A produção brasileira de laranjas destina-se à indústria de suco concentrado, principal produto citrícola, sendo o estado de São Paulo o maior produtor e exportador do país. Devido à diminuição da variabilidade genética causada pela multiplicação de plantas cítricas por enxertia, esta cultura se tornou alvo constante de inúmeras pragas e doenças. Dentre estas doenças que vem causando crescentes prejuízos para a citricultura brasileira destaca-se a pinta preta causada pelo fungo Guignardia citricarpa Kiely. O combate desta doença é feito por inúmeras pulverizações de fungicidas que aumenta significativamente o custo para os produtores. Uma possível alternativa para o combate a este patógeno seria a produção de plantas cítricas resistentes a doença, através de transformação gênica. Mas para isto, é necessário conhecer os mecanismos de respostas de defesa da planta e identificar quais genes podem estar relacionados com a defesa. Na tentativa de elucidar as respostas de defesa deste hospedeiro foram feitas análises anatômicas de frutos de laranja doce (Citrus sinensis Osbeck cv. Pêra) inoculados com o patógeno e análise transcricional de duas bibliotecas de cDNA, uma de albedo de frutos sadios(BAFS) e outra de albedo de frutos inoculados com o patógeno (BAFC). As análises anatômicas mostraram que os danos causados pelo patógeno na planta iniciam-se 24 horas após a inoculação com as lesões das células do epicarpo, e continuam gradativamente até 72 horas apresentando a diminuição na quantidade de amido e acúmulo de compostos fenólicos. Foi obtido 184 ESTs válidas da BAFS e 370 da BAF. A anotação e categorização destas sequencias apresentaram que o perfil transcricional encontrado nas duas bibliotecas foi semelhante, porém, na BAFC, foram encontrados transcritos pertencentes à defesa da planta como a catalase, a glutationa e monooxygenases. Está analise mostrou que a resposta de defesa da planta inicia-se com lesões nas células, que a interação é custo-intensiva (redução da reserva de amido) para o hospedeiro, e que a defesa da planta está relacionada a muitos genes de defesa. / The Brazilian production of oranges is mainly for the industry of concentrated juice, it is the most important citrus product, and the state of São Paulo is the largest producer and exporter of the country. Due to the low genetic variability caused by the multiplication of citrus plants by grafting, this culture became constant target of many pests and diseases. Among all the diseases that lead to elevated damage to the Brazilian citrus plantation, one is very relevant, the Black Spot disease caused by the fungus Guignardia citricarpa Kiely. The control of this disease is done by many sprays of fungicides that significantly increase the production cost to the producers. A possible alternative to control this pathogen is the development of resistant citrus plants to disease through genetic transformation. To that, it is necessary to understand the mechanisms of plant defense response and identify the genes related to the defense. In an attempt to elucidate the responses of this host both,anatomical analysis of sweet orange fruits (Citrus sinensis Osbeck cv. Pêra) inoculated with the pathogen and transcriptional analysis of two cDNA libraries of albedo section were done. One was from health fruits (BAFS) and another from albedo of fruits inoculated with the pathogen (BAFC). The analysis showed that the anatomical damage caused by the pathogen in the plant shall begin 24 hours after inoculation showing lesions on epicarp cells, and continue gradually until 72 hours also showing a decrease in the amount of starch and accumulation of phenolic compounds. It was obtained 184 valid ESTs of the BAFS and 370 from BAFC. The annotation and categorization of these sequences showed that the transcriptional profile in the two libraries were similar, however, in BAFC, were found transcripts belonging to plant defense such as catalase, the glutathione and monooxygenases. These analyses showed that the plant defense response begins with lesions in the cells, being it cost-intensive interaction for the host, (with reduction of starch reserves) and the plant defense to resistance is related to many genes.

