Molts productes d'interès en l'àmbit dels processos biotecnològics es produeixen per fermentació bacteriana i especialment, pel que fa a proteïnes recombinants, a partir del cultiu de bacteris com Escherichia coli. En aquest treball s'ha realitzat una caracterització fisiològica i metabòlica d' Escherichia coli en cultiu en bioreactor per tal d'obtenir les claus que permetin una millora de l'eficiència del procés des de l'enfoc de l'Enginyeria Metabòlica. S'ha identificat un factor que impedeix millorar l'eficiència del procés: l'excreció de subproductes. L'acetat és el principal subproducte metabòlic en cultius aeròbics d' Escherichia coli en medis minerals glucosats i, quan s'acumula al brou de fermentació, esdevé tòxic per a les cèl·lules, inhibint el creixement cel·lular i reduint l'expressió de gens recombinants. L'anàlisi de la distribució dels fluxos metabòlics intracel·lulars estimats per mitjà d'un model matemàtic del metabolisme basat en el plantejament de les equacions de balanç de matèria i l'estequiometria cel·lular, ha revelat que existeix un desajust entre la capacitat de captació i degradació de la glucosa fins a piruvat, producte final de la glucòlisi, i la d'incorporació d'Acetil-CoA al cicle dels àcids tricarboxílics (CAT). Aquest desajust impedeix a la cèl·lula aprofitar tota la glucosa captada per a funcions de biosíntesi i l'excreció d'acetat representa una vàlvula de seguretat pels excedents que la cèl·lula no pot aprofitar en la generació de nova biomassa i CO2. En aquest estudi ha sigut possible identificar els enzims clau involucrats en les reaccions suposadament causants del desajust metabòlic a Escherichia coli, s'han aïllat els gens i regulat la seva expressió mitjançant plasmidis d'expressió adequats. Les reaccions escollides com a potencials llocs d'actuació són la reacció d'incorporació de glucosa a la cèl·lula a través del sistema de transport de la Fosfotransferasa depenent de fosfoenolpiruvat (PTS) i la reacció anapleròtica de reompliment del CAT catalitzada per l'enzim Fosfoenolpiruvat-carboxilasa (PEPC). En ambdós casos es pretén balancejar el creixement en cultiu discontinu, reduint la formació de subproductes.La redistribució dels fluxos metabòlics per reducció del nombre de components EIICBGlc del sistema PTS mitjançant estratègies de silenciament de gens per RNA-Antisentit pel gen ptsG, així com la sobreexpressió del gen ppc que codifica per la PEPC ha permès reduir la formació d'acetat a Escherichia coli. La modificació dels nivells del component EIICBGlc del PTS ha permès redistribuir els fluxos sense afectar la velocitat específica de creixement. No obstant, la modificació dels fluxos per augment de la velocitat de reacció de la PEPC, ha afectat la velocitat específica de creixement i la velocitat específica de transport de glucosa. En resum es pot concloure que algunes de les modificacions genètiques realitzades han resultat satisfactòries en termes de l'objectiu desitjat -reduir la secreció d'acetat- i que els efectes de la modificació sobre la distribució dels fluxos metabòlics intracel·lulars es pot explicar a partir dels valors estimats pel model matemàtic. / Many products of biotechnological interest are produced by bacterial fermentation, among then recombinant products, by the bacteria Escherichia coli. In this work a physiological and metabolic study of Escherichia coli growing in a bioreactor it has been performed in order to obtain the parameters which permit an increase of the efficiency of the process from the point of view of Metabolic Engineering. It had been possible identify a limiting factor of the efficiency of the process: by-product generation. Acetate is the main by-product of the aerobic metabolism of Escherichia coli K12 in glucose minimal medium, and when it reaches a critical concentration becomes toxic for the cells, inhibiting the cell growth and reducing the expression of recombinant genes. The analysis of distribution of intracel·lular metabolic fluxes by means of a metabolic model based on the mass balance equations and the stoichiometry of the cell, has shown an intracel·lular uncoupling between glycolisis and tricarboxylic acid cycle (TCA), at the level of Acetil-CoA incorporation to the cycle. Such uncoupling effect restricts the total conversion of glucose into cellular structures, and the excretion of acetate is used by the cell to export the exceeding carbons that are not converted to CO2 and biomass.In this study it has been possible identify key enzymes that can have an important role in the metabolic uncoupling observed in E.coli cultured in vitro. Those reactions were the glucose uptake system (Phosphoenolpyruvate-Dependent Glucose Phosfotransferase system:PTS) and the anaplerotic reaction of Phosphoenolpyruvate Carboxilase (PEPC). Redistribution of the intracellular metabolic fluxes by reduction of the number of components of EIICBGlc of PTS by RNA-Antisense strategy of the gene ptsG, and over expression of ppc gene of PEPC had allow to reduce the acetate formation in Escherichia coli. The modification of the PTS component had allowed redistributing the intracellular fluxes without affecting the specific cell growth rate. However, the modification of the flux across the PEPC reaction had modified the specific cell growth rate and the specific glucose uptake rate. In summary, some of the metabolic engineering approaches investigated resulted successful in terms of the desired goal, and the effects of the genetic modifications on redistribution of the cell metabolism could be explained from the model based intracellular fluxes estimated.

