Dehidroepiandrosterona (DHEA) é um hormônio esteroide secretado pelas glândulas adrenais, gônadas e cérebro, que juntamente com sua forma sulfatada (DHEAS) constituem os esteroides mais abundantes da circulação. É um importante precursor para hormônios sexuais e exerce funções diretas sob diversos sistemas do corpo, dentre eles, o sistema imune. A relação entre sistema endócrino e imune já é bem estabelecida, tendo hormônios a capacidade de modular a resposta imune e vice-versa. Dentre os componentes da resposta imune, estão os neutrófilos, importantes células da imunidade inata que reconhecem e eliminam patógenos através de diversos mecanismos efetores como fagocitose, produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), desgranulação, neutrophil extracellular traps (NETs). Já é descrito que o avanço da idade é acompanhado pela redução dos níveis plasmáticos de DHEA, assim como a redução da atividade efetora de neutrófilo, podendo estes dois mecanismos estarem relacionados com estado de senescência e aumento da suscetibilidade de idosos à infecções. Porém, poucos estudos existem mostrando relação entre DHEA e neutrófilos. Desta forma, o objetivo do nosso trabalho, foi avaliar a influência do hormônio DHEA nas diversas funções efetoras de neutrófilos. Para tanto, neutrófilos humanos isolados do sangue periférico foram submetidos a um pré-tratamento com DHEA e infectado com Salmonella enterica serovar Typhimurium ou estimulados com LPS. Observamos que o tratamento prévio dos neutrófilos com 0,01 ?M de DHEA é capaz aumentar a fagocitose da S. Typhimurium, assim como aumento da atividade microbicida destas células. Para investigar o mecanismo pelos quais a capacidade microbicida foi aumentada, avaliamos a produção de EROs e formação de NETs. Curiosamente o hormônio não influenciou em nenhum destes processos. Então, por fim, avaliamos o perfil de produção de citocinas in vitro produzidas pelos neutrófilos tratados com DHEA e infectados com S. Typhimurium ou estimulados com LPS (lipopolissacarídeo). Nosso estudo mostrou que os neutrófilos infectados ou estimulados reduzem a produção de quimiocinas como IL-8, MIP-1? e MIP-1?, quando comparados aos neutrófilos sem tratamento. Em adição, neutrófilos tratados com esteroide e estimulados com LPS tiveram a produção de TNF-? reduzida, a produção da IL-4 foi aumentada nos neutrófilos tratados com DHEA e infectados e a relação entre IFN-?/IL-4 foi reduzida. Nossos dados mostram que o DHEA pode estar contribuindo para o controle da infecção por S. Typhimurium, principalmente através da fagocitose e killing intracelular. Apesar dos dados de citocinas mostrarem que o DHEA está direcionando a resposta de neutrófilos para um caráter menos inflamatório, acreditamos que este possa ser um mecanismo protetor ao organismo, a fim de evitar uma resposta inflamatória exacerbada que poderia causar lesões teciduais. Concluímos então, que o DHEA é um importante esteroide com atividades imunorreguladoras que podem estar contribuindo para o controle da infecção por S. Typhimurium, porém mais estudos são necessários para o entendimento dos mecanismos utilizados por este esteroide para modular a resposta de neutrófilos, células tão importantes ao organismo humano. / Dehydroepiandrosterone (DHEA) is a steroid hormone secreted by the adrenal glands, gonads and brain, which along with its sulfated form (DHEAS) are the most abundant circulating steroid. It is an important precursor to sex hormones and exerts direct roles in several body systems, including the immune system. The relationship between the endocrine and immune system is already well established, with the hormone modulating the immune response and vice versa. Among the components of the immune response, neutrophils are important innate immunity cells that recognize and eliminate pathogens through various effector mechanisms such as phagocytosis, production of reactive oxygen species (ROS), degranulation, neutrophil extracellular traps (NETs). It is reported that advanced age is accompanied by the reduction of plasma levels of DHEA as well as the reduction of the effector activity of neutrophils, these two mechanisms may be related to the state of senescence and increase in susceptibility of the elderly to infections. However, few studies exist showing the relationship between DHEA and neutrophils activity. Thus, the aim of our study was to evaluate the influence of the hormone DHEA in the several effector functions of neutrophils. To that end, human neutrophils isolated from peripheral blood were subjected to a treatment with DHEA and infected with Salmonella enterica serovar Typhimurium or stimulated with LPS (lipopolysaccharide). We observed that the treatment of neutrophils with 0.01 ?M of DHEA can increase phagocytic rates of S. Typhimurium, as well as increase the microbicidal activity of these cells. To investigate the mechanism by which the microbicidal capacity has been increased, we evaluated the production of ROS and formation of NETs. Interestingly the hormone did not influence in any of these processes. Then, we finally evaluated in the cytokine production profile produced by neutrophils treated in vitro with DHEA and infected with S. Typhimurium or stimulated with LPS. Our study showed that pré-treated and infected neutrophils or LPS-stimulated cells reduced the production of chemokines such as IL-8, MIP-1? and MIP-1? compared to untreated neutrophils. In addition, when steroid treated neutrophils were stimulated with LPS, a reduced TNF-? production was observed and the levels of IL-4 was increased in treated neutrophils with DHEA and infected with S. Typhimurium. The ratio of IFN-? / IL-4 was reduced. Our data show that DHEA may be contributing to the control of infection by S. Typhimurium, mainly by phagocytosis and intracellular killing. Although cytokines data show that DHEA is directing the neutrophil response to a less inflammatory response, and we believe that this may be a protective mechanism of the organism in order to avoid an exacerbated inflammatory response that could cause tissue damage to the body. We conclude then, that DHEA is a steroid with important immunoregulatory activities that may be contributing to the control of infection by S. typhimurium, but more studies are needed to understand the mechanisms used by this steroid to modulate neutrophil response, cells so important to the human body.

FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / Os acidentes ofÃdicos de serpentes representam um sÃrio problema de SaÃde PÃblica nos paÃses tropicais, tanto pela freqÃÃncia com que ocorrem e/ou pela morbi-mortalidade que ocasionam. As serpentes do gÃnero Crotalus estÃo representadas no Brasil pela espÃcie Crotalus durissus, a qual se divide em seis subespÃcies. Nosso trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos dos venenos das serpentes Crotalus durissus cascavella originadas do estado do Cearà (Cdcc) e MaranhÃo (Cdcm); Crotalus durissus collilineatus (Cdcol); Crotalus durissus ruruima (Cdru) e suas fraÃÃes, Crotoxina (CTXru) e Fosfolipase A2 (PLA2ru), nos processos biolÃgicos de espraiamento celular, fagocitose, atividade fungicida e alteraÃÃes hematolÃgicas. Camundongos Swiss, machos, foram inoculados por via intraperitonial com os venenos descritos acima, nas doses de 120, 50, 27, 20 (venenos) e 10Âg/Kg (fraÃÃes), respectivamente. Duas horas apÃs inoculaÃÃo foram coletadas amostras de sangue do plexo orbital e o exsudato peritonial. A anÃlise estatÃstica utilizada foi o teste t de Student com significÃncia de 95%. Os animais tratados foram comparados com o grupo controle (inoculados com salina 0,9%). Cdcm e a CTXru causaram as maiores alteraÃÃes no eritrograma. 37,5% dos eritrÃcitos apresentaram morfologia macrocÃtica e microcÃtica; 25,5% hipocrÃmia; 25% com anisocitose e presenÃa de policromasia. Foram observados 16,8% de corpÃsculos de Howell Jolly. A contagem global de leucÃcitos foi reduzida significantemente apÃs administraÃÃo do Cdcc (82,9%), Cdcm (70,1%) e Cdru (83,8%). A celularidade foi alterada depois da inoculaÃÃo de Cdcc, Cdru e CTXru, em todos os tipos de cÃlulas. A contagem global de cÃlulas do peritÃnio aumentou apÃs inoculaÃÃo de Cdcc, Cdcol, Cdru e a CTXru. Em adiÃÃo, o macrÃfago foi à cÃlula predominante na contagem diferencial de cÃlulas peritoniais, contudo, somente a Cdcol apresentou significÃncia estatÃstica para macrÃfago (62,3%). Foi encontrada reduÃÃo significativa do espraiamento celular depois da administraÃÃo de todos os venenos variando de 52,7 a 65,7%. A fagocitose foi estatisticamente reduzida pela Cdcc nos perÃodos de 30, 60, 90 e 120 minutos. Cdru reduziu a fagocitose apenas em 30, 60 e 120 minutos, Cdcm em 30 e 90 minutos e CTXru nos tempos de 60 e 120 minutos. A Cdcol, e a CTXru mostraram significÃncia na atividade fungicida contra C. albicans nos perÃodos de 30, 60, 90 e 120 minutos, mas a Cdcc mostrou resultado similar em 60, 90 e 120 minutos. Conclui-se que o veneno interfere diferentemente na resposta hematolÃgica e funcional. Em adiÃÃo pode-se postular que os macrÃfagos foram responsÃveis por estas alteraÃÃes. Estudos futuros deverÃo ser realizados na perspectiva da identificaÃÃo de provÃvel aÃÃo fungicida de venenos ofÃdicos e suas fraÃÃes / Venomous snake accidents represent a serious public health problem in tropical countries, as much as for their frequency of occurrence and/or morbidity and mortality that they caused. In Brazil, the genus Crotalus comprise only one species, termed Crotalus durissus, which is divided into six subspecies. The aim of our study was to evaluate the effects promoted by venoms of Crotalus durissus cascavella, originated from the States of Cearà (Cdcc) and MaranhÃo (Cdcm); C. durissus collilineatus (Cdcol); C. durissus ruruima (Cdru) and its isolated components, such as crotoxin (CTXru) and phospholipase A2 (PLA2ru), in the biological processes of cellular spreading, phagocytosis, hematological alterations and antifungal activity. Male Swiss mice were inoculated intraperitoneally with the venom doses of 120, 50, 27, 20, 10 and 10 Âg/Kg, respectively to the snakes described above. After two hours of inoculation blood samples and exudate were collected from orbital plex and peritoneum, respectively. Statistical evaluation was performed using Student-T test with significance level set at 95%. We compared the treated animals with a control group, where animals were inoculated with saline 0.9%. Cdcm and CTXru caused the most severe alterations in the erythrogram. We noticed that 37.5% of the erythrocytes showed macrocytic and microcytic morphology; 25.5% were hipocromic; 25% showed anisocytosis and the presence of polycromasia. We also found Howell Jolly bodies in 16.8% of the examined erythocytes. The total counting of leukocytes was reduced statistically after administration of Cdcc (82.9%), Cdcm (70.1%) and Cdru (83.8%). Cellularity was altered after the inoculation of Cdcc, Cdru and CTXru for all evaluated cells. We noticed a statistic increase of peritoneum total cells caused by Cdcc, Cdcol, Cdru and CTXru. In addition, macrophage was the most predominant cell after peritoneum differential cell counting. However, only Cdcol showed a statistic increase of macrophages (62.3%). We found significant reduction of cellular spreading after administration of all venoms ranging from 52.7 to 65.7%. Phagocytosis was statistically reduced by Cdcc in the periods of 30, 60, 90 and 120 minutes. However, Cdru reduced phagocytosis only at 30, 60 and 90 minutes, Cdcm decreased phagocytosis at 30 and 90 minutes and CTXru in the periods of 60 and 120 minutes. Cdcol and CTXru showed significant fungicide activity against C. albicans in the periods of 30, 60, 90 and 120 minutes, but Cdcc showed similar results at 60, 90 and 120 minutes. We conclude that distinct venoms interfered differently in the intensity of each functional and hematological response. In addition, we postulate that macrophages maybe partially responsible for these alterations. Further studies should be evaluated for the use of venoms as fungicides