Colletotrichum species are considered one of the most economically important plant pathogens. They cause many losses in tropical, subtropical and temperate regions affecting a wide range of plant species. In tropical and subtropical regions C. gloeosporioides and C. acutatum are associated with significant losses on pre and post-harvest anthracnoses. There are still many features to understand about Colletotrichum biology and its systematics. The accurate identification of species involved with each anthracnose is of high relevance to establish management strategies to control the disease. Although the great advances on Colletotrichum systematics, species complex such as C. gloeosporioides and C. acutatum are used in a broad sense in Brazil. These complexes were recently investigated and showed to be highly genetic and geographic variable. In this study multigene analysis were carried out based on ITS, GAPDH, CHS-1, TUB2 and CAL or HIS3 partial sequences for strains of C. gloesporioides and C. acutatum complexes collected from fruit crops in Brazil. Strains from different countries and exepitypes and others sequences available on GenBank from the species accepted on both complexes were added on dataset. Six strains from C. gloeosporiodes complex and five for C. acutatum were selected based on multigene phylogeny to investigate the pathogenicity through inoculations on detached fruit. The multigene phylogenies showed the occurrence of species in Brazil related to those complexes with a high genetic variability among them. The phylogeny of Brazilian strains belonging to the C. gloeosporioides complex showed that C. siamense represents the most genetically and host-specific variable clade. In contrast, C. asianum clade grouped only strains isolated from mango. The strains from this clade used on pathogenic test were not able to infect avocado and one of the strains caused symptoms only on mango. All strains from Brazil grouped in one subclade within the C. fructicola clade and seem to represent a genetically distinct group. C. theobromicola is first reported causing anthracnose on acerola fruit. Three new species (C. polyphialidicum, C. paranaense and C. pruni) belonging to the C. acutatum complex were recognized and their morphologic descriptions were provided. The pathogenic test for the strains in the C. acutatum complex showed their cross infection ability, but in some cases the larger lesions were produced on the original host. Most brazilian strains from C. acutatum complex grouped in one subclade within the C. nymphaeae clade and seem to be genetically distinct. / Fungos do gênero Colletotrichum são considerados um dos mais importantes economicamente na Fitopatologia. Espécies desse gênero são encontradas amplamente disseminadas e estão associadas a diversas espécies de plantas hospedeiras. Em regiões tropicais e subtropicais, espécies dos complexos C. gloeosporioides e C. acutatum são a principal causa das antracnoses em pré e póscolheita de frutos e consequentemente causam significantivas perdas. Ainda há muitos aspectos a serem compreendidos sobre o gênero Colletotrichum, como a biologia e a sistemática. A acurada identificação das espécies associadas a antracnoses é de suma importância para o estabelecimento de estratégias de controle. No entanto, apesar dos grandes avanços na sistemática desse gênero, complexos de espécies como aquelas citadas acima são tratados de modo genérico no Brasil. Estes complexos de espécies foram recentemente estudados e considerados geneticamente e geograficamente variáveis. Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivo caracterizar isolados de Colletotrichum spp. associados a diferentes frutos e regiões do Brasil por meio de análise filogenética. Para análise multilocus, foram utilizadas sequências parciais dos genes ITS, GAPDH, CHS-1, TUB2 and CAL ou HIS3. Sequências de espécies-tipos disponíveis no GenBank e de isolados de diferentes países foram adicionadas ao conjunto de dados. Com base nos resultados obtidos por meio de filogenia multilocus, seis isolados do complexo C. gloeosporiodes e cinco do complexo C. acutatum foram escolhidos para testes de patogenicidade cruzada. A espécie C. siamense, pertencente ao complexo C. gloeosporioides, foi a mais variável geneticamente e quanto ao hospedeiro de origem. Diferentemente, apenas isolados obtidos de manga se agruparam no clado C. asianum. Isolados agrupados neste clado não infectaram abacate e um dos isolados (CPC 20969) causou sintomas apenas em manga. No clado C. fructicola, isolados coletados no Brasil se agruparam em um subclado e parecem representar um grupo geneticamente distinto. A espécie C. theobromicola é relatada pela primeira vez em acerola. Foram identificadas três novas espécies, C. polyphialidicum, C. paranaense e C. pruni, pertencentes ao complexo C. acutatum. Isolados brasileiros agrupados no clado C. nymphaeae parecem representar um grupo geneticamente distinto, todos se agruparam em um subclado. Isolados do complexo C. acutatum utilizados no teste de patogenicidade provocaram sintomas nos hospedeiros testados, porém, em algumas inoculações, as lesões foram maiores no hospedeiro de origem.

