Submitted by NATÁLIA GONÇALVES TAKAHASHI GONÇALVES TAKAHASHI (naty_taka@hotmail.com) on 2017-06-07T16:14:24Z No. of bitstreams: 2 Dissertação_Natália_Gonçalves_Takahashi.pdf: 2126549 bytes, checksum: 2e4e7bc6e6b87efa3e00671b6137371c (MD5) Dissertação_Natália_Gonçalves_Takahashi.docx: 17831 bytes, checksum: 978787158c35816170d4451246ee80c5 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-06-07T16:29:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 takahashi_ng_me_jabo.pdf: 2126549 bytes, checksum: 2e4e7bc6e6b87efa3e00671b6137371c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-07T16:29:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 takahashi_ng_me_jabo.pdf: 2126549 bytes, checksum: 2e4e7bc6e6b87efa3e00671b6137371c (MD5) Previous issue date: 2017-06-05 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A busca pela diversificação de fontes da matriz energética, priorizando fontes renováveis, acarreta no maior consumo de etanol de primeira geração, podendo este ser insuficiente em suprir a necessidade da frota brasileira. Dessa forma, o etanol de segunda geração (E2G) surge como uma alternativa para aumento da produção de combustíveis renováveis. Ele é produzido a partir da fermentação dos resíduos de glicose após a quebra da celulose presente na biomassa vegetal. Contudo, além da celulose, a biomassa vegetal é também composta pela lignina, composto considerado recalcitrante no processo de obtenção deste tipo de etanol. Para transpor este obstáculo, é necessário encontrar maneiras de diminuir a quantidade ou modificar a composição da lignina. Fatores de transcrição (FTs) são alvos altamente promissores para a modificação deste polímero, uma vez que estão envolvidos com a regulação de sua via de biossíntese, bem como, da formação de toda parede celular secundária (PCS). Plantas de arroz transformadas para a superexpressão de AtSHN2 de Arabdopsis, apresentaram uma diminuição na quantidade de lignina e mostraram uma modulação na via de celulose, enquanto que a superexpressão do outro gene SHN de Arabidopsis (AtSHN1) em Arabidopsis apresentou uma modificação na via de biossíntese de cera e cutina. Isto ressalta a necessidade de avaliar os FTs de maneira espécie-específica. Assim sendo, este trabalho vem com o objetivo de ajudar a elucidar os mecanismos de funcionamento do FT SHINE (SHN), considerado um potencial regulador da PCS em gramíneas. Para a caracterização do FT SbSHN em sorgo foi primeiramente realizado um alinhamento de sequências de aminoácidos, contendo as proteínas codificadas pelos dois genes SHN em sorgo (SbSHN1 – Sb04g006970 e SbSHN2 – Sb10g023600) com outras sequências SHN disponíveis na literatura. Em seguida foi gerada uma árvore filogenética contendo todos esses mesmos SHN. Após isso, foi realizada a clonagem do FT SbSHN1 em vetor comercial pENTR/D-TOPO (Invitrogen), após verificação, a sequência foi recombinada com vetores de destino. Primeiramente, com o vetor pDEST15 para a expressão heteróloga da proteína SHN em E. coli.. De maneira complementar foi produzido um peptídeo sintético para reconhecimento da proteína SbSHN (anticorpo antiSHN). Posteriormente foi produzido um vetor contendo a sequencia de SHN em fusão com GFP, que foi utilizado para agroinfiltração de folhas de N. benthamiana, a fim de observar a localização subcelular do FT SbSHN. Para determinação da expressão através de qPCR em sorgo foram utilizados a folha, dividida em base e ponta, e a inflorescência, imatura e madura. Além disso, foi realizada a imunoprecipitação de cromatina (ChIP) das inflorescências imaturas e maduras de sorgo, com posterior análise inicial por ChIPqPCR para validação de alguns alvos de SbSHN. Como resultados, através da expressão heteróloga foi produzida uma proteína com massa de aproximadamente 52kDa (massa da proteína SHN adicionada de cauda GST), que foi reconhecida pelo anticorpo antSHN produzido. Foi confirmada a presença do FT SbSHN no núcleo celular, através de observação das folhas transformadas por agroinfiltração. As inflorescências imaturas de sorgo apresentaram maior expressão tanto de SbSHN1 quanto de SbSHN2. Com a técnica de ChIPqPCR foi possível validar in vivo os alvos SbNAC91 (Sb07g001550), SbNAC115 (Sb10g000460), SbMYB87 (Sb07g024970) e SbMYB60 (Sb04g031110) do FT SbSHN em sorgo. Em uma perspectiva de longo prazo, acredita-se que o conhecimento obtido a partir destes estudos não só fornecerão informações importantes sobre a função dos reguladores SHN em todo o reino vegetal, mas também fornecer uma poderosa ferramenta para a engenharia metabólica de compostos fenólicos e lignina por meio de melhoramento convencional ou abordagens transgênicas, impactando diretamente sobre a produção de E2G. / The search for alternative sources of the energy, prioritizing renewable sources, increase the consumption of first generation ethanol, which could not be enough to supply the needs of the Brazilian flex fuel car fleet. In this scenario, second generation ethanol (E2G) appears as an alternative to increase production of renewable fuels. E2G it is produced from the fermentation of glucose residues after breaking the cellulose present in the plant biomass. However, adhered to the cellulose is lignin, a compound considered recalcitrant in the process of obtaining this type of ethanol. To overcome this obstacle, it is necessary to find ways to decrease the amount or modify the lignin composition. Transcription factors (TFs) are highly promising targets for the modification of this polymer, since they are involved in the regulation of its biosynthesis pathway, as well as the formation of the whole secondary cell wall (PCS). Rice plants transformed for the overexpression of AtSHN2 from Arabidopsis showed a decrease in the amount of lignin and a modulation of cellulose pathway whereas the overexpression of another gene of SHN (AtSHN1) in Arabidopsis showed a modification in the biosynthesis pathway of wax and cutin. This highlights the need to evaluate TFs in a