Orientador: Sidney Luiz Stürmer. / Dissertação (mestrado) - Universidade Regional de Blumenau, Centro de Ciências Tecnológicas, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Ambiental.

Orientador: Andre Rodrigues / Coorientador: Fernando Carlos Pagnocca / Banca: Derlene Attili de Angelis / Banca: Vania Aparecida Vicente / Resumo: Os fungos negros são conhecidos por apresentarem melanina na parede celular, a qual proporciona resistência a diversos estresses ambientais. Nos últimos anos, foram descobertas várias associações entre formigas e fungos negros da ordem Chaetothyriales. No caso das formigas cultivadoras de fungos (atíneas), tais associações permanecem pouco exploradas. Fungos próximos ao gênero Cyphellophora (ex-Phialophora), encontrados no tegumento de formigas do gênero Apterostigma (uma atínea basal), inibem as actinobactérias simbiontes presentes no mesmo local, sendo considerados nocivos para as colônias dessas formigas. Por outro lado, espécies de fungos negros da mesma ordem foram encontradas em baixa abundância no tegumento de alados de Atta (uma atínea derivada). Nesse contexto, pouco se sabe sobre a abundância, diversidade e relação ecológica desses fungos em outros gêneros de atíneas derivadas. Este trabalho teve como objetivo descrever a presença e relação ecológica dos fungos negros no tegumento desses insetos. Utilizando dois métodos dependentes de cultivo, avaliamos a diversidade de fungos negros do tegumento de Acromyrmex coronatus (cortadeira de folhas) e Trachymyrmex tucumanus (não-cortadeira de folhas). Após o isolamento, os fungos foram purificados e identificados com base no sequenciamento da região ITS e um fragmento do gene tef1. Em seguida, foram realizados testes de co-cultivo in vitro entre quatro actinobactérias frente aos fungos negros obtidos das mesmas espécies de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Black fungi are known for the presence of melanin in their cell walls, which provides resistance to different types of environmental stresses. Recently, many associations between ants and black fungi in the order Chaetothyriales have been discovered. When it comes to fungus-growing ants (the "attines"), these associations remain underexplored. Fungi related to the genus Cyphellophora (ex-Phialophora), found on the integument of Apterostigma ants (lower attines), inhibit the symbiotic actinobacteria also present on the ant integument, and for that are considered detrimental for the ant colonies. However, black fungi species belonging to the same order were found in low abundance on the integument of gynes and drones of Atta (higher attines). In this context, little is known about the abundance, diversity and ecological relation of these fungi in other genera of derived attines. The aim of this study was to describe the presence and ecological relation of black fungi on the integument of these insects. By applying two different culture dependent methods, we evaluated the diversity of black fungi on the integument of Acromyrmex coronatus (leafcutter) and Trachymyrmex tucumanus (non-leafcutter). After isolation, fungi were purified and identified based on ITS region and partial tef1 gene sequences. Next, we put together in vitro co-culture assays between four actinobacteria and black fungi obtained from the same ant species. We found 111 black fungi in both species of ants, inclu... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues Pietro / Banca: Lourdes Campaner dos Santos / Banca: Nara Amélia de Rosa Farias / Banca: Maria Izabel Souza Camargo / Banca: Ary Fernandes Junior / Resumo: O carrapato Rhipicephalus sanguineus é a espécie de maior disseminação mundial e está comprovadamente envolvido na transmissão de agentes patogênicos. Estudos têm demonstrado aquisição de resistência a alguns dos princípios ativos usados em formulações comerciais de acaricidas. Neste trabalho, utilizando-se extrato etanólico 70% (PAEtOH70%) e óleo essencial (OE) de partes aéreas de Tagetes patula, avaliamos a ação carrapaticida in vitro contra os diversos estágios de desenvolvimento no ciclo de vida do ixodídeo R. sanguineus. Na concentração de 50,0 mg/mL, PAEtOH70% diminuiu a oviposição em 21,5%, eliminou 99,8% das larvas e destruiu 96,5% dos ovos. O OE a 4% inibiu a oviposição em 33,94%. Apesar da baixa taxa de mortalidade de fêmeas adultas ingurgitadas, análises microscópicas da estrutura dos ovários revelaram importantes alterações morfológicas na estrutura dos ovócitos II-V e células do pedicelo, interferindo diretamente na embriogênese normal, prejudicando ou inviabilizando a formação de larvas sadias. Para garantir o uso seguro em uma possível formulação, avaliamos a atividade citotóxica de PAEtOH70% e do OE frente a macrófagos murinos, obtendo-se IC50 de 210,9 µg/mL e IC50 de 0,04%, respectivamente. O extrato foi caracterizado fitoquimicamente por HPLC-EM, tendo sido identificados 12 favonóides O-glicosilados. O óleo foi caracterizado fitoquimicamente por CG-EM, revelando a presença de 55 compostos, sendo os principais o 4-vinil-guaiacol e o gama-terpineno. Quanto aos ensaios antimicrobianos, o extrato PAEtOH70% não inibiu o crescimento de B. bassiana e M. anisopliae (CIMs > 1250,0 µg/mL) e apresentou a melhor ação contra T. rubrum e T. rubrum (FOC) (312,5 e 468,75 µg/mL, respectivamente) / Abstract: The tick Rhipicephalus sanguineus is the species most worldwide spread and is proven to be involved in the transmission of pathogens. Studies have shown acquisition of resistance to some of the active ingredients used in commercial formulations