Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les protéines receptor-interacting protein kinase 1 (RIP1) et RIP3 ont été identifiées comme intervenant dans la régulation de la mort cellulaire apoptotique ou nécroptotique mais également dans la survie cellulaire. Ces deux protéines possèdent un domaine sérine/thréonine kinase, un domaine d’interaction spécifique RHIM (RIP homotypic interacting motif) et diffèrent dans leur domaine C-terminal car seule RIP1 possède un domaine de mort. Ces protéines font partie d’un ensemble de protéines régulatrices nommé ripoptosome. Des études ont montré une altération du ripoptosome dans les leucémies lymphoïdes chroniques (LLC) et les leucémies aigües lymphoïdes (LAL). Nous nous sommes intéressés aux leucémies aigües myéloïdes (LAM). L’analyse de l’expression des protéines RIP1 et RIP3 a été réalisée dans des blastes triées CD34+ de patients atteints de LAM ou dans des cellules CD34+ de donneurs sains en Q-RT-PCR. Les premières analyses montrent que RIP3 est significativement sous-exprimée chez les patients atteints de LAM en comparaison avec les cellules CD34+ issues de donneurs sains. Aucune différence n’a été mise en évidence pour l’expression de RIP1 dans les deux types de cellules CD34+. Afin de comprendre l’implication de l'extinction de RIP3 dans les LAM, nous avons étudié sa réexpression dans une lignée cellulaire leucémique murine (DA1-3b) où RIP3 n’est pas exprimée par métylation de son promoteur, au moyen d'un système d’expression conditionnelle (LacSwith II, IPTG). Après 10h d’induction de l’expression, on constate que la protéine RIP3 sauvage (RIP3-WT) induit une apoptose dans les cellules DA1-3b. Afin de déterminer l’implication des domaines de RIP3, nous avons utilisé une protéine mutante kinase Dead (RIP3-KD, activité kinase abolie) et une protéine mutante dans la séquence d’interaction spécifique avec RIP1 (RIP3-RHIM). L’analyse de la mortalité cellulaire en cytométrie en flux et en microscopie électronique montre que les protéines RIP3-WT et -KD induisent toutes les deux la mort apoptotique des cellules DA1-3b respectivement de 15% et de 50% après 10h d’expression. On constate donc que la protéine RIP3-KD induit une mort plus importante et plus précoce que la protéine sauvage. La protéine RIP3 mutée dans son domaine RHIM ne peut plus induire de mort cellulaire. Il semble donc que le domaine kinase de RIP3 jouerait un rôle régulateur dans la mort cellulaire induite par RIP3. L’utilisation du modèle de leucémie murine DA1-3b a permis de réaliser un étude in vivo de l’expression conditionnelle de RIP3-WT et -KD. Seule l'expression de RIP3-KD est capable de prolonger significativement la survie des souris.De plus, il a été démontré que RIP3 pouvait également induire la nécroptose dans les cellules lorsque l’apoptose ne peut aboutir, notament lorsque les caspases sont inhibées à l’aide d’un inhibiteur de pan-caspases le Z-VAD-FMK. Le traitement des cellules exprimant RIP3-WT par 50µM de Z-VAD-FMK induit une plus forte mortalité (45%) des cellules tandis que dans les cellules exprimant RIP3-KD, l’inhibiteur des caspases inhibe complètement le processus apoptotique et permet la survie des cellules (10%). Une étude en microscopie électronique a permis de déterminer que la présence de Z-VAD-FMK induit un switch de l’apoptose vers la nécroptose. Il semble donc que le domaine de kinase possède un rôle important dans la signalisation de la nécroptose car la protéine RIP3-KD n’est plus capable d’initier le switch entre l’apoptose et la nécroptose. Quelques données préliminaires semblent indiquer que les calpaïnes ainsi que la caspase 12 pourraient également être impliquées dans la balance apoptose/nécroptose. [...] / The receptor-interacting protein kinase 1 (RIP1) and 3 (RIP3) are