species-specific manner. Basing on this, the present work has the objective of helping to elucidate the mode of action of TF SHINE (SHN), considered a potential regulator of PCS in grasses. Aiming to characterize SbSHN TF in sorghum, initially an alignment was performed using amino acid sequence of proteins encoded by the two SHN genes in sorghum (SbSHN1 - Sb04g006970 and SbSHN2 - Sb10g023600) with other SHN sequences available in the literature. Then a phylogenetic tree containing all these SHN sequences was generated. After that, the SbSHN1 FT was cloned into commercial vector pENTR / D-TOPO (Invitrogen) and later used to recombinate in different destination vectors using gateway system. First, the vector pDEST15 was used for the production of heterologous expression in E. coli. Complementary, a synthetic peptide was produced for recognition of the SbSHN protein (antiSHN antibody). In parallel, the vector pK7WGF2 was used to obtain SHN phusioned to GFP. This vector was transientilly expressed in leaves of N. benthamiana in order to observe the subcellular location of SbSHN TF. Complementary, to determine the expression through qPCR, sorghum leaves, were splitted in base and tip, and the inflorescence, in immature and mature developmental stages, were used. In addition, chromatin immunoprecipitation (ChIP) of immature and mature sorghum inflorescences was performed, with initial analysis by ChIPqPCR for validation of some SbSHN targets. As results, through heterologous expression, a protein with mass of approximately 52kDa (mass of the SHN protein added with GST tail) was obtained, which was recognized by the antiSHN antibody produced. The presence of SbSHN TF in the cell nucleus was confirmed by observation of the transformed leaves by agroleakage. The immature inflorescences of sorghum presented higher expression level of both SbSHN1 and SbSHN2 genes. With the ChIPqPCR technique it was possible to validate in vivo some SHN targets such as: SbNAC91 (Sb07g001550), SbNAC115 (Sb10g000460), SbMYB87 (Sb07g024970) and SbMYB60 (Sb04g031110) in sorghum. In a long-term perspective, we believe that the knowledge gained from these studies will not only provide important information about the function of SHN as a master regulators throughout the plant kingdom, but also provide a powerful tool for the metabolic engineering of phenolic compounds and lignin using conventional breeding or transgenic approaches, directly impacting the production of E2G.

Orientador: Ana Carla Pereira Latini / Coorientador: Vânia Nieto Brito de Souza / Banca: Carlos Magno Castelo Branco Fortaleza / Banca: Milton Ozório Moraes / Resumo: hanseníase é uma doença de caráter complexa causada pelo Mycobacterium leprae, que é um patógeno intracelular obrigatório com predileção por macrófagos na pele e células de Schwann nos nervos periféricos. O genoma altamente conservado do bacilo sugere que o patógeno não seja o responsável pela variedade de fenótipos clínicos e biológicos observada na doença, atribuindo grande importância aos fatores genéticos do hospedeiro. Estudos de ligação do tipo genome-wide apontaram um locus de susceptibilidade para a doença na região cromossômica 10p13 e o gene GATA3, localizado na região 10p15, é um forte candidato a fazer parte dessa associação devido à sua localização no genoma e ao seu papel na resposta imune. O GATA-3 é um fator de transcrição clássico na diferenciação de células Th2, no entanto, sabe-se hoje que essa proteína possui outras funções importantes para o sistema imune. Nós empregamos a estratégia de estudo de associação do tipo caso-controle em série, utilizando duas amostras populacionais do Brasil com 1.633 indivíduos, para testar sete variantes genéticas do GATA3. Um estudo funcional também foi conduzido para avaliar o efeito dos polimorfismos associados sobre a expressão de GATA-3 e produção de citocinas. O alelo A do polimorfismo rs10905284 foi associado com resistência para a hanseníase em ambas as amostras. Na análise combinando as duas amostras este efeito do alelo A foi confirmado (OR 0,67; IC95%: 0,54-0,84; p=0,0004). A análise funcional mostrou que os indivíduos portadores do genótipo AA expressam altos níveis da proteína GATA-3 nos linfócitos. Portanto, nós confirmamos que o marcador rs10905284 está associado à hanseníase na população brasileira e influencia os níveis de expressão do fator de transcrição GATA-3 / Abstract: Leprosy outcome is a complex trait and the host-pathogen-environment interaction defines the emergence of the disease. The causative agent of the disease, Mycobacterium leprae, exhibits a conserved genome and could not be accountable for the variety of outcomes observed from exposition, infection and disease. Thus, host genetic risk factors have been successfully associated to leprosy. The 10p13 chromosomal region was linked to leprosy in familial studies and the GATA3 gene is a strong candidate to be part of this association due to its locus and the role that exerts in the immune response. The GATA-3 is a transcription factor involved in the Th2 cell differentiation, however, today it is recognized the ample role of this protein in the immune response. Here, we applied a stepwise strategy to test genetic variants at GATA3 in two case-control samples from Brazil comprising a total of 1,633 individuals. A functional investigation was also conducted to evaluate the effect of the polymorphisms on the GATA-3 protein and the cytokines production. The A allele of rs10905284 marker was associated to leprosy resistance in both samples. In the analysis combining the two samples this effect was reinforced (OR 0,67; CI95%: 0,54-0,84; p=0,0004). The functional analysis showed that individuals carrying AA genotype express higher levels of GATA-3 protein in lymphocytes. So, we confirmed that the rs10905284 is a locus associated to leprosy in the Brazilian population and influences the levels of this transcription factor. / Mestre