of acaricides. In this study, using 70% ethanol extract (PAEtOH70%) and essential oil (EO) from aerial parts of Tagetes patula, we evaluated the in vitro acaricide action against various developmental stages in the life cycle of ixodid R. sanguineus. At the concentration of 50.0 mg/mL, PAEtOH70% decreased the oviposition by 21.5%, eliminated 99.8% of the larvae and destroyed 96.5% of the eggs. The OE 4% inhibited oviposition in 33.94%. Despite the low mortality rate of engorged adult females, microscopic analysis of the structure of the ovaries showed significant morphological changes in the structure of II-V oocytes and cells of pedicel, interfering directly in normal embryogenesis, impairing or invalidating the formation of healthy larvae. To ensure safe use in a possible formulation, we evaluated the cytotoxic activity of PAEtOH70% and OE against murine macrophages, yielding IC50 of 210.9 mg/mL and IC50 of 0.04%, respectively. The extract was phytochemically characterized by HPLC-MS and was identified 12 flavonoids O-glycosylated. The oil was phytochemically characterized by GC-MS, revealing the presence of 55 compounds, the main ones being the 4-vinyl guaiacol and gamma-terpinene. Regarding antimicrobial assays, the extract PAEtOH70% did not inhibit growth of B. bassiana and M. anisopliae (MICs > 1250.0 mg/mL) and showed the best activity against T. rubrum and T. rubrum (FOC) (312.5 and 468.75 mg/mL, respectively) / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:37Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2003-01Bitstream added on 2014-06-13T20:37:48Z : No. of bitstreams: 1 nozaki_dn_me_botfca.pdf: 633380 bytes, checksum: bdc6e8491f4a3d0e89a675dd36415ae2 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O mal-do-panamá causado por Fusarium oxysporum Schlecht. f. sp. cubense (E. F. Smith) Snyder & Hansen é um dos problemas fitossanitários mais sérios da bananicultura mundial. Devido a esta doença, um dos manejos culturais recomendados para o cultivo da bananeira, é a formação da cultura em locais onde o patógeno ainda não foi detectado. Visando fornecer subsídios para futuros programas de manejo da cultura, este trabalho teve como objetivo avaliar a variabilidade genética entre isolados monospóricos do gênero Fusarium sp., presentes em tecidos de plantas e em diferentes tipos de solo do norte de Minas Gerais. Foram utilizados 19 isolados de tecidos de bananeira, tomateiro, coqueiro e tamareira, e 63 isolados obtidos de solo. Também foram incluídos neste trabalho, 5 isolados de F. oxysporum de diferentes formae speciales (2 isolados de Fusarium oxysporum f. sp. cubense, 1 de Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum, 1 de Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli e 1 de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici) e 4 de F. solani de feijoeiro. Através de polimorfismo do DNA amplificado ao acaso (RAPD) e análise das seqüências de nucleotídeos dos espaços transcritos internos (ITS1/ITS2) do DNA ribossomal (5.8S rDNA), avaliou-se a variabilidade genética dos isolados. Foi utilizado o método RAPD com a combinação de sete “primers”, o que resultou 72 bandas polimórficas. Através desta análise foi possível obter 3 grupos geneticamente distintos, com ponto de ramificação superior a 50% de similaridade. No sequenciamento, os produtos de PCR foram realizados com os “primers” ITS4 e ITS5 para o rDNA, obtendo fragmentos de 550 a 600 pb em todos os isolados. A análise do consenso das seqüências da região ITS e do gene 5.8S do rDNA foram comparadas com seqüências do GenBank. Os dendrogramas gerado por agrupamento UPGMA com os de RAPD e... . / Panamá disease caused by Fusarium oxysporum Schlecht. f. sp. cubense (E.F. Smith) Snyder & Hansen is one of the most serious phytosanitary problems of banana culture worldwide. Due to this disease, culture formation in locals where the pathogen has not been detected yet is one of the culture management recommended for banana plant culture. Aiming at providing subsidies for future culture management programs, this work evaluated the genetic variability among monosporous isolate of Fusarium sp. present in plant tissues and in different types of soil in north of Minas Gerais state. Nineteen tissue isolates of banana plant, coconut tree and date palm, and 63 isolates of soil were used. It was also included in this work 5 isolates of F. oxysporum of different formae speciales (2 isolates of F. oxysporum f. sp. cubense, 1 of F. oxysporum f. sp. vasinfectum, 1 of F. oxysporum f. sp. phaseoli and 1 of F. oxysporum f. sp. lycopersici) and 4 of F. solani of bean plant. Through polymorphism of DNA amplified at random (RAPD) and nucleotides sequence analysis of ribossomal DNA (5.8SrDNA) internal transcripted spaces (ITS1/ITS2), isolates genetic variability was assessed. It was used the RAPD method with combination of seven primers, what resulted in 72 polymorphic ribbons. Through such analysis, it was possible to obtain 3 genetically different groups, with ramification point over 50% of similarity. In the sequence, PCR products were carried out with the primers ITS4 and ITS 5 for rDNA, obtaining fragments of 550 to 600 pb in all isolates. Sequences analysis of ITS region and gene rDNA 5.8S was compared to GenBank sequences. The dendrographs generated by UPGMA grouping with the RAPD ones and those of nucleotides sequences were much similar. There was no correlation of the groups formed in the dendrographs concerning geographic location and host plant... (Complete abstract, click electronic address below).

