Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. Tesis para optar al grado de Magíster en Ciencias Animales, mención Medicina Preventiva Animal. / La salmonelosis es una de las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) más importante a nivel mundial, y una de las enfermedades zoonóticas más frecuentes y de alto impacto económico. En el presente estudio, se exponen los resultados sobre la prevalencia, resistencia antimicrobiana y factores de riesgo de Salmonella spp realizado en el Humedal Nacional “El Yali”, ubicado en la comuna de Santo Domingo, Región de Valparaíso, Chile. Este humedal es considerado una zona de alto riesgo para el ingreso de agentes zoonóticos, debido a la gran cantidad de especies de avifauna residentes y migratorias, además de que, en torno al humedal, habita un alto porcentaje de sistemas productivos de traspatio (SPT) que se caracterizan por criar aves y cerdos con escasas medidas de bioseguridad. La población objetivo del estudio, se conformó por los SPT que se encontraban localizados dentro de un radio de 3 km desde el límite de la reserva. A su vez, se realizaron dos períodos de muestreo, el primero fue en invierno en donde se muestrearon 39 SPT (205 muestras) y el segundo fue en verano con 40 SPT (236 muestras). Las muestras fecales fueron incubadas en APT + novobiocina por 24 horas a 37°C. Posteriormente fueron transferidas a MSRV + Novobiocina por 24/48 horas a 41,5°C. Para el diagnóstico selectivo, las muestras fueron incubadas en agar XLD a 37°C por 18-20h. Finalmente, las cepas fueron confirmadas mediante PCR. En la susceptibilidad antimicrobiana, las cepas aisladas fueron testeadas frente a nueve antibióticos usando el método de difusión en disco de Kirby –Bauer. La prueba fue realizada de acuerdo a los estándares del CLSI, y como control de calidad se utilizó la cepa E.coli ATCC 25922. Para caracterizar las medidas de bioseguridad que realizaban los SPT, para prevenir el ingreso de agentes zoonóticos, se realizó una encuesta epidemiológica a todos los productores que decidieron participar en el estudio. Sólo se encontraron muestras positivas en el segundo período (verano), presentando una prevalencia animal de un 1,27% (3/236) y una prevalencia a nivel predial de un 5% (2/40). Todas las cepas fueron sensibles a los nueve antibióticos testeados. De acuerdo a la encuesta epidemiológica, se comprobó que los SPT tenían deficientes o nulas medidas de bioseguridad. Se sugiere realizar nuevos estudios utilizando en conjunto la técnica de PCR y cultivo bacteriológico, con el fin de obtener una mejor sensibilidad en los resultados. Asimismo, se propone fortalecer programas de vigilancia epidemiológica y capacitación constante a los productores, con el objetivo de mejorar las condiciones de bioseguridad y en consecuencia evitar la presencia de agentes patógenos zoonóticos. / Salmonellosis is one of the most important food transmitted diseases and one of the most frequent zoonotic illnesses, which has a high economic impact on a worldwide scale. In the present study, you will find the results on prevalence, antimicrobial resistance and risk factors for Salmonella spp conducted at the National Wetland "The Yali" located in the district of Santo Domingo, Region of Valparaíso, Chile. This wetland is considered a high risk area for the entry of zoonotic agents due to the large number of resident and migratory bird species, in addition to that, around the wetland, there is a high percentage of backyard production systems (BPS) characterized by raising poultry and pigs with poor biosecurity measures. The target population of this study was composed by BPS located within 3 km radius from the borders of the wetland. Two sampling periods were conducted, (i) winter, where 39 BPS were sampled (205 samples) and (ii) summer with 40 BPS sampled (236 samples). Samples were incubated in “Buffered Peptone Water + novobiocin" for 24 h/37°C. One hundred μl of the incubated BPW were transferred to Modified Semisolid Rappaport-Vassilliadis (MSRV) + novobiocin and incubated 24/48 h/41.5 °C. For the selective diagnosis, samples were incubated in XLD agar for 18–20 h/37°C. Finally, the strains were confirmed by PCR. For antimicrobial susceptibility, isolates strains were tested to 9 antimicrobials using the Kirby–Bauer disk diffusion method. The test was performed using the CLSI, and as quality control, the strain ATCC 25922 was used. To characterize the biosecurity measures being taken by BPS, to prevent the entry of zoonotic agents, an epidemiological survey was conducted to all producers who chose to participate in the study. Positive samples were only found in the second period (summer), presenting an animal prevalence of 1.27% (3/236) and farm prevalence of 5% (2/236). All strains were sensitive to the nine tested antibiotics. According to the epidemiologic survey, it was found that the BPS had poor or no biosecurity measures. It is suggested to make further studies using both techniques, PCR and bacterial crop, in order to get a better sensitivity of the results. Furthermore, it is suggested to strengthen epidemiological surveillance programs and ongoing training for producers in order to improve biosafety conditions and consequently prevent the presence of zoonotic pathogenic agents. / Financiamiento: proyecto Fondecyt 11121389 y FIV 12101401.9102.011.