Orientador: Fernando Ferreira Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T01:23:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Hollanda_LucianaMariade_D.pdf: 4424025 bytes, checksum: 8c238f31a49b17fab4715981e3919ca2 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Várias mutações hereditárias no gene GATA1 localizadas no éxon 4 e conseqüentemente que afetam o domínio dedo de zinco N-terminal foram descritas em algumas famílias que apresentavam graus variáveis de plaquetopenia com ou sem anemia. Por outro lado, mutações adquiridas no éxon 2 deste gene foram observadas em quase todos os casos estudados de pacientes com Síndrome de Down e que apresentavam TMD ou AMKL. Essas mutações impedem a síntese da proteína total, mas permite a síntese da isoforma menor da proteína, denominada GATA-1s. Experimentos em camundongo sugeriram que a síntese única da isoforma GATA-1s seria suficiente para induzir hemopoese normal nesses animais. Neste trabalho descrevemos em pacientes e portadores de uma família a mutação 332G--C localizada no éxon 2 do gene GATA 1 que conduz a produção apenas da proteína GATA-1s nos homens afetados. Os perfis hematológicos desses pacientes demonstraram anemia macrocítica, neutropenia em vários casos e número normal de plaquetas. Em seu conjunto, esses dados sugerem que a proteína GATA -1s, produzida em níveis normais ou baixos não é suficiente para conduzir à eritropoese normal. Além disso, este é o primeiro estudo onde uma mutação hereditária no éxon 2 do gene GATA1 origina apenas a proteína GATA-1s e não provoca AMKL ou TMD em indivíduos não portadores de síndrome de Down. Desta forma este estudo indica que outros eventos cooperativos, como outras mutações ou a trissomia do cromossomo 21 provavelmente podem ser os responsáveis por essas anomalias em crianças com síndrome de Down / Abstract: Inherited mutations in exon 4 of the GATA1 gene, which codes for the N-terminal zinc finger domain of GATA-1, have been found in some families, leading to a familial dyserythropoietic anemia with thrombocytopenia, X-linked thrombocytopenia and X-linked thalassemia with thrombocytopenia. Acquired somatic mutations in exon 2 of the hematopoietic transcription factor GATA-1 have been found in individuals with Down syndrome with both transient myeloproliferative disorder and acute megakaryoblastic leukemia . These mutations prevent the synthesis of the full-length protein but allow the synthesis of its short isoform, GATA-1s. Experiments in mice suggest that GATA-1s supports normal adult megakaryopoiesis, platelet formation and erythropoiesis. Here we report a mutation, 332G-C, in exon 2 of GATA1, leading to the synthesis of only the short isoform in seven affected males from two generations of a family. Hematological profiles of affected males demonstrate macrocytic anemia, normal platelet counts and neutropenia in most cases. Altogether, data suggest that GATA-1s alone, produced in low or normal levels, is not sufficient to support normal erythropoiesis. Moreover, this is the first study to indicate that a germline splicing mutation does not lead to leukemia in the absence of other cooperating events, such as Down syndrome / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

A transição endotélio-mesenquimal (EndMT) é uma forma especializada da transição epitéliomesenquimal (EMT) e é caracterizada pela alteração da morfologia celular para um formato fibroblastoide, perda da expressão dos marcadores endoteliais e ganho da expressão dos marcadores mesenquimais, bem como a aquisição de propriedades invasivas e migratórias. Entretanto, o mecanismo molecular envolvido nesse processo ainda não está totalmente elucidado. O objetivo desse trabalho foi avaliar os fatores indutores da EMT em células endoteliais (CEs) de fontes distintas por meio da superexpressão do fator de transcrição SNAIL e do tratamento com TGF-?2, bem como identificar os mecanismos moleculares envolvidos nesse processo. Para tal, as linhagens de CE da artéria pulmonar (HPAEC), pool de CE primária de veia de cordão umbilical (PHUVEC), CE da aorta (PAEC) e CE da artéria coronária (CAEC) foram induzidas em três condições distintas: I) TGF-?2; II) superexpressão do fator de transcrição SNAIL; III) superexpressão do fator de transcrição SNAIL associado ao tratamento com TGF-?2 (SNAIL+TGF-?2). Após a indução, a expressão dos genes relacionados com a EndMT foi analisada por PCR em tempo real (qPCR) e as CAECs foram as células que apresentaram maior mudança no perfil de expressão gênica, no qual o grupo SNAIL+TGF-?2 apresentou um aumento dos marcadores mesenquimal FN1, SM22, CNN1 e CD90. O grupo SNAIL+TGF-?2 também mostrou uma diminuição dos marcadores endoteliais CD31 e CDH5 por Western blot. Em seguida, a técnica de microarray foi realizada nas CAECs induzidas à EndMT e as análises revelaram um dendrograma cujo perfil mostrou que SNAIL e SNAIL+TGF-?2 se agrupam separadamente das outras condições. Os dados de microarray resultaram em uma rede na qual os genes mesenquimais COL1A1, COL1A2, FN1 e CNN1 estavam aumentados no grupo SNAIL+TGF-?2 comparado com o grupo controle. Os genes diferencialmente expressos entre a análise CT vs. SNAIL+TGF-?2 foram analisados quanto a participação em vias canônicas e a via de regulação da EMT foi uma das mais representadas, a qual inclui a via de sinalização Notch e Wnt. Nos dados de microarray, NOTCH3 e WNT5B estavam superexpressos no grupo SNAIL+TGF-?2 comparado com o controle. Sabendo que Wnt5b pode inibir a via ?-catenina, a expressão de NOTCH3, WNT5B e ?-CATENINA foi avaliada por qPCR e a expressão de NOTCH3 e WNT5B confirmou os dados do microarray e nenhuma diferença estatística foi observada na expressão de ?