key signaling molecules in the regulation of apoptotic cell death or in the execution of a specific instance of regulated necrosis, named necroptosis, as well as in cell survival processes. These proteins have in common a serine/threonine kinase domain and a specific interacting motif RHIM (RIP homotypic interacting motif), while they differ in their C-terminal domain, as only RIP1 is characterized by a death domain. They belong to a family of regulatory proteins forming a cell death-inducing platform, referred to as Ripoptosome. Previous studies showed that the ripoptosome was altered in chronic lymphoid leukemia (CLL) and acute lymphoid leukemia (ALL). We decided to focus our studies on acute myeloid leukemia (AML).Expression profile of RIP1 and RIP3 was established by Q-RT PCR on CD34+ sorted cells of AML patients or healthy donors. Our first results show that if RIP3 is significantly under expressed in CD34+ cells of AML patients compared to healthy donors, there was no difference in RIP1 expression pattern in both cell types.To further understand the functional relevance of RIP3 down-regulation in the leukemia, we used a murine leukemic cell line (DA1-3b) in which RIP3 promoter is methylated, inhibiting its expression.A conditional expression system in DA1-3b cells has been realized (LacSwith II). IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactoside) treatment (1mM) allows expression of the proteins of interest in these cell lines. We noticed that, 10 hours after expression’s induction, the wild-type RIP3 protein (RIP3-WT) induces apotptosis in DA1-3b cells. In order to decipher the role of each RIP3 domains in this cell-death-induced phenomenon, several mutants were employed. We used a mutant protein with a non functional kinase domain, RIP3 Kinase Dead (KD) and a mutant unable to interact with RIP1, RIP1-RHIM. Cell death analysis, performed by flow cytometry and by electron microscopy, shows that both RIP3-WT and RIP3-KD induce apoptosis in DA1-3b cells (respectively 15% and 50%) after 10 hrs of expression. However, these results show that RIP3-KD induces a stronger and more rapid cell-death than the wild-type protein. In agrement with previous findings, we found that the protein mutated in the RHIM domain cannot engage a cell-death process. Our results thereby suggest that the RIP3 kinase domain palys a major regulatory role in cell-death.Taking advantage of a mouse model of leukemia, we also performed an in vivo study of conditional expression RIP3-WT and –KD. As a matter of fact, DA1-3b cells, obtained from C3H mice are able to induce a leukemia in these mice after transplantation. We have shown that the inducible expression of RIP3-KD in DA1-3b cells can increase significatively mice survival. Moreover, we have shown that, in certain conditions, RIP3 could also induce necroptosis when apoptosis is prevented by a pan-caspase inhibitor, Z-VAD-FMK. Treating RIP3-WT expressing cells with 50µM of Z-VAD-FMK induces a strong mortality (45%) while it inhibits totally the apoptotic process in RIP3-KD expressing cells, allowing cell survival (10%).Using electronic microscopy, we were able to demonstrate that the use of Z-VAD-FMK leads to a switch from apoptosis to necroptosis. Thus, as the kinase dead protein is not able to induce this switch, the kinase domain could play an important role in necroptotic signaling. Preliminary results suggest that calpains, as well as caspase 12, could also be involved in apoptosis/necroptosis balance. It has been shown that RIP1 and RIP3 could play a role in Nf-kB pathway regulation. Studying the effects of RIP3-KD expression on Nf-kB pathway, we were able to demonstrate that it led to a specific cleavage of Nf-kB p65 protein, forming two fragments of about 25 kDa and 40 kDa. [...]