Magíster en Bioquímica área de Especialización en Bioquímica Clínica / Las infecciones fúngicas o micosis son infecciones producidas por hongos oportunistas y/o patógenos que pueden ser superficiales o sistémicas. El agente etiológico más importante a nivel mundial de estas infecciones es Candida albicans, una levadura comensal que coloniza entre un 30-60% de los humanos; sin embargo, frente a cambios en las condiciones locales o en la inmunidad del hospedero es capaz de causar una infección. Los antifúngicos son agentes naturales o sintéticos que eliminan y/o inhiben la proliferación de hongos. Sus principales mecanismos de acción son la inhibición de la formación de la pared celular y la disrupción de la membrana celular. Se han estudiado varios mecanismos de resistencia a antifúngicos en C. albicans. Los principales apuntan a mutaciones y sobreexpresión de los genes ERG11 (azoles) y FKS1 (equinocandinas) y/o a la sobreexpresión de las bombas de eflujo CDR1, CDR2 y MDR1; sin embargo, su contribución real a la generación de resistencia no está del todo dilucidada. El objetivo de este trabajo fue caracterizar los mecanismos de resistencia a azoles y equinocandinas en cepas clínicas chilenas, estableciendo los mecanismos de resistencia más prevalentes. Se estudiaron 10 cepas de aislados chilenos resistentes a azoles y 10 cepas resistentes a equinocandinas de C. albicans de origen clínico, buscando mecanismos de resistencia mediante el análisis de genes candidatos por técnicas de secuenciación, q-PCR y además mediante ensayos de funcionalidad de bombas de eflujo. Se encontró que en las cepas resistentes, tanto a azoles como a equinocandinas, no existe un mecanismo de resistencia único. Sin embargo, el mecanismo de resistencia más prevalente a azoles fue la sobreexpresión de bombas de eflujo, encontrándose en el 60% de las cepas ensayadas. Por otra parte, en las cepas resistentes a equinocandinas el mecanismo predominante fueron mutaciones en el gen FKS1, principalmente en la región HS1, encontrándose mutaciones de interés en un 20% del total de cepas resistentes estudiadas. Estos resultados entregan información importante acerca de los mecanismos predominantes para dos familias de antifúngicos en aislados clínicos chilenos de C. albicans. Es necesario un estudio multicéntrico con un mayor número de cepas para conocer con más detalle la realidad nacional de la resistencia a agentes antifúngicos en C. albicans. / Fungal infections or mycoses are infections caused by opportunistic and/or pathogenic fungi that may be superficial or systemic. The most important etiologic agent globally of these infections is Candida albicans, a commensal yeast that colonizes 30-60% of humans. Changes in local conditions or host immunity can produce a switch from a harmless colonizing commensal to causing a pathogen infection. Antifungal agents are natural or synthetic agents that eliminate and/or inhibit the growth of fungi; their main mechanism of action is the inhibition of cell wall formation and disruption of the cell membrane. Several mechanisms of antifungal resistance of C. albicans have been studied. The most common are mutations and overexpression of the ERG11 and FKS1 genes, involved in resistance to azoles and echinocandins, respectively, and/or the overexpression of efflux pumps CDR1, CDR2 and MDR1. However the real contribution of each resistance mechanism in Chilean clinical isolates has not been elucidated. The aim of this work was to characterize the resistance mechanisms to azoles and echinocandins in Chilean clinical isolates, in order to establish the most prevalent resistance mechanism. We studied 10 strains of C. albicans resistant to azoles and 10 strains resistant to echinocandins, and evaluated their resistance mechanisms using sequencing, q-PCR and functional assays of efflux pumps. We found that several resistance mechanisms are present in the azole and echinocandin resistant strains. However, the most prevalent mechanism of azole resistance was the overexpression of an efflux pump, present in 60% of the tested strains. Resistance to echinocandins can be ascribed predominantly to mutations in the FKS1 gene, mainly in the HS1 region. Mutations of interest were found in 20% of the resistant strains tested. These results provide important information about the predominant resistance mechanisms against two families of antifungals in Chilean strains of C. albicans. A multicenter study, with a greater number of isolates, will be necessary to know the national status of antifungal resistance in C. albicans / Conicyt, Fondecyt

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Los antimicrobianos son medicamentos indispensables para el tratamiento de la mayoría de los procesos infecciosos bacterianos tanto en el hombre como en los animales. Su uso siempre se ha acompañado de la aparición de cepas bacterianas resistentes. Este problema tiene un impacto clínico, epidemiológico y microbiológico, transformándose en una de las principales amenazas de la salud pública mundial. En la mayoría de los países, los esfuerzos para abordar este problema solamente se enfocan en la salud humana, y sólo en los países más desarrollados se extiende esta iniciativa al área de la salud animal. En estos países más avanzados, existen sistemas de vigilancia integrados basados en el enfoque de ―Una Salud‖ de la OMS (Organización Mundial de la Salud). Este trabajo describe la situación respecto de las iniciativas de vigilancia integrada de la resistencia a los antibióticos de los países de la región APEC (Foro de Cooperación Asía Pacifico), entrega algunas recomendaciones internacionales y analiza el contexto actual en Chile con el fin de proponer una estrategia para implementar un sistema de vigilancia integrado, el cual en un futuro podría llegar a formar parte de un sistema de gestión integral del uso adecuado de antimicrobianos. / Antimicrobial drugs are essential for the treatment of most bacterial infectious processes, both in humans and animals. Their use has always been accompanied by the emergence of resistant bacterial strains. This problem has a clinical, epidemiological and microbiological impact, becoming one of the major threats to global public health. In most countries, efforts to address this problem only focus on human health, and only in developed countries this initiative also extends to animal health. In these more advanced countries, they have integrated surveillance systems based on the ―One Health‖ approach of the WHO (World Health Organization). This study describes the situation regarding integrated surveillance initiatives to control antibiotic resistance in economies from the APEC region (Asia-Pacific Economic Cooperation), gives some international recommendations and analyses the current situation in Chile and subsequently proposes a strategy to implement an integrated surveillance system, which in the future could be part of an integrated management system for appropriate antimicrobial use.