Made available in DSpace on 2016-08-12T19:15:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ShamyraGAS_Dissert.pdf: 1345668 bytes, checksum: 408f47b3e8a408dc7702858d04d13fc8 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Silk Flower [Calotropis procera (Aiton) W.T. Aiton] is a plant that has been highlighted by the case of a species that has several features such as animal feed, traditional medicine, agriculture, environment, cosmetics and textile industry, and may also act to combat pests, fungi and viruses through mechanisms defense associated with your latex. This study aimed to evaluate latex fluid from Silk Flower in inhibiting the development of pathogenic fungi of Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Colletotrichum musae and Monosporascus cannonballus and study the genetic diversity from Silk Flower genotypes using the RAPD and ISSR molecular markers. Twenty samples of species of leaves were collected in the Grossos/RN and Mossoró/RN cities (ten plants from each city). The plants latex were tested on four different types of phytopathogenic fungi, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Colletotrichum musae and Monosporascus cannonballus with two different methods (adding latex to the culture medium before and after polymerization middle), and with two different concentration level (neat and diluted 1:1). For molecular analysis, DNA of each plant was extracted with 11 RAPD primers and 10 ISSR primers. For latex analyzes, it was observed that there was no inhibitory effect for any of Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Colletotrichum musae and Monosporascus cannonballus isolates in any of the concentrations tested under the conditions studied. Molecular results showed a good standard for both amplification of DNA markers, showing the formation of different groups, and the presence of genetic variability has been detected. For the analysis with molecular markers there was the formation of the four distinct groups, and in the ISSR marker was observed the formation of six groups. When it was analyzed the two markers in a corresponding manner it was possible to detect the formation of seven distinct groups showing the existence of variability. The difference in the results of both markers can be explained by the case of two markers that covered different regions of the genome / Flor de Seda [Calotropis procera (Aiton) W.T. Aiton] é uma planta que tem recebido destaque por se tratar de uma espécie que possui diversas funcionalidades como alimentação animal, medicina tradicional, agricultura, meio ambiente, indústria cosmética e têxtil, podendo também atuar no combate à pragas, fungos e vírus através de mecanismos de defesa associados ao seu látex. Objetivou-se nesse estudo avaliar fluidos laticíferos da Flor de Seda na inibição do desenvolvimento de fungos fitopatogênicos de Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Colletotrichum musae e Monosporascus cannonballus e estudar a divergência genética de genótipos de Flor de Seda por meio de marcadores moleculares RAPD e ISSR. Vinte amostras de folhas da espécie foram coletadas na cidade de Grossos/RN e na cidade de Mossoró/RN no Campus Leste da UFERSA (dez plantas para cada local de coleta). O látex das plantas foram testados em quatro diferentes tipos de fungos fitopatogênicos, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Colletotrichum musae e Monosporascus cannonballus com duas diferentes metodologias (adicionando o látex ao meio de cultura antes e após a polimerização do meio) e com dois níveis diferentes de concentração (puro e diluído 1:1). Para as análises moleculares, o DNA de cada uma das plantas foi extraído com 11 primers RAPD e 10 primers ISSR. Para as análises do látex, foi observado que não houve efeito inibitório para nenhum dos isolados de Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Colletotrichum musae e Monosporascus cannonballus em nenhuma das concentrações testadas nas condições estudadas. Os resultados moleculares obtidos revelaram um bom padrão de amplificação para ambos os marcadores de DNA, mostrando à formação de grupos distintos, tendo sido detectada a presença de variabilidade genética. Para as análises com os marcadores RAPD houve a formação de quatro grupos distintos, e para o marcador ISSR foi possível observar a formação de seis grupos. Quando se analisou os dois marcadores de forma correlacionada foi possível detectar a formação de sete grupos distintos demonstrando a existência de variabilidade. A diferença encontrada nos resultados de ambos marcadores pode ser explicada por se tratar de dois marcadores que cobriram diferentes regiões do genoma

Made available in DSpace on 2016-08-12T19:18:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ShamyraGAS_Dissert.pdf: 1345668 bytes, checksum: 408f47b3e8a408dc7702858d04d13fc8 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Silk Flower [Calotropis procera (Aiton) W.T. Aiton] is a plant that has been highlighted by the case of a species that has several features such as animal feed, traditional medicine, agriculture, environment, cosmetics and textile industry, and may also act to combat pests, fungi and viruses through mechanisms defense associated with your latex. This study aimed to evaluate latex fluid from Silk Flower in inhibiting the development of pathogenic fungi of Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Colletotrichum musae and Monosporascus cannonballus and study the genetic diversity from Silk Flower genotypes using the RAPD and ISSR molecular markers. Twenty samples of species of leaves were collected in the Grossos/RN and Mossoró/RN cities (ten plants from each city). The plants latex were tested on four different types of phytopathogenic fungi, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Colletotrichum musae and Monosporascus cannonballus with two different methods (adding latex to the culture medium before and after polymerization middle), and with two different concentration level (neat and diluted 1:1). For molecular analysis, DNA of each plant was extracted with 11 RAPD primers and 10 ISSR primers. For latex analyzes, it was observed that there was no inhibitory effect for any of Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Colletotrichum musae and Monosporascus cannonballus isolates in any of the concentrations tested under the conditions studied. Molecular results showed a good standard for both amplification of DNA markers, showing the formation of different groups, and the presence of genetic variability has been detected. For the analysis with molecular markers there was the formation of the four distinct groups, and in the ISSR marker was observed the formation of six groups. When it was analyzed the two markers in a corresponding manner it was possible to detect the formation of seven distinct groups showing the existence of variability. The difference in the results of both markers can be explained by the case of two markers that covered different