Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Los fibroblastos cardíacos (FC) son células capaces de mantener la homeostasis de la matriz extracelular (MEC), regulando la estructura tisular, así como también participan de la señalización química y eléctrica del tejido cardiaco. Además, los FC están en estrecha relación con el proceso inflamatorio, manteniendo un rol clave en la homeostasis del tejido posterior a una injuria o daño tisular. En el proceso inflamatorio, producido por daño celular o por invasión microbiana, las células del sistema inmune son atraídas desde la circulación sanguínea al sitio de injuria, siendo los neutrófilos la primera línea de defensa del organismo. La llegada de neutrófilos al sitio de daño genera gradientes quimiotáxicos que atraen células del sistema inmune, gatillando el reclutamiento leucocitario, el cual es dependiente de las proteínas de adhesión molecular VCAM-1 e ICAM-1, generando una respuesta inflamatoria sostenida. En ese contexto, evidencias sugieren que un nuevo tipo de mediador lipídico, la Resolvina D1 (RvD1), ha demostrado moderar la respuesta inflamatoria, promoviendo el cese de la infiltración leucocitaria, además de mejorar la fagocitosis en macrófagos para así permitir la remoción de células y tejido apoptótico en la zona de injuria, finalizando así el proceso de inflamación. Hasta la fecha, la RvD1 no ha sido utilizada en modelos cardíacos, y por lo mismo, se desconoce su utilidad como agente antiinflamatorio en el corazón, específicamente en el FC. El objetivo de este trabajo fue caracterizar los efectos de RvD1 en la viabilidad y proliferación celular de FC neonatos (FCN), para así estudiar el efecto de RvD1 sobre FCN bajo un contexto inflamatorio, inducido por estímulo con LPS, midiendo los niveles de expresión de proteínas de adhesión VCAM-1 e ICAM-1, y consecuentemente, la adhesión de leucocitos a FCN. Además, se estudió si la RvD1 es capaz de mostrar un efecto citoprotector frente al daño provocado por un estímulo de isquemia/reperfusión simulada (I/Rs). Los resultados mostraron que en FCN la presencia de RvD1 no afecta la proliferación ni viabilidad de éstos; sin embargo, no previnieron la muerte celular inducida por I/Rs. Se demostró además que el pre-tratamiento de FCN con RvD1 y posteriormente tratados por LPS, disminuyó la expresión de VCAM-1 e ICAM-1, y como consecuencia de ello, previno la adhesión de SMC a FCN. De esta forma, la RvD1 se transforma en una potencial y valiosa herramienta terapéutica capaz de disminuir la respuesta inflamatoria luego de algún evento de injuria cardiaca como lo puede ser una miocarditis, o bien, un infarto al miocardio / Cardiac fibroblasts (FC) are cells capable of maintaining the homeostasis of the extracellular matrix (ECM), regulating tissue structure, as well as participating in the chemical and electrical signaling of cardiac tissue. In addition, FCs are closely related to the inflammatory process, maintaining a key role in tissue homeostasis following injury or tissue damage. In the inflammatory process, presented by cellular damage or by microbial invasion, the cells of the immune system are attracted from the blood circulation to the site of the lesion, with neutrophils being the first line of defense of the organism. The arrival of neutrophils to the site of damage to genomes chemotactic gradients that attract cells of the immune system, triggering the leukocyte recruitment, which is dependent on molecular adhesion proteins VCAM-1 and ICAM-1, generating a sustained inflammatory response. In this context, evidence suggesting a new type of lipid mediator, Resolvin D1 (RvD1), has shown that the inflammatory response, the growth of leukocyte infiltration, in addition to improving phagocytosis in macrophages to allow a separation of cells and tissue apoptotic in the area of injury, thus ending the process of inflammation. To date, RvD1 has not been used in cardiac models, and therefore, is unknown as the anti-inflammatory agent in the heart, specifically in the FC. The objective of this work was to characterize the effects of RvD1 on the viability and cellular proliferation of neonatal FC (FCN), in order to study the effect of RvD1 on FCN under an inflammatory context, induced by stimulation with LPS, measuring the levels of expression of adhesion proteins VCAM-1 and ICAM-1, and consequently, the adhesion of leukocytes to FCN. In addition, we studied whether RvD1 is able to show a cytoprotective effect against damage caused by a simulated ischemia / reperfusion stimulus (I / Rs). The results show that in FCN the presence of RvD1 does not affect the proliferation or viability thereof; however, they did not prevent cell death induced by I/Rs. It was also demonstrated the previous treatment of FCN with RvD1 and subsequently treated by LPS, decreased the expression of VCAM-1 and ICAM-1, and as a consequence, prevented the adhesion of SMC to FCN. In this way, RvD1 becomes a potential and valuable therapeutic tool capable of decreasing the inflammatory response after some event of cardiac injury such as myocarditis or myocardial infarction / FONDECYT N° 1130300 y 1170425

