In der Nutztierhaltung besitzt die Erkennung und Vermeidung von Geburtsstörungen beim Rind insbesondere aus ökonomischer Sicht einen hohen Stellenwert. Bei Hochleistungskühen können Schwergeburten eine erhöhte metabolische Belastung im peripartalen Zeitraum reflektieren. Besonders betroffen sind Färsen und Milchkühe mit einer negativen Energiebilanz. Hormon- und Stoffwechselfaktoren sind von zentraler Bedeutung für die Anpassung der Tiere an Veränderungen ihrer Körpermasse und -konstitution. Zur differenzierten Beurteilung metabolischer Belastungen bei Hochleistungskühen im peripartalen Zeitraum wurden mögliche Zusammenhänge zwischen Geburtsverlauf und den stoffwechselrelevanten Parametern Leptin, Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) und freien Fettsäuren (FFS) untersucht. Die vorliegende Studie umfasste 28 adulte, hochträchtige (13 primipare, 15 pluripare) Kühe mit Normal- bzw. Schwergeburt. Die Kälber wurden analog zu ihren Müttern ebenfalls 4  Gruppen (Kuhkalb/Normalgeburt; Kuhkalb/Schwergeburt; Färsenkalb/Normalgeburt; Färsenkalb/Schwergeburt) zugeordnet. Die Analyse von Leptin, IGF-1 und FFS im Blutserum erfolgte zwischen dem 16./14. Tag ante partum (a. p.) und dem 14. Tag post partum (p. p.). Leptin und IGF-1 wurden zusätzlich bei den neugeborenen Kälbern ab der Geburt bis 14 Tage p. p. gemessen. Die Hormonkonzentrationen wurden mittels eines Enzymimmunoassays bestimmt. Die FFS-Analysen erfolgten im Labor der Medizinischen Tierklinik mit dem Labor-Automaten HITACHI 912 i (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim). Unabhängig vom Geburtsverlauf konnten während des gesamten Untersuchungszeitraums bezüglich der Leptinkonzentrationen keine signifikanten Unterschiede zwischen Färsen und Milchkühen festgestellt werden. Vor allem zur Geburt besteht für alle Erstkalbinnen eine erhöhte metabolische Belastung, da deren IGF-1-Konzentrationen zu diesem Zeitpunkt niedriger (114 ±  40 vs. 158 ± 108 ng/ml) und deren FFS-Konzentrationen signifikant höher lagen (896 ±  273 vs. 705 ±  225 µmol/l, p = 0,05) als bei den Milchkühen. Im Vergleich zu den Kälbern von Milchkühen wiesen Kälber von Färsen 12 Stunden nach der Geburt signifikant höhere IGF-1-Werte (p = 0,05) auf. In Abhängigkeit vom Geburtsverlauf lagen die Leptinwerte bei allen Kühen mit Schwergeburt von Beginn der Untersuchungen bis einen Tag vor der Geburt niedriger als bei den Tiere mit Normalgeburt mit signifikanten Unterschieden am 13. bis 11. Tag a. p. (p = 0,009) und am 7. bis 5. Tag a. p. (p = 0,05). Während des gesamten Untersuchungszeitraums waren keine signifikanten Unterschiede in den Konzentrationen an IGF-1 und FFS zwischen allen Muttertieren mit einem normalen und einem erschwerten Geburtsverlauf festzustellen. Bei pluriparen Kühen mit Schwergeburt wurden im gesamten Untersuchungszeitraum niedrigere Leptinspiegel nachgewiesen als bei Tieren mit Normalgeburt, mit signifikanten Unterschieden a. p. und ab 3. Tag p. p. (p < 0,05 bzw. p < 0,01). Darüber hinaus fanden sich bei pluriparen Kühen mit Dystokie ab der Geburt höhere FFS-Konzentrationen mit signifikanten Unterschieden zur Kalbung (p = 0,05). Die Leptinkonzentrationen der Kälber lagen analog zu den dazugehörigen Muttertieren ab der Geburt bis 14. Tag p. p. bei allen Kälbern von pluriparen Kühen mit Schwergeburt niedriger als bei den normal geborenen Kälbern mit signifikanten Unterschieden am 7. Tag p. p. (p = 0,04). Im Vergleich zu den Färsen mit Normalgeburt hatten diejenigen mit Schwergeburt signifikant höhere Leptinwerte vom 3. bis 14. Tag p. p. (p = 0,004), signifikant niedrigere IGF-1-Konzentrationen am 10. bis 8. Tag a. p., zur Geburt und vom 3. Tag bis 14. Tag p. p. (jeweils p < 0,01) sowie postpartal niedrigere FFS-Konzentrationen mit signifikanten Unterschieden 12 Stunden p. p. (p = 0,008). Kälber von Färsen mit gestörtem Geburtsverlauf wiesen im Vergleich zu den Normalgeburts-kälbern 12 Stunden nach der Geburt signifikant niedrigere IGF-1-Werte (p = 0,005) auf. Die vorliegende Studie verdeutlicht den Zusammenhang zwischen einem gestörten Geburtsablauf und veränderten Serumkonzentrationen an Leptin, IGF-1 und FFS. Damit konnte gezeigt werden, dass diese Parameter zur Interpretation von Stoff-wechselstörungen bei Hochleistungskühen im peripartalen Zeitraum geeignet sind. / For livestock management, the identification and prevention of dystocia in cattle is of high significance, especially from an economic point of view. Dystocia in the high-yield cows may reflect an increased metabolic disorder during the peripartal period. Heifers and dairy cows with a negative energy balance are particularly affected. For the adaptation of animals to changes in their body mass and constitution, endocrine and metabolic factors are of central importance. To perform a differentiated assessment of metabolic disorders in high-yield cows during the peripartal period, possible relationships between calving and relevant parameters (leptin, insulin-like growth factor1 [IGF-1] and non-esterified fatty acids [NEFA]) were examined. The present study involved 28 adult high-pregnant (13 primiparous, 15 pluriparous) cows with normal birth and dystocia, respectively. Analogous to their mothers, the calves were likewise categorized into four groups (cow calve/ normal birth; cow calve/ dystocia; heifer calve/ normal birth; heifer calve/ dystocia). The analyses of leptin, IGF-1 and NEFA in blood serum were performed from 16/14 day ante-partum (a. p.) to day 14 post-partum (p. p.). Leptin and IGF-1 were additionally determined in all newborn calves from birth to 14 days p. p. Hormone concentrations were measured by enzyme immunoassay (EIA). Analyses of NEFA in dairy cows and heifers were carried out using HITACHI 912i device (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) at the laboratory of Large Animal Clinic for Internal Medicine. Independent of course of parturition, no significant differences between heifers and dairy cows were noticed concerning serum leptin during the entire examination period. Especially around calving time, all heifers were more intensively affected with metabolic disorders based on their lower IGF-1 values (114 ± 40 vs. 158 ± 108 ng/ml) as well as significantly higher NEFA (896 ± 273 vs. 705 ± 225 µmol/l, p = 0.05) compared to dairy cows. Calves of heifers had significantly higher IGF-1 values 12 hours after birth (p = 0.005) than calves of dairy cows. Dependent of course of parturition, all cows with dystocia displayed lower leptin concentrations from the beginning of the examination period to 1 day a. p compared to animals with normal calving with significant differences from day 13 to day 11 a. p. (p = 0.009) and from day 7 to day 5 a. p. (p = 0.05). During the entire examination period, no significant differences in the concentrations of IGF-1 and NEFA were found between all cows with a normal and difficult parturition. In pluriparous cows with difficult parturition lower leptin levels were detected during the entire examination period than in animals with normal calving with significant differences a. p. and from day 3 to day 14 p. p. (p < 0.05 and p < 0.01, respectively). Furthermore, higher NEFA concentrations were found from birth until 14 days p. p. in pluriparous cows with dystocia and significant differences at calving (p = 0.05). Calves of pluriparous cows with dystocia had p. p. lower leptin concentrations in comparison to those with normal births with significant differences on day 7 p. p. (p = 0.04). In comparison to heifers with normal birth, those with dystocia displayed significantly higher leptin levels in the period from day 3 to day 14 p. p. (p = 0.004), significantly lower IGF-1 concentrations (from day 10 to day 8 a. p., at birth and from day 3 to day 14 p. p.; each p < 0.01), as well as lower NEFA levels after birth with significant differences 12 hours p. p. (p = 0.008). Heifer calves with difficult parturition presented significantly lower IGF-1 values 12 hours p. p. (p = 0.005) in comparison to those with normal births. The present study underlines the relationship between dystocia and changed serum concentrations of leptin, IGF-1 and NEFA. In summary, it can be concluded that these parameters are suitable for interpretation of metabolic disorders in high-yielding cattle during peripartal period.