La dystrophie musculaire facioscapulohumérale (FSHD) est la troisième myopathie la plus fréquente en Europe. La maladie atteint progressivement les muscles du visage, des bras et des jambes. Les symptômes apparaissent dans la majorité des cas avant 20 ans et la maladie, souvent douloureuse, provoque fréquemment un handicap majeur qui nécessite de se déplacer en fauteuil roulant. J'ai démontré que la protéine KLF15 est surexprimée dans les tissus des patients FSHD et dans les myoblastes cultivés in vitro et prélevés sur des patients FSHD. Des résultats préliminaires indiquent que la surexpression du facteur KLF15 pourrait être expliquée par le stress oxydant induit par DUX4 et la surexpression de certains facteurs de myogenèse induits par DUX4c. J'ai démontré que KLF15 interagit directement avec les répétitions D4Z4 et contrôle leur fonction d'activation de transcription. Ainsi KLF15 sert de médiateur entre les répétitions D4Z4 et deux gènes dans la région 4q35: FRG2 et DUX4c ce que explique la surexpression de ces deux gènes dans la FSHD. La surexpression du gène DUX4c, homologue du DUX4, perturbe le programme de différentiation musculaire en activant certains facteurs de myogenèse (myomiRs ou microRNAs myogéniques). En somme, la découverte du rôle du facteur KLF15 dans la FSHD met en évidence une boucle de rétrocontrôle positif qui relie la surexpression du facteur KLF15 avec la surexpression des gènes codés dans la région 4q35. Le rôle central du facteur KLF15 dans ce nouveau modèle de la maladie permet d'envisager une nouvelle piste thérapeutique pour la dystrophie FSHD basé sur l'inhibition du facteur KLF15. / Facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD), a dominant hereditary disease with a prevalence of 7 per 100,000 individuals, is associated with a partial deletion in the subtelomeric D4Z4 repeat array on chromosome 4q. The D4Z4 repeat contains a strong transcriptional enhancer that activates promoters of several FSHD-related genes. We here report that the enhancer within the D4Z4 repeat binds the Krüppel-like factor KLF15. KLF15 was found to be upregulated during myogenic differentiation induced by serum starvation or by overexpression of the myogenic differentiation factor MYOD. When overexpressed, KLF15 activated the D4Z4 enhancer and led to overexpression of DUX4c (Double homeobox 4, centromeric) and FRG2 (FSHD region gene 2) genes, whereas its silencing caused inactivation of the D4Z4 enhancer. In immortalized human myoblasts the D4Z4 enhancer was activated by the myogenic factor MYOD, an effect that was abolished upon KLF15 silencing or when the KLF15 binding sites within the D4Z4 enhancer were mutated, indicating that the myogenesis-related activation of the D4Z4 enhancer was mediated by KLF15. KLF15 and several myogenesis-related factors were found to be expressed at higher levels in myoblasts, myotubes and muscle biopsies from FSHD patients than in healthy controls. We propose that KLF15 serves as a molecular link between myogenic factors and the activity of the D4Z4 enhancer, and thus contributes to the overexpression of the DUX4c and FRG2 genes during normal myogenic differentiation and in FSHD.

Les lymphocytes T CD4+ auxiliaires ou T helper en anglais sont capables de soutenir une grande diversité de fonctions grâce à leur capacité à se différencier en différents sous-types effecteurs en fonction de l’antigène rencontré et de l’environnement cytokinique dans lequel ils se trouvent. Les connaissances actuelles sur la différenciation des cellules T helper mettent en avant l’existence de réseaux transcriptionnels particulièrement complexes et spécifiques à chaque sous-ensemble T helper. En 2008, les cellules T CD4 sécrétrices d’IL-9 (Th9) sont identifiées comme un nouveau sous-type de cellules T helper. Différenciées en présence d’IL-4 et TGF-β, les cellules Th9 sécrètent de l’IL-9 et de l’IL-21, et contribuent au développement de maladies auto-immunes et allergiques. Les lymphocytes Th9 présentent également des propriétés anti-tumorales particulièrement intéressantes.Le réseau transcriptionnel des cellules Th9 résulte d’un équilibre entre les voies de signalisation induites par les différentes cytokines nécessaires à sa polarisation. L’IL-4 permet l’activation de STAT6 et l’expression de GATA3 et IRF4, tandis que le TGF-β conduit à l’activation de la voie des Smad et l’expression du facteur PU.1. Le module transcriptionnel IRF4/BATF ainsi que le facteur PU.1 sont des messagers indispensables au développement des cellules Th9 et à la sécrétion d’IL-9.IRF8 est un facteur de transcription critique pour le développement des cellules myéloïdes et des lymphocytes B. Récemment, il est apparu qu’IRF8 était impliqué dans la polarisation de sous-ensembles T helper. En effet, IRF8 limite la sécrétion d’IL-17 par les cellules Th17, de même qu’il réprime l’expression de l’Il4 et l’Il17 dans les cellules Treg. Structurellement