El Cava és un vi escumós de qualitat produït en una regió determinada (v.e.c.p.r.d, Council Regulation EC 1493/1999), segons un procés d'elaboració que consta de dos etapes: la vinificació en blanc del raïm i la segona fermentació, en botella tancada, del vi base i posterior criança en contacte amb els llevats de la segona fermentació. Aquesta criança provoca una sèrie de canvis de tipus fisicoquímics i/o biològics, encara molt desconeguts, però que proporcionen aromes que tenen gran acceptació pel consumidor i que justifiquen els llargs períodes de rima (anys) al que es sotmeten els caves d'alta gamma i l'elevat preu. No obstant, no es coneix quin és el límit òptim del temps de criança. Un cop s'han separat els llevats i s'ha addicionat el licor d'expedició comença la vida comercial del cava. Empíricament, els cavistes saben que el temps i les condicions a què és sotmès el cava durant l'emmagatzematge i/o la distribució són factors que juguen en contra de la qualitat organolèptica, que actualment es controla mitjançant l'anàlisi sensorial amb alt component subjectiu. Per aquestes raons, la hipòtesi d'aquesta tesi doctoral és: Proposar marcadors químics de criança i de vida comercial del cava.Per buscar marcadors químics d'envelliment en mostres de cava a temps real de rima i/o emmagatzematge es requereixen anys, un elevat cost i dificultat de monitorització. Així s'han accelerat els processos que es produeixen en el cava, durant la seva criança (fase de rima) o durant la seva distribució (emmagatzematge) mitjançant el disseny d'un test accelerat d'envelliment que utilitza una temperatura moderada (37ºC) i dos condicions d'espai de cap: condicions oxidants (atmosfera d'oxigen) i no oxidants (atmosfera de diòxid de carboni o nitrogen).S'ha caracteritzat el perfil volàtil dels caves durant la criança i vida comercial, mitjançant la tècnica SPME (microextracció en fase sòlida). S'ha detectat un augment de vitispirà, TDN i succinat de dietil relacionat significativament en funció del temps d'envelliment. Aquests indicadors són millors marcadors de la fase de rima, ja que els seus increments semblen estar condicionats pels canvis bioquímics que es produeixen principalment en el vi quan està en contacte amb els llevats. Tanmateix, el TDN pot ser útil pels caves comercials d'alta gamma. S'han aplicat dos mètodes (SDE i CLSA) d'elevada capacitat extractiva que han permès obtenir nous marcadors: compostos de nucli furànic (furfural, 5-metilfurfural, 2-acetilfuran, 2,3,4-trimetilfuran i furoat d'etil) i un compost sofrat (3-(metiltio)propanoat d'etil). Així, s'ha adequat la tècnica SPME per poder determinar-los i s'ha vist que augmenten en funció del temps, actuant com a marcadors de possibles alteracions organolèptiques dels caves comercials.Mitjançant la monitorizació dels compostos fenòlics per HPLC-DAD durant l'envelliment s'ha observat una disminució dels àcids fenòlics i hidroxicinnàmics. Tanmateix, s'ha detectat un compost no identificat que augmenta amb el temps i que és el responsable de l'augment de la absorbància a 280 nm (mesura enològica de l'índex dels compostos fenòlics). S'ha establert que es tracta d'una molècula polihidroxilada de fórmula molecular C6H10O6 i valor de massa exacte 178.0398 i, a més, s'ha obtingut el patró de fragmentació. Finalment, s'ha establert que l'origen de la seva formació són els sucres. Aquest compost té un gran interès com a possible marcador de la qualitat durant la fase de rima i l'emmagatzematge del producte acabat, ja que podria assenyalar alteracions organolèptiques del cava abans que es produeixi una modificació significativa de l'absorbància de la 420 nm (indicador d'enfosquiment) i podria monitoritzar-se fàcilment amb una lectura a 280nm. / Cava is a quality sparkling wine (Certified Brand of Origin) elaborated by the traditional method that consists of a second fermentation followed by biological ageing in contact with lees in anaerobic conditions for at least 9 months (Council Regulation (EC), 1493/1999). This special ageing of cava gives this wine a more complex volatile profile, which is highly appreciated by the consumers, and justify long time of ageing of more expensive cava. However, it is unknown how long could be this ageing. On the other hand, αnologists known that in commercial cava, without yeast and added with expedition liqueur, time and conditions of distribution decreases their quality. Until now, sensory analysis of cava, with high subjective component, made to follow the organoleptic quality. Due to this the aim of this thesis was propose chemical makers of biological ageing and commercial life of cava.To find chemical markers, ageing and distribution