Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Weeds are one of the major problems in the agricultural products cultivation and the main strategy of control is the use of chemical herbicides. Although is efficient, the herbicides bring direct and indirect consequences that overcome its benefits and this opened the way for bioherbicides. A significant barrier in the bioherbicide production is the development of an economically viable fermentation process. This way the aim of this work was to assess the production of a bioherbicide from the Phoma sp. fungus by submerged fermentation and solid-state fermentation, optimizing the fermentation medium in both cases and evaluating the herbicidal activity from the fermentation extracts in the control of the target plants. The culture medium was optimized and the cell growing was monitoring as response in the submerged fermentation. The optimum composition for the synthetic medium was glucose and peptone at 20 gL-1, yeast extract 7.5 gL-1 and an initial pH of 6.0. For the industrial medium, the ideal composition was 20 gL-1 of sucrose, 8 % CSL and initial pH of 6.0. Under these conditions, the maximum biomass obtained was 22 and 33 gL-1, for the synthetic and industrial medium, respectively. Therefore it was possible to obtain a 50 % higher biomass production in the industrial medium, reducing the cost of this fermentation medium. In the solid fermentation the composition of the culture medium was evaluated for obtaining the maximum herbicide action on target plants (cucumber). Bioassays were realized and the plant height, fresh weight, dry weight and phytotocixity mainly were the responses evaluated. The results obtained in the bioassays demonstrate that the bioherbicide presented activity towards the target plant and the intensity of the effect was influenced by the formulation of the fermentation medium. The optimized condition for bioherbicide production was moisture at 70 %, soybean bran of 30 wt% and CSL of 20 wt%, being possible to obtain a moderate injury, usually with recovery. The bioherbicide produced showed a mode of action based on the inhibition of carotenoids biosynthesis. / As plantas daninhas são um dos principais problemas no cultivo de produtos agrícolas e o principal método de controle é o uso de herbicidas químicos. Embora eficiente, os herbicidas trazem consequências diretas e indiretas que superam os benefícios em muitos casos, abrindo assim caminho para o desenvolvimento de bioherbicidas. Uma barreira significativa na produção de muitos bioherbicidas é o desenvolvimento de um processo economicamente viável, logo, os objetivos deste trabalho foram produzir um bioherbicida a partir do fungo Phoma sp. por fermentação submersa e fermentação em estado sólido, otimizar o meio de fermentação em ambos processos e avaliar a atividade herbicida dos extratos das fermentações no controle de plantas-teste. Na fermentação submersa foi otimizado o meio de cultivo e monitorado o crescimento celular como variável resposta. A composição otimizada do meio sintético foi 20 gL-1 de glicose e peptona, 7,5 gL-1 de extrato de levedura e pH inicial de 6.0. Para o meio industrial, a composição otimizada foi 20 gL-1 de sacarose, 8 % de água de maceração de milho (AMM) e pH inicial de 6.0. Nessas condições a máxima biomassa obtida foi de 22 e 33 gL-1, para o meio sintético e industrial, respectivamente, com uma produção de biomassa 50 % maior para o meio industrial e ainda possibilitou a redução do custo deste meio de fermentação. Na fermentação sólida foi otimizada a composição do meio de cultivo para obter a máxima ação do bioherbicida em plantas de pepino. Bioensaios foram realizados e o teste de Tukey mostrou que a altura da planta, massa verde da parte aérea, massa seca da parte aérea e principalmente os sinais de fitotoxidade foram significativos, entretanto, o comprimento do sistema radicular, a massa verde do sistema radicular, massa seca do sistema radicular e número de flores não apresentam resultados significativos. Os resultados obtidos nos bioensaios demonstraram que o bioherbicida apresenta atividade em plantas de pepino e a intensidade do efeito foi influenciado pela formulação do meio de fermentação. A condição otimizada para produção do bioherbicida foi 70 % de umidade, 30 % (p/v) de farelo de soja e 20 % (p/v) de AMM, nessas condições o nível de injúria obtida foi moderada com recuperação. O bioherbicida produzido mostrou um possível modo de ação baseado na inibição de biossíntese de carotenóides.