Einleitung Adipositas und die damit verbundenen Erkrankungen wie Hyperlipidämie, Insulindysregulation und Hufrehe stellen ein großes gesundheitliches Problem domestizierter Pferde und Ponys dar. Besonders Ponys, die als „leichtfuttrig“ gelten, sind öfter von Adipositas und den damit verbundenen Erkrankungen betroffen. Aktuelle Untersuchungen der intestinalen Mikrobiota bei Mäusen, Menschen und Pferden deuten darauf hin, dass es einen Zusammenhang zwischen der Mikrobiota und der Gewichtsentwicklung gibt und bei adipösen Individuen eine andere Zusammensetzung der Mikrobiota als bei normalgewichtigen Individuen vorliegt. Untersuchungen zu den Veränderungen der fäkalen equinen Mikrobiota während einer mehrmonatigen Gewichtszunahme bei Pferden und Ponys fehlen. Ziele der Untersuchungen Zweck der vorliegenden Studie war die Überprüfung der Effekte einer zweijährigen energiereichen Fütterung auf die fäkale Mikrobiota bei Pferden und Ponys. Dabei sollten folgende Hypothesen geprüft werden: (1) Die equine fäkale Mikrobiota verändert sich im Laufe der Gewichtszunahme hin zu einer Zusammensetzung wie sie für adipöse Individuen beschrieben ist. (2) Ponys besitzen eine andere Zusammensetzung der fäkalen Mikrobiota als Pferde. Tiere, Material und Methoden Zehn Shetlandponys (Alter 6 ± 3 Jahre) und zehn Warmblutpferde (Alter 10 ± 3 Jahre) erhielten zwei Jahre 200 % ihres Erhaltungsbedarfs an umsetzbarer Energie. Monatlich wurde der Energiebedarf an die aktuelle Körpermasse (KM) angepasst. Die Ration bestand zu 60 % aus Heu und zu 40 % aus einem Ergänzungsfutter (Rohprotein 13,4 %, Rohfett 14,4 %, Rohfaser 9,8 %, stickstofffreie Extraktstoffe 54,3 %). Morphometrische Daten (Body Condition Score (BCS), Cresty neck score (CNS) und Körpermasse (KM) wurden wöchentlich erfasst. Kotproben wurden 5 (t1), 11 (t2) und 23 (t3) Monate nach Beginn der energiereichen Fütterung bei den Pferden und Ponys gewonnen. Aus den Kotproben wurde die DNA extrahiert und die V3-V4 Region auf der 16S rRNA wurde mittels PCR vervielfältigt. Die PCR Produkte wurden mit Ilumina MiSequ sequenziert. Die Sequenzierungsdaten wurden mit FROGS ausgewertet und zur Beurteilung der Zusammensetzung der fäkalen Mikrobiota wurden die Diversität mittels Shannon und Simpson Index sowie das beobachtete Artenreichtum kalkuliert. Die Konzentrationen der gesamten kurzkettigen Fettsäuren (SCFA) sowie von Azetat, Propionat, Butyrat, Isobutyrat, Valerat und Isovalerat wurden mittels flüssig Gaschromatographie bestimmt. Der Laktatgehalt im Kot wurde mittels enzymatisch kolorimetrischer Messung ermittelt. Die statistische Auswertung erfolgte mit der Software Statistica ©. Der Zeiteffekt wurde mit einer Friedmanns ANOVA und anschließendem Wilcoxen Rangsummentest mit Bonferroni Korrektur ermittelt. Für die Rasseneffekte wurde ein Mann- Whitney- U Test verwendet. Das Signifikanzniveau lag bei p < 0,05. Ergebnisse KM, BCS und CNS stiegen signifikant während der zweijährigen hochkalorischen Fütterung an. Beim Pony kam es zu einem Anstieg des Phylums Firmicutes (p = 0,025) zwischen t2 und t3 und bei beiden Rassen wurde ein signifikanter Anstieg des Phylums Actinobacteria in der fäkalen Mikrobiota zwischen t1 und t3 beobachtet. Bei Pferden konnte während der größten Gewichtszunahme zwischen t1 und t2 ein Abfall des Phylums Fibrobacteres (p = 0,028) beobachtet werden. In der fäkalen Mikrobiota der Ponys zeigte sich ein signifikanter Anstieg des Phylums Proteobacteria zwischen t1 und t2, gefolgt von einem Abfall zwischen t2 und t3. Der einzige signifikante Unterschied zwischen der fäkalen Mikrobiota der Pferde und der Ponys zum Zeitpunkt t1 war ein vermehrtes Vorkommen der Familie F082 in der fäkalen Mikrobiota der Ponys. Zum Zeitpunkt t2 wurde das Phylum Proteobacteria seltener in der Mikrobiota der Ponys beobachtet (p = 0,01). Die größten Unterschiede in der fäkalen Mikrobiota von Pferden und Ponys konnten zum Zeitpunkt t3 beobachtet werden. Dort kam das Phylum Fibrobacteres (p = 0,026) häufiger in der fäkalen Mikrobiota der Pferde vor und 5 Bakterienfamilien unterschieden sich signifikant in ihrem Vorkommen bei Pferden und Ponys.Während der größten Gewichtszunahme zwischen t1 und t2 zeigte sich ein signifikanter Abfall in der Artenvielfalt in der fäkalen Mikrobiota der Ponys. Im Kot der Pferde konnten, verglichen mit dem der Ponys, signifikant höhere SCFA Konzentrationen gemessen werden: t1: Isobutyrat, t2: Isobutyrat und Azetat und t3: gesamt SCFA, Propionat und Isovalerat. Zwischen t1 und t2 zeigte sich ein signifikanter Anstieg der Laktat Konzentration in den Fäzes der Pferde und Ponys, der bei den Pferden anschließend von einem Abfall zwischen t2 und t3 begleitet wurde. Schlussfolgerungen Während der energiereichen Fütterung konnte ein Abfall der Artenvielfalt sowie Änderungen in den Phyla Firmicutes, Actinobacteria und Fibrobacteres beobachtet werden. Unterschiede in der Mikrobiota von Pferden und Ponys konnten vor allem gegen Ende der 23-monatigen hochkalorischen Fütterung beobachtet werden. Während beim Pony die Bakterienfamilien F082, Bacteroidales UCG- 001, Rikenellaceae und Ruminococcaceae vermehrt in der fäkalen Mikrobiota auftraten, kam beim Pferd das fibrolytischen Phylum Fibrobacteres und die fibrolytische Familie Fibrobacteraceae sowie verschiedene SCFAs häufiger vor. Dies könnte ein Hinweis auf eine verbesserte Faserfermentation der Pferde sein. Die funktionellen Konsequenzen dieser Mikrobiota Verschiebungen sollten zukünftig über Metabolomanalysen weiter abgeklärt werden.

Introduction: Obesity and its related comorbidities such as insulin dysregulation (ID), laminitis and hperlipaemia are increasing health issues in equines. In human medicine obesity is linked with a systemic inflammation deriving from adipose tissue (AT). Especially abdominal AT produces inflammatory cytokines and is therefore a risk factor for metabolic diseases in humans. However, in equines systemic inflammation linked to obesity is still controversial. Changes in lipid metabolism with increasing obesity are not well documented in equines. Aim of the study: The aim of the present study was to evaluate the following hypotheses: (1) ID develops with the long-term intake of a hypercaloric diet and alters lipid metabolism. (2) In the development of obesity macrophages are infiltrating AT and amounts of inflammatory cytokines in AT increase. These alterations are more pronounced in the subcutaneous (sc) AT depots compared to abdominal AT depots. Additionally, the amount of markers of lipid transport are influenced by BW gain in AT. (3) Ponies are more prone to produce inflammatory markers in AT, which may explain the higher predisposition for metabolic alterations. Materials and Methods: 19 healthy and normal weight geldings were included in this study (age at the start of the study: 8 ± 3 years): 10 Shetland ponies and 9 Warmblood horses. Over a period of two years equines received 200% of their maintenance energy requirements of metabolizable energy. 60% of the energy was provided by hay and 40% by a compound feed. Monthly energy requirements were calculated according to the increasing BW and rations were adjusted accordingly. During hypercaloric diet body weight (BW), body condition score (BCS) and cresty neck score (CNS) were assessed weekly. Before and after one and two year(s) of hypercaloric diet a combined glucose insulin test (CGIT) was performed and blood and AT samples (abdominal AT: retroperitoneal, mesocolon descendens; sc AT: nuchal crest, lateral to the tail head) were taken. AT samples were taken under general anesthesia 3-5 days after CGIT and 15 hours after a low-dose endotoxin infusion. Glucose was analysed in natrium fluoride plasma. Serum amyloid A (SAA), insulin, non-esterified fatty acids (NEFA) and triglycerides were measured in serum. Levels of inflammatory parameters (CD68, IL-1β, IL-6, TNFα) and markers of lipid metabolism (FABP4, LPL) were analyzed in AT samples by RT-qPCR. The project was approved by the Ethics Committee for Animal Rights Protection of the Leipzig District Government (No. TVV 32/15). Data were analysed for normal distribution by Shapiro-Wilks test. Statistical tests were applicated accordingly. Results: Ponies and horses showed a significant increase in BW (24%), BCS and CNS with hypercaloric diet. Two years of hypercaloric diet induced ID in 3 out of 19 equines (two horses, one pony). Two of these equines additionally developed laminitis (one horse, one pony) during the second year of hypercaloric diet. Basal serum NEFA concentrations increased in ponies by 290% but not in horses with BW gain. Laminitic equines showed an altered development of serum NEFA levels during CGIT with a delayed rise at the end of CGIT. The BW gain had no impact on SAA concentration of ponies and horses. CD68 mRNA levels increased in several AT depots of both breed types with BW gain. IL-1β, IL-6 and TNFα showed similar or decreased mRNA levels after BW gain compared to basal measurements in all AT. CD68 mRNA level were higher in abdominal AT compared to sc AT at the end of the study. However, IL-1β, IL-6 and TNFα mRNA levels were higher in sc AT. LPL and FABP4 mRNA levels were higher or similar after BW gain. Higher levels of LPL and FABP4 mRNA were detected in sc AT depots compared to abdominal AT. Breed related differences were seen but were not consistent. Conclusions: A BW gain of 24% over two years does not necessarily lead to ID in horses or ponies. However, laminitis might be correlated with changes of NEFA curve during a CGIT. Equine obesity is linked with macrophage infiltration of AT that is more pronounced in abdominal AT depots in equines. However, infiltrating macrophages are not linked with a systemic inflammation.:1 Introduction 1 2 Literature review 3 2.1 Obesity in equines 3 2.1.1 Objective measurements of obesity 3 2.1.1.1 Body condition score 3 2.1.1.2 Cresty neck score 4 2.1.1.3 Morphometric measurements 4 2.2 Insulin dysregulation 4 2.2.1 Laboratory diagnosis 5 2.2.1.1 Basal measurements 6 2.2.1.2 Dynamic testing 7 2.2.1.2.1 Oral tests..................................................................................7 2.2.1.2.2 Intravenous tests......................................................................7 2.3 Obesity related inflammation 9 2.3.1 