Memoria para optar al título de Ingeniero Civil en Biotecnología / La resistencia a antibióticos generada en las bacterias es un fenómeno natural que se ve acelerado por el uso excesivo e inadecuado de los antibióticos, lo que genera una necesidad por descubrir nuevos compuestos bioactivos que puedan suplir esa función. Streptomyces leeuwenhoekii C34 es una bacteria del desierto de Atacama que produce metabolitos llamados chaxamicinas y chaxalactinas, los cuales poseen bioactividad contra Staphylococcus aureus y E. coli. En este proyecto se buscan las condiciones óptimas para la producción de metabolitos especializados mediante la optimización de las condiciones de temperatura y pH, y concentración de glicerol en el medio de cultivo. Para ello, se estudia la diferencia en el nivel de producción de chaxamicinas mediante la medición del diámetro de los halos de inhibición de crecimiento producidos en placas de Petri inoculadas con S. aureus y expuestas al medio de cultivo de S. leeuwenhoekii C34. Adicionalmente, se realizan simulaciones en el modelo de escala genómica iVR1007 de S. leeuwenhoekii C34 para realizar predicciones y comparar con los resultados experimentales. Se obtuvo las condiciones óptimas de los parámetros, que corresponden a 33 [°C], pH 6 y 65 [g/L] de glicerol para crecimiento, y 37 [°C], pH 6,5-7 y 5 [g/L] de glicerol para producción de metabolitos especializados. A partir de la optimización de la concentración de glicerol, se obtuvo un valor máximo para la producción de metabolitos especializados de 5,428 [cm gDW-1 L-1], que es 135 veces más alto que el caso no optimizado. Las condiciones óptimas obtenidas se encuentran dentro de los rangos entregados por estudios previos para el caso de producción y para el caso de crecimiento, salvo para pH. Se determinó que la mejor alternativa para producción industrial era separar el proceso en una fase de crecimiento y otra de producción. Dicho proceso tentativo utiliza menor cantidad de insumos que las alternativas de síntesis química (representados por la ciprofloxacina en este estudio) presentes en el mercado, insumos que, en contraste, no son tóxicos. Las tendencias para crecimiento y producción de metabolitos predichas por las simulaciones coinciden en términos generales con las de los resultados experimentales. Sin embargo, se aprecian ciertas diferencias causadas en parte porque el modelo no incluye restricciones relacionadas con elementos regulatorios.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. / En la actualidad el proporcionar alimentos inocuos es responsabilidad de todos los países, la pérdida de inocuidad de los alimentos afecta la salud de quienes los consumen y son una importante causa de morbilidad y mortalidad de millones de personas en el mundo, quienes enferman al consumir alimentos contaminados. La salmonelosis es la enfermedad transmitida por los alimentos (ETA) que más casos provoca, ya que puede atravesar toda la cadena alimentaria y poseer múltiples reservorios tanto en fuentes típicas como animales silvestres y domésticos, como fuentes no convencionales: efluentes de agua, suelos y vegetales. Por otro lado, los antimicrobianos, son la principal herramienta para tratar las infecciones causadas por las bacterias, sin embargo, su utilización excesiva o errónea en medicina veterinaria y en medicina humana se ha vinculado a la aparición y propagación de bacterias resistentes, que hacen que los tratamientos dejen de ser eficaces, y han transformado a la resistencia a los antimicrobianos en una de las principales amenazas de la salud pública a las que se enfrenta la medicina moderna. El objetivo de este estudio fue aislar cepas de Salmonella enterica de muestras de hortalizas, agua y suelo desde seis puntos rurales de la Región Metropolitana, además de caracterizar su serotipo y su susceptibilidad a los antimicrobianos. Se analizaron 1.250 muestras de hortalizas, de las cuales no hubo presencia de Salmonella spp., también se analizaron 250 muestras de suelo en donde se logró aislar dos cepas de Salmonella correspondiente al serotipo Infantis, siendo una cepa resistente a cloranfenicol, mientras que la segunda cepa fue sensible a todos los antibióticos analizados. También se analizaron 25 muestras de agua y se logró aislar una cepa de Salmonella correspondiente al serotipo Muenchen, la cual presentó resistencia a 11 de los 16 antibióticos analizados. Por tanto los serotipos Infantis y Muenchen son potenciales zoonóticos lo cual es un riesgo para la salud publica ya que pueden usar las diferentes fuentes ambientales como vehículos para provocar enfermedad en el ser humano, además de que las cepas bacterianas podrían llegar a presentar resistencia antimicrobiana, cabe señalar que todas las cepas aisladas fueron de la misma comuna, en este caso Melipilla lo que podría representar un foco de contaminación de este patógeno / At present, providing safe food is responsibility of each country, the loss of food safety affects the health of those who consume them and are a major cause of morbidity and mortality of millions of people in the world who gets sick because of consuming contaminated food, Salmonellosis is the most common cause of foodborne illness in the world, as it can cross the entire food chain and have multiple reservoirs in both wild and domestic sources, as well as non-conventional sources such as water effluents, soils and vegetables. Antimicrobials are the main tool to treat infections caused by bacteria, however, their excessive or misuse in veterinary medicine as in