Orientador: Luis Henrique Souza Guimarães / Banca: João Atilio Jorge / Banca: Rosane Marina Peralta / Resumo: A tanase (EC 3.1.1.20) é uma enzima induzível que age sobre os taninos hidrolisando suas ligações éster e depsídicas obtendo-se como produtos a glicose e o ácido elágico ou ácido gálico, sendo este último, um importante substrato para as indústrias farmacêutica e química. Entre os diferentes organismos capazes de produzir tanases, os microorganismos, de modo especial os fungos filamentosos, vêm se destacando uma vez que são mais versáteis na degradação de diferentes tipos de taninos. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi estudar as tanases intra e extracelulares do fungo filamentoso Emericella nivea produzidas em Fermentação Submersa (FSbm) e em Fermentação em Substrato Sólido (FSS), purificando-as e caracterizando-as bioquimicamente, além de imobilizá-las em suportes de agarose. Em princípio, foi realizada a seleção da melhor cepa produtora de tanases, submetendo-se 42 linhagens fúngicas a FSbm em meio de cultura Khanna com 2% de ácido tânico como fonte de carbono, por 3 a 4 dias a 30ºC, tendo sido o fungo Emericella nivea selecionado para prosseguimento do trabalho. Para este microorganismo os maiores nívies enzimáticos extracelulares foram obtidos em 3 dias de cultivo em FSbm e 8 dias em FSS, sendo para esta última utilizados produtos agroindustriais e folhas de vegetais de diferentes espécies secas trituradas umedecidas com água de torneira (1:1; p/v). As tanases extra e intracelular foram purificadas 61 e 2,5 vezes com recuperação de 30% e 8,8%, respectivamente. Eletroforese em condições não desnaturantes (PAGE 7%) mostrou a presença de uma única banda protéica revelada por prata e para atividade tanásica com a mesma mobilidade relativa. A forma extracelular possui massa molecular nativa de aproximadamente 322kDa com 50% de conteúdo de carboidratos. Já a enzima intracelular apresentou massa molecular nativa de 258kDa e 17% de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Tannases (EC 3.1.1.20) are inducible enzymes that catalyze the hydrolysis of ester and depside bonds in hydrolysable tannins releasing glucose and ellagic acid or gallic acid, which is an important compound used in pharmaceutical and chemical industries. Among different organisms able to produce these enzymes, the microorganisms, especially filamentous fungi deserve attention since they can act on different tannins degradation ways. In this context, the aim of this work was to study the intra and extracellular tannases from the filamentous fungus Emericella nivea produced in Submerged Fermentation (SbmF) and Solid Substrate Fermentation (SSF), purifying and characterizing them biochemically, as well to immobilize the extracellular enzyme in agarose supports. First of all, it was selected the best tannase producer among 42 strains, in Khanna culture medium with 2% tannic acid as carbon source for 3-4 days at 30°C, and the fungus Emericella nivea was selected. This fungus produced high levels of extracellular enzyme at 3 and 8 days when cultivated in SbmF and SSF at 30°C, respectivally. FSS was performed with agroindustrial products or crushed dried leaves of different plants umidified with tap water (1:1, w/v). The extra and intracellular tannases were purified 61 times and 2.5-times, with recovery of 30% and 8.8%, respectivally. Non-denaturing electrophoresis (PAGE 7%), showed a unique proteic band stained by silver and for activity, both with the same relative mobility. The extracellular enzyme, probably, is a hetero-dimeric protein with native molecular mass of 322 kDa with 50% of carbohydrate content and the intracellular with native molecular mass of 258 kDa and 17% of carbohydrate. The optimum temperature were 45ºC and 50°C for the extra and intracellular enzymes, respectively and the optimum pH for both enzymes was 5.0. The soluble tannases were thermostable with... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Resumo: Extratos etanólicos do ritidoma, da casca do caule e do fruto e da semente de Swartzia argentea, S. laevicarpa, S. panacoco, S. polyphylla e de S. sericea foram testados para os fungos degradadores de madeira. O volume de 10 mL de cada extrato nas concentrações de 0, 1; 0,01 e 0,001 mg/ L foi adicionado a 90 mL de meio de cultura agar-malte e inoculado com Pycnoporus sanguineus (L.:Fr.) Murr., Trametes villosa (Fr.) Ryv. e Lenzites trabea Pers.:Fr. A área (cm2) da colônia do fungo e o índice antifúngico (IAF) dos extratos foram calculados. A diferença significativa entre as médias do crescimento dos fungos (cm2) foi observada nos extratos do ritidoma, da casca do fruto e da semente, independente da espécie de Swartzia, mas para os extratos da casca do caule não houve diferença significativa para S. laevicarpa e para S. sericea. Houve variação significativa entre as médias da área micelial (cm2) dos fungos para cada concentração do extrato. Os extratos dos ritidomas de