Interleukin-1β 9 2.3.2 Interleukin-6 10 2.3.3 Tumor necrosis factor α 11 2.4 White adipose tissue 13 2.4.1 Structure and Cell types 13 2.4.2 Adipokines 13 2.4.3 Changes with obesity 13 2.4.4 Depot differences 14 2.5 Lipid metabolism 14 2.5.1 Non-esterified fatty acids 15 2.5.2 Triglycerides 16 2.5.3 Lipoprotein lipase 16 2.5.4 Fatty acid binding protein 4 16 3 Published articles 17 3.1 Effects of body weight gain on insulin and lipid metabolism in equines 17 3.2 The influence of equine body weight gain on inflammatory cytokine expressions of adipose tissue in response to endotoxin challenge 27 4 Discussion 45 4.1 Insulin and glucose metabolism 45 4.2 Lipid metabolism 45 4.2.1 Serum NEFA and TG concentrations 45 4.2.2 Adipose tissue mRNA levels of lipid metabolism marker 46 4.3 Adipose tissue inflammation parameters 47 4.3.1 Effect of body weight gain 47 4.3.2 Adipose tissue depot effect 48 4.3.3 Breed effect in obese equines 48 4.4 Laminitic equines 49 4.5 Conclusion 50 5 Zusammenfassung 51 6 Summary 53 7 References 55 8 Appendix 65 8.1 Presentations as part of this thesis 65 8.2 Co-authorship 66 8.3 Original data 67 / Einleitung: Zunehmend leiden Pferde an Adipositas und deren Folgeerkrankungen wie Insulindysregulation (ID), Hufrehe, aber auch Hyperlipidämien. Bei adipösen Menschen wird ein chronischer Entzündungszustand beobachtet, wobei Entzündungsparameter hauptsächlich im Fettgewebe (FG) produziert werden. Durch die erhöhte Produktion von Entzündungs-parametern im abdominalen FG ist besonders dieses Fettdepot mit einem erhöhten Risiko für metabolische Krankheiten verbunden. Der Zusammenhang von Adipositas und einem systemischen Entzündungszustand wird bei Pferden aktuell noch kontrovers diskutiert. Studien zu den Veränderungen des Lipidmetabolismus im Verlaufe einer zunehmenden Gewichtszunahme liegen bislang bei Equiden nicht vor. Ziel der Studie: Die Studie diente dazu folgende Hypothesen zu untersuchen: (1) ID entwickelt sich mit der Langzeitfütterung einer hyperkalorischen Ration und beeinflusst den Lipidmetabolismus. (2) Durch die Gewichtszunahme kommt es zu einer Infiltration von Makrophagen und zu einem Anstieg von Entzündungsparametern im FG. Marker für den Lipidtransport im FG werden durch eine Körpergewichtszunahme beeinflusst. (3) Ponys produzieren mehr Entzündungs-parameter im FG und zeigen einen veränderten Lipidmetabolismus im Vergleich zu Pferden. Material und Methoden:19 gesunde, normalgewichtige Wallache (Alter zu Beginn der Studie: 8 ± 3 Jahre) wurden für diese Studie genutzt: 10 Shetlandponys und 9 Warmblutpferde. Diese Tiere erhielten über 2 Jahre 200% ihres Erhaltungsbedarfs an umsetzbarer Energie. 60% der Energie wurden durch Heu und 40% durch ein Ergänzungsfutter gedeckt. Monatlich wurde der Energiebedarf an das aktuelle Körpergewicht angepasst. Wöchentlich wurde das Körper-gewicht, der Body Condition Score (BCS) und der Cresty Neck Score (CNS) erfasst. Zu Beginn der Studie, nach einem und nach zwei Jahren der hyperkalorischen Fütterung wurde ein kombinierter Glukose-Insulin-Test (CGIT) sowie Blut- und FG-proben (abdominales FG: retroperitoneal, Mesocolon descendens; subkutanes FG: Nackenkamm und lateral der Schweifrübe) entnommen. Die FG-Probennahme erfolgte unter Allgemeinanästhesie 3-5 Tage nach dem CGIT und 15 Stunden nach einer moderat dosierten Endotoxininfusion. In den Blut-proben vom CGIT wurde Glukose im Natrium-Fluorid Plasma gemessen. Im Serum wurde Amyloid A (SAA), Insulin, freie Fettsäuren and Triglyceride analysiert. Im FG wurden die Level von Entzündungsparametern (CD68, IL-1β, IL-6, TNFα) und Lipidstoffwechselmarker (FABP4, LPL) mittels RT-qPCR analysiert. Der Tierversuch wurde genehmigt durch die Landesdirektion mit Sitz in Leipzig (TVV 32/15). Die Daten wuden mittels des Shapiro-Wilks Tests auf Normalverteilung getestet und die entsprechenden Tests wurden angewandt. Ergebnisse: Durch die hyperkalorische Ration haben Ponys und Pferde 24% ihres Körper-gewichts zugnommen. BCS und CNS sind währen der Studie angestiegen. Die Gewichts-zunahme hat in 3 von 19 Tieren eine ID ausgelöst (zwei Pferde, ein Pony). Zwei dieser Tiere (ein Pferd, ein Pony) entwickelten zusätzlich eine Hufrehe im zweiten Jahr der Studie. Basale freie Fettsäuren sind mit der Körpergewichtszunahme bei den Ponys angestiegen (290%), während sie bei den Pferden unverändert geblieben sind. Die freie Fettsäuren Kurve währen des CGITs war bei den Tieren mit Hufrehe durch einen verzögerten Anstieg am Ende des Tests im Vergleich zu den gesunden Tieren gekennzeichnet. Die SAA Konzentration blieben durch die Körper-gewichtszunahme unverändert. Bei beiden Rassen kam es mit der Körper-gewichtszunahme zu einem Anstieg des CD68 mRNA Levels in verschiedenen FG Depots. IL-1β, IL-6 und TNFα zeigten nach der Körpergewichtszunahme niedrigere oder unveränderte mRNA Level im Vergleich zu Basalwerten. Im Depotvergleich nach zweijähriger Körper-gewichtszunahme zeigte CD68 höhere mRNA Level in den abdominalen FG Depots ver-glichen mit beiden subkutanen FG Depots. IL-1β, IL-6 und TNFα hingegen wiesen zu diesem Zeitpunkt höhere mRNA-Expressionen in den subkutanen FG Depots auf. LPL und FABP4 mRNA Level stiegen an oder blieben unverändert im im Verlauf der Studie. Am Ende der Studie waren die mRNA Level von LPL und FABP4 in subkutanen FG Depots höher ver-glichen mit den abdominalen FG Depots. Eindeutige Rasseunterschiede konnten nicht charakterisiert werden. Schlussfolgerungen: Eine Gewichtszunahme von 24% der Körpermasse führte nicht bei allen Tieren zu einer ID. Jedoch erscheint das Auftreten einer Hufrehe von Veränderungen der freien Fettsäuren während des CGITs begleitet zu sein. Die Entwicklung der Adipositas war mit einer Makrophageninfiltration in das abdominale FG verbunden, allerdings war die Makrophageninfiltration nicht mit einem systemischen Entzündungsstatus assoziiert.:1 Introduction 1 2 Literature review 3 2.1 Obesity in equines 3 2.1.1 Objective measurements of obesity 3 2.1.1.1 Body condition score 3 2.1.1.2 Cresty neck score 4 2.1.1.3 Morphometric measurements 4 2.2 Insulin dysregulation 4 2.2.1 Laboratory diagnosis 5 2.2.1.1 Basal measurements 6 2.2.1.2 Dynamic testing 7 2.2.1.2.1 Oral tests..................................................................................7 2.2.1.2.2 Intravenous tests......................................................................7 2.3 Obesity related inflammation 9 2.3.1 Interleukin-1β 9 2.3.2 Interleukin-6 10 2.3.3 Tumor necrosis factor α 11 2.4 White adipose tissue 13 2.4.1 Structure and Cell types 13 2.4.2 Adipokines 13 2.4.3 Changes with obesity 13 2.4.4 Depot differences 14 2.5 Lipid metabolism 14 2.5.1 Non-esterified fatty acids 15 2.5.2 Triglycerides 16 2.5.3 Lipoprotein lipase 16 2.5.4 Fatty acid binding protein 4 16 3 Published articles 17 3.1 Effects of body weight gain on insulin and lipid metabolism in equines 17 3.2 The influence of equine body weight gain on inflammatory cytokine expressions of adipose tissue in response to endotoxin challenge 27 4 Discussion 45 4.1 Insulin and glucose metabolism 45 4.2 Lipid metabolism 45 4.2.1 Serum NEFA and TG concentrations 45 4.2.2 Adipose tissue mRNA levels of lipid metabolism marker 46 4.3 Adipose tissue inflammation parameters 47 4.3.1 Effect of body weight gain 47 4.3.2 Adipose tissue depot effect 48 4.3.3 Breed effect in obese equines 48 4.4 Laminitic equines 49 4.5 Conclusion 50 5 Zusammenfassung 51 6 Summary 53 7 References 55 8 Appendix 65 8.1 Presentations as part of this thesis 65 8.2 Co-authorship 66 8.3 Original data 67

Die Verfütterung von Fetten mit mehrfach ungesättigter Fettsäuren (PUFA) stellt seit Jahren eine nebenwirkungsfreie Alternative in der Behandlung atopischer Erkrankungen wie der Caninen Atopischen Dermatitis (CAD) dar. Zahlreiche Studien belegen die antiinflammatorische Wirkung der PUFA und die damit verbundene Besserung der klinischen Symptomatik. Diese antiinflammatorische Wirkung kommt auf molekularer Ebene zustande, indem die supplementierten Fettsäuren die Eigenschaften zellulärer Membranen verändern, intrazelluläre Signalwege und Enzyme beeinflussen sowie die Expression verschiedener Gene modulieren. Die cytosolische Phospholipase A2 (cPLA2) stellt eines der Schlüsselenzyme im Rahmen der Synthese proinflammatorischer Eikosanoide dar, die allergische Symptome wie Juckreiz und Hautrötungen bedingen. Sie spaltet bevorzugt Arachidonsäure (AA) aus der sn2-Position membranständiger Phospholipide ab und stellt somit das Substrat für die Synthese von Entzündungsmediatoren wie Prostaglandinen, Leukotrienen und Thromboxanen zur Verfügung. Peroxisomen-Proliferator-aktivierte Rezeptoren (PPAR) gehören zur Großfamilie der Kernrezeptoren. Besonders die Isoform PPARγ ist an der Regulation der Expression verschiedener proinflammatorischer Proteine beteiligt, wie z.B. der Cyclooxygenase (COX). PUFA gehören zu den natürlichen Liganden dieser Rezeptoren, was die Vermutung nahe legt, dass zumindest ein Teil der Wirkungen über die Beeinflussung dieser Rezeptoren vermittelt wird. Über die Beeinflussung der Expression des cPLA2-Gens durch PPAR existieren zurzeit noch keine Erkenntnisse. Mastzellen spielen eine zentrale Rolle im Rahmen der Pathogenese allergischer Erkrankungen. Auf einen allergenen Stimulus hin sind sie in der Lage, präformierte (z.B. Histamin) und de novo synthetisierte Entzündungsmediatoren (z.B. Eikosanoide) freizusetzen und damit die für allergische Erkrankungen typischen Symptome hervorzurufen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, an einer caninen Mastozytomzelllinie (C2) die zeitabhängigen Effekte der Supplementierung des Zellkulturmediums mit jeweils 20 μM n3- PUFA (α-Linolensäure LE, C18:3n3; Eikosapentaensäure EPA, C20:5n3) und n6-PUFA (Linolsäure LA, C18:2n6; Arachidonsäure AA, C20:4n6) auf das Wachstum, das zelluläre Fettsäurenmuster, die Histaminfreisetzung, die Aktivität und Expression der cPLA2 sowie die Expression von PPARγ zu untersuchen. Vergleichend wurden die C2 auch im Grundmedium kultiviert. Zur Untersuchung des Einflusses der PUFA auf das Wachstum der Zellen erfolgte die Kultivierung über einen Zeitraum von 8 Tagen. Um die zeitabhängigen Effekte feststellen zu können, wurden die Zellen 6 h, 48 h bzw. 6 Tage in den entsprechenden Medien bzw. dem Grundmedium