human medicine has been linked to the emergence and spread of resistant bacterias, which make the treatments less effective, antimicrobial resistance is one of the major threats to public health that face modern medicine. The objective of this study was to isolate strains of Salmonella enterica from six metropolitan region rural points, besides characterizing its serotype and its respective susceptibility to the antimicrobials of the different samples, 1.250 samples of vegetables, which there was not Salmonella spp. presence, 250 soil samples where two strains of Salmonella corresponding to Infantis serotype were isolated, presenting an extremely low resistance to antimicrobials, being a strain resistant only to chloramphenicol, while the second strain was sensitive to all antibiotics analyzed, 25 samples of water were taken, and a Salmonella strain corresponding to the Muenchen serotype was isolated, which showed high resistance to antimicrobials, being resistant to 11 of 16 antibiotics analyzed. Therefore the serotypes Infantis and Muenchen are zoonotic potentials which is a risk for public health since they can use the different environmental sources as vehicles to cause disease in humans, in addition to the bacterial strains could come to present antimicrobial resistance, It should be noted that all isolates were from the same municipality, in this case Melipilla, which could represent a source of contamination of this pathogen / Financiamiento: Proyecto FONIS 204668

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En la sociedad moderna, la tenencia de animales de compañía constituye una práctica cada vez más frecuente, extendiéndose a nivel mundial y a través de todas las clases socioeconómicas. Así, dentro de muchas otras áreas, la participación del médico veterinario ha aumentado en el ámbito clínico de mascotas, logrando grandes avances en técnicas diagnósticas, quirúrgicas y terapéuticas. Al igual que los humanos, las mascotas pueden sufrir diversas enfermedades, pudiendo tener algunas un componente infeccioso. Frente a las infecciosas de origen bacteriano, la principal herramienta con que cuentan los profesionales, son los antimicrobianos. Desde su descubrimiento, los antimicrobianos han constituido la primera línea de acción frente a enfermedades bacterianas, ayudando a disminuir su impacto -tanto en las personas como en distintas poblaciones animales- encontrándose disponible una variada gama de sustancias, con diferentes mecanismos de acción e indicaciones terapéuticas. Sin embargo, desde hace ya varios años se ha observado la presencia y aumento de la resistencia bacteriana a diversos antimicrobianos, constituyendo un tema de gran preocupación mundial tanto en medicina humana como veterinaria. Entre los antimicrobianos que han visto reducida su efectividad debido a la resistencia bacteriana se encuentran los betalactámicos, como meticilina y oxacilina, y las tetraciclinas, como doxiciclina y oxitetraciclina. El objetivo de este trabajo fue la detección, mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), del gen mecA involucrado en la resistencia a meticilina y de los genes tet(M) y tet(O), involucrados en la resistencia a tetraciclinas mediante la generación de proteínas de protección ribosomal, en cepas de Staphylococcus coagulasa positivas aisladas desde gatos. La aplicación de esta técnica de biología molecular permitió detectar dos de los tres genes mencionados, en cepas caracterizadas como sensibles, resistentes o de sensibilidad intermedia de acuerdo a antibiogramas por difusión en agar. Los resultados de este trabajo señalan que la detección de genes de resistencia a antimicrobianos complementaría la técnica del antibiograma de la Microbiología clásica en el estudio de la resistencia bacteriana. Finalmente, la secuenciación y posterior determinación del porcentaje de identidad nucleotídica respecto del GenBank® de uno de los genes detectados otorgó al laboratorio de Microbiología del Departamento de Medicina Preventiva Animal de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile, un control positivo para continuar con los estudios moleculares de resistencia bacteriana / Proyecto FIV Nº 12101401.9102.008

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El presente trabajo corresponde a un estudio transversal que incluyó cepas de Staphylococcus spp. coagulasa positivo de gatos con diversas patologías dermatológicas atendidos en el Hospital Clínico Veterinario de la Universidad de Chile entre marzo a diciembre del año 2010. Se ingresaron 68 muestras de 68 pacientes con afecciones dermatológicas, obteniéndose 30 cepas (44%) de Staphylococcus spp. coagulasa positiva de 30 pacientes, las cuales se identificaron mediante el kit BBL Crystal TM para Gram positivas y se les realizó el estudio de sensibilidad antimicrobiana mediante el método de difusión en placa de Kirby-Bauer, según las normas de Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2008). Los antimicrobianos en estudio fueron: oxacilina, amoxicilina con ácido clavulánico, ampicilina, clindamicina, eritromocina, cefadroxilo, doxiciclina, tetraciclina, sulfametoxazol-trimetoprim, vancomicina, ciprofloxacino y enrofloxacino. Staphylococcus intermedius fue la especie más frecuentemente aislada alcanzando el 67% (20 cepas), seguido por Staphylococcus aureus con un 33% (10 cepas). El 10% del total de cepas en estudio (3 cepas) fueron sensibles a todos los antimicrobianos utilizados, el 37% (11 cepas) fueron resistentes a un antimicrobiano y un 53% (16 cepas) fueron multirresistentes. El 13,3% del total de cepas (4 cepas) fueron resistentes a meticilina, siendo todas identificadas como S. intermedius, todas éstas fueron resistentes a fluoroquinolonas, lincosamidas, macrólidos y sulfonamidas. Ninguna cepa fue resistente a vancomicina / FIV 2009 Código: 12101401.9102.008