proche d’IRF4, IRF8 interagit avec des cofacteurs tels que PU.1 ou BATF afin de réguler l’activité transcriptionnelle.Ce travail présenté ici révèle que le facteur IRF8 participe à la polarisation des cellules Th9 in vitro et in vivo. Le TGF-β nécessaire à la différenciation des cellules Th9 régule directement l’expression d’Irf8 grâce à l’activation de Smad3. Comme dans d’autres types cellulaires, la fonction transcriptionnelle d’IRF8 est dépendante de ces partenaires d’interaction. Nous montrons qu’en présence des facteurs PU.1, IRF4 et BATF, IRF8 participe à un complexe multiprotéique nécessaire à l’induction des cytokines caractéristiques des cellules Th9, notamment l’Il9 et l’Il21. Nous démontrons également qu’en présence de la protéine ETV6, IRF8 est capable de former un complexe initiant la répression de l’activité transcriptionnelle de l’Il4. Nous soulignons ainsi le rôle bivalent joué par IRF8 dans le développement des cellules Th9 dépendamment de ses partenaires. Pour finir, l’expression d’Irf8 est nécessaire aux cellules Th9 pour exercer leurs fonctions anti-tumorales. / CD4 helper T cells support a wide range of functions due to their ability to differentiate into different effector subsets depending on the antigen encountered and the cytokine environment in which they are. Current knowledge on the differentiation of helper T cells highlights the existence of complex transcriptional networks specific to each T helper subset. In 2008, IL-9 secreting CD4 T cells (Th9) are identified as a new helper T cell subtype. Differentiated in the presence of IL-4 and TGF-β, Th9 cells secrete IL-9 and IL-21, and contribute to the development of autoimmune and allergic diseases. Th9 lymphocytes also exhibit strong anti-tumor properties.The transcriptional network of the Th9 cells results from a balance between the signaling pathways induced by the different cytokines required for its polarization. IL-4 allows activation of STAT6 and expression of GATA3 and IRF4, whereas TGF-β leads to activation of the Smad pathway and expression of the transcription factor PU.1. The IRF4 / BATF transcriptional module and the PU.1 factor are essential messengers for the development of Th9 cells and IL-9 secretion.IRF8 is a crucial transcription factor for the development of myeloid cells and B lymphocytes. Recently it appeared that IRF8 was involved in helper T subset polarization. Indeed, IRF8 limits the secretion of IL-17 by Th17 cells, as well as repressing the expression of Il4 and Il17 in Treg cells. Structurally close to IRF4, IRF8 interacts with cofactors such as PU.1 or BATF in order to regulate transcriptional activity.This work reveals that the IRF8 transcription factor contributes to the polarization of Th9 cells in vitro and in vivo. The TGF-β needed for Th9 cell differentiation activate Smad3 pathway which directly modulates the Irf8 expression. As in many cellular subtypes, the transcriptional function of IRF8 is dependent on these interaction partners. We show that in the presence of the transcription factors PU.1, IRF4 and BATF, IRF8 participates in a multiprotein complex essential for the induction of the Th9 cytokines, Il9 and Il21. We also demonstrate that in the presence of the ETV6 protein, IRF8 is able to form a complex responsible for the repression of Il4 expression. We underline the bivalent role played by IRF8 in the development of Th9 cells depending on its partners. Finally, expression of Irf8 is crucial for Th9 cells to exercise their antitumor functions.

Au cours des années, de nombreuses données ont été accumulées concernant le rôle et la régulation des facteurs de transcription MYB30 et MYB96 lors des réponses de défense de la plante Arabidopsis thaliana à l'attaque de bactéries pathogènes. Mon travail de thèse a consisté en la mise en place de méthodes de modélisation mathématique afin d'étudier l'effet de ces facteurs de transcription sur le métabolisme de la plante durant l'infection. Pour cela, j'ai développé des méthodes hybrides capables de combiner l'analyse de réseaux de régulation et du métabolisme. Ces études ont pu mettre en évidence l'importance de MYB96 qui semble réguler de nombreux gènes impliqués dans la biosynthèse d'acides gras à très longue chaîne et de leurs dérivés. / Over the years, a lot of data has been accumulated concerning the role and regulation of MYB30 and MYB96 transcription factors during the defence responses of the plant Arabidopsis thaliana in response to pathogenic bacteria. My PhD project consisted in using mathematical modelling methods to study the role of these transcription factors on plant metabolism during infection. I developed hybrid methods capable of combining analyses of regulatory and metabolic networks. These studies showed the importance of MYB96 which seems to positively regulate many genes involved in the biosynthesis of very long chain fatty acids and their derivatives.

Afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l'initiation des racines coronaires chez le riz nous avons recherché des gènes régulés par le facteur de transcription CROWN ROOTLESS 1 (CRL1) qui contrôle leur initiation en réponse à l'auxine. Différentes approches de transcriptome ont été mises en œuvre. La première a consistée à rechercher les gènes différenciellement exprimés dans les bases de tige du mutant crl1 par rapport au sauvage. La seconde a consisté à rechercher des gènes régulés par l'auxine de manière CRL1-dépendant. La troisième a consisté à rechercher des gènes dont l'expression est induite dans les bases de tige du mutant crl1 après expression conditionnelle ectopique du gène CRL1. Parmi les gènes identifiés des expériences de qRT-PCR nous ont permis de valider 11 gènes comme étant induit par l'auxine de manière CRL1 dépendant et des expérience d'hybridation in situ, 10 gènes qui s'expriment de manière spécifique dans les primordium de racine coronaires. La majorité de ces gènes codent pour des facteurs de transcription et des éléments de transduction de signaux. Certains sont des modulateurs de la stucture de la chromatine d'autre des transporteurs d'auxine. Ces résultats éclairent sur les cibles régulées par le facteur de transcription CRL1 et apportent des éléments nouveaux sur les mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation de l'initiation des racines coronaires chez le riz. / In order to understand better the mechanisms involved in crown root initiation in rice we researched the genes regulated by the CROW ROOT LESS 1 (CRL1) transcription factor that controls their initiation in response to auxin. Several transcript profiling approaches have been used. The first was to look for the genes differentially expressed in crl1 stem bases relatively to the wild type. The second one was to research genes that are CRL1-dependant auxin responsive. The last one consisted to research genes that are up-regulated in crl1 stem bases just after the inducible ectopic expression of CRL1. Among identified genes RT-qPCR experiments allowed to validate 11 CRL1-dependant auxin responsive genes and in situ hybridization experiments ten genes that are specifically expressed in crown root primordia. Most of these genes encodes transcription factors or components of transduction signal patways. Some of them encode chromating modulling factors or auxin transporters. These results give new knowledge about the gene regulatory network acting down-stream CRL1 and about the molecular mechanisms involved in crown root initiation in rice.

E4F1 est un facteur de transcription liant l'ADN, exprimé de façon ubiquitaire par tous les tissus, et qui possède une activité E3 ubiquitine ligase atypique dirigée contre le suppresseur de tumeur p53. La protéine E4F1 interagit directement avec plusieurs suppresseurs de tumeurs cellulaires et des oncogènes viraux (p53, pRb, DRAL, RASSF1A, p19ARF, BMI1, HBX et GAM1...), suggérant qu’elle est elle-même impliquée dans la tumorigenèse. La perte d’E4F1 dans des fibroblastes embryonnaires (Mefs) transformés ou dans des cellules de sarcomes histiocytaires déficientes pour la voie p53, entraine la mort de ces cellules. La même inactivation d'E4F1 dans les cellules normales n'affecte pas leur survie mais entraine un arrêt de prolifération. Des analyses transcriptomiques et de liaison à l'ADN à l'échelle du génome entier (ChIP-seq et analyses différentielles des transcriptomes de cellules E4F1 WT et KO) nous ont permis d’identifier une centaine de gènes liés et régulés directement par E4F1. Ces gènes codent notamment pour des protéines mitochondriales impliquées dans le métabolisme et l'homéostasie de cette organelle, dont plusieurs composants et régulateurs de l'enzyme multimérique, pyruvate déshydrogénase. Un second groupe de gênes cibles d’E4F1 est impliqué dans la réponse aux dommages à l'ADN, dont le gène codant pour la kinase CHK1 qui joue un rôle essentiel dans le contrôle de la stabilité du génome. En accord avec la fonction de ces gènes cibles, la perte d’E4F1 entraine des perturbations du métabolisme cellulaire et des checkpoints de réponse aux stress génotoxiques. Dans les cellules déficientes pour la voie p53, ces perturbations conduisent à des stress oxydatifs (surproduction de ROS mitochondriaux) et énergétiques, suivis de dommages aux protéines et à l'ADN, et in fine, à une mort cellulaire massive. Dans les cellules compétentes pour la voie p53 ces altérations sont fortement atténuées et conduisent à un arrêt de la prolifération. Une partie des effets protecteurs de p53 est due à sa capacité à stimuler l'expression du gène ALDH4a1 qui code pour une aldehyde dehydrogenase impliquée dans le catabolisme de la proline et dont l'activité possède des propriétés anti-oxydantes.Mes travaux mettent également en évidence que le niveau d'expression de la protéine E4F1 et son activité augmentent lors de