- CATENINA. Ainda, as CAECs induzidas foram submetidas ao ensaio de migração e de capacidade de formação de estruturas semelhantes a capilares. Foi observado que as CAECSNAIL+ TGF-?2 migraram significativamente comparadas com as outras condições e nenhuma das células induzidas (TGF-?2, SNAIL e SNAIL+TGF-?2) foram capazes de formar estruturas semelhantes a capilares. Alguns microRNAs foram selecionados e avaliados por qPCR. O miR-let7a foi significativamente expresso no grupo SNAIL e SNAIL+TGF-?2. O ensaio de perda e ganho de função do miR-let7a foi realizado, entretanto, a repressão ou a indução do miR-let7a não alterou a EndMT. Esses resultados sugerem que as CEs de fontes anatômicas distintas apresentam respostas diferentes quando estimuladas a sofrerem EndMT. Ademais, a associação entre SNAIL+TGF-?2 é um potente indutor para EndMT e essa indução pode ser mediada pelas vias de sinalização Notch e Wnt não canônica. / Endothelial-mesenchymal transition (EndMT) is a specialized form of epithelialmesenchymal transition (EMT) which is characterized by changes in cell morphology as a fibroblastoid conversion, expression of endothelial markers decreased, expression of mesenchymal markers increased and acquirement of invasive and migratory properties. However, the molecular mechanism associated with this process is not completely elucidated. The aim of this study was to evaluate the EMT-inducing factors in the endothelial cells (ECs) from different sources through the overexpression of the transcription factor SNAIL and through the treatment with TGF-?2, as well as to identify the molecular mechanisms involved in EndMT. For this purpose, primary pulmonary artery EC (HPAEC), primary pooled umbilical vein EC (PHUVEC), primary aortic EC (PAEC), primary coronary artery EC (CAEC) lineages were induced under three distinct conditions: I) TGF-?2; II) ectopic expression of SNAIL; III) ectopic expression of SNAIL associated with TGF-?2 (SNAIL+TGF- ?2). After the EndMT induction, the expression of the genes associated with EndMT was analyzed by Real time PCR (qPCR) and CAECs showed the most prominent alterations on their gene expression profile which showed that SNAIL+TGF-?2 group presented an increase of mesenchymal markers FN1, SM22, CNN1, and CD90 expression. CAEC-SNAIL+TGF-?2 group also showed a decrease of endothelial markers CD31 and CDH5 by western blot. Then, microarray was performed in CAECs after EndMT induction and hierarchical clustering analysis showed that the ectopic expression of SNAIL and SNAIL+TGF-?2 clustered separately from the other conditions. Microarray data resulted in a network which presented an upregulation of the mesenchymal genes such as COL1A1, COL1A2, FN1, and CNN1 in the CAEC-SNAIL+TGF-?2 compared to control cells. We analyzed the canonical pathways related to the differentially regulated genes between CAEC- SNAIL+TGF-?2 and control cells and the regulation of EMT pathways was the most represented, which includes Notch and Wnt signaling pathway. In the microarray data, NOTCH3 and WNT5B were overexpressed in CAEC-SNAIL+TGF-?2 compared to control. It is known that Wnt5b might inhibit the ?- catenin pathway. Therefore, NOTCH3, WNT5B and ?-CATENIN gene expression were analyzed by qPCR. NOTCH3 and WNT5B gene expression confirmed the microarray data and no statistical difference were observed in ?-CATENIN expression. Moreover, all the CAECs conditions were subjected to scratch migration assay and the formation of capillary-like structures assay. CAEC-SNAIL+TGF-?2 had a significant migration compared to other conditions and the three EndMT inductions (TGF-?2, SNAIL, and SNAIL+TGF-?2) were not able to form capillary-like structures. Some microRNAs were selected and evaluated by qPCR. The miR-let7a was significantly expressed in the SNAIL and SNAIL+TGF-?2 groups. The assay of gain or loss of function of miR-let7a was realized; however, the repression or induction of miR-let7a did not change the EndMT. These results suggest that endothelial cells from distinct anatomical sources have different responses when stimulated to undergo the EndMT. Moreover, the association between SNAIL+TGF-?2 is a potent inductor for EndMT and this induction can be mediated by Notch and non-canonical Wnt signaling pathway activation.

Orientadores: Sérgio Roberto Peres Line, Marcelo Rocha Marques / Texto em português e inglês / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-24T17:45:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ribeiro_MarianaMartins_D.pdf: 2903322 bytes, checksum: 9e0e5e91a22262495ca9bf8ae1d84cec (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: G-Quadruplexes são estruturas secundárias presentes nas moléculas de DNA e RNA, os quais são formados pelo empilhamento de G-quartetos (interação de quatro guaninas (G-tratos) delimitadas por ligações de hidrogênio do tipo Hoogsteen. O intron 1 do gene PAX9 humano tem um G-quadruplex formado na região localizada perto do exon 1, que é conservada entre os mamíferos placentários. Análises de Dicroísmo Circular (CD), e CD melting mostraram que estas sequências são capazes de formar estruturas quadruplex altamente estáveis. Devido à proximidade da estrutura quadruplex ao limite éxon-íntron foi utilizado um ensaio validado de splicing duplo repórter e PCR em tempo real para analisar o seu papel na eficiência de splicing. O quadruplex humano mostrou ter um papel chave na eficiência de splicing do íntron 1 do gene PAX9, já que uma mutação que aboliu a formação do quadruplex diminuiu drasticamente a eficiência de splicing. O quadruplex de rato, menos estável, mostrou menor eficiência quando comparado com sequências humanas. Além disso, o tratamento com 360A, um forte ligante que estabiliza estruturas quadruplex, aumentou ainda mais a eficiência de splicing do íntron 1 do PAX9 humano. Em conjunto estes resultados fornecem evidências de que as estruturas de G-quadruplex estão envolvidas na eficiência de splicing do intron 1 do gene PAX9 / Abstract: G-Quadruplex are secondary structures present in DNA and RNA molecules, which are formed by stacking of G-quartets (i.e. interaction of four guanines (G-tracts) bounded by Hoogsteen hydrogen bonding). Human PAX9 intron 1 has a putative G-quadruplex- forming region located near exon 1, which is conserved among