Fundação de Amparo a Pesquisa no Estado do Rio Grande do Sul / In this work, 150 fungal strains isolated in the Pampa biome were evaluated for. The microbial oil was produced by submerged fermentation in shaken flasks at 120 rpm, 28 °C for 7 days. The lipids were extracted from cells by Soxhlet (AOAC) method and the fatty acids profile determined by gas chromatography (GC-FID). Seven strains presented the best results in terms of lipids production, which were selected to evaluate the influence of temperature on microbial oil production and PUFA profiles. The fermentations were conducted under the same conditions previously defined at 15 and 28 °C. The fungus SPII65, identified as belonging to the genus Nigrospora sp., produced the highest level of lipids, yielding 11.28% and 6.02% with PUFAs production of 51.94% and 42.39% at 28 °C and 15 °C, respectively. From the results obtained, it was conceived a Plackett-Burmann design to investigate the main effects of temperature (15-25 °C), pH (4.0-6.0), agitation (120-200 rpm), corn steep liquor concentration (5-15% (v/v)) and sucrose (60-180 g/L). The largest production of PUFAs (55.75%) was observed in the smallest evaluated temperatures (15 °C), whereas the maximum lipid production was 5.54% at 25 °C. Lower lipid contents were produced using industrial medium compared to the results obtained with synthetic medium. PUFAs profiles were similar in the culture media evaluated. / O objetivo deste trabalho foi selecionar micro-organismos do Bioma Pampa com potencial para a produção de ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs). Foi avaliada a capacidade de produção de lipídeos de 150 cepas fúngicas, isoladas de plantas daninhas de áreas de cultivo de arroz irrigado e pastagens do Bioma Pampa. Os fungos foram cultivados em meio de cultura Batata Dextrose Ágar (BDA) a 28 °C durante 7 dias. Após esse período, foram repicados sucessivamente, em meio BDA, até a obtenção de colônias isoladas. A produção de óleo microbiano foi realizada através de cultivo submersa das 150 cepas isoladas, utilizando frascos mantidos sob agitação orbital a 120 rpm, 28 °C durante 7 dias. A determinação de lipídeos foi realizada através do método de Soxhlet e o perfil de ácidos graxos através de cromatografia gasosa (GC-FID). Dentre as cepas avaliadas, sete apresentaram maior produção de lipídeos, sendo, portanto, realizada nova fermentação onde foi avaliada a influência da temperatura na produção e perfil do óleo microbiano. A fermentação foi conduzida nas mesmas condições definidas anteriormente e as temperaturas avaliadas foram 15 e 28 oC. O fungo codificado SPII65, identificado como pertencente ao gênero Nigrospora sp., produziu o maior teor de lipídeos tanto a 28 oC quanto a 15 oC, produzindo 11,28% e 6,02%, respectivamente. Em relação aos PUFAs a produção foi de 51,94% a 28 ºC e 42,39% a 15 ºC. Através dos resultados obtidos, foi delineado um planejamento experimental do tipo Plackett-Burman, onde as variáveis estudadas foram: temperatura (15-25 ºC), pH (4,0-6,0), agitação (120-200 rpm), concentração da água de maceração de milho (5-15% (v/v)) e sacarose (60-180 g/L) durante 14 dias. A maior produção de PUFAs (55,75%) foi verificada nas menores temperaturas avaliadas (15 oC). Já a maior produção de lipídeos (5,54%) foi observada na temperatura de 25 oC. Foram produzidos menores teores de lipídeos utilizando meio industrial comparado aos resultados obtidos com meio sintético. Os perfis de PUFAs obtidos foram semelhantes nos meios de cultura avaliados.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A fisiologia microbiana é uma área promissora da biotecnologia para a síntese de compostos de elevado valor agregado. Os micro-organismos apresentam vantagens devido ao menor período de geração, às facilidades de modificações fisiológicas e genéticas e à grande diversidade de processos metabólicos. O objetivo deste trabalho foi degradar óleos e gorduras de efluente lácteo por lipases produzidas por Yarrovia lipolytica. Planejamentos fatoriais foram utilizados para investigar os efeitos de variáveis em três etapas: em fermentação para produção de lipases, em formulação de bioproduto com atividade lipásica para estabilização da ação catalítica da enzima e em tratamento de soro de queijo para degradação de óleos e gorduras. Na presença de resíduo de refinaria de óleo vegetal a 3 % e cloreto de amônio a 0,2 g.L-1 com 48 h a 28 oC, lipases foram produzidas sob cultivo submerso. O líquido metabólico livre de células com atividade lipásica foi estabilizado com sorbato de sódio a 0,5 %, glicerol a 5 % e RENEX-95 a 10 %. Esse bioproduto apresentou 177 UI.mL-1 da atividade enzimática durante 30 dias sob armazenamento à temperatura ambiente (27 - 30 oC); pH ótimo 5,0 e 7,0, temperatura ótima de 50 oC e estabilidade térmica durante 120 min com retenção de 100 % da atividade enzimática a 50 oC e pH 5,0. A aplicação de 7 % do bioproduto durante 12 h de tratamento de efluente lácteo degradou 98 % dos óleos e gorduras presentes no soro de queijo. As lipases produzidas por Y. lipolytica e formuladas com substâncias estabilizadoras tem potencial para serem aplicadas na degradação de óleos e gorduras. / The microbial physiology is a promising area of biotechnology for the synthesis of compounds of high value. The micro-organisms have advantages because of their shorter generation facilities to physiological and genetic changes and the wide variety of metabolic processes. The aim of this study was to degrade oils and fats from lipases produced by Yarrovia lipolytica. Factorial designs were used to investigate the effects of variables in three stages: fermentation for lipase production, bioproduct formulation for stabilization the catalytic action of lipases and treatment of whey for degradation of fats and oils. In the presence of a vegetable oil residue at 3 % and ammonium chloride at 0,2 g.L-1, during 48 h at 28 oC, lipases were produced under submerged cultivation. The cell-free liquid metabolic was stability with sodium sorbate at 0.5 %, glycerol at 5 %, RENEX-95 at 10 %. This bioproduct presented 177 UI.mL-1 of the lipase activity during 30 days of storage at room temperature (27 - 30 C); it showed optimum pH at 5.0 and 7.0, optimum temperature of 50 oC and thermal stability for 120 min with retention of 100 % of the enzyme activity at 50 oC and pH 5,0. The application of the bioproduct at 7 % during 12 h degraded 98 % of oils and fats present in cheese whey. The lipases produced by Y. lipolytica and formulated with stability agents have potential to be applied in the degradation of oils and fats.