kultiviert und danach die folgenden Verfahren angewendet. – Bestimmung des zellulären Fettsäurenmusters mittels Gaschromatographie (GC) – Bestimmung der Histaminfreisetzung mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) – Bestimmung der Aktivität der cPLA2 über Messung der freigesetzten [3H]Arachidonsäure – Bestimmung der Expression der cPLA2 und des PPARγ mittels Western Blot. Die Ergebnisse zeigen, dass die Fettsäuren-Supplementierung keinerlei Auswirkung auf das Zellwachstum hat. Sie führt aber zur Anreicherung der jeweils angebotenen Fettsäure sowie ihrer Elongations- und Desaturierungsprodukte. Die Effekte auf die spontane und auch auf die Mastoparan-stimulierte Histaminfreisetzung waren zeitabhängig sehr unterschiedlich. Die Zugabe der Fettsäuren hatte auf die spontane cPLA2-Aktivität der Zellen nur bei längerer Kultivierungsdauer (6 d) einen Einfluss, wobei es zu einer Minderung der Aktivität nach PUFA- Gabe kam. Im Gegensatz dazu zeigten die Mastoparan-stimulierten C2 nur nach 6- stündiger Kultivierung eine signifikante Erhöhung der cPLA2-Aktivität in den mit den n6-FS supplementierten Medien. Die cPLA2-Expression war in ihrer Höhe von der Kultivierungsdauer abhängig. Nach 6 h zeigten die PUFA-supplementierten C2 eine im Vergleich zum Grundmedium gesteigerte Expression, unabhängig von der Art der zugesetzten Fettsäure. Nach 48 h war die Expression in den C20-PUFA-supplementierten C2 deutlich erhöht, während sie nach 6-tägiger Kultivierung in den mit C20-PUFA angereicherten Medien signifikant reduziert war. Der fehlende Zusammenhang zwischen der Aktivität des Enzyms und der Höhe der cPLA2-Expression lassen auf eine unterschiedliche Regulation dieser beiden Parameter schließen. Die PPARγ-Expression verhielt sich, besonders nach 48-stündiger und 6- tägiger Kultivierung, umgekehrt zur cPLA2-Expression. Dabei deutet das annähernd gegensätzliche Verhalten von cPLA2 und PPARγ nach 48 h und 6 d auf eine mögliche Beteiligung des Kernrezeptors an der Regulation der cPLA2-Expression hin. Aus den vorliegenden Untersuchungen geht somit deutlich hervor, dass die C2 mit der cPLA2 und dem PPARγ zwei bedeutende Regulatoren von Entzündungsprozessen exprimieren und somit als Modell zur Erforschung der Pathogenese der CAD geeignet sind.

Massiver wirtschaftlicher Schaden und der Verlust des Verbrauchervertrauens hervorgerufen durch die BSE - Krise führten zu einer radikalen Änderung in der Futtermittel- und Lebensmittelgesetzgebung. Neben diversen anderen Maßnahmen wurden u. a. das Gehirn und Rückenmark von über 12 Monate alten Wiederkäuern vom Gesetzgeber als so genanntes spezifiziertes Risikomaterialien (SRM) definiert. Die spezielle Entsorgung und das Verarbeitungsverbot dieser Materialien in Lebens- und Futtermitteln hatte zum Ziel die Infektkette zu unterbrechen und dadurch das Risiko einer Infektion mit dem BSE-Erreger für den Verbraucher zu senken. Um die Einhaltung des Verarbeitungsverbotes von SRM in Lebensmitteln zu überprüfen, wurden diverse ZNS-Nachweisverfahren entwickelt. Jedoch ist keines, der hierfür entwickelten molekularbiologischen und immunochemischen Verfahren in der Lage sowohl Spezies, als auch Tieralter des nachgewiesenen ZNS zu bestimmen und damit eine potentielle Einordnung zum SRM zu ermöglichen. Darüber hinaus hat sich für fast alle ZNS-Marker der Einfluss von hohen Prozesstemperaturen als nachteilig für die Nachweisbarkeit erwiesen. NIEDERER und BOLLHALDER (2001) entwickelten ein auf Fettsäureanalytik basierendes ZNS-Nachweisverfahren, welches am Institut für Lebensmittelhygiene der Universität Leipzig weiterentwickelt wurde. Vorteile dieses Verfahrens sind die hitzestabilen Marker und die Möglichkeit mit Hilfe von spezifischen Fettsäureverhältnissen Spezies und Tieralters des nachgewiesenen ZNS zu ermitteln. Somit ist es mit diesem Verfahren erstmals möglich das nachgewiesene ZNS der Gruppe der spezifizierten Risikomaterialien zuzuordnen. Ziel dieser Arbeit war es, das am Institut für Lebensmittelhygiene weiterentwickelte Verfahren auf Praxistauglichkeit anhand eines externen Blindversuchs zu testen. Hierbei sollten mögliche Schwachstellen identifiziert und im weiterführenden Verlauf dieser Arbeit Lösungen erarbeitet werden. Für den Blindversuch wurden vom Max-Rubner-Institut, Standort Kulmbach, insgesamt 72 Brühwurstproben zur Verfügung gestellt, welche mittels des nach LÜCKER et al. (2005) beschriebenen Verfahrens untersucht wurden. Die Ergebnisse des Blindversuchs deuten auf eine grundsätzliche Eignung des Verfahrens für den Nachweis von spezifiziertem Risikomaterial in Fleischerzeugnissen hin. Jedoch konnte bei der Tierartdifferenzierung und vor allem bei der Altersbestimmung ein Optimierungsbedarf ermittelt werden. Somit ergaben sich für diese Arbeit folgende weiterführende Aufgabenstellungen: 1. Die Optimierung der Tierartbestimmung auch im Hinblick auf Erweiterung des Speziesspektrums und 2. die Optimierung der Tieraltersbestimmung von Rinder- und Schaf-ZNS. Insgesamt 257 ZNS-Proben der Spezies Rind, Schaf, Schwein, Ziege und Geflügel wurden einer Fettsäureanalyse unterzogen. Aus allen analysierten Fettsäuren wurden 67 Fettsäureverhältnisse gebildet. Zur Identifikation für die Speziesdifferenzierung geeigneter Fettsäureverhältnisse wurde das statistische Verfahren der Partial Least Square – Discriminant Analysis (PLS-DA) eingesetzt. Hierbei ergab sich, dass von den 67 untersuchten Fettsäureverhältnissen insgesamt 14 für die Differenzierung zwischen den Tierarten Rind, Schwein, Schaf, Ziege und Geflügel geeignet sind. Für die Optimierung der Tieraltersbestimmung wurden 37 ZNS-Proben vom Rind und elf ZNS-Proben vom Schaf untersucht. Die analysierten Fettsäuren wurden auf ihre Korrelation mit dem Alter untersucht. Stark korrelierende Fettsäuren und deren Verhältnisse wurden mit Hilfe der Regressionsanalyse auf ihre Vorhersagefähigkeit geprüft. Hierbei gelang die Identifikation von vier neuen Fettsäureverhältnissen. Für die Altersschätzung bei der Tierart Rind scheinen sich die FS-Verhältnisse 2OH-C24:0/2OH-C25:0 und 2OH-C24:1(n-7)/2OH-C25:0 am besten zu eignen. Für die Tierart Schaf sollten die Verhältnisse 2OH-C25:0/2OH-C26:0 und 2OH-C25:0/2OH-C26:1(n-7) bevorzugt eingesetzt werden. Im Vergleich zur bisherigen Verfahrensweise ist mit Hilfe dieser Fettsäureverhältnisse und deren Regressionsformeln eine deutlich präzisere Altersschätzung für die Tierarten Rind und Schaf möglich. Der neue Ansatz bietet die Möglichkeit flexibel auf zukünftige Änderungen der Altersgrenze von SRM zu reagieren. / The immense economical damage and the loss of consumer trust caused by the bovine spongiform encephalopathy (BSE) - crisis resulted in a radical alteration of the feed- and foodlegislation. Besides several other measures, the legislator defined the brain and spinal cord of ruminants older than 12 month as specified risk material (SRM). The special disposal and the processing prohibition of these materials in food and feedstuffs aimed to interrupt the infection chain and to reduce the risk of an infection caused by the BSE pathogen for the consumer. In order to control the processing prohibition of SRM in food, several CNS detection methods were developed. But none of the designed molecular biological or immuno chemical methods has the ability to detect species and age of the CNS. Therefore, a classification of the detected CNS as SRM is not possible. Furthermore, high process temperatures influence nega-tively the detection of almost all CNS markers. NIEDERER and BOLLHALDER (2001) developed a CNS detection procedure based on the analysis of fatty acids, which was improved at the Institute of Food Hygiene, University Leipzig. Advantages of this procedure are the heat stability of the markers and the possibility to identify species and age of the detected CNS. Therefore, this procedure is the first, which facilitates the potential of identifying SRM. The aim of this work was to test the practicability of the improved CNS detection procedure in an external blind trial. During this, possible weak points should be identified and solutions for their elimination presented. Furthermore, the sample preparation of the method should be optimized with regard to cost and time reduction. For the external blind trial the Max-Rubner-Institute, Kulmbach, produced 72 emulsion type sausages. These sausages were analysed according to the procedure described by LÜCKER et al. 2005. The results of the blind trial show the suitability of the procedure for the detection of SRM in meat products in principle. However, some results revealed that the species and age identification required further enhancement. Therefore, the following additional topics of this work were: 1. Optimization of species identification especially with regard to other species 2. Optimization of animal age prediction for cattle and sheep CNS. Selected fatty acids of total 257 CNS samples from cattle, pig, sheep, goat and several poultry species were analysed. These fatty acids were combined to 67 fatty acid ratios. Afterwards, the application of these ratios for the species detection was tested by using the statistical method of Partial Least Square – Discriminant Analysis (PLS-DA). In result, 14 out of 67 fatty acid ratios are suitable for differentiation between the species cattle, pig, sheep, goat and poultry. For the optimization of animal age prediction 37 CNS samples from cattle and eleven CNS samples from sheep were examined. All analyzed fatty acids were checked for their correlation with age. Afterwards strong correlating fatty acids and their fatty acid ratios were examined for their predictive ability by the application of regression analysis. In result, four new fatty acid ratios for age prediction could be identified. For the age prediction of cattle CNS the fatty acid ratios 2OH-C24:0/2OH-C25:0 and 2OH-C24:1(n-7)/2OH-C25:0 are the best choice. In sheep CNS the ratios 2OH-C25:0/2OH-C26:0 and 2OH-C25:0/2OH-C26:1(n-7) should be preferred for prediction of age. In comparison to the previous age prediction method, the application of these fatty acid ratios and their regression formula led to more accurate results. Furthermore, it offers the possibility to adopt to possible variations of the age limits within the SRM definition in future.