placental mammals. Using Circular Dichroism (CD) analysis, and CD melting we showed that this region is able to form highly stable quadruplex structures. Due to the proximity of the quadruplex structure to exon-intron boundary we used a validated double reporter splicing assay and real time PCR to analyze its role on splicing efficiency. The human quadruplex was shown to have a key role on splicing efficiency of PAX9 intron 1, as a mutation that abolished quadruplex formation decreased dramatically splicing efficiency. The less stable, rat quadruplex had a less efficient splicing when comparing to human sequences. Additionally, the treatment with 360A, a strong ligand that stabilizes quadruplex structures, further increased splicing efficiency of human PAX9 intron 1. Altogether these results provide evidences that G-quadruplex structures are involved in splicing efficiency of PAX9 intron 1 / Doutorado / Histologia e Embriologia / Doutora em Biologia Buco-Dental

Orientadores: Marcelo Menossi Teixeira, Augustina Gentile / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T18:33:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Feltrim_Daniela_M.pdf: 2255232 bytes, checksum: c1f34d09fda3a2de4f7c62d0c7b9ec71 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O presente trabalho possui como objetivo caracterizar fisiológica e funcionalmente um gene de milho que têm expressão relacionada com a tolerância ao cultivo em solo ácido contendo níveis tóxicos de alumínio (Al). Este gene, denominado Zmwrky69, foi identificado na linhagem de milho Cat100-6, tolerante ao Al (Mattiello et al., 2010). A análise da sequência da proteína ZmWRKY69 indica que ela pertence ao grupo III dessa família de fatores de transcrição, apresentando o motivo WRKYGKQ na região amino terminal e o motivo dedo de zinco Cx7Cx23HxC na região carboxi terminal. A proteína ZmWRKY69 está localizada no núcleo, conforme inferido por ensaio de localização subcelular em epitélio de cebola empregando uma fusão da proteína de milho com a proteína verde fluorescente (GFP). Ensaios de duplo híbrido em levedura indicam que a proteína ZmWRKY69 interage com um receptor de giberelina, uma proteína envolvida com a regulação por auxinas e uma proteína com função desconhecida. Plantas transgênicas de tabaco superexpressando Zmwrky69 apresentaram menor inibição do crescimento radicular na presença de Al, comparativamente às plantas selvagens. Esses resultados indicam que o gene Zmwrky69 codifica um fator de transcrição que apresenta um papel importante na tolerância ao Al em milho / Abstract: The objective of the present work is to characterize a gene differentially expressed in the maize inbred line Cat100-6 (aluminum tolerant) grown in acidic soil containing toxic levels of aluminum. This gene called Zmwrky69 was identified in the aluminum tolerant Cat100-6 inbred line (Mattiello et al., 2010). The sequence analysis of the ZmWRKY69 protein indicated that it belongs to the group III of this transcription factor family classification. The protein has the motif WRKYGKQ in the amino terminal region and a zinc finger motif Cx7Cx23HxC in the carboxi terminal region. This protein is localized in the nucleus as inferred by subcellular localization in onion epidermis using a maize protein fused to the Green Fluorescent Protein (GFP). Yeast two-hybrid essays indicate that the protein ZmWRKY69 interacts with a gibberellin receptor, a protein involved in auxin regulation and a protein with an unknown function. Transgenic tobacco plants overexpressing Zmwrky69 presented a lower degree of root growth inhibition in the presence of Al compared to wild type plants. These results indicate that Zmwrky69 gene encodes a transcription factor that presents an important role in Al tolerance in maize / Mestrado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Mestra em Genética e Biologia Molecular

Transtornos depressivos afetam de 1-6% dos adolescentes a cada ano ao redor do mundo. Esse aparecimento precoce anuncia uma doença mais grave e persistente na vida adulta, sendo considerada a terceira principal causa de suicídio na faixa etária entre 14-29 anos. Os exatos mecanismos moleculares envolvidos na fisiopatologia da depressão ainda não são compreendidos, e muitos estudos destacam o processo de apoptose como um possível mecanismo de contribuição para a depressão relacionada ao estresse crônico. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da submissão social em camundongos machos adolescentes, sobre comportamentos emocionais e sobre a localização celular hipocampal do fator de transcrição Max. Metodologia: Camundongos machos adolescentes, C57BL/6, foram submetidos durante 21 dias consecutivos a um modelo de submissão social e ambos os grupos, experimental (n=16) e controle (n=16) foram analisados nos aspectos comportamental, expressão gênica e localização da proteína Max. Resultados: Dados retidos devido à solicitação (publicação de dados, patentes ou diretos autorais). / Depressive disorders affect 1-6% of adolescents each year around the world. This early appearance heralds a more serious and persistent disease in adulthood, being considered the third leading cause of suicide in people aged between 14-29 years. The precise molecular mechanisms involved in the pathophysiology of depression are not yet understood, and many studies highlight the process of apoptosis as a possible mechanism contributing to depression related to chronic stress. Thus, the objective of this study was to evaluate the effects of social defeat in male adolescent mice on emotional behavior and on hippocampal cellular setting of the Max transcription factor. Methodology: C57BL/6 male mice were submitted to 21 consecutive days of a model for social defeat and, both the experimental (n=16) and control groups (n=16) were investigated for behavioral analysis and also for the Max protein expression and settings. Results: Request to retain data (publication, patent or copyright directs).