la transformation cellulaire ainsi qu'en réponse à des stress énergétiques, génotoxiques ou oxydatifs. Dans ces trois dernières conditions, la phosphorylation d'E4F1 est également augmentée au niveau de plusieurs sérines qui ont été identifiées par spectrométrie de masse. En résumé, tous ces éléments indiquent qu'E4F1 est un acteur important du contrôle de l'homéostasie métabolique et de la réponse aux stress, particulièrement essentiel pour la survie des cellules cancéreuses déficientes pour la voie p53. Mes observations suggèrent également qu'E4F1 est activé en réponse à différents stress et qu'il pourrait jouer un rôle essentiel dans la capacité des cellules cancéreuses à s'adapter aux multiples stress environnementaux auxquels elles sont exposées au cours de la tumorigenèse. / The ubiquitously expressed E4F1 protein acts as a transcription factor that binds a consensus DNA sequence at promoters, and as an atypical E3-ligase for the tumor suppressor p53. E4F1 physically interacts with several bona fide cellular tumor suppressors and viral oncoproteins (including p53, pRb, DRAL, RASSF1A, p19ARF, BMI1, HBX and GAM1...), suggesting that it might itself be involved in tumorigenesis. E4F1 genetic inactivation in transformed mouse embryo fibroblasts (Mefs) and in hematopoietic tumors deficient for the p53 pathway, results in massive cell death. Importantly, inactivation of E4F1 in normal cells does not affect cell survival. Genome wide approaches (ChIP-seq profiling and comparative transcriptomics performed on E4F1 WT and KO cells) identified a limited list (100) of genes that are bound and directly regulated by E4F1. Several E4F1 target genes code for mitochondrial proteins involved in mitochondria metabolism and homeostasis, including several components of the pyruvate dehydrogenase complex. Another set of E4F1 target genes codes for factors involved in DNA repair and damage checkpoints, including the checkpoint kinase CHK1. Accordingly, both mitochondrial and checkpoint functions are altered in E4F1 KO cells. In proliferating cells deficient for the p53 pathway, these defects lead to energetic and oxidative stresses, protein and DNA damages, and in fine, massive cell death. In p53-proficient cells, these alterations are attenuated and lead to growth arrest. Part of this protective effect of p53 is mediated by ALDH4a1, a p53 target gene encoding an aldehyde dehydrogenase involved in proline catabolism and that exhibits antioxidant properties.In this thesis, I also demonstrate that E4F1 protein level and activity is increased during cell transformation and upon exposure to genotoxic, energetic or oxidative stresses. These stresses also lead to E4F1 phosphorylation at specific serine residues that were identified by mass spectrometry. All together this work shows that E4F1 controls cellular functions that are important for mammalian cells metabolic homeostasis and stress responses, and that are essential for the survival of p53-deficient cancer cells. This work also suggests that E4F1 is activated in response to various stresses and therefore, that it could play an essential role in allowing cancer cells to adapt to environmental stresses.

L'arrivée des technologies de séquençage d’ADN à haut-débit a représenté une révolution dans le domaine de la génomique personnalisée, en raison de leur résolution et leur faible coût. Toutefois, ces nouvelles technologies présentent un taux d’erreur élevé, qui varie entre 0,1% et 1% pour les séquenceurs de seconde génération. Cette valeur est problématique dans le cadre de la recherche de variants de faible ratio allélique, comme ce qui est observé dans le cas des tumeurs hétérogènes. En effet, un tel taux d’erreur peut mener à des milliers de faux positifs. Chaque région de l’ADN étudié doit donc être séquencée plusieurs fois, et les variants sont alors filtrés en fonction de critères basés sur leur profondeur. Malgré ces filtres, le nombre d’artefacts reste important, montrant la limite des approches conventionnelles et indiquant que certains artefacts de séquençage ne sont pas aléatoires.Dans le cadre de cette thèse, nous avons développé un algorithme exact de recherche des motifs d’ADN dégénérés sur-représentés en amont des erreurs de séquençage non aléatoires et donc potentiellement liés à leur apparition. Cet algorithme a été mis en oeuvre dans un logiciel appelé DiNAMO, qui a été testé sur des données de séquençage issues des technologies IonTorrent et Illumina.Les résultats expérimentaux ont mis en évidence plusieurs motifs, spécifiques à chacune de ces deux technologies. Nous avons ensuite montré que la prise en compte de ces motifs dans l’analyse, réduisait considérablement le taux de faux positifs. DiNAMO peut donc être utilisé en aval de chaque analyse, comme un filtre supplémentaire permettant d’améliorer l’identification des variants, en particulier des variants à faible ratio allélique. / The