S. argentea, S. polyphylla e de S. sericea e da casca do caule de S. panacoco apresentaram o índice antifúngico de 100% para as três espécies de fungos. Estes extratos foram submetidos à partição líquido-líquido com solventes de polaridade crescente, obtendo-se as frações: hexânica, diclorometano, acetato de etila e aquosa, visando a atividade antifúngica das frações em ensaio de bioautografia. As frações: diclorometano, acetato de etila e aquosa, foram aplicadas em concentrações diferentes para cada espécie de Swartzia em cromatofolha de gel de sílica GF254, sendo que a fração aquosa foi eluída com a fase móvel butanol:etanol:agua (4,0;1,1;1,9), a fração acetato de etila com o sistema de solvente diclorometano:acetato de etila:metanol (5:3:2), acrescido de 0,01 mL de ácido acético, e a fração diclorometano com os sistema de solventes diclorometano:acetato de etila (7:3)...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Ethanolic extracts from the ritidome, the barks of the stem and of the fruit, and the seed of Swartzia argentea, S. laevicarpa, S. panacoco, S. polyphylla and S. sericea were tested for decay fungi. Pycnoporus sanguineus (L.:Fr.) Murr., Trametes villosa (Fr.) Ryv. and Lenzites trabea Pers.:Fr. were inoculated in 90 mL of Malt Agar plus 10 mL of each extract, in the concentrations of 0,1, 0.01 and 0,001 mg/mL. Colony area (cm2) and antifungal index of the extracts were calculated. Significant difference among the fungal growth average (cm2) was observed in the extracts of the ritidome, the barks of the fruit and of the seed, despite the species studied. However, there was no difference in the extracts of the barks of the stem in S. laevicarpa and S. sericea. There was significant variation among the averages of the fungal mycelial area (cm2) in each extract concentration. The extract of the ritidome of S. argentea, S. polyphylla, and S. sericea, besides one from the barks of the stem of S. panacoco, resulted in 100% antifungal index for all fungal species. These extracts were submitted to liquid-liquid partition with solvents of increasing polarity resulting the following fractions: hexanic, dichloromethane, ethyl acetate and water, aiming the fraction antifungal activity in thin layer cromatography TLC. Dichloromethane, ethyl acetate and the watery fraction were applied in different concentrations on each Swartzia species studied, in TLC GF254. The watery fraction was eluted with butanol:ethanol:water (4,0; 1,1; 1,9), the fraction ethyl acetate with the solvent system dichloromethane:ethyl acetate: methanol (5:3:2) plus 0,01mL acetic acid, and the dichloromethane fraction with the solvent system dichloromethane: ethyl acetate (7:3). The chromatograms were inoculated with P. sanguineus, T. villosa and L. trabea in Malt Agar, and chromatographic strips with no fractions...(Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Vera Lucia Ramos Bononi / Coorientador: Ana Cláudia Fernandes Amaral / Banca: Mauricio Bacci Junior / Banca: Dejanira de Franceschi de Angelis / Banca: Luiz Carlos Couto / Banca: Mario Tomazello / Doutor

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2016. Texto liberado parcialmente pelo autor. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-05-04T12:54:21Z No. of bitstreams: 1 2016_RaquelDall’AgnolMartarello_Parcial.pdf: 1017333 bytes, checksum: 90ff4a8255483fd191ac9be3648c66f7 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2016-05-04T12:59:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_RaquelDall’AgnolMartarello_Parcial.pdf: 1017333 bytes, checksum: 90ff4a8255483fd191ac9be3648c66f7 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-04T12:59:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_RaquelDall’AgnolMartarello_Parcial.pdf: 1017333 bytes, checksum: 90ff4a8255483fd191ac9be3648c66f7 (MD5) / A intolerância à lactose é caracterizada pela desordem na absorção do carboidrato lactose, que acomete milhares de pessoas em todo o mundo e está associada à deficiência na produção ou ausência da enzima β-galactosidase intestinal. Dentro deste contexto, a hidrólise enzimática deste dissacarídeo por β-galactosidase desempenha papel importante no processamento de produtos lácteos com baixo teor de lactose para o consumo por indivíduos intolerantes. A literatura descreve que, os microrganismos, como fungos filamentosos, são capazes de produzir enzimas de interesse industrial, como por exemplo β-galctosidases. Desta forma, o objetivo deste trabalho, foi avaliar a produção em meio líquido de β-galactosidase extracelular por fungos filamentosos isolados do solo do cerrado brasileiro, utilizando resíduos de soja como fonte de carbono. Inicialmente foi realizada uma triagem com 25 linhagens de fungos filamentosos quanto ao potencial de produção de β-galactosidase. Após a seleção do Aspergillus foetidus, como o melhor fungo produtor, a produção enzimática foi otimizada variando o meio de cultivo e em seguida, realizou-se um planejamento experimental com análise de