Os C/EBP (CCAAT/enhancer-binding proteins) são uma família de fatores de transcrição implicados numa variedade de processos da hematopoese, regulando tanto a diferenciação terminal como a proliferação celular. Dentre estes, sabe-se que o C/EBP gamma (C/EBPG) está envolvido na maturação funcional de células Natural Killer (NK). Entretanto, os mediadores dessa regulação não são conhecidos. As células NK são linfócitos com funções efetoras de citotoxicidade e de produção de citocinas, dependentes de um equilíbrio dinâmico entre a expressão de receptores ativatórios e inibitórios bem como de receptores de citocinas. As duas funções (citotóxica e secretora), fazem das células NK importantes componentes da hematopoese, capazes de eliminar alvos susceptíveis bem como de recrutar outras células e amplificar a resposta inflamatória. Diante de incompatibilidade entre as células-alvo e células NK efetoras, os efeitos citotóxicos preponderam; enquanto na ausência de incompatibilidade, os efeitos mediados por citocinas sobre as demais células hematopoéticas se sobressaem. Por exemplo, citocinas como IFN?, TNF?, TGF?, GM-CSF e IL-10, produzidas por células NK, são potenciais reguladoras da função das células-tronco hematopoéticas (CTH). Com o objetivo de estudar a regulação das células NK pelo C/EBPG, utilizamos células NK isoladas de animais transgênicos knockout (KO) para o C/ebpg e seus controles para analisar sua expressão gênica e função diferencial, com especial foco nos genes-alvo com potencial para regulação da hematopoese. Visando identificar potenciais genes-alvo do C/EBPG, isolamos células NK deficientes para o C/ebpg e controles, por meio de sorting, e realizamos posterior isolamento do RNA seguido de análise de expressão gênica em larga escala. A validação da expressão diferencial dos genes-alvo do C/ebpg, de interesse para a função secretória das células NK, foi realizada por PCR em Tempo Real para oito genes diferencialmente expressos na análise de expressão gênica em larga escala, a saber: Il-10, Gmcsf, Ifng, Tnfa, Tgfb, Tlr4, Myd88 e Irak4. Os dados referentes à expressão basal e estimulada com IL-2, destes genes em células NK de animais KO para o C/ebpg e seus controles, revelaram uma tendência ao aumento da expressão de Myd88 nos animais KO quando comparados aos controles. Foram verificados os níveis das citocinas IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, TNF? and IFN? por meio de citometria de fluxo, utilizando o sobrenadante da cultura de NK de ambos os animais, observando-se que, após a ativação com IL-2, a produção de IFN? mostrou-se diminuída em células NKdeficientes para o C/ebpg em comparação aos controles. Para caracterizar as células NK Cebpg-deficientes, analisamos a sua frequência (células linhagem-/CD3- /NK1.1+) e expressão dos receptores NKG2D, Ly49D e NKG2A, não sendo observadas diferenças numéricas ou de expressão de receptores entre células NK deficientes ou não para o C/ebpg. Os subtipos funcionais destas células foram caracterizados de acordo com a expressão de CD27 e CD11b, que permitem identificar as subpopulações de células NK imaturas secretórias, secretórias, citotóxicas e tolerantes. Os animais KO mostraram maior percentagem de células secretórias e redução percentual e numérica de células citotóxicas quando comparadas às células NK dos controles. Para demonstrar a deficiência funcional realizamos um ensaio de ativação de células. Em concordância, após a coincubação de esplenócitos totais com células YAC-1, o ensaio de detecção do CD107 revelou que as células dos animais KO para o C/ebpg são cinco vezes menos ativadas do que células NK controles. Ademais, foi realizado um ensaio de citotoxicidade por citometria de fluxo utilizando o CTO (Cell Tracker Orange) como sonda fluorescente, o qual se incorpora às células-alvo da linhagem YAC-1. Como resultado, para a razão 10:1 NK: células-alvo, as células NK C/ebpg KO foram menos citotóxicas do que as células NK dos controles. Concluímos que as células NK de animais transgênicos KO para o C/ebpg têm função deficiente, menor potencial citotóxico e expressão de genes e citocinas alteradas em relação aos seus controles. Os mediadores apontados, em especial, o IFN?, são alvos importantes para a regulação da função secretória das células NK. / C/EBP (CCAAT/enhance-binding proteins) are a family of transcription factors involved in a variety of hematopoietic processes, regulating both terminal differentiation and cellular proliferation. Among these, it is known that C/EBP gamma (C/EBPG) is involved in the functional maturation of Natural Killer (NK) cells. However, the mediators of this regulation are unknown. NK cells are lymphocytes with effector functions of cytotoxicity and production of cytokines, both dependent on a dynamic equilibrium between the expression of activating and inhibitory receptors as well as cytokine receptors. The two functions (cytotoxic and secretory) make NK cells important components of hematopoiesis, able to eliminate susceptible targets as well as recruit other cells to amplify inflammatory responses. In face of incompatibility between target cells and NK effector cells, cytotoxic effects predominate; while in the absence of incompatibility, cytokine-mediated effects that influence other hematopoietic cells prevail. For example, cytokines such as IFN?, TNF?, TGF?, GMCSF and IL-10, produced by NK cells, are potential regulators of hematopoietic stem cells (HSC). With the aim of studying the regulation of NK cells by C/EBPG, we isolated NK cells from transgenic C/ebpg knockout (KO) animals and controls to analyze their differential gene expression and function, with a special focus on hematopoiesis regulation. In order to identify potential C/EBPG target genes, we isolated C/ebpg-deficient and control NK cells by the use of sorting by flow cytometry and isolated RNA for gene expression analysis. Differential expression of C/ebpg target genes was performed by Real-time PCR for eight genes differentially expressed in the microarray analysis: Il-10, Gmcsf, Ifng, Tnfa, Tgfb, Tlr4, Myd88 e Irak4. When compared to controls, non-activated and IL-2-stimulated C/ebpg KO NK cells presented a tendency to have higher expression of Myd88. Cytokine levels of IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17?, TNF? and IFN?, obtained from NK culture supernatants, were verified by flow cytometry, after IL-2 activation. Among these cytokines, the production of IFN? by C/ebpg-deficient NK cells was found to be reduced. To further characterize NK cells, we analyzed their frequency (Lineage- /CD3-/NK1.1+ cells) and the expression of the receptors NKG2D, Ly49D and NKG2A, and both analyses presented similar expression between control or C/epbg KO NK cells. The functional subtypes of these cells were characterized according to the expression of CD27 and CD11b, which allow the identification of NK subpopulationsas immature secretory, mature secretory, cytotoxic or tolerant. The KO animals showed higher percentage of secretory cells and percentual and numerical reduction of cytotoxic cells when compared to the NK control cells. In agreement, CD107a expression was 5-times lower in C/ebpg KO splenocytes than in control splenocytes after co-incubation with YAC-1 cells. In addition, a cytotoxicity assay by flow cytometry was performed. The fluorescent probe CTO (Cell Tracker Orange) was incorporated to YAC-1 cells, used as target cells. As a result, in the 10:1 NK:target cells ratio, C/ebp KO cells were less cytotoxic than NK control cells. We concluded that C/ebpg-deficient cells are dysfunctional, have a greater secretory potential and an altered expression of genes and cytokines as compared to their controls. The potential mediators revealed by our study, in particular, IFN?, may be important targets for the regulation of NK secretory function.