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Los fibroblastos cardiacos son las principales células encargadas de la reparación y mantenimiento de la matriz extracelular del tejido cardiaco, aunque en los últimos años se ha determinado que pueden secretar y responder a citoquinas y quimioquinas pro inflamatorias. También se ha determinado que poseen el receptor TLR4, el cual es capaz de responder a PAMPS (como LPS), sugiriendo así que el fibroblasto cardiaco tiene un rol clave en el proceso inflamatorio cardiaco gatillado por un daño o patógeno. Las cininas son péptidos pro inflamatorios asociados principalmente a la vasodilatación y a la formación de edema cuando se unen a sus receptores en el sitio de injuria. Se ha demostrado que el fibroblasto cardiaco posee de forma constitutiva receptor B2 (cuyo ligando es BK), no así receptor B1 (cuyo ligando es DAKD), ya que este último es inducible en este fenotipo celular. Se ha descrito en células endoteliales que tanto LPS, así como también las cininas, son capaces de aumentar los niveles proteicos de moléculas de adhesión celular (ICAM-1 y VCAM-1), favoreciendo así la adhesión de células del sistema inmune al sitio de daño. Sin embargo, se desconoce si los fibroblastos cardiacos tratados de manera conjunta con cininas y LPS modulan la expresión de estas moléculas de adhesión. Mediante análisis de inmunowestern blot se demostró que LPS aumentó considerablemente los niveles proteicos de las moléculas de adhesión desde las 8 hasta las 48 h, mientras que no se observó efecto con BK o DAKD, sugiriendo así que el efecto pro inflamatorio de las cininas no favorecería de manera directa la adhesión de células del sistema inmune a los fibroblastos cardiacos. Por otro lado, se determinó que BK aumentó de forma significativa los niveles proteicos de TLR4 a las 72 h y a su vez que disminuyó los niveles basales de -SMA en fibroblasto cardiaco. También se determinó que el pre tratamiento por 48 h con BK moduló negativamente la acción de LPS sobre VCAM-1 a las 24 h. Estos resultados en conjunto indican que el pre tratamiento de fibroblastos cardiacos con BK es capaz de evitar la diferenciación de estos a miofibroblastos, favoreciendo así una respuesta pro inflamatoria y antifibrótica por parte de estos / Cardiac fibroblasts are the main cells responsible for the repair and maintenance of cardiac matrix. Although in the last years has been determined to be able of secreting and also respond to proinflammatory cytokines and chemokines (IL-1 and TNF-). Also it has been determined the presence of TLR4, which is able to respond to PAMPs (such as LPS), suggesting that cardiac fibroblast has a key role in cardiac inflammatory process triggered by damage or pathogen. Kinins are proinflammatory peptides mainly associated to vasodilation and edema formation when are bind to their receptors at the site of injury. It has been shown that cardiac fibroblast express constitutively B2 receptor (whose ligand is BK), not B1 receptor (whose ligand is DAKD), since the latter is inducible in this cell phenotype. It has been described that LPS and kinins are able to increase protein levels of celular adhesion molecules (ICAM-1 and VCAM-1) in endothelial cells, thus enhancing the adhesion of immune cells to the site of injury. However, it is unknown whether cardiac fibroblasts treated together with kinins and LPS modulate the expression of these adhesion molecules. Through analysis of immuno western blot it was determined that LPS is able to significantly increase the protein levels of adhesion molecules from 8 to 48 hours, not BK and DAKD, thus suggesting that the proinflammatory effect of kinins are not directly linked to the adhesion of immune system cells. Furthermore, it was determined that BK can significantly increase TLR4 protein levels at 72 hours and in turn is capable of decreasing basal levels of -SMA in cardiac fibroblast. It was also determined that pretreatment for 48 hours with BK is able to modulate negatively the action of LPS on VCAM-1 at 24 hours. These results together indicate that pretreatment of cardiac fibroblasts with BK is capable of preventing differentiation of these to myofibroblast, thus supporting a proinflammatory response from these