Es gibt keine bekannte Lungenerkrankung, die eine so frühe, chronische und intensive Entzündungsreaktion hervorruft, wie sie in den Atemwegen von Patienten mit Mukoviszidose (CF) auftritt. CF ist die häufigste tödliche autosomal-rezessiv vererbte Krankheit in der kaukasischen Bevölkerung, die durch eine Mutation im CFTR-Gen (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) verursacht wird, dass für das CFTR-Protein kodiert. Defekte in diesem Protein führen zu einer epithelialen Dysfunktion und betreffen mehrere Organe, aber die Lungenpathologie ist für über 85% der Morbidität und Mortalität bei CF verantwortlich. Die CF-Lungenpathologie konzentriert sich auf die Wechselwirkungen zwischen Wirt und Erreger, wobei die CFTR-Dysfunktion Infektionen begünstigt und die Infektionen in Verbindung mit einer dysfunktionalen Immunantwort einen anhaltenden Entzündungskreislauf in Gang setzen. Dieser Teufelskreis aus Infektion und Entzündung führt schließlich zu Lungenschäden, Atemversagen und letztlich zum Tod. Die vorherrschende Infektion bei Mukoviszidose ist die durch P. aeruginosa, wobei im europäischen Durchschnitt 41% der erwachsenen Patienten infiziert sind. Bemerkenswert ist, dass das Mikrobiom der Atemwege bei Mukoviszidose polymikrobieller Natur ist. Da frühere Studien einen positiven Zusammenhang zwischen einer hohen Mikrobiom-Diversität und einer verbesserten Lungenfunktion bei Mukoviszidose festgestellt haben, wurde die Hypothese aufgestellt, dass bestimmte Kommensalen vor einer Infektion mit P. aeruginosa in den CF-Atemwegen schützen könnten. Um dies genauer zu untersuchen wurden 105 kommensale Isolate aus 32 verschiedenen Arten von Sputumproben von Patienten mit Mukoviszidose isoliert und mit einem fluoreszierenden P. aeruginosa PA01-mcherry-Stamm auf antagonistische Wirkungen bei direkten Erreger-Kommensalen-Interaktionen untersucht. Diese Isolate wurden zusätzlich auf immunmodulatorische Effekte bei Kommensal-Wirt-Pathogen-Interaktionen, unter Verwendung von BEAS-2B-Bronchialepithelzelllinien, untersucht. Ausgewählte Isolate mit schützender Wirkung wurden anschließend auf immunmodulatorische Effekte unter Verwendung von CFBE41o ΔF508-Zellen und einem natürlicheren Lungen-Präzisionsschnitt-Modell (PCLS) untersucht und die produzierten Zytokine mittels ELISA sowie mit einem Multiplex-Zytokin-Assay gemessen. Genexpressionsanalysen wurden zudem mittels qRT-PCR durchgeführt. Die zugrundeliegenden Mechanismen wurden mittels transkriptomischer Analysen, Vergleiche der gesamten Genomsequenz (WGS) und mechanischer Studien einschließlich Stoffwechselanalysen mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass ausgewählte Streptokokken-Kommensal-Isolate, insbesondere Vertreter von S. mitis, S. oralis, S. cristatus, S. gordonii, S. sanguinis und S. parasanguinis, starke antagonistische Effekte auf das Wachstum von P. aeruginosa in direkten Kokulturen haben. Ausgewählte Vertreter von S. mitis, S. oralis und S. cristatus verhinderten zudem das Wachstum anderer klinischer und nicht-klinischer Isolate von P. aeruginosa, sowie anderer typischer Mukoviszidose-Erreger wie Staphylococcus aureus, Burkholderia spp., Achromobacter xylosoxidans, Proteus mirabilis, Haemophilus influenzae, Stenotrophomonas maltophilia, Enterococcus faecalis und Klebsiella pneumoniae. Eine wirksame Mukoviszidose-Therapie sollte nicht nur die Infektion, sondern auch die damit einhergehende bösartige Entzündung bekämpfen. Im Gegensatz zu den Mitgliedern der gram-negativen Neisseria spp., die die IL-8-Produktion bei einer Monoinfektion signifikant stimulierten, taten dies alle gram-positiven Kommensalen-Isolate nicht. Ausgewählte Kommensalen regulierten auch die P. aeruginosa PA01- und LPS-induzierte Produktion mehrerer entzündlicher Zytokine in menschlichen Atemwegsepithelzellen (BEAS-2B sowie CFBE41o ΔF508 und korrigierte wtCFTR) und in PCLS der Maus. Diese Ergebnisse wurden auch durch Genexpressionsanalysen bestätigt, was darauf hindeutet, dass die Immunmodulation möglicherweise durch eine veränderte TLR-Signalübertragung vermittelt wird. Transkriptomische Analysen nach Koinfektion von S. mitis Isolat 4 (SM4) und PA01 auf PCLS zeigten eine signifikante Runterregulation von Entzündungsreaktionen wie mTOR und Toll-like-Rezeptor-Signalen. Ein WGS-Vergleich zeigte, dass mehr als die Hälfte der am stärksten angereicherten Genfunktionen bei hemmenden Streptokokken-Isolaten für den Kohlenhydrat-Transport und -Stoffwechsel verantwortlich waren, während sie bei den nicht hemmenden Streptokokken-Isolaten unter den am stärksten angereicherten Genfunktionen fehlten. Mechanische Untersuchungen zeigten, dass der glykolytische Signalweg für die antipseudomonische Wirkung entscheidend ist und dass hemmende Kommensalen hemmende Wirkungen vermitteln, indem sie den pH-Wert ihrer Wachstumsmedien < 5,0 senken und Acetat > 0,2 mg/ml produzieren. Es wurde nachgewiesen, dass Acetat signifikante immunmodulatorische Effekte gegen PA01- und LPS-induzierte Entzündungsreaktionen in BEAS-2B und PCLS vermittelt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ausgewählte kommensale Bakterien Schutzwirkungen in den Atemwegen von Mukoviszidose-Patienten herbeiführen, indem sie Acetat produzieren, das antipseudomonale und immunmodulatorische Wirkungen vermittelt. Einserseits direkt, indem es durch Bakterien- und Wirtszellen diffundiert und so unmittelbare Auswirkungen hat, als auch indirekt, indem es Wirtszellen dazu anregt, Bakterien effizient zu beseitigen und Entzündungen zu kontrollieren. Da die Verwendung ganzer Bakterien als Probiotika bei immungeschwächten Patienten beispielsweise bei Mukoviszidose mit einigen Herausforderungen verbunden ist, stellt die Verwendung von bakteriellen Metaboliten wie Acetat eine sicherere, einfachere und praktischere Alternative dar.:List of Abbreviations (i) Table of Contents (iv) 1. SUMMARY (1) 1.1 Zusammenfassung (1) 1.2 ABSTRACT (3) 2. INTRODUCTION (5) 2.1 Cystic fibrosis (5) 2.2 Development of the CF lung pathology (6) 2.3 The immune response (8) 2.3.1 Innate and adaptive immunity (8) 2.3.2 Toll-like receptors (TLRs) (9) 2.4 Inflammation in CF (11) 2.4.1 Neutrophils in CF (11) 2.4.2 Macrophages in CF (12) 2.4.3 Eicosanoid metabolites in CF (12) 2.4.4 Chemokines in CF (12) 2.5 Airway sampling for microbiome studies (13) 2.6 CF airway microbiome (14) 2.6.1 The healthy lung microbiome (14) 2.6.2 Pathogenic bacterial members of the CF microbiome and pulmonary exacerbations (15) 2.6.3 Pseudomonas aeruginosa in CF (16) 2.6.4 Anaerobic CF microbiota (17) 2.6.5 Fungal CF microbiota (17) 2.6.6 Virus CF microbiota (18) 2.6.7 Commensal-pathogen interactions in CF (18) 2.7 CFTR modulators (18) 2.8 Human epithelial cell lines and murine precision-cut lung slices (PCLS) as in vitro model systems (19) 2.9 Next-generation sequencing (NGS) in CF microbiome studies (20) 2.10 Objectives of this study (21) 3. MATERIALS AND METHODS (23) 3.1 Materials (23) 3.1.1 Devices and Instruments (23) 3.1.2 Software (24) 3.1.3 Consumables (25) 3.1.4 Chemicals, Reagents, Media, and Antibiotics (26) 3.1.5 Kits (29) 3.1.6 Buffers, Media, and Solutions (30) 3.1.7 qPCR Primers (32) 3.1.8 Cell lines (33) 3.1.9 Mouse strains (33) 3.1.10 Bacteria isolates (34) 3.2 Methods (37) 3.2.1 Isolation, identification, and storage of isolates (37) 3.2.2 Pathogens-Commensals direct cocultures (38) 3.2.3 HPLC of conditioned media from bacterial isolates (40) 3.2.4 Cell-Pathogen-Commensal cocultures (41) 3.2.5 PCLS cocultures (42) 3.2.6 RNA extraction, cDNA preparation, and quantitative RT-PCR (43) 3.2.7 RNA Sequencing and Transcriptome analysis (45) 3.2.8 Bacteria DNA extraction and Whole Genome Sequencing (46) 3.2.9 Biochemistry (47) 3.2.10 Statistical analyses (49) 4. RESULTS (50) 4.1 Analysis of direct commensal-pathogen interactions (50) 4.1.1 Several streptococcal isolates inhibit the growth of P. aeruginosa with inter- and intra-species variability in the antipseudomonal effect (51) 4.1.2 Further commensal isolates that do not inhibit the growth of P. aeruginosa (54) 4.1.3 The lack of antipseudomonal effect by noninhibitory isolates is not due to insufficient cell numbers (54) 4.1.4 Fungal CF isolates in this study do not possess antipseudomonal effects (56) 4.1.5 SCAPEs (Selected Commensals with strong Anti-Pseudomonal Effects) also inhibit other P. aeruginosa strains (58) 4.1.6 SCAPEs inhibit other non-pseudomonal pathogenic CF isolates (60) 4.1.7 Inhibitory effects mediated by SCAPEs do not extend to the fungal CF isolates in this study (63) 4.2 Analysis of commensal-host-pathogen interactions using human bronchial epithelial cell lines (63) 4.2.1 Some commensal isolates are able to modulate PA01-induced IL-8 release in BEAS-2B cells (64) 4.2.2 Commensal-mediated IL-8 modulation in BEAS-2B cells is not due to PA01 growth inhibition (67) 4.2.3 Selected commensal isolates also modulate LPS-induced IL-8 release in BEAS-2B cells (68) 4.2.4 Selected S. mitis isolates also modulate IL-8 release in BEAS-2B cells induced by other CF P. aeruginosa isolates (68) 4.2.5 Selected commensal isolates modulate PA01-induced IL-8 release in CFBE41o cells (70) 4.2.6 Protective commensals need to be metabolically active to exert immunomodulatory