O fungo filamentoso Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) é o principal produtor de enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas utilizadas para a produção de biocombustíveis a partir de biomassa lignocelulósica. Para que o custo de produção de etanol de segunda geração (2G), em escala industrial, seja competitivo, uma mistura eficiente de enzimas hidrolíticas é necessária para degradar a biomassa vegetal em açúcares fermentescíveis. Dada a crescente demanda pelo desenvolvimento de processos que reduzam os custos de enzimas de interesse biotecnológico, o presente trabalho se propôs a analisar o perfil global do transcriptoma de T. reesei em presença de celulose, soforose e glicose como fontes de carbono, a fim de prover um melhor entendimento de como essas enzimas são produzidas por esse microrganismo. Para isso, foi utilizada a abordagem RNA-seq e duas linhagens de T. reesei: QM9414 (parental) e xyr1 (mutante). No Capítulo I, foram anlisados 22 genes que codificam celulases e xilanases, com o intuito de verificar a regulação da expressão gênica pelo fator de transcrição XYR1 em diferentes fontes de carbono. Foi observada uma dependência da fonte de carbono e redução da expressão destes genes que codificam celulases e xilanases quando se comparou a linhagem mutante com a parental, cultivados na presença de celulose e soforose. Na presença de glicose, a maior parte dos genes analisados apresentou aumento de expressão no mutante xyr1. Por meio de análises in silico foi identificado o elemento regulatório cis para o fator de transcrição XYR1 usando quatro conjuntos de dados de genes dependente-condição envolvendo os experimentos RNA-seq e qPCR-TR. Foram identificados dois motivos com o consenso de ligação proposto para o regulador XYR1 (nomeado PWMXYR1). Ao usar esses motivos identificados, foi analisada a presença e disposição dos putativos elementos regulatórios cis nesses conjuntos de dados, sendo que sítios com intervalos curtos foram mais associados a promotores dependentes de XYR1 do que sítios simples. Além disso, a abordagem utilizada permitiu a identificação de sítios de ligação XYR1, na região promotora dos genes cel7a e xyn1 e mapear a potencial sequência alvo do regulador na região promotora do gene cel6a. Adicionalmente, sete outros promotores (genes cel7b, cel61a, cel61b, cel3c, cel3d, xyn3 e swo) apresentaram sítios de ligação putativos de XYR1. Usando a arquitetura do regulador PWMXYR1, foram identificados potenciais genes alvos de regulação direta por XYR1 no genoma de T. reesei. O mapeamento do referido sítio foi realizado, também, nos genes diferencialmente expressos na linhagem mutante xyr1, destacando que a regulação indireta desempenha um papel fundamental nas vias de sinalização. Estes resultados fornecem novas informações sobre os mecanismos de sinalização mediados por XYR1 na regulação de promotores de celulases. No Capítulo II, foi analisado o transcriptoma global da linhagem parental (QM9414) em diferentes fontes de carbono: celulose; soforose e glicose. Aplicando limites rigorosos de corte, 2060 genes foram identificados como diferencialmente expressos em pelo menos uma das fontes de carbono analisadas. Clusterização hierárquica desses genes diferencialmente expressos identificaram-se três possíveis regulons, representando 123 genes controlados por celulose, 154 genes controlados por soforose e 402 genes controlados por glicose. A análise da rede regulatória demonstrou a inter-relação existente entre as condições, permitindo a identicação de 75 genes específicos do crescimento em soforose e 107 de celulose. Esses resultados revelaram novos genes envolvidos na degradação da celulose, tais como: proteínas acessórias, transportadores, fatores de transcrição e CAZymes que respondem especificamente a presença de celulose ou soforose. No Capítulo III, analisou-se o perfil transcricional da linhagem mutante xyr1 comparando com a linhagem parental (QM9414), na presença das três fontes de carbono. As análises de expressão gênica revelaram que 2185 genes foram diferencialmente expressos na condição celulose, 2124 genes na condição soforose e 46 genes em glicose. Esses genes foram utilizados para analisar a inter-relação existente entre as condições, com destaque para grande número de genes exclusivos nas condições de indução (celulose e soforose). Por meio da clusterização hierárquica foram identificados 6 possíveis regulons, sendo 3 deles compostos por genes up-regulados e 3 regulons por genes down-regulados. Na ausência do regulador XYR1, a expressão de genes CAZys, fatores de transcrição, transportadores, entre outros, foram afetadas de modo dependente da fonte de carbono. Essas análises permitiram verificar que o fator de transcrição XYR1 é fundamental no processo de indução de enzimas de interesse biotecnológico, além de participar de outros processos bioquímicos/moleculares. Desse modo, todos os resultados obtidos fornecem informações sobre os eventos moleculares envolvidos na regulação da expressão gênica durante a adaptação de T. reesei frente a diferentes condições ambientais como: diferentes fontes de carbono e necessidades nutricionais. Contribuindo, assim, para uma melhor caracterização desse fungo filamentoso em relação à produção de enzimas e o desenvolvimento de mutantes metabólicos para utilização industrial. / The filamentous fungus Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) is a major producer of cellulolytic enzymes used for biofuels production from lignocellulosic biomass. In order to achieve a low cost second generation ethanol production in industrial scale, an efficient mix of hydrolytic enzymes are required for the degradation of plant biomass into fermentable sugars. Given the growing demand for development of processes in order to reduce the cost of enzymes production, the present work proposes a large-scale transcriptomic analysis of T. reesei in presence of cellulose, sophorose, and glucose as carbon sources, in order to provide insights about the mechanisms of enzymes production by this microorganism. For this purpose, RNA-seq approach was employed, as well, as two T. reesei strains: QM9414 (parental) and xyr1 (mutant). In