La aterosclerosis es una enfermedad multifactorial que depende en gran parte de factores ambientales, pero con una fuerte base genética que puede predisponer a padecerla. Además de la susceptibilidad individual, en el desarrollo de esta patología tienen una gran importancia las modificaciones en la expresión génica que se producen en las células como una respuesta homeostática ante estímulos de tipo pro-aterogénico. Esta respuesta es un intento de corregir o adaptar la función celular ante el estímulo, pero puede acabar contribuyendo al desarrollo de la enfermedad. Por otra parte, muchos de los fármacos empleados en el tratamiento y prevención de la aterosclerosis y sus complicaciones actúan en gran parte modificando la expresión o actividad de algunos de los genes relacionados con esta patología. La complejidad de estos procesos y el elevado número de genes que pueden estar implicados constituyen un reto para la comunidad científica. Su conocimiento permitirá una mejor comprensión de los mecanismos moleculares que conducen al desarrollo de la aterosclerosis, y por tanto, permitirá diseñar estrategias terapéuticas para prevenirla o frenarla. En este contexto, el objetivo general de la presente tesis doctoral ha sido contribuir al estudio de la regulación de la expresión génica en monocitos y macrófagos, células clave en todas las etapas de la aterogénesis, como respuesta ante diferentes condiciones pro-aterogénicas y/o fármacos. La consecución de este objetivo ha llevado a la realización de los cuatro trabajos que se presentan, cuyos objetivos específicos fueron: I. Determinar el perfil de expresión génica en monocitos de pacientes con hiperlipemia familiar combinada (HFC), antes y después de un tratamiento con atorvastatina, mediante la utilización de microarrays de cDNA. II. En un modelo in vitro (monocitos THP-1 diferenciados a macrófagos), determinar el efecto de estímulos pro-aterogénicos sobre la expresión de los genes más relevantes identificados en el anterior objetivo, explorando las vías de señalización intracelulares que resultan afectadas. III. En el mismo modelo, estudiar el efecto del inhibidor de proteasas ritonavir sobre la expresión de genes que controlan la acumulación de colesterol en el macrófago. Las principales conclusiones del trabajo experimental de la presente tesis doctoral han sido las siguientes: I. Los monocitos de pacientes con HFC presentan un perfil de expresión génica diferente de los individuos controles sanos. Los genes diferencialmente expresados corresponden a proteínas con funciones clave en los monocitos, relacionadas con el proceso aterosclerótico. El tratamiento de los pacientes con ATV durante un mes es capaz de revertir algunos de los cambios inducidos por la HFC en el patrón de expresión génica de los monocitos circulantes. II. La expresión de IL-1R2 se halla reducida en monocitos de sangre periférica de pacientes con HFC, en macrófagos THP-1 tratados con LDL acetiladas o con VLDL, y también en lesiones ateroscleróticas humanas. La represión génica de IL-1R2 observada en los tratamientos con lipoproteínas se relaciona con la acumulación intracelular de lípidos en el macrófago. Además, las lipoproteínas evitan el incremento en la expresión de receptores de IL-1 y reducen la expresión proteica de la cinasa asociada IRAK-1 en macrófagos activados por LPS. III. La expresión de TFPI-2 se encuentra incrementada en monocitos de pacientes con HFC en comparación con sujetos control. El tratamiento con trombina provoca el aumento de la expresión, tanto génica como proteica, de TFPI-2 en macrófagos THP-1 y macrófagos derivados de monocitos humanos, mediante un mecanismo en el que se encontrarían implicados NF-kB, ERK1/2 y JNK. IV. El tratamiento de macrófagos THP-1 con ritonavir induce un incremento en la expresión de genes implicados en el transporte de colesterol (CD36, ABCA1 y CYP27), por un mecanismo en el que intervendrían SREBP-1, PPARγ y LXR. / Atherosclerosis is a multifactorial disease, in which development are very important changes in gene expression that occur in cells as a homeostatic response to pro-atherogenic stimuli. Moreover, many of the drugs used in the treatment and prevention of atherosclerosis and its complications largely act by modifying