regions of the genome / Flor de Seda [Calotropis procera (Aiton) W.T. Aiton] é uma planta que tem recebido destaque por se tratar de uma espécie que possui diversas funcionalidades como alimentação animal, medicina tradicional, agricultura, meio ambiente, indústria cosmética e têxtil, podendo também atuar no combate à pragas, fungos e vírus através de mecanismos de defesa associados ao seu látex. Objetivou-se nesse estudo avaliar fluidos laticíferos da Flor de Seda na inibição do desenvolvimento de fungos fitopatogênicos de Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Colletotrichum musae e Monosporascus cannonballus e estudar a divergência genética de genótipos de Flor de Seda por meio de marcadores moleculares RAPD e ISSR. Vinte amostras de folhas da espécie foram coletadas na cidade de Grossos/RN e na cidade de Mossoró/RN no Campus Leste da UFERSA (dez plantas para cada local de coleta). O látex das plantas foram testados em quatro diferentes tipos de fungos fitopatogênicos, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Colletotrichum musae e Monosporascus cannonballus com duas diferentes metodologias (adicionando o látex ao meio de cultura antes e após a polimerização do meio) e com dois níveis diferentes de concentração (puro e diluído 1:1). Para as análises moleculares, o DNA de cada uma das plantas foi extraído com 11 primers RAPD e 10 primers ISSR. Para as análises do látex, foi observado que não houve efeito inibitório para nenhum dos isolados de Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Colletotrichum musae e Monosporascus cannonballus em nenhuma das concentrações testadas nas condições estudadas. Os resultados moleculares obtidos revelaram um bom padrão de amplificação para ambos os marcadores de DNA, mostrando à formação de grupos distintos, tendo sido detectada a presença de variabilidade genética. Para as análises com os marcadores RAPD houve a formação de quatro grupos distintos, e para o marcador ISSR foi possível observar a formação de seis grupos. Quando se analisou os dois marcadores de forma correlacionada foi possível detectar a formação de sete grupos distintos demonstrando a existência de variabilidade. A diferença encontrada nos resultados de ambos marcadores pode ser explicada por se tratar de dois marcadores que cobriram diferentes regiões do genoma

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:37:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 330706 bytes, checksum: 9be020e5be4feef0a4967a862388b2b0 (MD5) Previous issue date: 2009-10-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / To base the cultivation of Cylindrocladium pteridis and inoculation of the fungus under controlled conditions, was evaluated in this study sporulation in culture, conidial germination, mycelial growth and defoliation of eucalyptus at different temperatures. In preliminary experiments, we evaluated the effect of light and incubation time on germination of conidia. The presence of continuous light significantly reduced germination, resulting in higher germination of conidia in the dark. In assessing the germination under different incubation periods, it was observed that the germination of C.pteridis is very fast, and obtained 100% conidia germinated after 4 h of incubation. In assessing the germination under different temperatures, the optimum for germination was 25 ° C (84.6%). The mycelial growth also varied with temperature, and the maximum was 25 ° C. Aiming to solve the problem of low production of conidia in vitro were evaluated three methods of sporulation of C. pteridis in culture. We compared three methods, and the method of scraping the aerial mycelium followed by flood water was the most sporulation in media AVDA, MEA, PDA and GAA, after 10 days of incubation. We obtained the greatest number of conidia on PDA, with an average of 14.13 x 104 conidia / mL. With half SNA was no significant difference between the methods studied. Subsequently, to study the effect of temperature on leaf eucalyptus, is inoculated plants were kept in a moist chamber at 18, 26, 28 and 30 º C. After 48 h, were transferred to a greenhouse (25 ± 5 º C). The temperature significantly influenced the leaf classes in the base of the crown 50 days after inoculation, and the highest percentage of defoliation occurred at 26 º C. / A fim de embasar o cultivo de Cylindrocladium pteridis e a inoculação do fungo em condições controladas, avaliou-se neste trabalho a esporulação em cultura, a germinação de conídios, o crescimento micelial e a desfolha causada em eucalipto sob diferentes temperaturas. Em experimentos preliminares, avaliou-se o efeito da luminosidade e o tempo de incubação na germinação de conídios. A presença de luz contínua reduziu significativamente a germinação, obtendo-se maior germinação de conídios no escuro. Ao avaliar a germinação sob diferentes períodos de incubação, observou-se que a germinação de C.pteridis é muito rápida, sendo obtido 100% de conídios germinados após 4 h de incubação. Ao avaliar a germinação sob diferentes temperaturas, o ótimo para germinação foi 25 °C (84,6%). O crescimento micelial também variou com a temperatura, e o máximo foi a 25 ºC. Objetivando-se solucionar o problema da baixa produção de conídios in vitro, avaliaram-se três métodos de esporulação de C. pteridis em cultura. Compararam-se três métodos, e com o método de raspagem do micélio aéreo seguido de inundação em água obteve a maior esporulação do fungo nos meios AVDA, MEA, BDA e GAA, após 10 dias de incubação. Obteve-se a maior produção de conídios em BDA, com média de 14,13 x 104 conídios/mL. Com o meio SNA não houve diferença significativa entre os métodos estudados. Posteriormente, para se estudar o efeito da temperatura na desfolha em eucalipto, inocularam-se plantas que foram mantidas em câmara úmida a 18, 26, 28 e 30 ºC. Após 48 h, foram transferidas para casa de vegetação (25±5 ºC). A temperatura influenciou significativamente a desfolha em ramos da base da copa aos 50 dias após inoculação, e o maior percentual de desfolha ocorreu a 26 ºC.