advent of Next Generation DNA Sequencing technologies has revolutionized the field of personalized genomics through their resolution and low cost. However, these new technologies are associated with a relatively high error rate, which varies between 0.1% and 1% for second-generation sequencers. This value is problematic when searching for low allelic ratio variants, as observed in the case of heterogeneous tumors. Indeed, such error rate can lead to thousands of false positives. Each region of the studied DNA must therefore be sequenced several times, and the variants are then filtered according to criteria based on their depth. Despite these filters, the number of errors remains significant, showing the limit of conventional approaches and indicating that some sequencing errors are not random.In the context of this thesis, we have developed an exact algorithm for over-represented degenerate DNA motifs discovery on the upstream of non-random sequencing errors and thus potentially linked to their appearance. This algorithm was implemented in a software called DiNAMO, which was tested on sequencing data from IonTorrent and Illumina technologies.The experimental results revealed several motifs, specific to each of these two technologies. We then showed that taking these motifs into account in the analysis reduced significantly the false-positive rate. DiNAMO can therefore be used downstream of each analysis, as an additional filter to improve the identification of variants, especially, variants with low allelic ratio.

Les macrophages sont des cellules immunitaires innées présentes dans chaque organe. Ils sont des cibles thérapeutiques dans de nombreuses maladies, dont le cancer. En dépit de travaux récents sur l'origine des macrophages, les mécanismes régulant leur différenciation sont mal définis. L'expression de Jun, membre de la famille AP-1, augmente pendant la différenciation des macrophages, mais son rôle dans ce processus n'est pas connu.Au cours de mon doctorat, nous avons caractérisé le rôle de Jun dans le développement et l'homéostasie des macrophages, dans un modèle de souris avec délétion conditionnelle de Jun dans la lignée myéloïde (JunΔCsf1r). Nous montrons que Jun contrôle la différenciation, induite par CSF1, des monocytes en macrophages. In vivo, Jun régule l'accumulation de macrophages dérivés de monocytes dans les poumons et intestins. Les macrophages associés aux tumeurs (TAMs) jouent un rôle crucial dans la progression des cancers. L’absence de Jun freine la croissance d’un mélanome et la différenciation, induite par CSF1, des TAMs dérivés de monocytes qui participent à l’angiogénèse tumorale. Cependant, lors d'une inflammation aiguë, Jun n’affecte pas le recrutement de macrophages inflammatoires.En conclusion, nos résultats identifient Jun comme un régulateur central de la différenciation des macrophages. Dans un modèle de mélanome, les macrophages Jun-dépendants exercent des fonctions pro-tumorales. Le fait que Jun soit un régulateur sélectif du développement des macrophages dépendants de CSF-1 permettra de définir de nouvelles approches ciblant sélectivement la différenciation des macrophages, sans altérer les réponses immunitaires dépendantes des monocytes. / Macrophages are immune cells present in every organ. Given their variety of functions, macrophages are therapeutic targets in many diseases including cancer. Despite the research efforts to characterise their origins, the molecular mechanisms regulating macrophage differentiation are still poorly defined. Expression of the AP-1 factor, Jun, increases during differentiation, but its role in macrophage development is not known.During my PhD, we characterised how Jun affects macrophage development and homeostasis. We developed a conditional mouse model in which Jun is deficient in the myeloid lineage (JunΔCsf1r). We showed that Jun controls CSF1-mediated monocyte to macrophage differentiation, proliferation and survival. In vivo, Jun loss limits macrophage accumulation in lungs and intestine. Tumour-associated macrophages (TAMs) play critical roles in cancer progression. We observed that Jun deficiency dampens melanoma growth and the differentiation of CSF1-dependent monocyte-derived TAMs. We further showed that Jun-dependent TAMs mediate vessel normalisation in melanoma. During inflammation, Jun was dispensable for the recruitment of monocyte-derived inflammatory macrophages.Altogether, our results identify Jun as a master regulator of macrophage differentiation, without altering monocyte effector functions. In a melanoma model, we showed that Jun-dependent TAMs play tumour-promoting roles. Therefore, Jun is a selective regulator of CSF-1-dependent macrophage development, which is redundant during inflammation; this observation should help to define novel approaches to selectively target macrophage differentiation, without altering monocyte-dependent immune responses.