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-11-16Bitstream added on 2014-06-13T19:14:40Z : No. of bitstreams: 1 silva_rr_me_sjrp.pdf: 961028 bytes, checksum: 0d7989443c42fd25745d208364a42a88 (MD5) / A produção de proteases de origem microbiana depende das condições de cultivo e da diversidade bioquímica de cada espécie. Estudos comparativos entre fermentação em estado sólido (FES) e fermentação submersa (FSm) usando farelo de trigo e meio sintético, respectivamente, foram realizados para a determinação dos parâmetros de produção de proteases pelo fungo Aspergillus fumigatus Fresenius. A melhor produção de protease foi em FES no período de 96 horas utilizando farelo de trigo, temperatura de 30 ºC e 1x106 esporos/5g de substrato com 1.517 U/mL. Em FSm o pico de produção foi em pH 6,0, a 30ºC, 5x105 esporos/mL de meio no período de 72 e 96 horas em meio contendo 0,5 e 0,25% de caseína, respectivamente, ambos com 40 U/mL. Conforme a produtividade dos processos fermentativos, o extrato enzimático da FES foi utilizado para estudos de purificação e caracterização bioquímica. Neste estudo, a protease purificada apresentou atividade ótima em pH 7,5 e 50ºC, sendo inibida por Fenil-metil-sulfonil-fluoreto (PMSF) e mais intensamente por antipaína (1,6 µM). Sobre efeito de íons, foi observado modulação da atividade proteolítica, principalmente com inibição por AlCl3, cuja atividade proteolítica residual foi de 18% após incubação com este íon. Na presença de Ditiotreitol (DTT) e uréia houve diminuição da atividade proteolítica, apresentando atividades residuais de 63% em 200 mM de DTT e 10% com 5 M de uréia. Comparativamente, na concentração de 0,1% de cada surfactante estudado, notou-se redução da atividade proteolítica, sendo 97% em presença de Brometo de cetil-trimetil amônio (CTAB), 79% para 4 - (1,1,3,3 - Tetrametilbutil) fenil- polietileno glicol (Triton X-100), 55% com Polyoxyethylenesorbitan monolaurato (Tween-20) e completa redução da atividade (0%) em... / The microbial protease production depends on growing conditions and the biochemical diversity of each species. Comparative studies between solid-state fermentation (SSF) and submerged fermentation (SmF) using wheat bran and synthetic medium, respectively, were performed to determine the optimum parameters for protease production by the fungus Aspergillus fumigatus Fresenius. The best protease production was in SSF within 96 hours using wheat bran, temperature 30°C and 1x106 spores/5g of substrate, with 1,517 U/mL. In SmF peak production was at pH 6.0 at 30°C, 5x105 spores/mL of media within 72 and 96 hours in medium containing 0.5 and 0.25% casein, respectively, with 40 U/mL. According to the productivity of the fermentative processes, enzymatic extract was used from SSF to study purification and biochemical characterization. In this study, purified protease showed optimum activity at pH 7.5 and 50°C, and inhibited by Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) and more intensely for antipain (1,6 µM). Concerning to the effect of ions, we observed modulation of the proteolytic activity, especially with inhibition by AlCl3, which residual activity was of 18 % after incubation with this ion. In the presence of Dithiothreitol (DTT) and ureia, we observed progressive decrease in proteolytic activity, presenting residual activities of 63% with 200 mM DTT, and 10% with 5 M ureia. Comparatively, in the concentration of 0.1% of each surfactant studied, there was a reduction in the proteolytic activity in 97% in presence of Cetyl trimethylammonium bromide (CTAB), 79% with 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol (Triton X-100), 55% with Polyoxyethylenesorbitan monolaurate (Tween-20) and a complete inactivation in the presence of Sodium dodecyl sulfate... (Complete abstract click electronic access below)

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The objective of this work was the polyunsaturated fatty acids (PUFAs) production by submerged fermentation from the fungus Mortierella isabellina. A Plackett Burman experimental design was designed to evaluate the best conditions for PUFAs production in shake flasks. Three different components of the culture medium (yeast extract, peptone, and sucrose) and three fermentation parameters (agitation, temperature and pH) were evaluated. Analyzing the results of experimental design new assays were performed with increasing concentration of yeast extract. Fermentations were conducted in Erlenmeyer flasks with 10% (v/v) inoculums for 120h, micronutrients ((NH4)2SO4, FeSO4.7H2O, MnSO4.H2O, MgSO4.7H2O) were fixed. The scale up using STR bioreactor with 2.5 L of culture medium and 10% (v/v) inoculums for 120h was defined through better results of Plackett Burman.. A 2² central composite design was set to evaluate the effect of agitation and aeration in fungal biomass production, lipids content and fatty acids profile. The lipid was extracted from dried biomass and the fatty acids were analyzed by gas chromatography. The results of the fermentation in shake flasks showed that only yeast extract had a significant effect (p <0.1) in PUFAs production and this effect was positive. The highest percentage of PUFAs produced (28.17%) was obtained in higher yeast extract concentration (3.75 g / L). Agitation and aeration did not had a significance effect (p <0.1) in the evaluated range, in bioreactor on PUFAs and lipids production. However, agitation had a significant positive effect on biomass production.The presence of fatty acids of family n-3 (α-linolenic acid, eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid) and n-6 families (linoleic acid and γ-linolenic acid) were observed. Nitrogen source is directly related to increased PUFAs production. The variables agitation and aeration, in the evaluated range, did not influence the PUFAs production. The Mortierella isabellina produced fatty acids n-3 and n-6 family, but additional studies are needed to optimize this production. / O objetivo deste trabalho foi produzir ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs) por fermentação submersa a partir do fungo Mortierella isabellina. Um planejamento experimental Plackett Burman foi delineado para avaliar as melhores condições para produção de PUFAS em frascos agitados. Foram avaliados três diferentes componentes do meio de cultura (extrato de levedura, peptona e sacarose) e três parâmetros de fermentação (agitação, temperatura e pH). Através dos resultados obtidos no planejamento experimental, novos ensaios foram definidos com o aumento da concentração de extrato de levedura. As fermentações foram realizadas em frascos Erlenmeyers com 10% de inoculo (v/v) durante 120h e a composição de micronutrientes ((NH4)2SO4, FeSO4.7H2O, MnSO4.H2O, MgSO4. 