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:37:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 4648060 bytes, checksum: 02f10a0cc1d0bf768aa16e7168f46ef9 (MD5) Previous issue date: 2010-02-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Nowadays, Brazil is the largest producer of papaya and the third largest exporter of fruit in the world. Papaya can be affected by various diseases that prevent them from being marketed and, consequently, the exportation of the fruit. Among the fungal diseases, smallpox, or blight, caused by Asperisporium caricae, is one of the diseases that affect the orchards in all regions. This disease interferes directly in the profitability and viability of the production. Beyond its incidence on leaves, it can also cause lesions on the fruit surface, making them unsuitable for marketing. It s almost impossible to find publications related to the biology of the fungus and to the phylogenetic position of the species. A. caricae is considered by many authors as a biotrophic pathogen, based on the difficulty of cultivation and sporulation in vitro. Some aspects of the taxonomic genus Asperisporium are controversial, such as proving Mycosphaerella as a teleomorph organism, the phylogenetic relationships with other genera of the complex cercosporoidal and the separation of the genus Asperisporium from Passalora. Other authors relate M. caricae to the anamorph Phoma caricae-papaya (= Ascochyta caricapapaya), causal agent of stalk rot. However, through the manual identification the genera Phoma and Ascochyta are related to the teleomorph Didymella. The differences between the genders Didymella and Mycosphaerella is the presence of pseudo paraphyses in the last one. This feature is difficult to visualize in histological sections under a light microscope, thus being liable to misunderstand at the time of identification. The aims of the study were the isolation of A. caricae in pure culture, examining the growth and sporulation of the isolates in seven different media and make a morphological characterization of isolates. Beyond these, other aim was to verify the relationship between Asperisporium caricae and Mycosphaerella caricae by comparing nucleotides of three DNA regions (ITS rDNA, LSU and mtSSU) and the phylogenetic relationships with other genera of the complex cercosporoidal, by comparing the sequences obtained to sequences published in databases. It was possible to cultivate A. caricae in all tested media. The culture medium potato dextrose agar, supplemented or not with amino acids, were those who presented the best source to the fungus. Moreover, the species produced spores in vitro in all tested media, except in the medium consisting of papaya leaves. Through the molecular data and clusters obtained, it can be concluded that A. caricae belongs to the family Mycosphaerellaceae grouping it with species of true Passalora and Mycosphaerella. M. caricae was grouped with species of the genus Phoma, Ascochyta and Didymella, representatives of the order Pleosporales. Thus, it is possible that M. caricae is a species of Didymella and teleomorph of Phoma carica-papaya. / O Brasil é o maior produtor mundial de mamão e o terceiro maior exportador da fruta. O mamoeiro pode ser afetado por diversas doenças que inviabilizam a sua comercialização e, consequentemente, a exportações de frutos. Dentre as doenças fúngicas, a varíola, ou pinta preta, causada por Asperisporium caricae, é uma das doenças que afetam os pomares em todas as regiões produtoras. Interfere diretamente na rentabilidade e viabilidade da produção, pois, além de incidir em folhas, pode também causar lesões na superfície dos frutos, tornando-os inadequados para a comercialização. Trabalhos referentes à biologia do fungo são quase inexistentes, bem como sobre o posicionamento filogenético da espécie. A. caricae é considerado por muitos autores como biotrófico, baseado na dificuldade de cultivo e esporulação in vitro. Alguns aspectos taxonômicos do gênero Asperisporium são controversos, como a comprovação de Mycosphaerella como teleomorfo, o relacionamento filogenético com os demais gêneros do complexo cercosporóide e a separação de Asperisporium do gênero Passalora. Outros autores relacionam M. caricae ao anamorfo Phoma caricae-papaya (=Ascochyta caricae-papayae), agente etiológico da podridão peduncular. Contudo, por meio dos manuais de identificação os gêneros Phoma e Ascochyta estão relacionados ao teleomorfo Didymella. A distinção entre os gêneros Didymella e Mycosphaerella está na presença de pseudoparáfises neste último, sendo esta característica dificilmente visualizada em cortes histológicos em microscópio de luz, deste modo, sendo passível o equívoco no momento da identificação. Os objetivos do trabalho foram: realizar o isolamento de A. caricae em cultura pura, analisar o crescimento e a capacidade de esporulação dos isolados em sete diferentes meios de cultura e proceder a caracterização morfológica dos isolados; verificar a relação entre Asperisporium caricae e Mycosphaerella caricae por meio da comparação de nucleotídeos de três regiões do DNA (ITS do rDNA, LSU e mtSSU), assim como o relacionamento filogenético com os demais gêneros pertencentes ao complexo cercosporóide, por meio da comparação das sequências obtidas com as sequências publicadas em bancos de dados. Foi possível o cultivo de A. caricae em todos os meios de cultura testados, sendo que os meios de cultura batata-dextrose-ágar, suplementado ou não com aminoácidos, foram os que proporcionaram melhor desenvolvimento ao fungo. Além disso, a espécie produziu esporos in vitro em todos os meios de cultura testados, exceto no meio composto por folhas de mamão. Por meio dos dados moleculares e dos agrupamentos obtidos, pode-se concluir que A. caricae pertence à família Mycosphaerellaceae, agrupando com espécies de Passalora verdadeiras e de Mycosphaerella. M. caricae agrupou-se com espécies pertencentes ao gênero Phoma, Didymella e Ascochyta, representantes da ordem Pleosporales. Com isso, é possível que M. caricae seja uma espécie de Didymella, e teleomorfo de Phoma caricae-papayae.