PGC-1 é uma família de coativadores de fatores de transcrição que controlam a expressão de diversos genes envolvidos na homeostase energética celular. As isoformas PGC-1 e estão presente em tecidos com alto metabolismo oxidativo e são capazes de aumentar biogênese mitocondrial, -oxidação de ácidos graxos e gliconeogênese em resposta à exposição ao frio, jejum e exercício. Inicialmente mostramos que macrófagos in vitro aumentaram a expressão de PGC-1 após 1h da exposição à zymosan. Com isso, hipotetizamos que PGC-1 poderia ter sua expressão aumentada em resposta a um insulto bacteriano. Para verificar nossa hipótese analisamos a expressão de PGC-1 em um modelo de pancreatite aguda (PA), caracterizada por uma forte resposta inflamatória estéril inicial, seguida, após poucos dias, por translocação bacteriana intestinal e infecção disseminada. PA foi induzida por infusão retrograda de taurocolato de sódio (2,5%). Também analisamos PGC-1 em um modelo de sepse por ligadura e perfuração cecal (CLP), cujo conteúdo intestinal é depositado no peritôneo, causando infecção grave local e disseminada. Animais tratados com Imipenem durante 48h após PA também foram analisados, bem como a interferência de PGC-1 ASO no processo de fagocitose. A expressão de PGC-1 e foi medida por PCR quantitativo. PA foi confirmada pelo aumento da amilase sérica e a inflamação sistêmica ratificada por leucocitose. PGC1 aumentou no baço e nos leucócitos circulantes 48h após PA e no lavado peritoneal 24h após PA e CLP. No entanto, PGC1 diminuiu no baço 24h após PA. Tratamento com Imipenem diminuiu PGC- 1. A diminuição de PGC-1 após transfecção com ASO levou à redução do processo de fagocitose. Assim, concluímos que ocorre aumento de PGC-1 na presença de bactérias e esse aumento está relacionado com fagocitose / PGC1 is a family of transcriptional coactivators that controls the expression of several genes involved in cell energy homeostasis. PGC1 isoforms and are present in tissues with high oxidative metabolism and are able to enhance mitochondrial biogenesis, -oxidation of fatty acids and gluconeogenesis in response to exposure to cold, fasting and exercise. Initial results showed macrophages in vitro present increased PGC-1 expression after 1h exposure to zymosan. Thus, we hypothesized that PGC-1 could be up-regulated in response to bacterial insult. We tested our hypothesis following PGC-1 expression in an acute pancreatitis (AP) model, characterized initially by a strong sterile inflammatory response, followed, few days later, by bacterial intestinal translocation and disseminated infection. AP was induced by retrograde infusion of sodium taurocholate (2.5%). We also analysed PGC-1 in a model of sepsis by cecal ligation and puncture (CLP), whose intestinal content is deposited in the peritoneum, causing a severe local and disseminated infection. Animals submitted to PA and treated with Imipenem for 48 hours were also analyzed, as well as the interference of PGC-1 ASO in phagocytosis process. PGC-1 and expression were measured by quantitative PCR. AP was confirmed by increased blood amylase and the systemic inflammation was noted by leukocytosis after 48h. PGC1 was increased in spleen and circulating leukocytes 48h after AP and in peritoneal lavage 24h after AP and CLP. On the other hand, PGC1 was decreased in spleen 24h after AP induction. Imipenem treatment decreased PGC-1. The decreased of PGC-1 after ASO transfection led to a reduction of phagocytosis process. Thus, we conclude there is a PGC-1 increase in bacterial presence and this increase is related to phagocytosis

A mudança anual de penas é um componente crítico do ciclo biológico de todas as espécies de aves e pode modificar as respostas imunológicas individuais, sendo que suas consequências são pouco estudadas. Neste contexto, uma vez que são escassos os estudos acerca do perfil clínico e parâmetros imunológicos de pinguins-de-Magalhães em diferentes fases da muda, este estudo propôs avaliar determinados aspectos relacionados a esses perfis, em animais mantidos em ambiente controlado. Foram estudados 21 indivíduos adultos (dez machos e 11 fêmeas) e os parâmetros avaliados foram: teste de hipersensibilidade cutânea tardia à fitohemaglutinina (FHA) com a avaliação histopatológica de biópsias que incluíram a análise qualitativa e quantitativa dos tipos celulares presentes na reação e no controle às 6, 24 e 48 horas; parâmetros clínicos (massa corpórea e hematologia); fagocitose e burst oxidativo; fenotipagem e resposta linfoproliferativa. O teste de FHA demonstrou diferença significativa na espessura da membrana interdigital de ambas as patas inoculadas com FHA e com o controle (PBS) quando comparadas antes da inoculação e antes da biópsia às 24 e 48 horas. A análise histomorfométrica revelou não haver diferenças significativas na frequência relativa de granulócitos (heterófilos/ eosinófilos), linfócitos, macrófagos ou trombócitos entre as patas inoculadas com FHA e PBS em nenhum dos momentos analisados. Este resultado sugere que a diferença na espessura da membrana interdigital das patas inoculadas seja em decorrência do edema e não do infiltrado inflamatório. Para analisar os efeitos do ciclo da muda nos parâmetros clínicos e hematológicos, os animais foram divididos em três grupos: pré-muda (-5 a 0 dias da muda), muda (10º ao 21º dia da muda) e padrão basal (>120 dias da muda). Os resultados mostraram que em relação ao momento basal: houve aumento significativo na massa corpórea dos animais no momento da pré-muda; diminuição significativa de proteínas totais, hematócrito, eritrócitos totais e leucócitos totais na pré-muda e muda. Não houve diferença no número total de monócitos e heterófilos, contudo, houve eosinofilia e linfopenia na pré-muda e muda, respectivamente. Com relação aos parâmetros imunológicos, houve aumento no burst oxidativo gerado pelo estímulo biológico (Staphylococcus aureus) na pré-muda em relação à muda e ao padrão basal; ocorreu aumento do burst oxidativo gerado pelo estímulo químico (éster de forbol) na pré-muda em relação à muda. Em relação à fagocitose, houve diminuição desta capacidade dos leucócitos dos animais na pré-muda e muda em relação ao padrão basal quando o agente foi bacteriano; entretanto, o mesmo não foi observado para a fagocitose de leveduras (Zymosan A); houve diminuição de linfócitos T CD4+ circulantes na pré-muda e muda em relação ao padrão basal e o índice de proliferação de linfócitos aumentou durante o período de muda em relação ao basal. Esses resultados tomados em conjunto sugerem que as mudanças fisiológicas observadas durante o ciclo da muda interferem na modulação de parâmetros imunológicos e são sugestivas de serem consequência do prejuízo energético sofrido, mesmo em animais mantidos em ambientes controlados / The annual replacement of feathers is a critical component of the biological cycle