of cava was accelerated using a moderated temperature (37ºC) and two headspace conditions: Oxidant with oxygen added and not oxidant with nitrogen or carbon dioxide.Volatile profile of cava during biological ageing and commercial life was obtained using SPME (solid phase microextraction). An increase of Vitispirane, diethyl succinate and TDN was detected and they were correlated (p<0.001) with ageing time. These markers were better correlated with biological ageing than commercial life, despite of TDN that was well correlated with time in commercial cava. Moreover, two extraction methods with high recoveries (SDE and CLSA) were applied in order to obtain new markers of cava as furfural, 5-methylfurfural, 2-acetylfuran, 2,3,4-trimethylfuran, ethyl furoate and ethyl 3-methylthiopropanoate.Finally, phenolic compounds were studied. A compound with &#955;max at 284 nm was the source of the increase of the Abs at 280 nm (phenolic index) observed despite of phenolic and hydroxycinnamic compounds decreases. This compound is a polyhydroxylate structure which have an accurate mass of 178,0398 and a molecular formula of C6H10O6. In addition, the origin of this compound was related with reducing sugars of the cava. So, the easily determination of this compound measuring the Abs at 280nm could be useful to follow the correct evolution of cava during biological ageing and commercial life before a significant colour alteration (Abs 420nm) could be detected.

Les fermentacions a baixes temperatures (13ºC o inferiors) són interessants en l'elaboració de vins blancs i rosats, ja que augmenten la retenció i la producció dels aromes, i per tant la qualitat del producte final. Però aquestes baixes temperatures també tenen certs desavantatges, com una disminució en la velocitat de consum de sucres, obtenint fermentacions més llargues i amb risc de parades.Per intentar millorar el procés fermentatiu i la qualitat del producte final es van fixar els següents objectius:- L'estudi del metabolisme del llevat a baixes temperatures de fermentació (13ºC), i la seva influència en aspectes com la cinètica fermentativa, el creixement dels llevats; el metabolisme lipídic; la producció dels aromes, i la expressió gènica global del llevat.- El coneixement del metabolisme nitrogenat del llevat en la fermentació alcohòlica, així com en les addicions de nitrogen realitzades a diferents moments de la fermentació.Els resultats obtinguts mostren que les baixes temperatures, a part d'augmentar la durada de fermentació, augmenten la viabilitat dels llevats al llarg del procés, provoquen canvis en la composició lipídica, augmentant la fluïdesa de la membrana, i milloren la composició aromàtica del vi, incrementant la producció d'aromes beneficiosos i disminuint-ne la de compostos perjudicials pel la qualitat vi final.Amb l'objectiu d'identificar els mecanismes moleculars que causen aquests canvis metabòlics a baixes temperatures, vam utilitzar la tècnica de "chips de DNA" o "microarrays" per comparar l'expressió global dels gens del llevat fermentant a 13ºC i fermentant a 25ºC. En general, aquest anàlisis de l'expressió global del llevat dut a terme per primer cop en condicions industrials rebel·la importants canvis en la expressió d'alguns gens tant al llarg de la fermentació com entre les dos temperatures. La fermentació a 13ºC presenta l'avantatge d'induir una ràpida resposta al estrès que podria aportar més resistència al llevat al llarg de la fermentació, i per això augmentar-ne la seva viabilitat. En l'estudi del metabolisme nitrogenat del llevat al llarg de la fermentació, vam observar que en la fermentació alcohòlica les cèl·lules evolucionen d'una situació de repressió per nitrogen al començament de la fermentació, quan hi ha compostos nitrogenats en el medi, a una situació de de-repressió quan el nitrogen ha estat consumit pel llevat. Aquestes situacions de repressió/de-repressió determinen el perfil de consum de l'amoni i dels aminoàcids, els quals determinen a la vegada la producció d'alguns compostos aromàtics. La repressió dels gens de les permeases GAP1 i MEP2, la baixa activitat arginasa o la inhibició en la captació de l'arginina, poden ser considerats bons marcadors de Repressió Catabòlica per Nitrogen (NCR). L'addició de nitrogen és una pràctica habitual en bodega per evitar problemes fermentatius. Els nostres estudis demostren que el moment de dur a terme aquesta addició condiciona no només la cinètica fermentativa i el creixement del llevat, sinó també el perfil de consum d'amoni i aminoàcids, i la producció de compostos secundaris. L'assimilació de nitrogen per part dels llevats també depèn de la temperatura de fermentació, la qual