superfície resposta com as variáveis independentes pH, temperatura e agitação para avaliar a influência destes parâmetros físico-químicos na produção da enzima. A melhor atividade de β-galactosidase (26,4 U/mL) foi encontrada no sistema contendo casca de soja 2% (p/v) em pH inicial 7,0 a 28°C com 120 rpm. A curva de indução indicou o 7° dia de cultivo como o período de melhor atividade. A β-galactosidase foi parcialmente purificada utilizando cromatografia de gel filtração e troca iônica. A fração mais pura da enzima foi então, caracterizada visando sua aplicação industrial alimentícia e farmacêutica sendo sua atividade máxima a 50°C e pH 3,0. A enzima hidrolisou 63% da lactose presente no leite (Molico®), e quando testada sua estabilidade em condições de simulação gástrica manteve-se ativa por 2 horas a 37°C. Estes resultados apontam para a parcial purificação de uma β-galactosidase ácida e estável de Aspergillus foetidus com potencial aplicação industrial a partir de resíduo de baixo custo. / Lactose intolerance is characterized by a disorder in absorption of the carbohydrate lactose, which affects thousands of people worldwide and is associated with a deficiency or absence of intestinal β-galactosidase enzyme. In this context, the enzymatic hydrolysis of this disaccharide by β-galactosidase plays an important role in the processing of dairy products with low lactose content for consumption by intolerant individuals. The literature describes that microorganisms such as filamentous fungi can produce enzymes of industrial interest, such as β-galactosidases. Thus the objective of this study was to evaluate the production of extracellular β-galactosidase by filamentous fungi isolated from the soil of the Brazilian savanna in liquid medium using soybean residue as a carbon source. Initially a screening of 25 filamentous fungi strains grown in soybean residue medium was performed assessing β-galactosidase production potential. After selecting Aspergillus foetidus as the best producer, enzyme production was optimized by varying the culture medium followed by an experimental design with response surface analysis with the independent variables pH, temperature and stirring to assess the influence of these physico-chemical parameters in enzyme production. The best β-galactosidase activity (26.4 U/mL) was found in the system containing soybean residues 2% (w/v) at initial pH 7.0 at 28°C with 120 rpm. The induction curve indicated the 7th culture day as the period of highest activity. β-galactosidase was half purified using gel filtration and ion exchange chromatography. The purified enzyme was then characterized aiming its food and pharmaceutical industrial uses with maximal activity at 50°C and pH 3.0. The enzyme hydrolyzed 63% of the lactose present in milk (Molico®), and when tested its stability in gastric simulated conditions it remained active for 2 hours at 37°C. These results demonstrate the half purification of an acidic and stable β-galactosidase from Aspergillus foetidus with potential industrial application from low-cost residue.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-05-05T17:48:01Z No. of bitstreams: 1 2016_JoãoHeitorColombelliManfrãoNetto.pdf: 1500333 bytes, checksum: 58867afadd739ebf359eaf75cd3a70fc (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-05-20T19:51:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_JoãoHeitorColombelliManfrãoNetto.pdf: 1500333 bytes, checksum: 58867afadd739ebf359eaf75cd3a70fc (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-20T19:51:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_JoãoHeitorColombelliManfrãoNetto.pdf: 1500333 bytes, checksum: 58867afadd739ebf359eaf75cd3a70fc (MD5) / Humicolagriseavar.thermoidea é um ascomiceto termofílicoprodutor de enzimas lignocelulolíticas, principalmente celulases e xilanases, sendo proposto para utilização na bioconversão de resíduos agrícolas em produtos úteis. A metilação de DNA é um mecanismo epigenético de regulação gênica que tem sido amplamente estudado, sendo geralmente associado à repressão transcricional. Enzimas DNA metiltransferases (DNMsT) são responsáveis por realizar a metilação do DNA. Drogas que inibem as DNMTs são frequentemente utilizadas em estudos de patologias como o câncer, entre outros, porém nada se sabe a respeito de um possível efeito na produção, atividade ou secreção de enzimas hidrolíticas de fungos, assim como na regulação da expressão dos respectivos genes. No presente trabalho, avaliou-se o efeito da droga 5-aza-2’-desoxicitidina (5-AZA; inibidora da ação de DNMTs), em duas concentrações (25 e 50 µM), sobre a atividade enzimática secretada e os níveis de transcritos de genes de celulase e xilanase de H. grisea crescido em diferentes resíduos agrícolas [bagaço de cana de açúcar explodido a vapor (BCA), feno moído e farelo de trigo (FT)], e em glicose. A presença de 5-AZA mostrou-se relacionada a um aumento de atividade de CMCase após crescimento do fungo H. grisea em FT 