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La resistencia a antimicrobianos es una de las amenazas más relevantes a la salud pública mundial. Actualmente es común encontrar bacterias multirresistente, con resistencia extrema e incluso panresistentes dejando escasas alternativas para el tratamiento de las infecciones. Los animales son considerados como reservorios de resistencia a antimicrobianos, transfiriendo genes a otras bacterias patógenas que pueden afectar al ser humano. Es por esto que se han desarrollado diversos programas de vigilancia bajo el concepto “Una Salud”, utilizando bacterias comensales como Escherichia coli para monitorear los niveles de resistencia. El objetivo de este trabajo fue conocer el estado actual de resistencia antimicrobiana en terneros de lechería del sur de Chile, junto con determinar posibles factores de riesgo para la mantención de esta. Se recolectaron heces de terneros sanos, con diarrea y de las camas de las ternereras de 20 predios y se les realizó cultivo para el aislamiento de E. coli y antibiograma con los 7 antimicrobianos más utilizados en bovinos según los reportes del SAG en el año 2015. Adicionalmente se aplicó una encuesta de manejos a los productores. Los resultados muestran que existen niveles elevados de resistencia (sobre el 20%) a oxitetraciclina, amoxicilina, sulfametoxazol-trimetoprim, enrofloxacino y florfenicol, manteniendo bajos niveles de resistencia a gentamicina y ceftiofur. Los terneros con diarrea presentaron mayores niveles de multirresistencia y extrema resistencia. Además, se encontró que, del total de las muestras, un 18,9% de las muestras presentó resistencia a 5 o más antimicrobianos. En relación con los factores de riesgo analizados a partir de la encuesta, no se encontró asociación entre las variables evaluadas y los niveles de resistencia. Por otra parte, se encontró que los terneros de menor edad tenían mayores niveles de resistencia que los terneros mayores (p<0,001). El presente trabajo da cuenta de que existen elevados niveles de resistencia antimicrobiana en los terneros de lechería del sur del país, dejando en evidencia un problema serio y que requiere de acciones urgentes para enfrentarlo dado el potencial riesgo que representa para la salud pública / Antimicrobial resistance is one of the most significant threats to global public health. It is now common to find multiresistant bacteria and even extreme resistance leaving few alternatives for the treatment of infections. Livestock are considered as reservoirs of resistance, transferring genes to other pathogenic bacteria that can even affect the human population. Therefore, several surveillance programs have been developed under the "One Health" concept, using commensal bacteria like E. coli to monitor the resistance levels. Calves found in dairy systems are not exempt from the problem, and it is suggested that there are factors involved in the maintenance and diffusion of resistance. The objective of this work was to assess the current state of antimicrobial resistance in dairy calves of southern Chile and to determine possible risk factors associated with it. Twenty fecal samples were collected from healthy calves, calves with diarrhea and from the closer environment. These were cultured and an antimicrobial resistance testing was performed. A questionnaire was also applied to all the participating producers. The results show that there are high levels of resistance to oxytetracycline, amoxicillin, sulfamethoxazole-trimethoprim, enrofloxacin and ceftiofur, but maintaining low levels of resistance to gentamicin and florfenicol. Calves with diarrhea presented higher levels of resistance and multiresistance. In addition, it was found that 18.9% of the samples presented resistance to 5 or more antimicrobials. In relation to the risk factors evaluated through the questionnaire thought to be involved in the observed antimicrobial resistance levels, none showed statistically significant association. Nevertheless, it was found that younger calves had higher levels of resistance than the older calves (p<0,001). The present work allowed to describe the actual situation on E. coli antimicrobial resistance in dairy calves in southern Chile and defined which are the potentially relevant elements that can participate in the antimicrobial resistance in this complex environment / Financiamiento: Proyecto U-Inicia VID 121017019102106

Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias / Staphylococcus spp. son bacterias que forman parte de la microbiota de seres humanos, principalmente en la nariz, y también son reconocidos patógenos resistentes a múltiples antimicrobianos que producen diversas enfermedades. Se transmite entre humanos y mascotas, por lo que el personal médico y técnico veterinario pueden actuar como reservorios y diseminadores de cepas de Staphylococcus spp. multirresistentes, sin embargo su impacto para la salud pública aún no se ha esclarecido del todo. Por lo anterior, este estudio pretende establecer la presencia de cepas de Staphylococcus spp. meticilino resistentes en la nariz del personal médico y técnico asociado a la atención en clínicas de pequeños animales de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile. Las muestras nasales fueron obtenidas mediante torulado de una fosa nasal, realizando cultivo tradicional en medio selectivo y definiendo las especies aisladas desde la nariz mediante PCR para el gen nuc para las especies S. aureus y S. pseudintermedius. A las cepas aisladas se les hizo antibiograma por Kirby-Bauer de acuerdo al CLSI (2015), incluyendo los siguientes antimicrobianos: amoxicilina (10μg), amoxicilina/ácido clavulánico (30μg), cefoxitin (30μg), cefadroxilo (30μg), ciprofloxacino (5μg), clindamicina (2μg), doxiciclina (30μg), eritromicina (15μg), gentamicina (10μg), mupirocina (30μg). Finalmente, a todas las cepas meticilino resistentes (cefoxitin) se les determinó la Concentración Mínima Inhibitoria (CIM) por un método estándar (CLSI 2015) y la presencia del gen mecA mediante PCR. La portación nasal de Staphylococcus spp. en las 67 personas en estudio fue de 100% y del 51% para Staphylococcus spp. meticilino resistente. Del total de cepas (236) aisladas, 10 correspondieron a Staphylococcus aureus, todas ellas fueron meticilino resistente. El análisis de los antibiogramas del total de cepas de Stpahylococcus spp. permitió la identificación de 56 perfiles de resistencia, donde todas las cepas meticilino resistentes fueron multiresistentes. Los mayores porcentajes de resistencias se presentaron frente a la amoxicilina, clindamicina y eritromicina (28,1%, 19,4% y 16,7% respectivamente). La CIM para la oxacilina varió entre 0,5 y 16 μg/mL en las 56 10 cepas resistentes, logrando identificar la presencia del gen mecA en 47 de las 56 (83,9%) cepas de Staphylococcus spp. meticilino resistentes. Se discuten diferencias de prevalencia según origen de las muestras. Los resultados de este estudio permiten concluir que el personal de la RAV analizado es portador nasal de Staphylococcus spp. meticilino resistentes portadores del gen mecA, situación que, indudablemente, constituye un problema de salud pública que debiera ser abordado de acuerdo a lo recomendado por la OMS, la OIE y FDA / Staphylococcus spp. they are bacteria that are part of the microbiota of humans, mainly in the nose, and are also recognized pathogens resistant to multiple antimicrobials that produce various diseases. It is transmitted between humans and pets, so that medical personnel and veterinary technicians can act as reservoirs and disseminators of strains of Staphylococcus spp. multiresistant, however its impact on public health has not yet been fully clarified. Therefore, this study aims to establish the presence of strains of Staphylococcus spp. resistant methicillin in the nose of medical and technical personnel associated with the care of small animal clinics of the Faculty of Veterinary and Animal Sciences of the University of Chile. The nasal samples were obtained by torulation of a nostril, performing traditional culture in a selective medium and defining the species isolated from the nose by PCR for the nuc gene for S. aureus and S. pseudintermedius species. Isolated strains were tested by Kirby-Bauer according to CLSI (2015), including the following antimicrobials: amoxicillin (10μg), amoxicillin / clavulanic acid (30μg), cefoxitin (30μg), cefadroxil (30μg), ciprofloxacin (5μg), clindamycin (2μg), doxycycline (30μg), erythromycin (15μg), gentamicin (10μg), mupirocin (30μg). Finally, all the methicillin-resistant strains (cefoxitin) were determined the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) by a standard method (CLSI 2015) and the presence of the mecA gene by PCR. The nasal portability of Staphylococcus spp. in the 67 people in the study it was 100% and 51% for Staphylococcus spp. methicillin resistant. Of the total strains (236) isolated, 10 corresponded to Staphylococcus aureus, all of them were methicillin resistant. The analysis of the antibiograms of the total strains of Stpahylococcus spp. allowed the identification of 56 resistance profiles, where all the methicillin-resistant strains were multiresistant. The highest percentages of resistance were presented against amoxicillin, clindamycin and erythromycin (28.1%, 19.4% and 16.7% respectively). The MIC for oxacillin varied between 0.5 and 16 μg / mL in the 56 resistant strains, achieving the presence of the mecA gene in 47 of the 56 (83.9%) strains of Staphylococcus spp. methicillin resistant. Differences in prevalence according to the origin of the samples are discussed. The results of 12 this study allow us to conclude that the personnel of the analyzed RAV is a nasal carrier of Staphylococcus spp. methicillin resistant carriers of the mecA gene, a situation that undoubtedly constitutes a public health problem that should be addressed according to the recommendations of WHO, OIE and FDA