effects (72) 4.2.7 Hydrogen peroxide produced by peroxide-producing Streptococcus spp. affects the viability of human bronchial epithelial cells (72) 4.2.8 Selected peroxide-producing Streptococcus spp. possess immunomodulatory activity when peroxide-induced cell death is prevented (75) 4.3 Analysis of commensal-host-pathogen interactions using mouse PCLS (80) 4.3.1 PCLS is more resilient against peroxide-induced loss of viability (80) 4.3.2 Selected S. mitis isolates modulate PA01-induced inflammatory response in mouse PCLS (82) 4.3.3 Immunomodulation of PA01-induced response by SM4 in PCLS is not due to active PA01 growth inhibition (84) 4.4 Analysis of the underlying mechanisms behind the streptococcal-mediated effects via transcriptome and whole genome sequencing (84) 4.4.1 Transcriptomic analyses show that SM4 downregulates signalling pathways involved in PA01-induced inflammatory responses in mouse PCLS (84) 4.4.2 Whole genome sequence comparison shows that in inhibitory commensals, most of their genes are involved in carbohydrate transport and metabolism (87) 4.5 Uncovering the mechanisms behind the observed streptococcal-mediated antipseudomonal effects (89) 4.5.1 Conditioned medium (CM) from SCAPEs inhibits the growth of P. aeruginosa and other typical CF pathogens (89) 4.5.2 Inhibitory activity of SCAPEs CM is neither heat sensitive nor proteinaceous (91) 4.5.3 Iron competition and the arginolytic pathway are not responsible for the observed inhibitory effects (91) 4.5.4 Peroxide production may contribute but does not play a major role in the antipseudomonal effects (94) 4.5.5 Several members of Streptococcus spp. mediate antipseudomonal effects via the glycolytic pathway (94) 4.5.6 Low pH plays a major role in the observed inhibition (97) 4.5.7 SCAPEs and other selected commensal isolates can mediate antipseudomonal effects by simultaneously lowering the pH and secreting acetate (98) 4.5.8 Extracellular addition of 0.5 mg/ml acetate at pH 5.0 inhibits the growth of P. aeruginosa (100) 4.5.9 Other SCFAs like propionate and butyrate at pH 5.0 also inhibit P. aeruginosa isolates (102) 4.5.10 Acetate has better antipseudomonal activity than propionate and butyrate (103) 4.6 Commensals may mediate their protective effects via acetate production (104) 4.6.1 SCFAs modulate PA01- and LPS-induced IL-8 release in BEAS-2B cells (104) 4.6.2 SCFA levels used are well below cell toxicity levels (105) 4.6.3 Acetate modulates PA01 and LPS-induced immune response in mouse PCLS (107) 5. DISCUSSION (110) 5.1 SCAPEs mediate inhibitory effects in direct commensal-pathogen interactions against P. aeruginosa and other typical CF pathogens (110) 5.1.1 Members of Streptococcus spp. mediate inter- and intra-species variability in their antipseudomonal effects (111) 5.1.2 SCAPEs inhibit other clinical and nonclinical P. aeruginosa strains as well as other typical CF pathogens (113) 5.2 Selected commensals modulate PA01- and LPS-induced inflammatory response in human airway epithelial cells and mouse PCLS (115) 5.2.1 The gram-positive commensal isolates in this study do not significantly stimulate inflammatory response in human bronchial epithelial cells and mouse PCLS (115) 5.2.2 Selected gram-positive commensal isolates modulate P. aeruginosa-triggered inflammatory response in BEAS-2B cells with inter- and intra-species variation (117) 5.2.3 Selected commensal isolates modulate P. aeruginosa-triggered inflammatory response in CFBE41o ΔF508 (120) 5.2.4 Selected S. mitis isolates modulate P. aeruginosa-induced inflammatory response in mouse PCLS (121) 5.3 Commensals exert protective effects against P. aeruginosa infection via acetate production (124) 5.3.1 Conditioned medium (CM) from selected commensal isolates need to be acidic to mediate inhibition of growth of P. aeruginosa and other typical CF pathogens (125) 5.3.2 The glycolytic pathway is important for streptococcal-mediated antipseudomonal effects (127) 5.3.3 Commensal bacteria mediate growth inhibitory effects by simultaneously lowering the pH and producing acetate (128) 5.3.4 Acetate modulates PA01- and LPS-induced inflammation in bronchial epithelial cells and PCLS (131) 5.4 Conclusions and Outlook (134) 6. DECLARATIONS (158) 6.1 Statement of Authorship (158) 6.2 Declaration of compliance (160) 7. Acknowledgements (161) / There is no known lung disease that causes such a very early, chronic, and intense inflammatory reaction as seen in the airways of patients with cystic fibrosis (CF). CF is the most common lethal autosomal recessive genetic condition in the Caucasian population caused by a mutation in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene encoding for the CFTR protein. Defects in this protein result into epithelial dysfunction and affect several organs but lung pathology accounts for over 85% of CF morbidity and mortality. The CF lung pathology centers on the host-pathogen interactions where CFTR dysfunction predisposes to infections and the infections coupled with a dysfunctional immune response drive a sustained inflammatory cycle. This vicious cycle of infection and inflammation ultimately results in lung damage, respiratory failure and then, death. The most predominant infection in CF is by P. aeruginosa with an overall European average of 41.0% of adult patients infected. Of note, airway microbiome in CF is of polymicrobial nature. Given that previous studies have established positive correlations between a high microbiome diversity and improved lung function in CF, it was hypothesized that certain commensals may be protective against P. aeruginosa infection in the CF airways. Therefore, 105 commensal isolates from 32 different species were isolated from sputum samples of patients with CF and screened for antagonistic effects in direct pathogen-commensal interactions using a fluorescent P. aeruginosa PA01-mcherry strain. These isolates were also screened for immunomodulatory effects in commensal-host-pathogen interactions using BEAS-2B bronchial epithelial cell lines. Selected isolates with protective effects were subsequently screened for immunomodulatory effects using CFBE41o ΔF508 cells and a more natural precision-cut-lung-slices (PCLS) model and the produced cytokines were measured via ELISA as well as via a multiplex cytokine assay. Gene expression analyses were also conducted via qRT-PCR. Underlying mechanisms were explored via transcriptomic analyses, whole genome sequence (WGS) comparisons, and mechanistic studies including metabolic analyses via high-performance liquid chromatography. It was demonstrated that selected streptococcal commensal isolates, especially members belonging to S. mitis, S. oralis, S. cristatus, S. gordonii, S. sanguinis, and S. parasanguinis, mediate potent antagonistic effects against the growth of P. aeruginosa in direct cocultures. Selected members from S. mitis, S. oralis, and S. cristatus also prevented the growth of other P. aeruginosa clinical and nonclinical isolates as well as other typical CF pathogens including Staphylococcus aureus, Burkholderia spp., Achromobacter xylosoxidans, Proteus mirabilis, Haemophilus influenzae, Stenotrophomonas maltophilia, Enterococcus faecalis, and Klebsiella pneumoniae. An effective CF therapy should not only address infection but the accompanying vicious inflammation as well. Unlike the members of the gram-negative Neisseria spp. which significantly stimulated IL-8 production in mono-infection, all the gram-positive commensal isolates did not. Selected commensals also modulated P. aeruginosa PA01- and LPS-induced production of several inflammatory cytokines in human airway epithelial cells (BEAS-2B as well as CFBE41o ΔF508 and corrected wtCFTR) and in mouse PCLS. These findings were also confirmed via gene expression analyses indicating that the immunomodulation may be mediated by altered TLR signalling. Transcriptomic analyses after co-infection of S. mitis isolate 4 (SM4) and PA01 on PCLS revealed a significant downregulation of inflammatory responses such as mTOR and toll-like receptor signalling. WGS comparison showed that over half of the most enriched gene functions in inhibitory streptococcal isolates were responsible for carbohydrate transport and metabolism but were absent among the most enriched gene functions for the noninhibitory streptococcal isolates. Mechanistic investigations demonstrated that the glycolytic pathway was essential for antipseudomonal effects and that inhibitory commensals mediate inhibitory effects by lowering the pH of their growth media < 5.0 and producing acetate > 0.2 mg/ml. Acetate was demonstrated to mediate significant immunomodulatory effects against PA01- and LPS-induced inflammatory response in BEAS-2B and PCLS. In conclusion, selected commensal bacteria induce protective effects in the CF airway by producing acetate, which mediates antipseudomonal and immmunomodulatory activities both directly by diffusing across bacterial and host cells to mediate direct effects as well as indirectly by stimulating host cells to clear bacteria efficiently and control inflammation. Given that the use of whole bacteria as probiotics in immunocompromised patients like in CF possesses several