A Podridão Floral dos Citros é uma doença que tem limitado a produção citrícola em várias regiões produtoras do mundo. A sintomatologia esta associada principalmente quando coincide alta pluviosidade e intensa florada. O fungo se encontra na forma quiescente em órgãos vegetais e na presença de nutrientes exógenos reinicia o processo de infecção. Os objetivos do trabalho foram: (i) avaliar o efeito das águas de lavagem bruta (ALB) obtidas a partir de flores, botões e folhas de laranjeira Valência, sobre o crescimento micelial, germinação e formação de apressórios por C. acutatum; (ii) avaliar o efeito dos compostos voláteis liberados pelas ALB e as frações produzidas a partir das águas de lavagem de flores e botões sobre a germinação e formação de apressórios; (iii) estabelecer uma metodologia para observação de estruturas de infecção em folhas de citros. Foram realizados dois bioensaios de germinação e formação de apressórios e crescimento micelial para as águas de lavagem bruta. O primeiro representado pelos tratamentos: testemunha (T), água de lavagem das flores (F), botões (B), folhas novas (FN), folhas velhas (FV) e a diluição da água das flores em 1:10, 1:100, 1:1000 e 1:10000 (v/v). O segundo por testemunha (T), água de lavagem das flores (F), botões (B), folhas novas (FN), folhas velhas (FV) e a autoclavagem destes mesmos tratamentos. Os voláteis liberados pelas águas de lavagem de flores e botões primeiramente foram identificados por SPME-CG-MS e logo após as frações foram obtidas de acordo com o tempo de retenção de cada pico encontrado, totalizando 5 frações para cada amostra. Realizou-se um bioensaio de germinação e formação de apressórios com as frações obtidas em contato direto com os esporos. Para a observação de estruturas de infecção, discos foliares de plantas cítricas foram inoculados, submetido a clareamento e posterior coloração para a observação ao microscópio. Os resultados das ALB mostraram que todos os tratamentos estimularam a germinação e formação de apressórios por C. acutatum. Os voláteis não apresentaram efeito indutor sobre os esporos, porém quando fracionados e colocados em contato direto com as estruturas, as frações botão apresentaram uma maior atividade indutora quando comparada a testemunha. Nenhum tratamento alterou o crescimento micelial do fungo. A melhor visualização dos esporos nas folhas ocorreu 48 horas após a inoculação. Com base nesses resultados, pode-se concluir que as águas de lavagem estimulam a germinação e formação de apressórios, e apenas os voláteis presentes nas frações botão estimularam a germinação de C. acutatum. / The Post Bloom Fruit Drop is a limiting disease in citrus production around the world and the symptoms are associated to high rainfall and intense blooming. The fungus is found in a quiescent state in plant organs and under the presence of exogenous nutrients it restarts the infection process. Thus, the objectives of the work were: (i) evaluate the direct effect of washing crude water (WCW) obtained from flowers, flower buds and leaves of Valencia orange trees on the mycelial growth, germination and appressorium formation by C. acutatum; ii) evaluate the effect of volatile compounds released by the WCW and the fractions obtained from the washing water from flower and flower buds in the germination and appressorium formation, and (iii) establish a methodology for observing structures of fungal infection in citrus leaves. Two bioassays were carried out to evaluate germination, appressorium formation and mycelial growth in the presence of WCW. The first one was represented by the treatments: control (C), washing water from flowers (F), flowers buds (FB), young leaves (YL), old leaves (OL), and dilution (1:10, 1:100 , 1:1000 and 1:10000; v/v ) from the flower washing water. The second one included control (C), washing water from flowers (F), flowers buds (FB), young leaves (YL), old leaves (OL) and all of washings autoclaved. The volatiles released by the washing water from flowers and flowers buds were first separated and identified by SPME-GC-MS and then fractions were obtained according to the retention time of each peak found, making up five fractions for each sample. A bioassay for germination and appressorium formation was carried out by using the fractions obtained and placed into direct contact with the spores. To observe the fungal infection structures, leaf discs from citrus plants were inoculated, subject to bleaching and then stained for observation under a microscope. The results obtained by using the WCW samples showed that all treatments stimulated spore germination and appressorium formation by C. acutatum. The volatiles did not show any inductive effect on the spores, but when fractionated and placed into direct contact with the fungal structures, the fractions from the flowers buds showed a higher inducing activity when compared to the control. None treatment changed the in vitro mycelial growth of the fungus and the best visualization of spores in the leaves occurred 48 hours after inoculation. Based upon on these results, it can be concluded that the crude washing water stimulated germination and appressorium formation, and only the volatiles present in the fraction flowers buds were able to stimulate the germination of C. acutatum spores.