[ES] La resistencia a los antibióticos en la tuberculosis es un grave problema de salud mundial y un obstáculo creciente para el control de la enfermedad. En esta tesis utilizamos la genómica como herramienta para estudiar diferentes aspectos de la biología de la bacteria en relación con el desarrollo de resistencia a los antibióticos y aportar nuevos conocimientos para afrontar el reto de su erradicación. En primer lugar, caracterizamos los nuevos determinantes genómicos de la resistencia a isoniazida utilizando un enfoque basado en genómica funcional y asociación filogenética. El método consiste en la secuenciación de transposones de bacterias expuestas al antibiótico para determinar los genes implicados tanto en sensibilidad como en resistencia, y su filtrado con datos genómicos de una colección global de cepas clínicas. Hemos comprobado la importancia de las rutas metabólicas de síntesis de la pared bacteriana en el mecanismo de acción de los antibióticos, y también hemos descubierto nuevos genes implicados en el equilibrio redox celular que confieren resistencia de bajo nivel. Estos resultados pueden utilizarse para desarrollar nuevas técnicas de diagnóstico o dianas terapéuticas, y el método es aplicable a nuevos antibióticos para predecir futuros determinantes de resistencia. En segundo lugar, exploramos la diversidad bacteriana de la tuberculosis en su sitio natural de infección. Hemos analizado muestras de diferentes partes de la lesión pulmonar de pacientes en Georgia, un país con una alta incidencia de tuberculosis resistente, y hemos detectado un número significativo de infecciones policlonales (causadas por dos o más cepas diferentes). Estas diferentes cepas pueden a su vez ser resistentes a diferentes antibióticos, por lo que es fundamental detectarlas a tiempo. Las muestras quirúrgicas nos dieron una imagen más completa de la diversidad bacteriana que el esputo de rutina, y nos permitieron detectar infecciones policlonales con mayor precisión. Este tipo de infecciones se están subestimando en países con alta carga de TB y pueden afectar negativamente al resultado del tratamiento, por lo que en estos entornos sería recomendable una segunda muestra durante el curso del régimen de antibióticos. Y en tercer lugar, evaluamos el papel del VIH en el desarrollo de resistencias durante las primeras semanas de tratamiento. Para ello, hemos tomado muestras de pacientes de Mozambique con y sin VIH de forma seriada durante el primer mes para analizar cuál es el impacto de la coinfección en las presiones selectivas inmunes y antibióticas. Hemos detectado una mayor diversidad total en los pacientes seronegativos y, en comparación, los pacientes VIH+ presentan dificultades para eliminar esta diversidad durante las etapas tempranas del tratamiento que podrían afectar a su éxito. Gracias a la secuenciación profunda, también hemos podido observar una acumulación de variantes en genes relacionados con resistencia, y hemos asociado algunas de ellas a cambios en las CMI (concentraciones mínimas inhibitorias) de las muestras. Estos pequeños cambios tempranos pueden servir como predictores de una menor capacidad para eliminar la diversidad bacteriana, y podrían indicar un futuro fallo de tratamiento. En resumen, en esta tesis nos hemos centrado en entender mejor los factores bacterianos y del hospedador que impactan el desarrollo de la tuberculosis resistente a antibióticos y como resultado permitirán desarrollar nuevos diagnósticos y modelos epidemiológicos para controlarla. La secuenciación genómica es una gran herramienta para estudiar éste y otros patógenos y ofrece la posibilidad de detectar resistencias rápidamente y con alta precisión en el ámbito clínico. Un correcto diagnóstico asegura un tratamiento adecuado, más corto y exitoso, y además previene la transmisión a nuevos huéspedes. Las técnicas y resultados expuestos aquí contribuyen a lograr estos objetivos y mejorar el control global de la epidemia de TB resistente. / [CA] La resistència als antibiòtics a la tuberculosi és un greu problema de salut mundial i un obstacle creixent per al control de la malaltia. En aquesta tesi utilitzem la genòmica com a eina per estudiar diferents aspectes de la biologia del bacteri en relació amb el desenvolupament de resistència als antibiòtics i aportem nous coneixements per fer front al repte de la seua eradicació. En primer lloc, caracteritzem els nous determinants genòmics de la resistència a isoniazida utilitzant una aproximació basada en genòmica funcional i associació filogenètica. El mètode consisteix en la seqüenciació de transposons de bacteris exposats a l'antibiòtic per determinar els gens implicats tant en sensibilitat com en resistència, i el filtratge amb dades genòmiques d'una col·lecció global de soques clíniques. Hem comprovat la importància de les rutes metabòliques de síntesi de la paret bacteriana en el mecanisme d'acció dels antibiòtics, i també hem descobert nous gens implicats en l'equilibri redox cel·lular que confereixen resistència de baix nivell. Aquests resultats es poden utilitzar per desenvolupar noves tècniques de diagnòstic o dianes terapèutiques, i el mètode és aplicable a nous antibiòtics per predir futurs determinants de resistència. En segon lloc, explorem la diversitat bacteriana de la tuberculosi al seu lloc natural d'infecció. Hem analitzat mostres de diferents parts de la lesió pulmonar de pacients de Geòrgia, un país amb alta incidència de tuberculosi resistent, i hem detectat un nombre significatiu d'infeccions policlonals (causades per dues o més soques diferents). Aquestes soques poden ser resistents a diferents antibiòtics, per la qual cosa és fonamental detectar-les a temps. Les mostres quirúrgiques ens van donar una imatge més completa de la diversitat bacteriana que l'esput de rutina, i ens van permetre detectar infeccions policlonals amb més precisió. Aquest tipus d'infeccions s'estan subestimant en països amb alta càrrega de TB i poden afectar negativament el resultat del tractament, per això en aquests entorns seria recomanable una segona mostra durant el curs del règim d'antibiòtics. I en tercer lloc, avaluem el paper del VIH en el desenvolupament de resistències durant les primeres setmanes de tractament. Per això, hem pres mostres de pacients de Moçambic amb i sense VIH de manera seriada durant el primer mes per analitzar quin és l'impacte