of all bird species. Molt can modify their individual immune response, and the consequences of this are not well known. Within this context, and the few studies on the clinical profile and immunological parameters of Magellanic penguins at different stages of their molt, this study aimed to evaluate certain aspects related to the clinical profiles of animals kept in a controlled environment. A total of 21 adult individuals (ten males and 11 females) was analyzed and the parameters evaluated in this study were: delayed-type hypersensitivity test to phytohemagglutinin (PHA) based on the histopathological evaluation of foot web biopsies that included qualitative and quantitative analysis of cell types present in the essay and control at 6, 24 and 48 hours; clinical parameters (body mass and hematology); phagocytosis and oxidative burst; phenotyping and lymphoproliferative response. The PHA test showed significant differences in the thickness of the webbing of both feet inoculated with PHA and control (PBS), when compared before inoculation and before biopsy at 24 and 48 hours. Histomorphometric analysis revealed no significant differences in the relative frequencies of granulocytes (heterophils/ eosinophils), lymphocytes, macrophages, thrombocytes, or between the feet inoculated with PHA and with PBS in any of the samples. This result suggests that the difference in thickness of the foot webbing is due to edema and not an inflammatory infiltrate. To analyze the effects of the molting cycle on clinical and hematological parameters, the birds were divided into three groups: pre-molt (from -5 days to the start of the molt, day 0), molt (10th to 21st days of molt) and baseline (>120 days after the completion of the molt). The results showed that in comparison with baseline values: a significant increase in body mass occurred during pre-molt; and a significant decrease in total protein, hematocrit, total erythrocytes and total leukocytes occurred during pre-molt and molt. There was no difference in the total numbers of monocytes and heterophils, however, there were eosinophilia and lymphopenia during pre-molt and molt, respectively. There was an increase in the oxidative burst generated by the biological stimulus (Staphylococcus aureus) in the pre-molt compared to molt and baseline levels; and there was an increased oxidative burst generated by the chemical stimuli (phorbol esters) in the pre-molt in relation to the molt. There was a decreased capacity of phagocytosis for the leukocytes in animals during pre-molt and molt compared to baseline when the agent was bacterial; however, this was not observed for the phagocytosis of yeast (Zymosan A). There was a decrease of circulating CD4+ T lymphocytes in the pre-molt and molt compared to baseline, and the lymphocyte proliferation index increased during the molt compared to baseline. The results suggest that the physiological changes observed during the molt cycle does interfere with the modulation of immune parameters, and are suggestive of resulting as a consequence of from the high energy demands of molt, even for birds kept in controlled environments

Benzodiazepínicos (BDZ) são fármacos ansiolíticos que se caracterizam por atuar em receptores GABAa presentes no sistema nervoso central. Além dos receptores centrais os BDZ também possuem afinidade por sítios ligantes periféricos presentes em vários tecidos, dentre eles nas glândulas adrenais e em células polimorfonucleares. O presente experimento analisou os efeitos de BDZ sobre a atividade de neutrófilos e sobre os níveis séricos de corticosterona de ratos. Especificamente, o burst e a fagocitose de neutrófilos foram estudados após o tratamento ex vivo e in vitro com diazepam, RO 5-4864, clonazepam e/ou PK 11195. Os efeitos do diazepam sobre a atividade de neutrófilos também foram avaliados após o uso prolongado deste fármaco. Finalmente, os efeitos in vitro dos BDZ foram estudados após a incubação com um bloqueador do canal de cálcio (Ca2+) o L-verapamil. Os resultados mostraram que (1) o tratamento agudo ex vivo com diazepam (10 mg/kg) produziu um aumento do burst oxidativo e da fagocitose induzida por PMA, LPS e Staphylococcus aureus; (2) o tratamento prolongado (21 dias) com diazepam (10 mg/kg) produziu um aumento do burst oxidativo induzido pelos mesmos estímulos e reduziu a fagocitose dos neutrófilos (porcentagem e intensidade); (3) o tratamento agudo ex vivo com diazepam, mas não o prolongado, aumentou os níveis séricos de corticosterona; (4) os efeitos da adição in vitro de diazepam (100 nM) foram na mesma direção daqueles observados após o tratamento agudo; (5) o RO 5-4864 (100 nM) induziu in vitro efeitos similares aos obtidos ex vivo (10 mg/kg) e in vitro (100 nM) com diazepam; (6) o tratamento ex vivo com clonazepam (10 mg/kg) diminuiu o burst oxidativo de neutrófilos induzido por PMA, LPS e Staphylococcus aureus enquanto que o tratamento com este fármaco na dose de 1 mg/kg aumentou o burst oxidativo destas células frente a todos os estímulos; (7) o tratamento ex vivo (1 e 10 mg/kg) e in vitro (100 nM) com clonazepam não alterou a fagocitose de neutrófilos; (8) os efeitos da adição in vitro de clonazepam sobre a atividade de neutrófilos vão na mesma direção daqueles observados após o tratamento ex vivo na dose de 1 mg/kg; (9) o clonazepam (1 e 10 mg/kg) aumentou os níveis séricos de corticosterona; (10) a adição in vitro do PK 11195 (100 nM) per se ou associado com diazepam (100 nM) ou RO 5-4864 (100 nM) aumentou o burst oxidativo e diminuiu a fagocitose realizada pelos neutrófilos; (11) a adição in vitro do PK 11195 (100 nM) associado com o clonazepam (100 nM) diminuiu o burst oxidativo induzido por PMA e diminuiu a fagocitose realizada por estas células; finalmente, (12) a pré incubação por 2 minutos com L-verapamil (100 nM) bloqueou todos os efeitos do diazepam sobre a atividade de neutrófilos estimulada por PMA, LPS e Staphylococcus aureus e reverteu os efeitos do RO 5-4864 no burst oxidativo induzido por PMA. Esses resultados sugeriram que os efeitos dos BDZ não estão relacionados com a ativação de PBR nas células da glândula adrenal e também que eles não estão relacionados a um aumento dos níveis séricos de corticosterona. Indicaram que os BDZ tenham produzido mudanças