A produção brasileira de laranjas destina-se à indústria de suco concentrado, principal produto citrícola, sendo o estado de São Paulo o maior produtor e exportador do país. Devido à diminuição da variabilidade genética causada pela multiplicação de plantas cítricas por enxertia, esta cultura se tornou alvo constante de inúmeras pragas e doenças. Dentre estas doenças que vem causando crescentes prejuízos para a citricultura brasileira destaca-se a pinta preta causada pelo fungo Guignardia citricarpa Kiely. O combate desta doença é feito por inúmeras pulverizações de fungicidas que aumenta significativamente o custo para os produtores. Uma possível alternativa para o combate a este patógeno seria a produção de plantas cítricas resistentes a doença, através de transformação gênica. Mas para isto, é necessário conhecer os mecanismos de respostas de defesa da planta e identificar quais genes podem estar relacionados com a defesa. Na tentativa de elucidar as respostas de defesa deste hospedeiro foram feitas análises anatômicas de frutos de laranja doce (Citrus sinensis Osbeck cv. Pêra) inoculados com o patógeno e análise transcricional de duas bibliotecas de cDNA, uma de albedo de frutos sadios(BAFS) e outra de albedo de frutos inoculados com o patógeno (BAFC). As análises anatômicas mostraram que os danos causados pelo patógeno na planta iniciam-se 24 horas após a inoculação com as lesões das células do epicarpo, e continuam gradativamente até 72 horas apresentando a diminuição na quantidade de amido e acúmulo de compostos fenólicos. Foi obtido 184 ESTs válidas da BAFS e 370 da BAF. A anotação e categorização destas sequencias apresentaram que o perfil transcricional encontrado nas duas bibliotecas foi semelhante, porém, na BAFC, foram encontrados transcritos pertencentes à defesa da planta como a catalase, a glutationa e monooxygenases. Está analise mostrou que a resposta de defesa da planta inicia-se com lesões nas células, que a interação é custo-intensiva (redução da reserva de amido) para o hospedeiro, e que a defesa da planta está relacionada a muitos genes de defesa. / The Brazilian production of oranges is mainly for the industry of concentrated juice, it is the most important citrus product, and the state of São Paulo is the largest producer and exporter of the country. Due to the low genetic variability caused by the multiplication of citrus plants by grafting, this culture became constant target of many pests and diseases. Among all the diseases that lead to elevated damage to the Brazilian citrus plantation, one is very relevant, the Black Spot disease caused by the fungus Guignardia citricarpa Kiely. The control of this disease is done by many sprays of fungicides that significantly increase the production cost to the producers. A possible alternative to control this pathogen is the development of resistant citrus plants to disease through genetic transformation. To that, it is necessary to understand the mechanisms of plant defense response and identify the genes related to the defense. In an attempt to elucidate the responses of this host both,anatomical analysis of sweet orange fruits (Citrus sinensis Osbeck cv. Pêra) inoculated with the pathogen and transcriptional analysis of two cDNA libraries of albedo section were done. One was from health fruits (BAFS) and another from albedo of fruits inoculated with the pathogen (BAFC). The analysis showed that the anatomical damage caused by the pathogen in the plant shall begin 24 hours after inoculation showing lesions on epicarp cells, and continue gradually until 72 hours also showing a decrease in the amount of starch and accumulation of phenolic compounds. It was obtained 184 valid ESTs of the BAFS and 370 from BAFC. The annotation and categorization of these sequences showed that the transcriptional profile in the two libraries were similar, however, in BAFC, were found transcripts belonging to plant defense such as catalase, the glutathione and monooxygenases. These analyses showed that the plant defense response begins with lesions in the cells, being it cost-intensive interaction for the host, (with reduction of starch reserves) and the plant defense to resistance is related to many genes.

A citricultura brasileira concentra-se principalmente no Estado de São Paulo que contribui com 80,4 % da produção nacional, sendo o Brasil um dos maiores produtores mundiais de citros. Um dos problemas enfrentados pela citricultura é a sua vulnerabilidade a pragas e doenças, devido principalmente a baixa diversidade genética nas variedades comerciais utilizadas, associada ao sistema de plantio em áreas extensas. Uma das doenças que vem causando crescentes prejuízos para a citricultura brasileira é a pinta preta ou mancha preta dos citros causada pelo fungo Guignardia citricarpa Kiely. O uso de conhecimentos de biologia molecular e métodos biotecnológicos devem ser considerados como importante alternativa para a produção de plantas geneticamente modificadas expressando genes de resistência. Para se obter plantas de citros resistentes a doenças, se faz necessário identificar genes que estejam relacionados com os mecanismos de defesa da planta. Na tentativa de identificar estes genes, o objetivo geral deste trabalho foi a identificação de genes in silico no banco de dados do Projeto Millenium CitEST e a análise de expressão diferencial de genes envolvidos na defesa. Mais de 7600 sequencias foram identificadas nas buscas no CitEST com similaridade aos genes R e genes envolvidos na HR e defesa, MAPKs e SNF1. Destes, foram selecionados 273 sequencias para experimentos de macroarranjo para análise da interação Citrus sinensis-Guignardia citricarpa. A análise estatística revelou que 171 genes (62,63%) apresentaram expressão diferencial significativa ao nível de 5% de probabilidade. Destes, 80 apresentaram expressão diferencial significativa maior do que duas vezes, dos quais 38 genes foram induzidos e 42 foram reprimidos no tecido infectado. Entre os genes induzidos estão MAPKs, genes de resistência (R), genes envolvidos na resposta de hipersensibilidade (HR) e na defesa da planta. Entre os transcritos reprimidos, há quatro similares a peroxidases e cinco similares a catalases, o que era esperado já que catalases e algumas peroxidases são capazes de remover H2O2, e assim a planta produz espécies reativa de oxigênio capaz de desencadear a ativação de genes de defesa. Os dados do macroarranjo foram validados via transcrição reversa seguida de PCR quantitativo em tempo real (RT-PCRq) de 9 genes. As análises confirmaram a expressão diferencial de 8 deles sendo que somente um apresentou resultado contrastante ao macroarranjo, o que demonstra a eficiência da metodologia de macroarranjos para estudo de