de la coinfecció en les pressions selectives immunes i antibiòtiques. Hem detectat una major diversitat total en els pacients seronegatius i, en comparació, els pacients VIH+ presenten dificultats per eliminar aquesta diversitat durant les primeres etapes del tractament que podrien afectar el seu èxit. Gràcies a la seqüenciació profunda, també hem pogut observar una acumulació de variants en gens relacionats amb resistència, i n'hem associat algunes a canvis en les CMI (concentracions mínimes inhibitòries) de les mostres. Aquests petits canvis primerencs poden servir com a predictors d'una capacitat menor per eliminar la diversitat bacteriana, i podrien indicar un futur fracàs del tractament. En resum, en aquesta tesi ens hem centrat a entendre millor els factors bacterians i de l'hoste que impacten el desenvolupament de la tuberculosi resistent a antibiòtics i com a resultat permetran desenvolupar nous diagnòstics i models epidemiològics per controlar-la. La seqüenciació genòmica és una gran eina per estudiar aquest i altres patògens i ofereix la possibilitat de detectar resistències ràpidament i amb alta precisió a l'àmbit clínic. Un diagnòstic correcte assegura un tractament adequat, més curt i exitós, i prevé la transmissió a nous hostes. Les tècniques i els resultats exposats aquí contribueixen a assolir aquests objectius i millorar el control global de l'epidèmia de tuberculosi resistent. / [EN] Antibiotic resistance in tuberculosis is a serious global health problem and a growing obstacle to the control of the disease. In this thesis we use genomics as a tool to study different aspects of the biology of the bacterium in relation to the development of antibiotic resistance and provide new knowledge to meet the challenge of its eradication. First, we characterize new genomic determinants of resistance to isoniazid by using an approach based on functional genomics and phylogenetic association. The method consists of transposon sequencing of bacterial populations exposed to the antibiotic to determine the genes involved in both sensitivity and resistance, and their filtering with genomic data from a global collection of clinical strains. We have verified the importance of the metabolic pathways of bacterial wall synthesis in the mechanism of antibiotic action, and also discovered new genes involved in cellular redox balance that confer low-level resistance to the bacteria. These results can be used to develop new diagnostic techniques or therapeutic targets, and the method is applicable to new antibiotics to predict future resistance determinants. Second, we explored the bacterial diversity of tuberculosis at its natural site of infection and the population dynamics of antibiotic resistance. We have analyzed samples from different parts of the lung lesion from patients in Georgia, a country with a high incidence of resistant tuberculosis, and detected a significant number of polyclonal infections (caused by two or more different strains). These different strains can in turn be resistant to different antibiotics, which makes it essential to detect them in time to offer the patient the most appropriate treatment possible. The surgical specimens gave us a more complete picture of bacterial diversity than sputum, the routine clinical specimen, and allowed us to detect polyclonal infections more accurately. The data show that we are underestimating these types of infections in high TB burden countries and they may adversely affect treatment outcome, so in these settings a second sampling during the course of the antibiotic regimen would be advisable. Third, we evaluated the role of one of the most important comorbidities of tuberculosis, HIV, in the development of resistance during the first weeks of treatment. To this end, we have sampled patients from Mozambique with and without HIV on a serial basis during the first month to analyze the impact of co-infection on both immune and antibiotic selective pressures. We have detected a higher total diversity in seronegative patients and furthermore, in comparison, HIV+ patients present difficulties in eliminating this diversity during the early stages of treatment that could affect their success. Thanks to deep sequencing, we have also been able to observe an accumulation of variants in resistance-related genes, and we have associated some of them with changes in the MICs (minimum inhibitory concentrations) of the samples. These small changes during the first month may serve as predictors of a reduced ability to eliminate bacterial diversity, and could indicate future treatment failure. In summary, in this thesis we have focused on better understanding the bacterial and host factors that have an impact on the development of antibiotic resistant tuberculosis and as a result will allow the development of new diagnostics and epidemiological models to control it. Genomic sequencing is a great tool to study this and other pathogens in real time, and offers the possibility of detecting resistance quickly and with high certainty in the clinical setting. A correct diagnosis ensures adequate, shorter and more successful treatment, and also prevents transmission to new hosts. The techniques and results presented here contribute to achieve these objectives and improve the global control of the resistant tuberculosis epidemic. / Moreno Molina, MÁ. (2023). Functional and evolutionary genomics of antibiotic resistance in tuberculosis: from biology to global DR-TB control [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/199255