na concentração do Ca2+ intracelular dos neutrófilos através da ativação de PBR seguida de um aumento da permeabilidade da membrana plasmática ao Ca2+ através da abertura de canais sensíveis ao L-verapamil, permitindo a entrada do Ca2+. Os diferentes efeitos dos BDZ sobre o burst oxidativo e a fagocitose de neutrófilos foram atribuídos a ações específicas deste fármaco em subtipos de PBR presentes nos neutrófilos e nas membranas mitocondriais. Finalmente, os resultados sugeriram o desenvolvimento de tolerância aos efeitos do diazepam sobre os níveis séricos de corticosterona mas não sobre a atividade de neutrófilos. / Benzodiazepines (BDZ) exert their anxiolytic effects via specific binding sites coupled to neuronal GABAa receptors. They also affect a second, pharmacologically different type of receptor, which has been found in many sites such as blood polimorphonuclear cells and adrenals. The present experiment was designed to analyze the effects of BDZ on neutrophil activity and corticosterone serum levels in rats. Specifically, neutrophil oxidative burst and phagocytosis were studied after ex vivo and in vitro treatments with diazepam, Ro 5-4864, clonazepam and/or PK 11195. Diazepam effects on neutrophil activity were also taken after long-term treatment. Finally, in vitro effects of BDZ were studied after incubation with L-verapamil, a Ca2+ channel blocking agent. Results showed that (1) acute and ex vivo diazepam (10.0 mg/kg) treatment induced an increment on PMA, LPS and Staphylococcus aureus induced oxidative burst and phagocytosis (2) long-term (21 days, 10 mg/kg/day) diazepam treatment increased the oxidative burst induced by the same stimuli and reduced both intensity of phagocytosis and the percentage of neutrophil performing phagocytosis; (3) acute and ex vivo diazepam treatment, but not long-term diazepam treatment increased corticosterone serum levels; (4) the effects induced by in vitro addition of diazepam (100 nM) were in the same direction of those observed after acute treatment; (5) Ro 5-4864 (100 nM) induced similar effects to those of diazepam after ex vivo (10.0 mg/kg) and in vitro (100 nM) treatments; (6) ex vivo (10.0 mg/kg) clonazepam treatment decreased the neutrophil oxidative burst induced by PMA and S. aureus after a 1.0 mg/kg dose and decreased these parameters after a higher (10 mg/kg) dose; (7) ex vivo (1.0 and 10.0 mg/kg) and in vitro (100 nM) clonazepam treatments did not change neutrophil phagocytosis; (8) in vitro clonazepam (100 nM) induced effects on neutrophil activity that were in the same direction of those observed after the 1.0 mg/kg dose (9) clonazepam (1.0 and 10.0 mg/kg) increased corticosterone serum levels; (10) in vitro PK 11195 (100 nM) per se or associated with diazepam (100 nM) or Ro 5-4864 (100 nM) increased PMA, LPS and S. aureus induced neutrophil oxidative burst and decreased cell phagocytosis; (11) in vitro PK 11195 (100 nM) together with clonazepam (100 nM) decreased PMA-induced oxidative burst and decreased S. aureus phagocytosis; finally, (12) in vitro L-verapamil (100 nM) incubation for 2 minutes prevented all effects induced by diazepam on PMA, LPS and S. aureus -induced neutrophil activity and reverted the effects induced by Ro 5-4864 (100 nM) on PMA-induced oxidative burst. These results suggest that BDZ effects on neutrophil activity were not related to PBR activation within the adrenal gland cells, leading to increments on corticosterone serum levels. They suggest instead that BDZ induced [Ca2+]i changes in neutrophils through PBR activation followed by an increase in plasma membrane permeability due to L-verapamil sensitive Ca2+ channels and subsequent extracelular Ca2+ entry. The differences of BDZ effects on neutrophil oxidative burst and phagocytosis were attributed to specific actions on different PBR subtypes present on neutrophil and mitochondrial membranes. Finally, results suggest the development of tolerance to diazepam effects on corticosterone serum levels but not on neutrophil activity.

Os efeitos de EPA e DHA sobre a função de neutrófilos foram comparados. Para isso, foram realizados experimentos em neutrófilos isolados de ratos. Foram analisadas células com a membrana plasmática íntegra e fragmentação de DNA com o intuito de determinar as concentrações não tóxicas de EPA e DHA. Aumento da produção de peróxido de hidrogênio ocorreu a partir de concentrações menores de DHA (50 <font face=\"Symbol\">mM comparado com 100 <font face=\"Symbol\">mM de EPA). Já para a produção de ânion superóxido, EPA estimulou em doses menores (12.5 <font face=\"Symbol\">mM e o DHA em 100 <font face=\"Symbol\">mM). Ambos AGs aumentaram a síntese e liberação das citocinas CINC-2 e TNF-<font face=\"Symbol\">&#945 e não modificaram a produção de IL1-<font face=\"Symbol\">b e óxido nítrico após incubação das células por 18 horas. Somente DHA elevou a capacidade fagocitária e a atividade fungicida dos neutrófilos. EPA e DHA apresentaram efeitos distintos na produção de citocinas, fagocitose e atividade fungicida dos neutrófilos. Já na produção das EROS, EPA e DHA apresentaram efeitos similares, embora em concentrações diferentes. / The effects of eicosapentaenoic (EPA) and docosahexaenoic (DHA) on neutrophil function were compared. For this purpose, experiments were performed in isolated rat neutrophils. Cells with intact plasma membrane and DNA fragmentation were analyzed in order to determine the non-toxic concentrations of EPA and DHA. Production of H2O2 was increased in lower concentrations of DHA (50 <font face=\"Symbol\">mM compared to 100 <font face=\"Symbol\">mM of EPA). For production of O2 -, EPA stimulated at lower doses (12.5 <font face=\"Symbol\">mM compared to 100 <font face=\"Symbol\">mM of DHA). Both FAs increased synthesis and release of cytokines, CINC-2 and TNF-<font face=\"Symbol\">&#945, and did not change the production of IL-1<font face=\"Symbol\">b and nitric oxide after incubation of the cells for 18 hours. Only DHA increased the phagocytic capacity and fungicidal activity of neutrophils. These FAs showed distinct effects on cytokine production, phagocytosis capacity and fungicidal activity by neutrophils. For production of ROS, both EPA and DHA had similar actions, although at different concentrations.