7H2O) foi mantida fixa. Na melhor condição definida em frascos agitados foi realizada a ampliação da fermentação para biorreator STR, com 2,5 L de meio de cultura e 10 % de inoculo (v/v) durante 120h. Um delineamento composto central 2² foi definido para avaliar o efeito das variáveis agitação e aeração na produção de biomassa fúngica, lipídeos e no perfil dos ácidos graxos. A fração lipídica foi extraída a partir da biomassa seca da fermentação e os ácidos graxos foram analisados por cromatografia em fase gasosa. Os resultados da fermentação em frascos agitados demonstraram que somente a variável extrato de levedura teve efeito significativo (p<0,1) na produção de PUFAs sendo este efeito positivo. O maior percentual de PUFAs produzidos (28,17%) foi obtido na maior concentração de extrato de levedura (3,75 g/L). Os resultados obtidos na fermentação em biorreator demonstraram que as variáveis agitação e aeração não foram estatisticamente significativas (p<0,1) para o acúmulo de PUFAs e lipídeos dentro das faixas avaliadas. Entretanto a agitação teve efeito significativo positivo na produção de biomassa. Foi observada a presença dos ácidos graxos da família n-3 (ácido α-linolênico, ácido eicosapentaenóico e ácido docosaexaenóico) e da família n-6 (ácido linoléico e o ácido γ-linolênico). Em vista dos resultados obtidos, pode-se concluir que a fonte de nitrogênio esta diretamente relacionada com o aumento da produção de PUFAs. As variáveis agitação e aeração nas faixas avaliadas não influenciaram no acúmulo de PUFAs. A Mortierella isabellina produziu ácidos graxos da família n-3 e n-6, entretanto estudos adicionais devem ser realizados para otimizar esta produção.

Submitted by Izabel Franco (izabel-franco@ufscar.br) on 2016-10-26T17:28:34Z No. of bitstreams: 1 TeseJBCS.pdf: 2225419 bytes, checksum: d3ec7a73f461b658739175f8e171c762 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-11-08T18:27:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseJBCS.pdf: 2225419 bytes, checksum: d3ec7a73f461b658739175f8e171c762 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-11-08T18:27:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseJBCS.pdf: 2225419 bytes, checksum: d3ec7a73f461b658739175f8e171c762 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-08T18:27:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseJBCS.pdf: 2225419 bytes, checksum: d3ec7a73f461b658739175f8e171c762 (MD5) Previous issue date: 2016-08-25 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Cell-associated lipases have been considered biocatalysts economically advantageous because they are produced at low cost, avoiding further recovery or purification steps. Few studies regarding Streptomyces clavuligerus lipase have reported the production of extracellular enzyme, although at first this had been considered a cell-associated enzyme. In this context, the aim of this work was the production of the cell-associated lipase from Streptomyces clavuligerus (whole-cell lipase, Sc-WCL) by submerged fermentation, the biochemical characterization of the enzyme and its use in the synthesis of butyl butyrate, an aroma ester with industrial importance. The culture conditions on rotary shaker and the operational parameters for cultivation in bioreactor were evaluated in order to establish a protocol for Sc- WCL production. The conditions for S. clavuligerus cultivation in rotary shaker that resulted in maximal hydrolytic activity of Sc-WCL (3,000 U.L-1) were: baffled flask, free-glycerol production medium, pH 6.8 and 28 °C. The operational parameters in bench reactor that resulted in maximal volumetric productivity of Sc-WCL (54 U.L-1.h-1) were agitation of 400 rpm and aeration of 1 vvm. The maximal volumetric productivity in bioreactor operated under selected conditions (52.5 U.L-1.h-1) was reached after 24 h, while similar productivity in rotary shaker (54.8 U.L-1.h -1) was achieved only after 48 h fermentation. The catalytic potential of Sc-WCL in hydrolysis reactions was comparable to the commercial lipase preparations. Sc- WCL was more active at 60 °C and pH 10.7, and stable at 30-40 °C after 1 h incubation at pH 10. For butyl butyrate synthesis catalyzed by Sc-WCL, the reaction conditions that resulted in higher ester conversion (85%) were: 5 g of Sc-WCL/ L, molar ratio of fatty acid: alcohol 1:1 in heptane and 8 h reaction. The stability at alkaline pH and organic medium (leastwise in heptane and butanol), associated with the low cost, make Sc-WCL attractive in industrial applications, such as flavors synthesis, detergent formulations, hydrolysis of vegetable oils, among others. / Lipases associadas à célula têm se destacado como biocatalisadores economicamente vantajosos, pois são produzidas a baixo custo, dispensando etapas posteriores de recuperação ou purificação. Poucos estudos sobre lipase de Streptomyces clavuligerus relatam a produção da enzima extracelular, embora esta tenha sido, a princípio, considerada uma enzima associada à célula. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi a produção de lipase associada à célula de Streptomyces clavuligerus (lipase “whole-cell”, Sc-WCL) por fermentação submersa, a caracterização bioquímica da enzima e sua aplicação na síntese de butirato de butila, um éster de aroma com importância industrial. As condições de cultivo em shaker e os parâmetros operacionais para cultivo em biorreator foram avaliados com o intuito de estabelecer um protocolo para a produção de Sc-WCL. As condições de cultivo de S. clavuligerus em shaker que resultaram em maior atividade hidrolítica de Sc-WCL (3.000 U.L- 1) foram: frasco aletado, ausência de glicerol no meio de produção, pH 6,8 e 28 ºC. Os parâmetros operacionais em reator de bancada que resultaram em maior produtividade volumétrica de Sc-WCL (54 U.L-1.h-1) foram: agitação de 400 rpm e aeração de 1 vvm. A máxima produtividade volumétrica em biorreator operado nas condições selecionadas foi alcançada após 24 h de cultivo (52,5 U.L-1.h-1), enquanto que produtividade similar em shaker foi obtida somente após 48 h de cultivo (54,8 U.L-1.h-1). O potencial catalítico de Sc-WCL em reações de hidrólise foi comparável ao de preparações comerciais de lipase. Sc-WCL foi mais ativa a 60 ºC e pH 10,7, e mais estável na faixa de 30 a 40 ºC após 1 h de incubação a pH 10. Na síntese de butirato de butila catalisada pela Sc-WCL, as condições reacionais que resultaram em maior conversão (85%) foram: 5 g de Sc-WCL/ L, razão molar ácido graxo/álcool 1:1 em heptano e 8 h de reação. A estabilidade em pH alcalino e em meio orgânico (pelo menos em heptano e butanol), associada ao baixo custo, tornam a Sc-WCL atrativa em aplicações de interesse industrial, tais como, síntese de aromas, formulações de detergentes, hidrólise de óleos vegetais, dentre outras.

Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae) biotype B is a cosmopolitan, devastating insect pest due to their direct damages and transmission of plant viruses. Entomopathogenic fungi comprise the most diverse group of pathogens regulating arthropod pest populations in agroecosystems. Anamorphic fungal entomopathogens, including Beauveria bassiana, Isaria fumosorosea, and Lecanicillium spp., are among the main biocontrol agents of whitefly populations. Advances in research focusing on virulence, mass production, formulation, and storage stability of fungal propagules are imperative for the development of efficient mycopesticides toward whiteflies and other soft-bodied insects. Therefore, this study placed emphasis on screening for virulent fungal strains, enhancement of efficacy using nonionic surfactants in spray tank-mix, development of liquid culture conditions for rapid production and stabilization processes of single-yeast like cells known as blastospores. Firstly, we selected virulent strains of B. bassiana and I. fumosorosea displaying fastest speed of kill and inciting highest mortality levels of whitefly nymphs and adults along with their ability to produce high numbers of conidia on moistened parboiled rice. Secondly, insecticidal performance was enhanced by combining nonionic surfactants with spore suspensions rendering additive or synergistic effects. These surfactants also allowed reducing the volume application rate without altering fungal bioefficacy. Results from liquid fermentation studies using B. bassiana and I. fumosorosea revealed that appropriate amounts of inexpensive ingredients, such as cottonseed flour and glucose, are suitable for the rapid production of high yields of blastospores (3 days pre-culture and 2-3 days culture). The resultant blastospores of various strains survived well to desiccation and remained viable for more than one year under refrigeration. Moreover, these air-dried blastospores of both fungal species showed higher virulence against whitefly nymphs when compared with solid-substrate produced conidia. Optimized liquid culture production for B. bassiana blastospores was also achieved through the manipulation of oxygen rates and osmotic pressure in the liquid media. Furthermore, these blastospores produced in highly aerated and hyperosmotic liquid medium containing 140 g glucose L-1 were also more virulent to whitefly nymphs than those cells derived from low-osmotic medium amended with 40 g glucose L-1. These optimal conditions were also scaled up in 5-L bioreactor that yielded 1-2 × 1012 viable blastospores L-1 in 6 days at a cost of US$ 0.19 L-1. These blastospores were formulated with diatomaceous earth for air drying or for spray drying. Formulated blastospores of B. bassiana survived dehydration using both drying methods and showed improved shelf life when stored under vacuumpackaged at 4 °C rather than 28 °C. However, when these blastospores were actively packaged with dual action oxygen-moisture scavenging system, blastospores showed prolonged stability for up to 7 months at 28 °C and still remained virulent to whiteflies. Therefore, this low-cost production and stabilization method for the rapid production of shelf stable, virulent blastospores of B. bassiana and I. fumosorosea may expand the commercial use of mycopesticides for insect control in mainstream agriculture. / A mosca-branca, Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae) biótipo B, é uma praga cosmopolita e devastadora devido aos prejuízos oriundos dos seus danos diretos e transmissão de vírus. Fungos entomopatogênicos compreendem um grupo diversificado, que desempenha ação importante na regulação de populações de praga em agroecossistemas. Fungos ascomicetos anamórficos, como Beauveria bassiana, Isaria fumosorosea e Lecanicillium spp., constituem relevantes agentes de biocontrole de moscas-brancas. Avanços na pesquisa focando virulência, produção massal, formulação e estabilização de propágulos fúngicos são fundamentais para o desenvolvimento de micopesticidas eficientes contra moscas-brancas e outros insetos. Desta forma, este trabalho objetivou selecionar isolados fúngicos virulentos à mosca-branca; aumentar a eficácia mediante uso de surfactants não-iônicos em suspensões conidiais; desenvolver meios de cultura para produção rápida e estável por fermentação líquida submersa de células leveduriformes conhecidas por blastosporos. Na primeira etapa, isolados virulentos de B. bassiana e I. fumosorosea foram selecionados pela rápida e elevada atividade inseticida a ninfas e adultos de mosca-branca, bem como alto rendimento de conídios em arroz parboilizado. A adição de surfactantes organosiliconados permitiu a redução do volume de calda aplicado com resultados aditivos ou sinérgicos de controle. Foi ainda verificado que altos rendimentos de blastosporos tanto de B. bassiana como I. fumosorosea foram obtidos em curto tempo de fermentação líquida (3 dias de précultivo e 2-3 dias de cultivo) usando nutrientes de baixo custo, como glucose e farelo de algodão. Esses blastosporos foram tolerantes à dessecação e mantiveram viabilidade por mais de um ano sob refrigeração (4 °C). Os blastosporos foram mais virulentos que conídios aéreos, o que coloca esta estrutura como a mais indicada como ingrediente ativo em bioinseticidas para moscas-brancas. Mediante manipulação nutricional e física do ambiente de fermentação, a produção de blastosporos de B. bassiana foi optimizada mediante aumento da aeração e pressão osmótica do meio líquido. Blastosporos produzidos em