determina tant la qualitat com la quantitat dels requeriments nitrogenats dels llevats. A baixa temperatura de fermentació, l'amoni i la glutamina són menys consumits, mentre que els aminoàcids regulats per NCR ho són més.Aquesta tesi és una aproximació global al comportament del llevat a baixes temperatures i al metabolisme nitrogenat, i ens obra moltes possibilitats d'estudi, punts on s'hauria d'aprofundir per un millor coneixement i millora d'aquestes fermentacions. / Wines produced at low temperatures (10-15ºC) are known to develop certain characteristics of taste and aroma, not only related to primary aroma retention. However, low temperature fermentations have also some disadvantages that comprise an increase of the duration of the process and a higher risk of stuck and sluggish fermentation.In order to improve the fermentation performance and the quality of wine, we established the following objectives: - The study of wine yeast metabolism at low temperature fermentation (13ºC), and its influence in aspects as the fermentation kinetic, the yeast growth, the yeast lipid metabolism, the production of aromatic compounds, and the global yeast gene expression.- The study of nitrogen metabolism of yeast in alcoholic fermentation, as well as the study of nitrogen supplementations at different points of the fermentation.Our results showed that low temperatures increased the length of fermentation, the yeast viability along the process, but also modified the lipid composition of yeast cells, increasing the membrane fluidity, and improved the aromatic composition of the wine, increasing the flavour-active compounds and decreasing the unpleasant ones such as acetic acid and fusel alcohols. To identify the molecular mechanism that causes these changes in aroma profiles and to verify that 13°C-fermentation does not hinder other cellular properties, we compared the expression programs during wine fermentation at 13ºC and 25°C (using Microarrays technology), and tentatively correlated the differential genes expression with changes in intracellular lipid content, and in the production of flavour-active metabolitesThis genome-wide analysis carried out for the first time with a commercial yeast strain under true industrial conditions revealed many major differential genes expression both during the course of the wine fermentation and between two fermentation temperatures. With respect to industrial output, wine fermentation conducted at 13°C presents the advantage to induce an early cold stress response that apparently does not penalize the wine fermentation process, further than the longest fermentation length. In the study of the nitrogen metabolism of yeast along the fermentation we observed that in wine fermentations the cells evolve from a nitrogen-repressed situation at the beginning of the process to a nitrogen-derepressed situation as the nitrogen is consumed. These nitrogen-repressed/derepressed conditions determined the different patterns of ammonium and amino acid consumption. Arginine and alanine were hardly used under the repressed conditions, while the uptake of branched-chain and aromatic amino acids increased. The repression of GAP1 and MEP2 genes in the cells, low arginase activity or inhibition of arginine uptake could be considered as a good Nitrogen Catabolite Repression markers. Winemakers systematically supplement grape musts with diammonium phosphate to prevent nitrogen-related fermentation problems. The timing of the nitrogen additions influenced the biomass yield, the fermentation performance, the patterns of ammonium and amino acid consumption, and the production of secondary metabolites. These nitrogen additions induced a nitrogen-repressed situation in the cells, and this situation determined which nitrogen sources were selected. Nitrogen assimilation also depends on fermentation temperature. Fermentation temperature is an important factor determining utilization of nitrogen sources during fermentation of grape juice, and influences the quantity and the quality of nitrogen requirement. Ammonium and glutamine, the preferred source for biomass production, are less consumed at low temperature. Likewise amino acids that are only taken up under derepressed conditions (arginine, alanine, asparagine, etc.) are more consumed at low temperature.The information provided by this thesis represents a starting point for deciphering the regulatory circuits during wine fermentation, overall at low temperature, and should help us to understand the properties of wine yeasts. Our results open up a lot of interesting perspectives that will further our knowledge of wine yeast metabolism during wine fermentations.