Les Lymphocytes T CD4 (LT CD4) sont des cellules du système immunitaire adaptatif extrêmement plastiques qui, en fonction des signaux présents dans le microenvironnement cellulaire, ont la capacité de se différencier en différentes sous-populations de LT CD4 possédant des fonctions distinctes. Ce processus est hautement régulé par l'expression de facteurs de transcription (FT) clés tels que T-Bet, GATA-3, RORgammaT et Foxp3, nécessaires à la mise en place des lignages Th1, Th2, Th17 et Treg respectivement. Néanmoins, ces protéines n'agissent pas seules, et d'autres facteurs de transcription sont nécessaires pour amplifier, soutenir et maintenir ces différents lignages. Chaque lignage permet de lutter efficacement face à différents types de pathogènes ; toutefois, si la réponse immune n'est pas adaptée, ils peuvent également être responsables du développement de maladies auto-immunes. Afin de mettre en évidence les voies de signalisation et les facteurs de transcription impliqués dans la différenciation des LT CD4 pathogènes, nous avons utilisé le modèle de l'Encéphalomyélite Auto-immune Expérimentale (EAE), un modèle murin de Sclérose En Plaques (SEP). Dans ce modèle, nous avons mis en évidence le rôle clef de deux facteurs de transcription, Foxo3 et Eomes, dans la différenciation des LT CD4. En effet, les souris déficientes en Foxo3 développent une EAE moins sévère que les souris WT, et cette moindre sévérité de la maladie est associée à une proportion réduite de cellules productrices d'IFN-gamma et de GM-CSF in vivo, suite à l'immunisation. L'analyse du transcriptôme des souris Foxo3KO et WT a révélé que la déficience en Foxo3 a pour conséquence une diminution drastique de l'expression du FT Eomes. Bien que cette protéine soit nécessaire à la mise en place des réponses cytotoxiques dans les LT CD8 et les NK, son rôle précis dans les LT CD4 reste peu connu. D'un point de vue moléculaire, nous avons pu prouver, par des techniques d'Immuno-Précipitation de la Chromatine (ChIP) et des analyses de gènes rapporteurs, que le FT Eomes est un gène cible direct de Foxo3 dans les LT CD4.[...] / CD4 T cells are extremely plastic, and depending on the cytokines that are present within the microenvironment, they have the ability to differentiate into several subpopulations. This process is finely regulated by the expression of Master Regulator of each lineage such as T-Bet, GATA-3, RORgammaT and Foxp3, that are mandatory for the differentiation of Th1, Th2, Th17 and Treg cells respectively. However, they do not act alone, and several other transcription factors are required to stabilize, amplify and lock CD4 T cell lineages. Each subpopulation of CD4 T cells is highly specialized in the elimination of particular types of pathogen; however, in case of dysregulation of the immune response, they can also be involved in the development of autoimmune diseases. In order to determine how such properties are acquired by pathogenic CD4 T cells, we used the Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) model which mimic Multiple Sclerosis pathology. In this model, we identified two transcription factors, Foxo3 and Eomes, that are critical for the differentiation of a particular and highly pathogenic subset of CD4 T cell. Indeed, Foxo3-deficient mice develop a less severe disease as compared to WT littermate and this decreased disease severity is associated with a decreased proportion of IFN-gamma and GM-CSF producing cells. Transcriptomic analysis of Foxo3KO versus WT CD4 T cells revealed that the most downregulated gene within Foxo3KO CD4 T cells is Eomes, which is essential for/to the acquisition of cytotoxic functions and production of IFN-gamma by NK and CD8 T cells. At the molecular level, using Chromatin Immuno-Precipitation experiments and Luciferase assays, we showed that Eomes is a direct target gene of Foxo3 in CD4 T cells. Then, in order to determine which of the downregulated gene is responsible for the decreased production of IFN-gamma and GM-CSF, we decided to overexpress Eomes in Foxo3KO CD4 T cells. Eomes overexpression restored IFN-gamma and, to a lesser extent, GM-CSF production by CD4 T cells, thus indicating that Eomes is involved in IFN-gamma and GM-CSF regulation in CD4 T cells.[...]