meio líquido altamente aerado e hiperosmótico (140 g glucose L-1) mostraram-se mais virulentos à mosca-branca em relação àqueles produzidos em meio hipo-osmótico (40 g glucose L-1). Esse processo foi reproduzido em escala piloto usando biorreator de 5 L resultando numa produção de 1-2 × 1012 blastosporos viáveis L-1 em apenas 3 dias a um custo de US$ 0,19 L-1. Blastosporos de B. bassiana formulados com terra de diatomáceas e secados em fluxo de ar contínuo, ou secados em spray dryer tiveram estabilidade extendida por até 8 meses a 4 °C e superior em relação a 28 °C. Durante empacotamento, o uso de sachês absorventes de oxigênio e umidade prolongou consideravelmente a viabilidade de blastosporos armazenados a 28 °C por até 7 meses sem afetar sua eficiência contra mosca-branca. Em suma, esses resultados demonstram a viabilidade técnica e econômica de produção de blastosporos virulentos de B. bassiana e I. fumosorosea, tolerantes à dessecação e estáveis durante armazenamento. Esta tecnologia é uma nova opção que pode contribuir para expansão comercial de bioinseticidas à base de fungos entomopatogênicos.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2016-06-08T14:47:27Z No. of bitstreams: 1 Julio Cezar dos Santos Nascimento.pdf: 1976053 bytes, checksum: 53410347ad1578d486d39f21c31e19aa (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-08T14:47:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Julio Cezar dos Santos Nascimento.pdf: 1976053 bytes, checksum: 53410347ad1578d486d39f21c31e19aa (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 / During ripening, vegetable seeds and grain accumulated substantial amount of phytic acid, representing over 60% of total phosphorus in them. Phytate acts as an energy source for seed germination and is rarely available for non-ruminants, since they do not synthesize the enzyme. Due to the unavailability of biological organic phosphorus in many vegetable foods, research has sought alternative sources of phosphorus in order to better use. Incorporated in this context are the phytases, which form a group of enzymes that catalyze reactions gradual dephosphorylation of phytate. For enzyme purification the aqueous two-phase systems (ATPS) have been widely used for protein separation due to its low cost compared to other purification processes. The aim of this study was to evaluate the variables that influence production and purification of phytase by aqueous two-phase systems, as well as the biochemical characteristics of phytase produced by Aspergillus niger var. phoenicis URM 4924. The culture medium for the production of phytase were studied using factorial design and response surface methodology. The best condition for the production of phytase (8.80 U/mL) was found matching 1.25% of rice bran and 3.0% corn steep liquor. The optimum pH was 5.0, and remains at over 80% of residual activity at pH 5.0 to 9.0 for 15 hours. The phytase showed affinity constant of 0.12 mM and maximum velocity of 7.9 ηmol.s-1. The best conditions of extraction in aqueous two-phase systems were obtained with 26% (w/w) PEG 8000 (g/mol), pH 8.0 and 12% (w/w) citrate thus promoting purification factor of 7.58, partition coefficient of 3.62 and yield of 113.4%. The extraction using ATPS PEG/citrate proved to be promising for purification of phytase produced by A. niger var. phoenicis URM 4924 and may be applied in the composition of animal feed non-ruminants. / Durante o amadurecimento, sementes de legumes e cereais acumulam quantidade substancial de ácido fítico, representando mais de 60% do fósforo total dos mesmos. O fitato serve como fonte de energia para a germinação da semente, sendo pouco disponível para animais não-ruminantes, pois esses não sintetizam a fitase. Devido à indisponibilidade biológica do fósforo fítico em diversos alimentos de origem vegetal, as pesquisas têm buscado por fontes alternativas de fósforo, visando um melhor aproveitamento. Inseridas neste contexto estão as fitases, que formam um grupo de enzimas que catalisam reações graduais de defosforilação do fitato. Para a purificação de enzimas os sistemas de duas fases aquosas (SDFA) têm sido amplamente usados para separação de proteínas por conta do seu baixo custo quando comparado a outros processos de purificação. O objetivo deste trabalho foi a avaliação das variáveis que influenciam a produção e purificação da enzima por sistemas de duas fases aquosas, bem como a determinação das características bioquímicas de fitase produzidas por Aspergillus niger var. phoenicis URM 4924. Os meios de cultivo para a produção de fitases foram estudados utilizando planejamento fatorial e metodologia de superfície de resposta. A melhor condição para a produção de fitase (8,80 U/mL) foi encontrada combinando 1,25% de farelo de arroz e 3,0% de milhocina. A fitase apresentou temperatura ótima a 60°C e manteve 38,4% da atividade residual a 90°C por 120 minutos. O pH ótimo foi 5,0, e permaneceu com mais de 80% da atividade residual na faixa de pH 5,0 a 9,0 por 15 horas. A fitase apresentou constante de afinidade de 0,12 μM e velocidade máxima de 7,9 ηmol.s-1. As melhores condições de extração em sistemas de duas fases aquosas foram obtidas com 26% (m/m) de PEG 8000 (g/mol), pH 8,0 e 12% (m/m) de citrato promovendo assim, aumento de pureza de 7,58, coeficiente de partição de 3,62 e recuperação de 113,4%. A extração utilizando SDFA PEG/citrato demonstrou ser promissora para purificação de fitase produzida por A. niger var. phoenicis URM 4924, podendo ser aplicada na composição de rações de animais não-ruminantes.