muitos genes simultaneamente. Os genes diferencialmente expressos identificados na interação C. sinensis-G. citricarpa são de grande importância, pois são fortes candidatos para serem utilizados na transformação genética de plantas com o objetivo de obter novas variedades de plantas com resistência a patógenos. / The Brazilian citrus industry is concentrated mainly in the State of Sao Paulo which contributes with 80.4% of national production, with Brazil being a leading world producer of citrus. One of the problems facing the citrus industry is its vulnerability to pests and diseases, mainly due to low genetic diversity of the commercial varieties used, linked to the system of planting in extensive areas. A disease that is causing increasing damage to the brazilian citrus industry is the black spot of citrus caused by the fungus Guignardia citricarpa Kiely. The use of knowledge of molecular biology and biotechnological methods should be considered as an important alternative for the production of genetically modified plants expressing genes for resistance. In order to obtain citrus plants resistant to diseases it is necessary to identify genes that are related to the defense mechanisms of the plant. In an attempt to identify these genes, the general aim of this study was to identify genes in silico in the database of the Millennium CitEST Project and to perform differential expression analysis of genes involved in the defense mechanisms. More than 7600 reads were identified in the CitEST search with similarity to R genes, genes involved in HR and defense, MAPKs and SNF1. It was selected 273 reads for macroarray experiments to analysis of Citrus sinensis-Guignardia citricarpa interaction. Statistical analysis revealed that 171 genes (62.63%) showed significant differential expression at the level of 5% probability. From these, 80 showed significant differential expression higher than two fold, in which 38 genes were induced and 42 were repressed in infected tissue. Among the induced genes are MAPKs, resistance (R) genes, genes involved in hypersensitivity response (HR) and plant defense. Among the suppressed transcripts, there are four similar to peroxidases and five similar to catalases, which is expected because catalases and some peroxidases are able to remove H2O2, and so the plant produces reactive oxygen species capable of triggering the activation of defense genes. The macroarray data were validated by reverse transcription followed by quantitative real-time PCR (RT-PCRq) of 9 genes. The analysis confirmed the differential expression of 8 of them, and only one presented different result of macroarray which demonstrate the efficiency of the macroarray methodology to analyze several genes simultaneously. The genes differentially expressed in the interaction of C. sinensis x Guignardia citricarpa identified are of great importance because they are strong candidates for use in genetic transformation of plants with the objective of obtaining new varieties of plants resistant to pathogens.

O gênero Fusarium é um grupo de fungos de importância mundial, não só por causar patologias em plantas, mas também porque abriga espécies toxigênicas. Dentre estas, Fusarium verticillioides, Fusarium proliferatum e Fusarium subglutinans, cujos teleomorfos se agrupam no complexo Gibberella fujikuroi, estão associadas a patologias em milho. O presente estudo caracterizou uma coleção de 100 isolados de Fusarium spp. tanto do ponto de vista morfológico como molecular com vistas a identificá-los em nível de espécie. Para isto, foram usados como marcadores morfológicos a presença/ausência de clamidósporos, o tipo de célula conidiogênica e a disposição dos microconídios sobre a célula conidiogênica. Os isolados foram também identificados em espécie baseado em informações disponíveis na literatura acerca de marcadores moleculares desenvolvidos a partir da reação de PCR e primers espécie-específicos. A ausência de clamidósporo permitiu alocar a totalidade dos isolados no complexo G. fujikuroi. Os demais critérios morfológicos permitiram identificar 77 isolados como F. verticillioides, 20 como F. proliferatum, 2 como F. subglutinans. Apenas 1 isolado não foi possível identificar em espécie. Análises moleculares concordaram em 100% dos casos em que os isolados foram identificados como F. verticillioides e F. subglutinans. Porem, no caso dos 20 isolados identificados morfologicamente como F. proliferatum apenas 4 foram confirmados na análise molecular; os demais foram identificados como F. verticillioides. A diversidade genética estudada por AFLP ratificou a separação das espécies F. verticillioides e F. proliferatum, com um índice de similaridade de 0,40. Marcadores AFLP também evidenciaram alta diversidade genética de F. verticillioides. Todos os isolados causaram podridão do colmo em três híbridos comerciais de milho e não variaram em agressividade, independente do nível de resistência dos híbridos. / The genus Fusarium is an important group of fungi worldwide, not only for its capability to cause disease but because it also contains species which produce toxins. Among these, Fusarium verticillioides, Fusarium proliferatum and Fusarium subglutinans, which teleomorphs are grouped in the Gibberella fujikuroi group are associated with diseases in maize. This study characterized a collection of 100 isolates of Fusarium spp. under morphological and molecular criteria to identify them at the species level. For this purpose, morphological markers such as presence/absence of chlamydospores, conidiogenou cell type and microconidia arrangement on conidiogenou cell were assessed. The isolates were also identified at the species level based upon available information about molecular markers developed from the PCR reaction using speciesspecific primers. The absence of chlamydospores in all of the isolates placed them within the G. fujikuroi complex, and based on the other morphological criteria, 77 isolates were identified as F. verticillioides, 20 as F. proliferatum, 2 as F. subglutinans and one isolate remained unidentified at the species level. The molecular analyses agreed with the morphological identification of all F. verticillioides and F. subglutinans. However, in the case of 20 isolates identified morphologically as F. proliferatum only 4 were confirmed, the rest being identified as F. verticillioides. The genetic diversity based on AFLP confirmed the separation of F. verticillioides and F. proliferatum in two groups, with a similarity index of 0.40. AFLP markers also showed high genetic diversity within F. verticillioides. All isolates were caused stalk rot on three commercial hybrids and did not vary in aggressiveness regardless of the resistance level of the hybrids.