12 h/50 μM (67,15%) e em glicose 2 h/50 μM (47,62%). Uma diminuição dessa atividade foi verificada quando do crescimento do fungo em BCA 96 h em 5-AZA 25 (29,12%) e 50 µM (29,95%).A atividade de xilanase secretada por H. grisea, na presença de 5-AZA, diminuiu em cultivo em BCA/96 h 25 (32,39%) e 50 µM (30,59%) e FT 2 h/50 μM (59,72%). Porém, em crescimento em FT por 12 e 96 h, na concentração de 25 μM, a 5-AZA levou a um aumento na atividade xilanolítica (19,97% e 25,35%, respectivamente).A produção de proteínas totais secretadas para o sobrenadante não foi afetada pelo crescimento de H. grisea em presença de 5-AZA, independentemente do substrato empregado como fonte de carbono.A 5-AZA afetou diferencialmente a expressão dos genes de celulase egl1, cbh.1.1, cbh1.2 e de xilanasexyn1 e xyn2 de H. grisea, provocando diminuição ou aumento do acúmulo de transcritos, dependendo da concentração utilizada e do resíduo agrícola empregado para o crescimento. Já em crescimento em glicose, a 5-AZA mostrou-se capaz de superar a repressão catabólica e aumentar os níveis dos transcritos de egl1, cbh1.1, cbh1.2 e xyn2. O acúmulo de transcritos dos genes de celulase egl4 e bgl4 não foi alterado em nenhuma condição experimental. Os dados desse trabalho indicam, pela primeira vez na literatura científica, que a modulação epigenética, no nível de metilação do DNA, exerce papel na regulação da expressão dos genes de celulase e xilanase de fungos e que pode ser empregada visando à otimização de processos biotecnológicos de conversão de resíduos agrícolas em produtos de maior valor agregado. _______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Humicolagrisea var. thermoidea is a thermophilicascomycete that produces lignocellulolytic enzymes, particularly cellulases and xylanases and, in this view, it is proposed as a bioagent for the conversion of agricultural residues into useful byproducts. DNA methylation is an epigenetic mechanism of gene regulation that has been widely studied, being generally associated with transcriptional repression. DNA methyltransferases (DNMTs) are the enzymes responsible for performing DNA methylation. Drugs that inhibit DNMTs activity are frequently employed in studies of diseases such as cancer, amongst others, but nothing is known about a possible effect on the production, secretion, or activity of fungal hydrolytic enzymes, as well as on the regulation of expression the respective genes. In this study we evaluated the effect of the drug 5-aza-2'-deoxycytidine (5-AZA; an inhibitor of DNMTs activity) at two concentrations (25 and 50 µM) on secreted enzyme activity and on the levels of xylanase and cellulase gene transcripts from H. grisea grown in different agricultural residues [steam exploded sugarcane bagasse (BCA), ground hay and wheat bran (FT)], as well as in glucose, as the sole carbon source.The presence of 5-AZA led to an increase in CMCase activity after H. grisea was grown in FT 12 h/50 µM (67,18%) and glucose 2 h/50 µM (47,62%). A decrease in this activity was observed when the fungus was grown in BCA in the presence of 25 (29,12%) or 50 µM (29,95%) 5-AZA for 96 h.The xylanase activity secreted by H. grisea grown in the presence of 5-AZA decreased upon cultivation on BCA for 96 h 25 (32,39%) and 50 µM (30,59%) and on FT 2 h/50 µM (59,72%). However, upon growth on FT for 12 and 96 h, at a concentration of 25 µM, 5-AZA led to an increased xylanolytic activity (19,97% and 25,35%, respectively).The production of total secreted proteins into the supernatant was not affected by H. grisea growth in the presence of 5-AZA, regardless of the substrate used as the carbon source.5-AZA differentially affected the expression of H. grisea egl1, cbh1.1 and cbh1.2 cellulase genes, and of the xyn1 and xyn2 xylanase genes, causing decreased or increased accumulation of transcripts, depending on the concentration used and on the agricultural residue employed to support fungal growth. Notably, when H. grisea was grown on glucose as the sole carbon source, 5-AZA overcame catabolite repression and increased the levels of the egl1, cbh1.1, cbh1.2 and xyn2 transcripts. The accumulation of transcripts of the egl4 and bgl4 cellulase genes was not altered under any experimental condition. Our data indicate that epigenetic modulation, at the level of DNA methylation, plays a role in regulating the expression of fungal cellulase and xylanase genes. This information is pioneering in the scientific literature and can be used with the aim of optimizing biotechnological processes for the conversion of agricultural wastes into valuable products.