Made available in DSpace on 2015-04-20T12:31:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Raimundo Felipe da Cruz Filho.pdf: 1412659 bytes, checksum: aba20cdd1aa35484f5932ead0d0bc3e7 (MD5) Previous issue date: 2013-04-18 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The fibrinolytic proteases degrade fibrin clots and therefore play an important role in the pharmaceutical industry as chemotherapeutic agents in the treatment of cardiovascular diseases. These biocatalysts were gradually discovered from plants, insects, earthworms, snakes and microorganisms (bacteria and fungi). Cardiovascular disease has been one of the leading causes of death in the world. A major cause of heart disease is the accumulation of fibrin in the arteries, causing thrombosis. According to the World Health Organization (WHO), about 17.5 million people will die of cardiovascular disease this year, and in 2030, this amount will be 23.6 million. Given the great potential of microbial biodiversity and the growing regional Amazon applicability of enzymes in the production of drugs, this research was conducted with the objective to (1) evaluate the growth of Bacillus stearothermophilus, (2) establish growth parameters associated with production of fibrinolytic proteases in submerged fermentation and (3) assess the effect of the extractive fermentation in the separation of these enzymes. In this study techniques of extractive fermentation and solid-state fermentation were employed. By submerged fermentation the following parameters were determined: Profile of growth of Bacillus stearothermophilus and the production of protease using 100 mL of the liquid medium [(g / L) 2 g KH2PO4, (NH4)2SO4 1 g, MgSO4 7H2O 0,1 g Na2HPO4 2H2O 0,9 g, yeast extract 1 g, distilled water 1000 ml] pH 7.2 supplemented with 0.5% gelatin in an 500 mL Erlenmeyer flask. The growth of the bacteria was determined at 610 nm, once every 2 hours for 36 hours. To determine the best conditions for the production of proteases were evaluated the influence of pH, stirring and temperature, age of inoculum and substrate concentration, the influence of natural sources of carbon (tapioca, arraruta and crueira), nitrogen sources and aeration. In the recovered extract was also performed a toxicity bioassay in Artemia salina and degradation tests in vitro of the blood clot by the fibrin plate method and the artificial clot degradation in tube. In addition, the partition coefficient (K), the purification factor (PF) and recovering the enzyme were determined. The solid-state fermentation was performed using as substrate 10g of manteiguinha bean [Vigna unguiculata (L.) Walp] with 60% humidity, pH 5.0 in a 250 ml Erlenmeyer flask. In extractive fermentation the best conditions were pH 5.0, 180 rpm and 25 °C in systems using PEG 1000 (g/mol-1) to 20% (w/w) and phosphate salts 15% (w/w) with K 1.05; FP 1.00; 152.54 Y. 34 mm halo in fibrin plate and partial degradation of the clot in tube. In the solid-state fermentation, the production of protease was 8.87 (U/mL), 23 mm of translucent halo in fibrin plate with total degradation of the blood clot in 24 hours. In this study, protease produced from Bacillus stearothermophilus by extractive fermentation and semi-solid fermentation was evaluated, showing in the optimum cultivation conditions that this microorganism presents physiology for industrial application in the production of the fibrinolytic protease / As proteases fibrinolíticas degradam coágulos de fibrina, por isso têm um importante papel na indústria farmacêutica como agentes quimioterapêuticos no tratamento de doenças cardiovasculares. Estes biocatalisadores foram descobertos gradualmente a partir de plantas, insetos, anelídeos, serpentes e micro-organismos (bactérias e fungos). Doenças cardiovasculares tem sido a principal causa de morte no mundo. Uma das principais causas de doenças cardíacas é o acúmulo de fibrina nas artérias, acarretando trombose. De acordo com Organização Mundial da Saúde (OMS), cerca de 17,5 milhões de pessoas morrerão este ano de doenças cardiovasculares, e em 2030, esse montante será de 23,6 milhões. Tendo em vista o grande potencial da biodiversidade microbiana regional Amazônica e a crescente aplicabilidade de enzimas na produção de medicamentos, esta pesquisa foi realizada com o objetivo de (1) avaliar o crescimento de Bacillus stearothermophilus, (2) estabelecer os parâmetros de crescimento associado a produção de proteases fibrinolíticas por fermentação submersa e (3) verifica o efeito da fermentação extrativa na separação dessas enzimas. Neste estudo foram empregados técnicas de fermentação extrativa e fermentação semi-sólida. Por fermentação submersa foram determinados os seguintes parâmetros: Perfil do crescimento de Bacillus stearothermophilus e a produção de protease utilizando 100mL do meio líquido [(g/L) KH2PO4 2g; (NH4)2SO4 1g; MgSO4 7H2O 0,1 g; Na2HPO4 2H2O 0,9 g; Extrato de Levedura 1 g; água destilada 1000mL] pH 7,2 suplementado com gelatina 0,5%, em frasco de Erlenmeyer de 500mL. O crescimento da bactéria foi determinado a 610nm, de 2 em 2 horas, durante 36 horas. Na Determinação das melhores condições para produção de proteases foram avaliados a influência do pH; agitação, temperatura, a idade do inóculo, da concentração do substrato, a influência das fontes de naturais de carbono (tapiocas, araruta e crueira), fontes de nitrogênio e aeração. No extrato recuperado foi realizado também bioensaio de toxicidade em Artemia salina e testes de degradação in vitro do coágulo sanguíneo pelos métodos da placa de fibrina e degradação do coagulo artificial em tubo. Foi determinado também o coeficiente de partição (K), o fator de purificação (FP) e a recuperação da enzima. A fermentação semi-sólida foi realizada utilizando como substrato 10g feijão manteiginha [Vigna unguiculata (L.) Walp], com 60% umidade, pH 5,0 em frasco Erlenmeyers de 250 mL. Na fermentação extrativa as melhores condições foram: pH 5,0; 180 rpm e 25 ºC, no sistemas utilizaram PEG 1000 (g/mol-1) a 20% (p/p) e sais fosfato a 15% (p/p) com K de 1,05; FP de 1,00; Y de 152,54. Halo de 34 mm na placa de fibrina e degradação parcial do coagulo em tubo. Na fermentação semi-sólida a produção de protease foi de 8,87 (U/mL), halo translucido de 23 mm em placa de fibrina com degradação total do coagulo de sangue em 24h. No presente estudo, protease de Bacillus stearothermophilus produzido em fermentação extrativa e fermentação semi-sólida foi avaliada, demonstrando nas condições ótimas de cultivo que este micro-organismo apresenta fisiologia para aplicações industriais na produção de protease fibrinolítica