La presencia de productos fitosanitarios en la vendimio procedentes de los tratamientos viticolas para prevenir las plagas y las enfermedades de la viña, puede llegar a provocar retrasos y paradas durante la fermentación alcoholica. La presente tesis doctoral, es un estudio de los efectos del oxicloruro de cobre y la diclofluanida sobre la fermentación alcoholica. Su presencia ocacinó retrasos en la cinética fermentativa así como una elevada mortalidad de la población de células viables, cuando no se guardaban los períodos de seguridad aconsejados. En estas mismas circunstancias, se observaron modificacions de las actividades enzimaticas de dos enzimas claves de la fermentación alcohólica (Hexoquinasa y alcohol deshidrogenasa) modificaciones que no llegaron a justificar los retrasos de la fermentación observados anteriormente. Sin embargo quedaron muy afectados tanto la actividad de la atpasa de protones como la actividad del transportador de baja afinidad de la glucosa, mecanismos bioquimico/celulares que si explicarían los retrasos observados durante la fermentación. En los vinos procedentes de mostos tratados con los pesticidas estudiados, también se observaron alteraciones tanto de los parámetros químicos como de los parámetros que influyen en la composición aromática de los vinos.

S’ha estudiat la formació de sulfur d’hidrogen (H2S) i altres compostos de sofre volàtils lleugers com els mercaptans i disulfurs per part dels llevats durant la fermentació vínica. Es proposen mètodes per mesurar i evitar el problema de l’olor desagradable del H2S i els seus derivats, des de la vinya, el most, els llevats i el vi, i respectar les aromes pròpies de cada varietat. S’han analitzat diferents factors de la producció dels compostos de sofre, la descripció dels defectes associats, la formació dels sulfurs: anàlisi, identificació i quantificació dels sulfurs en vins, s’han identificat compostos com l’etil mercaptà, sulfur de dimetil i en menor quantitat el sulfur de dietil i el sulfur de metil. S’ha estudiat el moment de la formació en mostos model, i s’ha vist una o dues fases durant la fermentació on la producció de sulfur és alta. S’han estudiat les aromes típiques de varietats locals mitjançant l’anàlisi sensorial descriptiva. En un estudi de soques de llevat, s’ha observat que la majoria (60%) produeixen alguna quantitat de sulfurs durant la fermentació i que l’elecció de la soca és un factor important. S’han provat tres tipus de reg en vinya i s’ha vist que influeix en els estils dels vins i en els compostos nitrogenats dels mostos resultants. En vinya per la prevenció de l’oïdi es van fer tractaments alternatius sense sofre, per tal d’evitar la formació de sulfurs. Per a identificar el component genètic de la producció de H2S s’han comparat els transcriptomes de dues soques amb propietats enològiquessimilars, però diferent producció de H2S: UCD 522 (alta producció) i P29 (baixa producció). Les mostres es van extreure durant fermentacions en el moment de màxima producció de H2S. Degut a què no eren soques de laboratori es van fer tres tipus d’estudi del perfil de transcripció de les dues soques de llevat: un array basat en el cADN, un array basat en oligonucleòtids i un anàlisi per qRTPCR d’una selecció de transcripts. Els resultats foren similars amb les tres tècniques. Més del 90% dels gens no van mostrar diferències entre les dues soques. En canvi, la majoria dels gens relacionats amb la biosíntesi de la tiamina van tenir una sobreexpressió a la soca amb alta producció de H2S. Per contra, gens relacionats amb el catabolisme dels aminoàcids, una possible font de H2S, no van mostrar diferències d’expressió entre les dues soques. Això suggereix que, en les condicions estudiades, el metabolisme secundari com la biosíntesi de la tiamina i altres compostos amb sofre pot ser clau per explicar la producció de H2S per algunes soques de llevat durant la fermentació. En vins amb defectes de compostos de sofre volàtil s’han tractat amb citrat de coure i s’ha vist que podia ser una alternativa al sulfat de coure que s’ha fet servir tradicionalment.