopituitarismo neste caso, o material genético deste paciente e de seus familiares foram submetidos ao sequenciamento do exoma, mas os resultados estão inconclusivos até o momento / Studies of transgenic animal models have allowed for the discovery of genes involved in human pituitary embryogenesis and the genetic etiology of hypopituitarism. However, the genetic causes of most cases of congenital hypopituitarism, especially those associated with an ectopic posterior pituitary, remain poorly defined. Mutations in the gene PROP1 are the most common genetic causes of hypopituitarism described to date, and are always associated with an ectopic posterior pituitary. Studies to elucidate the molecular mechanisms of Prop1 mutations in mice have demonstrated the involvement of the Notch signaling pathway, including its downstream target Hes1. The HES1 gene encodes a transcription factor that participates in early stages of pituitary development and is involved in posterior pituitary morphogenesis. Hes1 knockout mice exhibit a hypoplastic anterior pituitary and absence of a posterior pituitary. Conversely, constitutive expression of Hes1 is associated with hypopituitarism. Since an ectopic posterior pituitary is commonly found in congenital hypopituitarism and the HES1 gene may be related to its pathophysiology, the coding region of gene HES1 was screened in 192 patients with congenital hypopituitarism. A heterozygous allelic variant c.578G >A (p.G193D) was identified in a patient with congenital hypopituitarism associated with an ectopic posterior pituitary. Assessment by MutationTaster, a bioinformatic tool for in silico prediction of functional effect of missense variants, suggests that substitution of glycine (a highly conserved amino acid in this position among mammals) for aspartic acid is deleterious. In the genetic study of family members, we identified four apparently normal siblings with the same variant, two of which have discrete changes in their pituitary MRI. In conclusion, we described a new allelic variant in the gene HES1, absent in large databases and healthy Brazilian controls, but present in the unaffected siblings. In vitro functional studies are needed to clarify the biological effect of this variant. A complex pattern of inheritance with incomplete penetrance is possible in this case, as it has already been described in other genes associated with hypopituitarism. In an attempt to elucidate the genetic cause of hypopituitarism in the family described, DNA samples of this patient and his family were submitted to exome sequencing, but results are inconclusive at this time

A expressão de Smads e de membros da família AP1/ jun-fos podem refletir alterações da via de TGFb, uma via importante para o câncer epidermóide de cabeça e pescoço (HNSCC). Encontramos expressão aumentada dos mRNAs das Smads1-8 em HNSCC em comparação com tecido normal adjacente, por RPA. Além disso, as curvas de sobrevida de Kaplan Meier e a análise multivariada mostraram que a Smad6+ parece ser um fator determinante de bom prognóstico em HNSCC. Quanto a família AP-1, mensurado por Northern blot, somente Fra-1 mostrou-se aumentado no tumor e associado à presença de linfonodos comprometidos. Nossos dados sugerem que a positividade de Smad6 possa ser marcador de bom prognóstico em HNSCC / Smad and AP1 messenger RNA expression may underlie disruptions affecting TGFb signaling in head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC). Analysis of Smads1-8 mRNA expression by RPA has shown Smad expression is globally increased in tumor as compared to adjacent normal tissue. Kaplan Meier survival curves and multivariate analysis revealed that Smad6 positivity in tumor was an independent good prognostic factor in HNSCC. In relation to AP-1, as measured by Northern blot, only Fra-1 was overexpressed in tumor and directly related to the presence of lymph node involvement. Our data suggest that Smad6 may be a marker of good prognosis in HNSCC