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2017-07-28T13:17:05Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO.pdf: 1904426 bytes, checksum: 881aba48363b69adb462f39f38edbbe8 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-28T13:17:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO.pdf: 1904426 bytes, checksum: 881aba48363b69adb462f39f38edbbe8 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / As proteases são enzimas com a capacidade de hidrolisar proteínas em peptídeos menores ou aminoácidos livres, sendo essenciais para animais, plantas e micro-organismos devido à sua atuação na regulação metabólica. As proteases são utilizadas com diversas finalidades, no processo industrial da fabricação de detergentes, na indústria farmacêutica e de alimentos, além de ser utilizada na recuperação e aproveitamento de resíduos e subprodutos. Em virtude da grande importância das proteases este trabalho teve como objetivo comparar a produção de proteases produzidas por Mucor subtilissimus UCP 1262 em fermentação em estado sólido (FES) e submersa (FS), bem como extrair em Sistema de duas fases aquosas (SDFA) PEG/Fosfato, as colagenases oriundas de ambas as fermentações. O meio de produção da FES e FS no qual o micro-organismo foi cultivado era constituído principalmente de farelo de soja e farinha de soja. As determinações enzimáticas e dosagem proteica foram realizadas após 72h de fermentação. Para montagem do SDFA foram realizados dois planejamentos fatoriais 23, o primeiro planejamento foi realizado com amostras da FES e o segundo com amostras da FS. Neste sistema foi analisada a influência de três variáveis no processo de extração: massa molar do PEG (200, 550 e 1000 g/mol), concentração do PEG (17,5; 20 e 22,5%) e concentração do sal fosfato de sódio (15; 17,5 e 20%). A maior produção de proteases (362,66 U/ml) ocorreu na FES, enquanto que na FS obteve-se apenas 26,33 U/ml. Dentre as atividades proteásicas específicas: colagenolítica, fibrinolítica e queratinolítica, os melhores resultados foram obtidos para a atividade colagenolítica, sendo esta de: 179,81 U/ml, em FES. A colagenase presente no extrato bruto obtida nos processos fermentativos foram particionadas para fase rica em PEG do SDFA. O maior valor para a variável resposta Fator de purificação (FP=3,49) foi obtido no sistema que utilizou o extrato obtido por FES. Com base nas condições estudadas, os dois sistemas mostraram-se viáveis para a extração de colagenase, pois além de ser um processo que pode ser utilizado em larga escala é constituído por componentes de baixo custo e as condições utilizadas no SDFA favoreceram a extração desta enzima. Todavia, a extração da colagenase oriunda da FES foi mais promissora em virtude da maior concentração da enzima de interesse encontrada nesse tipo de fermentação. / Proteases are enzymes with the ability to hydrolyze proteins into smaller peptides and free amino acids. They are vital for animals, plants and micro-organisms due to their role in metabolic regulation. Proteases have been used in various purposes, in the industrial process of detergents, pharmaceutical and food industry, as well as being used in the recovery and utilization of waste and by-products. Due to their economic feasibility and great medical and farmaceutical importance this study aimed to compare the production of proteases produced by Mucor subtilissimus UCP 1262 in solid state fermentation (SSF) and submerged fermentation (SF) as well as extract collagenolytic proteases using Aqueous two-phase system (ATPS) -PEG/Phosphate from both fermentations. The medium composition for the fungal fermentation in SSF and SF was based in soybean flour. Enzymatic determinations and protein levels were performed after 72 hours of fermentation. To mount the ATPS were two 23 factorial design, the first planning was carried out with samples of SSF and the second with samples of SF. In this system was analyzed the influence of three variables in the extraction process: PEG molar mass (200, 550 and 1000), the PEG concentration (17,5; 22,5 and 20%) and sodium phosphate salt concentration (15; 17,5 and 20%). The higher proteolytic activity (362,66 U/ml) was produced using SSF, while in the FS was obtained 26,33 U/ml. Among the specific proteolytic activities: collagenolytic, fibrinolytic and keratinolytic, the best results were obtained for the collagenolytic activity, this being: 179,81 U / ml in the SSF. The Collagenase present in the crude extract obtained in the fermentative processes partitioned preferencially to the PEG-rich phase. The highest value for the variable response Purification Factor (PF = 3,49) was obtained in the system that used SSF crude extract. According with the showed results, both extraction systems seemed to be feasible for collagenase extraction, as well as being a process that can be used in large scale, constituted by low cost components and conditions used in this ATPS favored the enzyme extraction. Furthermore, the collagenase extraction from the SSF was more promising because of the higher interest enzyme concentration found in this type of fermentation.