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2008. / Submitted by Kathryn Cardim Araujo (kathryn.cardim@gmail.com) on 2009-09-25T14:12:57Z No. of bitstreams: 1 2008_CeciliaLiviaFalcomerFraga.pdf: 1242140 bytes, checksum: bf9492049c683e72ee9d8b3235ce68f1 (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-10-19T12:30:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_CeciliaLiviaFalcomerFraga.pdf: 1242140 bytes, checksum: bf9492049c683e72ee9d8b3235ce68f1 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-10-19T12:30:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_CeciliaLiviaFalcomerFraga.pdf: 1242140 bytes, checksum: bf9492049c683e72ee9d8b3235ce68f1 (MD5) Previous issue date: 2008 / O fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da micose sistêmica paracoccidioidomicose, cuja região endêmica restringe-se a América Latina, sendo o Brasil, a Colômbia e a Venezuela os países com alta freqüência na incidência de casos. O desenvolvimento da doença depende diretamente da interação entre o P. brasiliensis e o hospedeiro, aspectos como a virulência do fungo e o tipo de resposta imune que ele induz no hospedeiro são importantes para compreender as diferenças nas formas clínicas desta doença. Um aspecto importante a ser considerado nesta interação são as diferenças genéticas, observadas entre os grupos filogenéticos, do gênero Paracoccidioides. Assim, neste trabalho avaliamos as diferenças morfológicas entre dois isolados P. brasiliensis (Pb01 e Pb18), como também, observamos a interação destes isolados com macrófagos in vitro. Além de realizar a caracterização da resposta imune induzida por diferentes vias de infecção em camundongos. As células do isolado Pb01 apresentaram um menor diâmetro em relação à do Pb18 e com o formato circular predominante tanto para células mães como para os brotamentos, enquanto Pb18 variou sua morfologia entre a forma elíptica e circular. As leveduras Pb01 são fagocitadas mais rápido e numa porcentagem maior que as do Pb18, as quais sobrevivem por um tempo maior dentro dos macrófagos e induzem uma menor produção óxido nítrico. Na infecção sistêmica, os animais inoculados com Pb01 apresentaram uma resposta linfoproliferativa mais eficiente até 30 dias após infecção. Após este período a resposta tornou-se similar com a do Pb18, no qual ocasiona supressão da resposta linfoproliferativa. Neste tipo de infecção observou-se uma resposta imunológica predominantemente Th1. Mas, na infecção pela via intratraqueal houve uma resposta imunológica mista (Th1 e Th2) nos animais infectados, porém nas duas formas de infecção, houve uma baixa carga fúngica recuperada do tecido pulmonar e não apresentou a formação da resposta inflamatória granulomatosa. Os animais infectados com o isolado Pb18, nas duas formas de infecção, houve predomínio da resposta Th2, como também, uma quantidade crescente na carga fúngica recuperada do pulmão e uma resposta inflamatória granulomatosa neste órgão. Portanto, o isolado Pb01 possui uma menor patogenicidade em relação ao Pb18, como também, induz uma resposta imunológica mais efetiva nos animais experimentais. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The dimorphic fungus Paracoccididoides brasiliensis is the etiologic agent of systemic mycosis paracoccidioidomycosis, it is restrict to Latin American. It is frequently diagnosed in Brazil, Colombia and Venezuela. The evolution of this disease depends directly on the interaction between P.brasiliensis and host. Aspects of fungus’s virulence and the immune type response of host that is caused by fungi are important to understand differences on the clinical form’s disease. An important aspect to be considerated on this interaction are genetic differences, observed between phylonegetics groups from Paracoccidioides genus. In this work we analyzed morphological differences of two isolate of P. brasiliensis (Pb01 and Pb18) and studied the interaction of these isolate and macrophages in vitro. Immune response induced by distinct ways of infection in murine was caracterizated. The isolate Pb01 cells showed mainly a circular shape and a littlest diameter either to mother’s cells and budding compared to Pb18 that presented an elliptical and circular shape. Yeasts Pb01 are phagocyted fastly and in a major quantity than Pb18. Yeasts Pb18 survived for more time inside macrophages and induced a little oxide nitric’s production. In systemic infection, inoculated animals with Pb01 presented more efficient linfoproliferative response until 30 days after infection. After this period, the response became similar to Pb18, which causes suppression of linfoproliferative response. In this kind of infection we observed an immunological response predominantly Th1. But, in infection by intratracheally way occurred a mixed immunological response (Th1 e Th2) in infected animals, however in two types of infection, a low fungic’s load was recovered from lung’s tissue and did not present formation of inflammatory granulomatosa response. Infected animals with isolate Pb18, in both ways of infection, occurred mainly response Th2 and a crescent increase on quantity of fungal burden recovered from lungs and an inflammatory granulomatosa in this organ. Then, the isolate Pb01 has a minor pathogenicity in relation to Pb18 and induces an immunological response more efficient in model animals.