challenges, the use of bacterial metabolites like acetate presents a safer, easier, and more practical alternative.:List of Abbreviations (i) Table of Contents (iv) 1. SUMMARY (1) 1.1 Zusammenfassung (1) 1.2 ABSTRACT (3) 2. INTRODUCTION (5) 2.1 Cystic fibrosis (5) 2.2 Development of the CF lung pathology (6) 2.3 The immune response (8) 2.3.1 Innate and adaptive immunity (8) 2.3.2 Toll-like receptors (TLRs) (9) 2.4 Inflammation in CF (11) 2.4.1 Neutrophils in CF (11) 2.4.2 Macrophages in CF (12) 2.4.3 Eicosanoid metabolites in CF (12) 2.4.4 Chemokines in CF (12) 2.5 Airway sampling for microbiome studies (13) 2.6 CF airway microbiome (14) 2.6.1 The healthy lung microbiome (14) 2.6.2 Pathogenic bacterial members of the CF microbiome and pulmonary exacerbations (15) 2.6.3 Pseudomonas aeruginosa in CF (16) 2.6.4 Anaerobic CF microbiota (17) 2.6.5 Fungal CF microbiota (17) 2.6.6 Virus CF microbiota (18) 2.6.7 Commensal-pathogen interactions in CF (18) 2.7 CFTR modulators (18) 2.8 Human epithelial cell lines and murine precision-cut lung slices (PCLS) as in vitro model systems (19) 2.9 Next-generation sequencing (NGS) in CF microbiome studies (20) 2.10 Objectives of this study (21) 3. MATERIALS AND METHODS (23) 3.1 Materials (23) 3.1.1 Devices and Instruments (23) 3.1.2 Software (24) 3.1.3 Consumables (25) 3.1.4 Chemicals, Reagents, Media, and Antibiotics (26) 3.1.5 Kits (29) 3.1.6 Buffers, Media, and Solutions (30) 3.1.7 qPCR Primers (32) 3.1.8 Cell lines (33) 3.1.9 Mouse strains (33) 3.1.10 Bacteria isolates (34) 3.2 Methods (37) 3.2.1 Isolation, identification, and storage of isolates (37) 3.2.2 Pathogens-Commensals direct cocultures (38) 3.2.3 HPLC of conditioned media from bacterial isolates (40) 3.2.4 Cell-Pathogen-Commensal cocultures (41) 3.2.5 PCLS cocultures (42) 3.2.6 RNA extraction, cDNA preparation, and quantitative RT-PCR (43) 3.2.7 RNA Sequencing and Transcriptome analysis (45) 3.2.8 Bacteria DNA extraction and Whole Genome Sequencing (46) 3.2.9 Biochemistry (47) 3.2.10 Statistical analyses (49) 4. RESULTS (50) 4.1 Analysis of direct commensal-pathogen interactions (50) 4.1.1 Several streptococcal isolates inhibit the growth of P. aeruginosa with inter- and intra-species variability in the antipseudomonal effect (51) 4.1.2 Further commensal isolates that do not inhibit the growth of P. aeruginosa (54) 4.1.3 The lack of antipseudomonal effect by noninhibitory isolates is not due to insufficient cell numbers (54) 4.1.4 Fungal CF isolates in this study do not possess antipseudomonal effects (56) 4.1.5 SCAPEs (Selected Commensals with strong Anti-Pseudomonal Effects) also inhibit other P. aeruginosa strains (58) 4.1.6 SCAPEs inhibit other non-pseudomonal pathogenic CF isolates (60) 4.1.7 Inhibitory effects mediated by SCAPEs do not extend to the fungal CF isolates in this study (63) 4.2 Analysis of commensal-host-pathogen interactions using human bronchial epithelial cell lines (63) 4.2.1 Some commensal isolates are able to modulate PA01-induced IL-8 release in BEAS-2B cells (64) 4.2.2 Commensal-mediated IL-8 modulation in BEAS-2B cells is not due to PA01 growth inhibition (67) 4.2.3 Selected commensal isolates also modulate LPS-induced IL-8 release in BEAS-2B cells (68) 4.2.4 Selected S. mitis isolates also modulate IL-8 release in BEAS-2B cells induced by other CF P. aeruginosa isolates (68) 4.2.5 Selected commensal isolates modulate PA01-induced IL-8 release in CFBE41o cells (70) 4.2.6 Protective commensals need to be metabolically active to exert immunomodulatory effects (72) 4.2.7 Hydrogen peroxide produced by peroxide-producing Streptococcus spp. affects the viability of human bronchial epithelial cells (72) 4.2.8 Selected peroxide-producing Streptococcus spp. possess immunomodulatory activity when peroxide-induced cell death is prevented (75) 4.3 Analysis of commensal-host-pathogen interactions using mouse PCLS (80) 4.3.1 PCLS is more resilient against peroxide-induced loss of viability (80) 4.3.2 Selected S. mitis isolates modulate PA01-induced inflammatory response in mouse PCLS (82) 4.3.3 Immunomodulation of PA01-induced response by SM4 in PCLS is not due to active PA01 growth inhibition (84) 4.4 Analysis of the underlying mechanisms behind the streptococcal-mediated effects via transcriptome and whole genome sequencing (84) 4.4.1 Transcriptomic analyses show that SM4 downregulates signalling pathways involved in PA01-induced inflammatory responses in mouse PCLS (84) 4.4.2 Whole genome sequence comparison shows that in inhibitory commensals, most of their genes are involved in carbohydrate transport and metabolism (87) 4.5 Uncovering the mechanisms behind the observed streptococcal-mediated antipseudomonal effects (89) 4.5.1 Conditioned medium (CM) from SCAPEs inhibits the growth of P. aeruginosa and other typical CF pathogens (89) 4.5.2 Inhibitory activity of SCAPEs CM is neither heat sensitive nor proteinaceous (91) 4.5.3 Iron competition and the arginolytic pathway are not responsible for the observed inhibitory effects (91) 4.5.4 Peroxide production may contribute but does not play a major role in the antipseudomonal effects (94) 4.5.5 Several members of Streptococcus spp. mediate antipseudomonal effects via the glycolytic pathway (94) 4.5.6 Low pH plays a major role in the observed inhibition (97) 4.5.7 SCAPEs and other selected commensal isolates can mediate antipseudomonal effects by simultaneously lowering the pH and secreting acetate (98) 4.5.8 Extracellular addition of 0.5 mg/ml acetate at pH 5.0 inhibits the growth of P. aeruginosa (100) 4.5.9 Other SCFAs like propionate and butyrate at pH 5.0 also inhibit P. aeruginosa isolates (102) 4.5.10 Acetate has better antipseudomonal activity than propionate and butyrate (103) 4.6 Commensals may mediate their protective effects via acetate production (104) 4.6.1 SCFAs modulate PA01- and LPS-induced IL-8 release in BEAS-2B cells (104) 4.6.2 SCFA levels used are well below cell toxicity levels (105) 4.6.3 Acetate modulates PA01 and LPS-induced immune response in mouse PCLS (107) 5. DISCUSSION (110) 5.1 SCAPEs mediate inhibitory effects in direct commensal-pathogen interactions against P. aeruginosa and other typical CF pathogens (110) 5.1.1 Members of Streptococcus spp. mediate inter- and intra-species variability in their antipseudomonal effects (111) 5.1.2 SCAPEs inhibit other clinical and nonclinical P. aeruginosa strains as well as other typical CF pathogens (113) 5.2 Selected commensals modulate PA01- and LPS-induced inflammatory response in human airway epithelial cells and mouse PCLS (115) 5.2.1 The gram-positive commensal isolates in this study do not significantly stimulate inflammatory response in human bronchial epithelial cells and mouse PCLS (115) 5.2.2 Selected gram-positive commensal isolates modulate P. aeruginosa-triggered inflammatory response in BEAS-2B cells with inter- and intra-species variation (117) 5.2.3 Selected commensal isolates modulate P. aeruginosa-triggered inflammatory response in CFBE41o ΔF508 (120) 5.2.4 Selected S. mitis isolates modulate P. aeruginosa-induced inflammatory response in mouse PCLS (121) 5.3 Commensals exert protective effects against P. aeruginosa infection via acetate production (124) 5.3.1 Conditioned medium (CM) from selected commensal isolates need to be acidic to mediate inhibition of growth of P. aeruginosa and other typical CF pathogens (125) 5.3.2 The glycolytic pathway is important for streptococcal-mediated antipseudomonal effects (127) 5.3.3 Commensal bacteria mediate growth inhibitory effects by simultaneously lowering the pH and producing acetate (128) 5.3.4 Acetate modulates PA01- and LPS-induced inflammation in bronchial epithelial cells and PCLS (131) 5.4 Conclusions and Outlook (134) 6. DECLARATIONS (158) 6.1 Statement of Authorship (158) 6.2 Declaration of compliance (160) 7. Acknowledgements (161)

Detritus is an important energy source of stream food webs. Being a mix of allochthonous and autochthonous sources, it is often unknown, which components contribute to the growth of stream organisms. This study focussed on the comparison of two different detritus types (riparian detritus and stream detritus) with respect to food quality and effects on growth as a fitness parameter of juvenile freshwater pearl mussels (FPM). We performed feeding experiments with juvenile FPM under laboratory conditions using the two detritus types from four different natural sources each. Food quality was determined by analysing the fatty acid composition. Stream detritus (conditioned to stream environment including autochthonous microbes) resulted in significantly higher growth rates of juvenile FPM than predominately terrestrial-based riparian detritus indicating higher food quality. Significantly positive correlations were found between mussel growth and different groups of polyunsaturated fatty acids (PUFA). This suggests that especially trace substances such as long-chained n-3 PUFAs and a high ratio of n-3 to n-6 PUFAs enhance the food quality of stream detritus for juvenile FPM. These results highlight the importance of instream conditioning of detritus for the food mix in headwater streams and the importance of PUFAs for the development of juvenile FPM.