A imunidade inata é um mecanismo ativado rapidamente para permitir a defesa do organismo contra injúrias de diferentes origens. No entanto, a exacerbação do processo inato é prejudicial ao hospedeiro e pode levar a cronicidade do processo. Os neutrófilos são as células importantes na resposta inata, que após exercerem suas ações no processo, devem ser eliminadas para o retorno da homeostasia. Nesta fase, os neutrófilos entram em apoptose e são fagocitados por macrófagos residentes. O ácido clorogênico (ACG) é componente frequente de alimentos, em especial em grãos, e apresentam propriedades anticancerígenas, antimutagênicas, antipiréticas, antifúngicas, antioxidantes, analgésicas e anti-inflamatórias. Neste último contexto, as ações do ACG na instalação do processo têm sido bem demonstradas, mas seu potencial de interferir com a resolução da inflamação ainda é fragmentária. Desta forma, o presente trabalho visou avaliar os mecanismos de ação do ACG na resolução da inflamação, focando nos mecanismos de morte dos neutrófilos, de fagocitose e \"killing\" de macrófagos. Para tanto, foram empregados camundongos, adultos, machos da linhagem Swiss. Neutrófilos peritoneais foram recrutados 4 horas após injeção local de glicogênio de ostra 1% e macrófagos peritoneais foram obtidos 96 horas após a injeção local de tioglicolato de sódio a 3%. Os resultados obtidos mostraram que o tratamento com ACG por 24 horas, na concentração 1, 10, 50 e 100 mM, aumentou a porcentagem de número de neutrófilos apoptóticos e não alterou a porcentagem de neutrófilos em necrose; a incubação de ACG por 1 hora, na concentração 1, 10, 50 e 100 mM, com macrófagos peritoneais aumentou a capacidade destas células fagocitarem neutrófilos apoptóticos; reduziu a secreção do tumor de necrose tumoral (TNF-alfa), não alterou a secreção de interleucina-10 e não interferiu com as expressões de MHC-II e de CD36. Em conjunto, os dados obtidos sugerem que o ACG pode controlar a resolução da inflamação por induzir a apoptose de neutrófilos e a fagocitose destes por macrófagos. / Innate immunity is a rapidly activated mechanism to allow the body\'s defense against injuries from different origins. However, exacerbation of innate process is detrimental to the host and can lead to chronic process. Neutrophils are important cells in innate response, which after performing their actions in the process, should be eliminated for the return of homeostasis. At this stage, the neutrophils undergo to apoptosis and are phagocytosed by resident macrophages. The chlorogenic acid (CGA) is a frequent component of foods, in particular grain, and it has anticancer, antimutagenic, antipyretic, antifungal, antioxidant, anti-inflammatory and analgesic properties. In this latter context, the actions of the ACG in the initial phases of the inflammatory process have been well documented, but its potential to interfere with the resolution of inflammation is still fragmented. Thus, the present study aimed to evaluate the mechanisms of action of ACG in the resolution of inflammation, focusing on mechanisms of neutrophil death and phagocytosis of macrophages. Hence, Swiss adult, male mice were employed as donor of neutrophils and macrophages. Peritoneal neutrophils were recruited 4 hours after local injection of 1% oyster glycogen and used for assessment of cell death mechanism, besides being used as apoptotic cells to be phagocyted. Peritoneal macrophages recruited 96 hours after the injection of 3% thioglycollate medium were used to 1) phagocytosis assay 2) Quantification of inflammatory mediators in the supernatant 3) quantification of MHC-II and CD36. The results showed that treatment with ACG, during 24 hours, at concentrations of 1, 10, 50 or 100 mM increased the percentage of apoptotic neutrophils and did not induced necrosis; incubation of macrophages during 1 hour with 1, 10, 50 or 100 mM increased the capacity of these cells to phagocyte apoptotic neutrophils; reduced tumor secretion of tumor necrosis factor (TNF-alpha) and did not alter the secretion of interleukin-10, and did not interfere with the expression of MHC-II and CD36. Together, these data suggest that the ACG can control the resolution of inflammation, by interfering with events in neutrophils and macrophages.

No início da lactação as vacas podem apresentar várias doenças metabólicas e infecciosas, como a mastite, devido às abruptas mudanças fisiológicas, entre elas a supressão da reposta imune, concomitante com a queda da ingestão de matéria seca e da concentração sérica de vitamina E. Com o objetivo de estudar a influência da suplementação de vitamina E nas atividades funcionais dos neutrófilos do leite de bovinos, catorze novilhas da raça holandesa foram divididas aletoriamente em dois grupos, sendo um com sete animais não suplementados (controle) e outro com sete animais suplementados com 1000 UI/dia de vitamina E durante 30 dias antes do parto previsto e 10 dias após o mesmo. Na primeira semana após o parto foi colhido o leite dos quartos mamários CMT negativo, após estimulação da leucocitose com a infusão intramamária de solução de glicogênio de ostra a 0,1% e 0,5%, 36 e 12 horas respectivamente, antes da colheita do leite. As células foram isoladas, contadas e estimou-se a viabilidade das mesmas. Em seguida foram realizados os testes de fagocitose incubando-se zimosan opsonizado (2x108/ml) com neutrófilos (2x107/ml), contados no microscópio óptico. Suspensões na concentração de 2x108/ml de cepas de Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Corynebacterium bovis, Escherichia coli e Prototheca zopfii procedendes de casos de mastite clínica bovina foram incubados com neutrófilos (2x107/ml). A solução foi plaqueada antes da incubação para fagocitose, após a fagocitose, após o tratamento com antibióticos e após a lise dos neutrófilos para a determinação dos patógenos destruídos. As análises estatíscas foram feitas através da ANOVA. A porcentagem de células que englobaram três ou mais partículas de zimosan opsonizado foi de 52% no grupo não suplementado e 66% no grupo suplementado (P<0,05). Não foram detectadas diferenças estatísticas para a porcentagem de fagocitose de microrganismos opsonizados, sendo 30,2% e 28,8% para o grupo controle e suplementado, respectivamente. A destruição intracelular de patógenos foi de 99%, não diferindo entre os grupos. Em seguida, determinou-se a produção de O2- e H2O2, sendo 1,6 e 3,0 nmol de O2- e 0,83 e 0,67 &micro;M de H2O2 para o grupo controle e suplementado, respectivamente. A atividade enzimática no grupo controle e suplementado foi de 4,3 e 3,6 &micro;mol/min/mg proteína para a catalase, 43 e 49 nmol/min/mg de proteína para a glutationa redutase, 16,2 e 30 nmol/min/mg proteína para a glutaiona peroxidase, 3,85 e 6,32 U/mg proteína para a superóxido dismutase e 0,67 e 0,29 U/mg proteína para a mieloperoxidase, sendo que não foram encontradas diferenças estatísticas entre os grupos. A suplementação com vitamina E aumentou a habilidade fagocitária dos neutrófilos somente no ensaio com zimosan e não alterou a atividade enzimática assim como a produção de espécies reativas de oxigênio. O equilíbrio entre