the expression or activity of some genes associated with this pathology. In this context, the objective of this thesis was the study of regulation of gene expression in monocytes and macrophages, in response to different pro-atherogenic conditions and/or drugs. Achieving this goal has led to the creation of four works presented, whose specific objectives were: I. Determine the profile of gene expression in monocytes from patients with familial combined hyperlipidemia, before and after treatment with atorvastatin. II. In an in vitro model, determine the effect of pro-atherogenic stimuli on the expression of most relevant genes identified in the above objective, exploring intracellular signaling pathways that are affected. III. In the same model, study the effect of the protease inhibitor ritonavir on the expression of genes that control the accumulation of cholesterol in the macrophage. The main conclusions of the experimental work are: I. Monocytes from patients with FCH have a different gene expression profile of healthy control individuals. Treatment with ATV is able to reverse some of the HFC-induced changes in the pattern of gene expression in circulating monocytes. II. IL-1R2 expression is reduced in peripheral blood monocytes from patients with HFC, in THP-1 macrophages treated with lipoproteins, and also in human atherosclerotic lesions. Repression of IL-1R2 gene observed in treatments with lipoproteins is associated with intracellular accumulation of lipids in the macrophage. In addition, lipoproteins modify LPS-induced expression of IL-1R2 and IL-1 signalling. III. TFPI-2 expression is increased in monocytes from patients with FCH compared with control subjects. Thrombin treatment causes increased expression in THP-1 macrophages and human monocyte-derived macrophages through a mechanism that would be found involved NF-κB, ERK1/2 and JNK. IV. Treatment of THP-1 macrophages with ritonavir induces an increased expression of genes involved in cholesterol transport (CD36, ABCA1 and CYP27), by a mechanism which would involve SREBP-1, PPARγ and LXR.

El ácido abscísico (ABA) es una hormonal vegetal que tiene un papel crucial en las respuestas adaptativas de las plantas al estrés por sequía, salinidad o frío, además de regular importantes procesos del desarrollo de las plantas. Existen múltiples evidencias de que las proteínas fosfatasas 2C (PP2Cs) son claves para comprender los procesos en los que media esta hormona. Nuestro trabajo se centra en la PP2C HAB1 (HYPERSENSITIVE TO ABA) cuyo secuencia genómica fue clonada por homología con ABI1 y ABI2. Realizamos un abordaje de genética reversa, novedoso en el campo de la señalización por ABA, con el aislamiento y caracterización de un alelo de pérdida de función hab1-1 y, con la generación y el estudio de líneas que sobre expresan HAB1. La hipersensibilidad del mutante hab1-1 y la insensibilidad de las plantas 35S:HAB1 proporcionan una nueva evidencia genética del papel de la PP2C HAB1 como regulador negativo de la señalización por ABA. Para profundizar más en los detalles moleculares de la función de HAB1 en la ruta de señalización por ABA, realizamos una búsqueda por doble híbrido de las posibles dianas de interacción de HAB1 en una librería de cDNA de Arabidopsis. HAB1 interacciona con la proteína SWI3B, un homólogo de la subunidad SWI3B del complejo remodelador de cromatina SWI/SNF de levaduras. Estudios previos a esta tesis no habían analizado mutantes de pérdida de función sencillos, dobles y triples en PP2Cs de plantas. El objetivo es determinar su contribución a la ruta de señalización por ABA y desentrañar posibles interacciones génicas y una posible redundancia funcional entre ellas. En esta tesis hemos generado mutantes hipersensibles a ABA tolerantes a la sequía por inactivación combinada de las PP2Cs HAB1 y ABI1. En experimentos de pérdida de agua por transpiración en condiciones de sequía hab1-1abi1-2 y hab1-1abi1-3 muestran una reducción notable en la pérdida de agua respecto a los mutantes parentales sencillos. Estos resultados muestran que la inactivación combinada de PP2Cs específicas involucradas en la señalización por ABA puede ser una herramienta biotecnológica en la mejora de cultivos tolerantes a la sequía. / Saez Somolinos, AE. (2010). Ruta de transducción de señal del ácido abscísico: Regulación por HAB1 y dianas de interacción. La inactivación combinada de PP2Cs como herramienta biotecnológica para incrementar la tolerancia a sequía en plantas [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/8658 / Palancia