Chapter I, 22 genes encoding cellulases and xylanases were analyzed regarding the regulation through the transcription factor XYR1. This regulation seems to occur in a carbon source dependence manner, and the expression of cellulases and xylanases was diminished in the mutant strain compared to the parental strain in the presence of cellulose and sophorose. In glucose, most of the analyzed genes showed higher expression in the mutant compared to the parental strain. In silico analysis identified a cis regulatory element for XYR1 using four datasets of condition-dependent genes based on RNA-seq and qPCR experiments. Two binding motifs have been identified with the proposed consensus for the XYR1 (named PWMXYR1). Using these motifs, the presence and arrangement of putative cis regulatory elements was analyzed, and the results indicate that the sites with short intervals were stronger associated with XYR1 dependent promoters than single sites, even with high scores. Moreover, this approach allowed the identification of XYR1 binding sites in the promoter region of cel7a and xyn1, as well as, map the potential target sequence in the promoter of cel6a gene. In addition, seven other promoters from genes cel7b, cel61a, cel61b, cel3c, cel3d, xyn3 and swo presented XYR1 putative binding sites. Using the cis-regulatory architecture of PWMXYR1, potential targets for direct regulation by XYR1were identified in a genome wide manner. The putative binding sites were also mapped in the differentially expressed genes identified in the mutant strain xyr1, suggesting that indirect regulation plays a key role in signaling pathways. Taken together, the data provided here provides important information regarding signaling mechanisms mediated by XYR1 in the regulation of cellulases promoters. In Chapter II, the transcriptome of the parental strain (QM9414) was analyzed in three carbon sources, cellulose, sophorose and glucose. By applying a stringent cut-off threshold, 2,060 genes were identified as differentially expressed in at least one of the carbon sources analyzed. Hierarchical clustering of differentially expressed genes identified three possible regulons, representing 123 genes controlled by cellulose, 154 genes controlled by sophorose and 402 genes controlled by glucose. The analysis of the regulatory network demonstrated the interrelation between the conditions, allowing the identification of 75 genes specifically expressed in soforose and 107 in cellulose. These results revealed new players involved in cellulose degradation, such as accessory proteins, transporters, transcription factors and CAZymes, that specifically respond to the presence of either cellulose or sophorose. In Chapter III, a genome wide comparative transcriptional analysis were performed between the mutant xyr1 strain and the parental strain (QM9414) using the three carbon sources. Gene expression analysis revealed 2,185 genes differentially expressed in cellulose, 2124 genes in sophorose and 46 genes in glucose. These differentially expressed genes were used to analyze the relationship between the conditions, revealing a greater number of exclusive genes in theinducing conditions (cellulose and sophorose). The hierarchical clustering analysis revealed 6 possible regulons, being three composed by up-regulated genes and 3 regulons composed by down-regulated genes. In the absence of the regulator XYR1, the expression of CAZy genes, transcription factors among other genes were affected in a carbon-dependent manner. These analyses showed that the transcription factor XYR1 has an essential role in induction of enzymes of biotechnological interest and participates in other biochemical/molecular processes. Taken together these results provide important information about the molecular events, involved in gene expression regulation during T. reesei adaptation to different environments such as: carbon sources and/or nutritional needs, thus contributing to a better understanding of this filamentous fungus regarding the the production of enzymes and the development of mutants for industrial applications.

Para compreensão da biologia dos tumores adrenocorticais são utilizados marcadores moleculares que em geral são genes reguladores do ciclo celular. AP-1 é um fator dimérico composto principalmente pelas proteínas JUN (JUN, JUNB e JUND) e FOS. Nesse projeto tivemos como hipótese que as proteínas da família JUN, se correlacionam com proteínas reguladoras do ciclo celular em tumores adrenocorticais, e poderiam ser utilizados no diagnóstico e prognóstico desse tipo de tumor. O objetivo foi analisar o padrão de expressão gênica e proteica (PCR e Immunobloting). A análise por PCR Array em culturas de células de tumores adrenais, mostrou que os genes da família JUN e o gene FOS estão pouco expressos nessas culturas, o que foi confirmado em ensaios de qPCR. Não foi possível determinar um padrão de expressão que diferenciasse os tipos de culturas celulares estudados, ou mesmo tumores adultos e pediátricos. Os tratamentos com ACTH aumentam a expressão da proteina JUN e JUNB, e podem ter certa importância em tumores responsivos à esse hormônio, que merecem análises futuras. / In order to have a better comprehension of adrenocortical tumor biology, molecular markers are utillized because they are in general cell cycle regulators. AP-1 is a dimeric factor, compound mainly by JUN (JUN, JUNB, JUND) and FOS proteins. In the present study, our hypothesis is that JUN proteins are correlated with others cell cycle regulatory proteins and could be utilized as a prognose and diagnostic predictor for adrenocortical tumors. To confirm our hypothesi the aim was genic and protein profile analyzes (PCR and Immunobloting). The PCR Array analysis showed that JUN and FOS gene expression were down regulated in these adrenocortical tumors cells which were confirmed through qPCR analysis. The genes expression analysis wasn´t able to stablish a standard of expression between the studied cell cultures or even between adults and pediatric tumors. The ACTH treatments increased JUN and JUNB proteins that may have some significance in responsive tumors to this hormone, and deserve further analysis.