as espécies reativas de oxigênio, importante para a destruição intracelular de patógenos, e os antioxidantes é extremamente complexo, não sendo afetado pela suplementação de um único agente antioxidante / At the early lactation, lactating cows are more exposed to metabolic and infectious diseases as mastitis, due to the physiological modifications accomplished with diminishing of dry matter ingestion, immune response depressed and the vitamin E plasmatic concentration level reduction. Therefore, to study the influence of vitamin E supplementation on the function of milk neutrophils, fourteen primigravid holstein heifers were casually allocated in two groups: one was oral supplemented with vitamin E (1000UI/day) 30 days pre parturition and 10 days post parturition, the other group did not receive vitamin E supplementation (control group). During the first week post-parturition, milk was collected from negative CMT quarter after induction of leucocytosis with a intramammary infusion of oyster glycogen infusion (0,1% e 0,5%, 36 e 12 hours respectively). The cells were isolated from milk, counted and the viability was estimated. After these trials the assays: phagocytosis with opsonized zymosan and phagocytosis with microorganisms that cause mastitis were performed. zymosan opzonized particles (2x108/mL) were incubated with neutrophils (2x107/mL) and counted on the optic microscope. The microorganisms (2x108/mL) Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Corynebacterium bovis, Escherichia coli and Prototheca zopfii were incubated with neutrophils (2.107/mL) from milk. Solution were spread plated pre phagocytosis assay, after phagocytosis, post treatment with antibiotics and after break of neutrophils. The results were analysed from the statistical ANOVA. For the phagocytosis assays, 52% of neutrophils from control group phagocyted three or more zymosan particles, and in the supplemented group, 66% of the cells (P< 0,05). For the microorganisms, did not have statistical difference and the results were 30.7% and 28.2% for the control and supplemented groups. The average of the pathogens intracellular kill was 99% in the both groups. In sequence the tests for production O2- and H2O2, enzimatic activity of catalase, superoxide dismutase, glutathione redutase, glutathione peroxidase and myeloperoxidase were made. It were no detected any statiscal differences in respect to the production of O2- and H2O2. The production of O2- was 1,6 nmol and 3,0 nmol and the H2O2 production was 0,83 &micro;M and 0,67 &micro;M for the groups control and supplemented. The control and supplemented group enzymatic activity results obtained were: catalase 4.3 and 3.6 &micro;mol/min/mg protein, glutathione redutase 43 and 49 nmol/min/mg protein, glutathione peroxidase 16.2 and 30 nmol/min/mg protein, superoxide dismuthase 3.85 and 6.32 U/mg protein and myeloperoxidase 0,67 and 0,29 U/mg protein. In relation to these results it was not detected any statistical difference. Vitamin E supplementation increased zymosan phagocytosis and did not affect enzyme activities involved in the mechanisms of protection against oxigen reactive species and microorganism phagocytosis in the neutrophils. The vitamin E supplementation didn´t change the complex balance among the reactions of antioxidants and oxigen reactive species. It can be concluded that due to the complexity of the mechanisms involved the supplementation with just one isolate antioxidant did not interfered with the defence neutrophil activities

Neste estudo avaliamos a ocorrência de fagocitose por parte de alguns tipos celulares presentes na hemolinfa do carrapato bovino B. microplus e a produção de espécies reativas de oxigênio durante a resposta imune. As técnicas empregadas para avaliação da produção de espécies reativas de oxigênio foram luminescência amplificada por luminol, oxidação de fenol vermelho, microscopia de fluorescência e fluorimetria com o corante dihidrorrodamina 123 (DHR). Observamos um aumento da luminescência amplificada por luminol quando hemócitos foram incubados na presença de bactérias Micrococcus luteus ou zimosam ou PMA. Esta luminescência foi inibida por superóxido dismutase (SOD) e por catalase (CAT), enzimas antioxidantes que removem superóxido e peróxido de hidrogênio, respectivamente. LPS não elicitou aumento da luminescência dos hemócitos em relação ao controle. Através da oxidação de fenol vermelho em reação inibida por CAT, verificamos aumento nos níveis de H2O2 produzido pelos hemócitos quando estimulados com PMA e Micrococcus luteus, enquanto não houve aumento quando o estímulo foi LPS, corroborando os resultados da luminescência. Usando microscopia de fluorescência para avaliar a produção de ERO pelos hemócitos, encontramos que cerca de 25% dos hemócitos fluorescem com maior intensidade quando estimulados com zimosam, sendo esta fluorescência inibida por CAT. Através de fluorimetria usando DHR observamos um aumento na intensidade de fluorescência dos hemócitos estimulados com PMA em reação inibida por cisteína, substância redutora que remove peróxido de hidrogênio e peroxinitrito. Nosso conjunto de resultados permitem concluir que os hemócitos do carrapato bovino produzem espécies reativas de oxigênio durante a resposta imune, semelhantemente ao que ocorre em vertebrados e em invertebrados como moluscos, crustáceos e insetos. Este é o primeiro trabalho mostrando produção de ERO pelos hemócitos de aracnídeos. / The phagocytic activity and the reactive oxygen species (ROS) production during immune response of some hemocytes of the cattle tick Boophilus microplus were evaluated in this study. The ROS production was evaluated by luminol amplified luminescence, phenol red oxidation, dyhydrorhodamine (DHR) fluorescence microscopy and fluorimetry. The luminol-amplified luminescence increased when hemocytes were incubated with bacteria (Micrococcus luteus) or zymosam or phorbol 12-miristate 13 acetate (PMA). The superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), antioxidant enzymes that removes superoxide and hydrogen peroxide, respectively, inhibited this luminescence. Lipopolysaccharide (LPS) did not elicit luminescence of hemocytes in relation to controls. The catalase-inhibittable phenol red oxidation assay also showed an increase in the level of hydrogen peroxide produced by hemocytes stimulated with PMA or Micrococcus luteus. LPS did not stimulate the hemocytes, similarly to the observed by luminescence assay's. We also evaluated ROS production by fluorescence microscopy and we found approximately 25% more fluorescent hemocytes when zymosam was used. This fluorescence was inhibited by catalase. In DHR fluorimetry assay we observed an increase in the intensity of fluorescence in PMA stimulated hemocytes. This fluorescence was inhibited by cystein, a reducing agent that removes hydrogen peroxide and peroxinitrite. We conclude that hemocytes of the tick, like other invertebrate such as mollusks, crustaceans and insects and vertebrate, produce reactive oxygen species during the immune response. This is the first report of reactive oxygen species production by arachnid hemocytes.