A rinossinusite crônica é uma doença complexa, com etiologia multifatorial. O seu manejo é controverso, principalmente no paciente pediátrico. O tratamento preconizado é a antibioticoterapia empírica, embora o papel da infecção bacteriana não esteja completamente definido na patogênese da rinossinusite crônica. A técnica de coleta de secreção considerada padrão áureo é a punção do seio maxilar via fossa canina. Entretanto, provoca dor, necessita da colaboração do paciente, pode causar dano ao nervo infraorbitário e em crianças, pode lesionar brotos dentários. Além disso, principalmente em pacientes pediátricos, requer sedação ou anestesia geral e identifica apenas germes restritos ao seio maxilar. A visualização do meato médio, considerado área-chave da doença rinossinusal, através de endoscópios, permite a coleta de amostras com desconforto mínimo e a execução de culturas e testes de sensibilidade. Este estudo visou determinar a microbiologia do meato médio por meio de coleta sob visão endoscópica em crianças com rinossinusite crônica bem como testar a sensibilidade dos germes identificados. Foram incluídos na pesquisa 39 pacientes pediátricos com sinais e sintomas de rinossinusite por mais de 3 meses, cujas endoscopias nasais evidenciaram secreção no meato médio e com tomografia computadorizada demonstrando comprometimento dos seios paranasais. Um grupo de 94 adultos com rinossinusite crônica (RSC) foi estudado paralelamente. Os germes mais freqüentemente encontrados no grupo das crianças foram o Streptococcus pneumoniae (33%), a Moraxella catharralis (23%) e oHaemophilus influenzae (21%). O Streptococcus pneumoniae foi resistente a sulfametoxazol-trimetropim em 23% e à penicilina em 17% das amostras. Cepas produtoras de beta-lactamase foram encontradas em 67% e 12,5% das amostras de Moraxella catharralis e Haemophilus influenzae, respectivamente. Nos adultos, o Staphylococcus aureus e o Staphylococcus coagulasenegativo foram os germes mais freqüentes, e apresentaram 83 % e 89 % de resistência à penicilina, respectivamente. Bactérias Gram-negativas e Streptococcus pneumoniae foram estatisticamente mais freqüentes no grupo das crianças. Haemophilus influenzae e Staphylococcus coagulase negativo foram os germes que apresentaram diferença estatisticamente significativa em relação à resistência antimicrobiana entre crianças e adultos, sendo mais resistentes nestes últimos. / Chronic rhinosinusitis is a complex disease and its etiology multifactorial. Its management is controversal, especially in the pediatric population. Although bacterial infection is not totally defined in its pathogenesis the recomended treatment is still empiric antibiotics. The gold standard technique to obtain secretion for culture is piercing the maxillary sinus through the canine fossa. It needs patient´s colaboration, may damage the infraorbitary nerve and, in children, may hurt the teeth buds. In children it may also require sedation or general anesthesia, and it can only help identify microorganisms restricted to the maxillary sinuses. Visualization through the middle meatus, considered the key area for the rhinosinusal disease, through endoscopy, permits the collection of samples for culture, with minimum discomfort. This study tried to determine the microbiology of the middle meatus through collection of samples for culture and sensitivity testing under direct endoscopic vision in children with chronic rhinusinusitis. Thirty nine children and ninety four adults with signs and symptoms attributable to rhinosinusitis for longer than three months were included in this study. All patients had nasal endoscopy with evidence of secretion in the middle meatus and computed tomography showing envolvment of the paranasal sinuses. The microorganisms most frequently encountered among children were: Streptococcus pneumoniae 33%, Moraxella catharralis 23%, Haemophilus influenzae 21%. Streptococcus pneumoniae was resistant tosulfametoxazol-trimetropim in 23%, and to penicillin in 17% of the samples. Beta-lactamase producing organisms were found in 67% of Moraxella catharralis and 12,5% of the Haemophilus influenzae samples. In adults, Staphylococcus aureus and Staphylococcus coagulase negative were the most frequently found bacteria and were resistant to penicillin in 83% and 89% respectively. Gram-negative bacteria and Streptococcus pneumoniae were statistically most frequent in the children group. Haemophilus influenzae and Staphylococcus coagulase negative showed a statistically significant diference regarding resistance to antimicrobials, between children and adults, being more resistant in the latter.