Claritromicina e clofazimina são utilizadas no tratamento da hanseníase e em infecções causadas pelo complexo Mycobacterium avium, comuns em portadores do HIV. Devido à escassez de dados sobre a toxicidade de esquemas terapêuticos que associam estes fármacos, este estudo teve por objetivo avaliar os efeitos adversos desta terapia, em ratos machos Wistar, por meio da determinação de parâmetros hematológicos, hemostáticos e bioquímicos e correlação destes parâmetros com a dose e concentração plasmática dos medicamentos, em regime de doses únicas e múltiplas. Para tanto foram realizados: a) contagem global e específica de leucócitos (método manual) e ensaios de fagocitose e burst oxidativo de neutrófilos (citometria de fluxo); b) contagem de plaquetas (método manual), tempo de protrombina, tempo de tromboplastina parcial ativada, níveis plasmáticos dos fatores VII e X (método automatizado); c) níveis séricos de gama-glutamiltransferase (método cinéticocolorimétrico) e bilirrubinas total e direta (método colorimétrico); d) concentrações plasmáticas dos fármacos (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência). Não houve diferenças entre as concentrações plasmáticas dos fármacos administrados em monoterapia ou politerapia. Entretanto, tanto clofazimina como claritromicina tiveram redução das concentrações plasmáticas em regime de doses múltiplas, quando comparadas à dose única. Houve aumento do número de leucócitos (dose múltipla) e de células polimorfonucleares (doses única e múltipla) nos grupos tratados com claritromicina em monoterapia ou associada à clofazimina, e redução das células mononucleares, em doses única e múltipla, nos mesmos grupos. Os fármacos parecem inverter a proporção entre células mono e polimorfonucleares. Observou-se aumento do burst oxidativo nos animais tratados com os fármacos tanto em monoterapia como em regime de politerapia. Entretanto, não houve diferença entre os tratamentos com os fármacos em relação ao controle DMSO, em dose única. Em doses múltiplas, os tratamentos com clofazimina e claritromicina em monoterapia ou politerapia estimularam o aumento do burst oxidativo (p < 0,0001) em relação ao controle DMSO. Não foram verificadas diferenças na fagocitose entre os grupos tratados e controle, tanto em dose única como em doses múltiplas. Tempo de protrombina e tempo de tromboplastina parcial ativada não foram alterados com o uso dos fármacos. Os fatores VII e X da coagulação tiveram aumento de suas atividades quando os ratos foram tratados em regime de dose múltipla com claritromicina, em regime de mono e politerapia. Houve perda de cerca de 8 % do peso de ratos tratados com clofazimina e 18 % daqueles tratados com claritromicina ou com a associação dos dois fármacos, no esquema de doses múltiplas, entretanto não houve diferença entre os grupos quando foram avaliados os níveis de gama-glutamiltransferase e bilirrubinas total e direta. Concluindo, clofazimina e claritromicina provocam alterações hematológicas, hemostáticas e bioquímicas e os resultados de concentração plasmática são valiosos para avaliação de efeitos adversos em estudos comparativos de monoterapia e politerapia entre os medicamentos. / Clarithromycin and clofazimine have been used to treat leprosy and infections caused by Mycobacterium avium complex in HIV patients. Because there are few data about the toxicity of treatment regimens involving these drugs, this study aimed to evaluate the adverse effects of this therapy in male Wistar rats through the determination of hematological, haemostatic and biochemical parameters and correlate them with the dose and plasma concentrations of drugs, under a single and multiple dose regimen. Evaluation was performed as follows: a) Global and specific count of leukocytes (manual method), phagocytosis and oxidative burst of neutrophils assays (flow cytometry), b) platelet count (manual method), prothrombin time, activated partial thromboplastin time, plasma levels of factors VII and X (automated method), c) Gamma-glutamyltransferase (kinetic-colorimetric method) and total and direct bilirubin serum levels (colorimetric method), d) plasma concentrations of drugs (High-Performance Liquid Chromatography). There were no differences between plasma concentrations of the drugs administered in monotherapy or polytherapy. However, the concentrations of both clofazimine and clarithromycin have decreased in plasma in multiple dose regimen compared to single dose. There was an increase in the number of leukocytes (multiple dose) and polymorphonuclear cells (single and multiple doses) in the groups treated with clarithromycin in monotherapy or in association with clofazimine, and a decrease in the number of mononuclear cells in single and multiple doses, in the same groups. Both drugs seemed to reverse the proportion between mononuclear and polymorphonuclear cells. The oxidative burst was observed in animals treated with drugs in polytherapy or in monotherapy, however there was no difference between the treatment with drugs and the control with DMSO in single dose. In multiple doses, treatment with clofazimine and clarithromycin in monotherapy or polytherapy stimulated the increase of oxidative burst (p <0.0001) compared to control. There were no differences in phagocytosis between the treated and control groups in single and multiple doses. Prothrombin time and activated partial thromboplastin time have not changed with the use drugs. In contrast, the activities of factors VII and X of coagulation have increased when rats were treated with multiple doses regimes with clarithromycin alone or in association with clofazimine. There was weight loss of 8% in rats treated with clofazimine and 18% in those treated with clarithromycin or with association of the drugs in the multiple doses regimen. However, there was no difference between the groups when gammaglutamyltransferase and total and direct bilirubin levels were analyzed. Therefore, clofazimine and clarithromycin induce hematological, hemostatic and biochemical changes and the results of plasma concentration is valuable for assessing adverse effects in comparative studies of monotherapy and polytherapy of these drugs.