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In order to investigate the effect of food restriction on fat mobilization in horses with impaction in left ventral colon during treatment, serum triglycerides, NEFA and total bilirubine (TB) were measured before and after treatment. On another side, the determination of alcohol dehydrogenase (ADH) activity in serum could facilitate the distinguishing of the non-strangulating intestinal obstruction from the potential fatal strangulation obstruction and could submit a new prognostic biochemical parameter for intestinal strangulation. With the intention of giving a highlight over the analgesic effect of Buscopan® compositum in horses with colic, it was attempted to investigate the effect of Buscopan® compositum on the intestinal motility of healthy conscious horses in different regions of intestine. A significant elevation of NEFA and TB was observed in horses with impaction in left ventral colon at admission. By relieving the impaction, there was a significant elevation of triglycerides in comparison to its level at admission. There was a significant increase in ADH activity in all horses with acute intestinal obstruction. ADH activity was significantly higher in horses with strangulation in comparison to non-strangulation obstruction. There was only a significant correlation between ADH and lactate in horses with non-strangulation obstruction and colon torsion. Only AST and GLDH were significantly increased in horses with colon torsion. ADH activity > 20 U/l had 80.56% specificity and 80.49% sensitivity for discriminating horses with intestinal strangulation from non-strangulation obstruction. ADH activity < 80 U/l had 94.44% specificity and 66.67% sensitivity for survival. Buscopan® compositum had an immediate, rapid and significant (p< 0.05) reduction of duodenal, cecal and left ventral colon contractions after application. Cecal and left ventral colon contractions restored rapidly their normal contractions after 30 min, while duodenal contractions returned to the normal rate after 120 min of Buscopan® compositum administration. The horses with impaction in left ventral colon are susceptible to fat mobilization during the period of treatment as a result of food restriction. It was characterized by a revisable hypertri-glyceridemia and hyperbililrubinemia. Serum ADH activity could have a useful clinical value in detecting the intestinal strangulation and predicting the prognosis in horses with intestinal strangulation. Buscopan® compositum at its therapeutic dosage has an immediate, potent, short-lived reductive effect on cecum and left ventral colon contractions but a minor, longer effect on the duodenal contractions. Therefore, it is thought to be more effective in treatment of spasmodic colic than in large colon impaction.:Contents I List of Abbreviations II 1 Introduction and Literature 1 2 Results 4 2.1 Publication 1: Triglyceride, free fatty acids and total bilirubin in horses with left ventral large colon impaction 4 2.2 Publication 2: Clinical evaluation of serum alcohol dehydrogenase activity in horses with acute intestinal obstruction 9 2.3 Publication 3: Effect of Buscopan® compositum on the motility of the duodenum, cecum and left ventral colon in healthy conscious horses 43 3 Discussion 60 4 Summary 68 5 Zusammenfassung 70 6 References 72 7 Acknowledgement 81 / Um den Effekt der Nahrungskarenz auf die Fettmobilisation bei Pferden mit Verstopfung der linken ventralen Längslagen des Kolons während der Behandlung zu untersuchen, wurden Triglyceride (TG), freie Fettsäuren (FFS) und Gesamtbilirubin (GB) bestimmt. Andererseits ermöglicht die Bestimmung der Aktivität der Alkoholdehydrogenase (ADH) im Serum die Unterscheidung zwischen einer nichtstrangulierenden intestinalen Obstruktion und einer potentiell tödlichen Strangulation. ADH kann somit als ein neuer prognostischer biochemischer Parameter für die intestinale Strangulation eingesetzt werden. Um den spasmolytischen Effekt von Buscopan compositum bei Pferden mit Kolik zu untersuchen, wurde der Effekt von Buscopan compositum auf die intestinale Kontraktion von gesunden Pferden in verschiedenen Regionen des Darmes getestet. Eine signifikante Erhöhung der FFS und des GB wurde bei Aufnahme von Pferden mit einer Verstopfung in der linken ventralen Längslagen festgestellt. Nach der Behandlung der Verstopfung konnte eine signifikante Erhöhung der Konzentration von TG, bezogen auf die TG Konzentration bei Aufnahme in die Klinik, festgestellt werden. Bei Pferden mit akuter intestinaler Obstruktion wurde eine signifikante Erhöhung der Aktivität der ADH beobachtet. Die Aktivität der ADH war bei Pferden mit einer Strangulation signifikant höher als bei Pferden, die eine nichtstrangulierende Obstruktion des Darmes hatten. Bei Pferden mit einer nichtstrangulierenden Obstruktion oder einer Kolontorsion wurde eine positive Korrelation zwischen der ADH-Aktivität und der Laktatkonzentration im Serum festgestellt. Nur bei Pferden mit Kolontorsion waren die Aktivitäten von AST und GLDH signifikant erhöht. Für die Unterscheidung zwischen Pferden mit einer intestinalen Strangulation oder einer nichtstrangulierenden Obstruktion wurde für die ADH- Aktivität größer als 20 U/l eine Spezifität von 80,56% und eine Sensitivität von 80,49% ermittelt. Eine ADH-Aktivität kleiner 80 U/l zeigt, mit einer Spezifität von 94,44% und einer Sensitivität von 66,67%, eine günstige Prognose für das Überleben des Pferdes an. Nach Gabe von Buscopan® compositum trat eine sofortige schnelle und signifikante (p<0,05) Reduktion der Kontraktionen im Duodenum, Zäkum und den linken ventralen Längslagen ein. Die Kontraktionen des Zäkums und der linken ventralen Längslagen normalisierten sich schnell innerhalb von 30 min, wogegen die Kontraktionen des Duodenums erst 120 min nach der Applikation von Buscopan® compositum den Normalzustand erreichten. Pferde mit einer Verstopfung in der linken ventralen Längslagen des Kolons sind während der medizinischen Behandlung anfällig für Fettmobilisation aufgrund der reduzierten Futter-aufnahme. Dies ist gekennzeichnet durch eine reversible Hypertriglyceridämie und eine Hyperbilirubinämie. Die Aktivität von ADH im Serum kann ein nützlicher klinischer Parameter sein, um eine intestinale Strangulation zu identifizieren und bietet sich auch als prognostischer Marker bei intestinaler Strangulation an. Die Applikation von Buscopan® compositum in der therapeutischen Dosierung hat eine sofortige, potente und kurzzeitige Reduktion der Kontraktionen des Zäkums und der linken ventralen Längslage aber einen geringen und länger anhaltenden Effekt auf die duodenalen Kontraktionen zur Folge. Daraus folgt, dass Buscopan® compositum bei der Behandlung von Krampfkoliken effektiver ist als bei Verstopfungen des großen Kolons.:Contents I List of Abbreviations II 1 Introduction and Literature 1 2 Results 4 2.1 Publication 1: Triglyceride, free fatty acids and total bilirubin in horses with left ventral large colon impaction 4 2.2 Publication 2: Clinical evaluation of serum alcohol dehydrogenase activity in horses with acute intestinal obstruction 9 2.3 Publication 3: Effect of Buscopan® compositum on the motility of the duodenum, cecum and left ventral colon in healthy conscious horses 43 3 Discussion 60 4 Summary 68 5 Zusammenfassung 70 6 References 72 7 Acknowledgement 81

Polyunsaturated fatty acids (PUFA) have been used with some success in the treatment of canine atopic dermatitis (CAD). Correspondent in vitro studies revealed that PUFA play a crucial role in the exocytosis of mast cells. n3 PUFA such as α-linolenic acid (LNA), eicosapentaenoic acid (EPA), docosahexaenoic acid (DHA), as well as the n6 PUFA linoleic acid (LA) have been shown to arrest the secretion of inflammatory mediators. Contrary, the n-6 PUFA arachidonic acid (AA) has been proven to promote the production of mast cell inflammatory mediators. However, we are still lacking a complete picture of the mode of action. The goal of this work was to further characterize the modulatory effects of PUFA supplementation on the plasma membrane lipid composition of mast cells. Furthermore the consequences of a membrane modulation of mast cells by PUFA on the localization and activity on of the membrane bound enzyme phospholipases D (PLD) were investigated. Canine mastocytoma cells (C2) were supplemented with one of the following PUFA: LNA, EPA, DHA, LA or AA. To investigate the influence of PUFA on the lipid composition of membrane microdomains, lipid rafts were separated from non-raft plasma membranes of mast cells for the first time using a detergent-free isolation technique. Results show that PUFA are significantly increased in rafts as well as in non-rafts microdomains (Publication 1). The incorporation of PUFA into the membrane goes along with an increase of the unsaturation status and the fluidity of the membrane. This rise in membrane fluidity may result in a reorganization of membrane signaling molecules and enzymes such as the PLD. To define the impact of a PUFA supplementation on PLD trafficking, C2 were transfected with green fluorescent protein (GFP) fusion plasmids encoding PLD1 or PLD2. Since the transfection ability of the suspension cell line C2 is limited, a special transfection protocol was established, suitable for non-adherent cell lines. Transfection succeeded using chicken egg white as coating material for the cell culture plates. The transfection efficiency rose to 50% versus 5% in uncoated plates. In addition to the obvious increase in the transfection efficiency, the new technique is simple and economic and might be suitable for a wide range of suspension cell lines (Publication 2). Using this optimized protocol the influence of PUFA on the trafficking of PLD isoforms was studied. LNA, EPA, DHA and LA but not AA prevented the stimulation-induced translocation of PLD1 to the plasma membrane. Since the translocation of PLD1 is important for mast cell exocytosis, LNA, EPA, DHA and LA do have an inhibiting effect on the stimulation-induced release of pro-inflammatory mediators. All PUFA tested boosted the total PLD activity. In order to rule out, which PLD isoform was affected by the PUFA, the mast cells were supplemented with DHA or AA in the presence of specific PLD isoform inhibitors. DHA completely abolished the inhibitiory effect of the PLD1 inhibitor but had no effect on the inhibitory effect of PLD2 inhibitor. On the other hand, AA suppressed the inhibitory effect of both PLD1 and PLD2 inhibitor (Publication 3). Taking together, the studies provide a mechanistic base for the role of PUFA in the exocytosis processes of mast cells. PUFA of the n3 and the n6 families impact the lipid composition of membrane microdomains, which in turn lead to a modulation of the physiochemical properties of the membrane. LNA, EPA, DHA and LA suppress the release of inflammatory mediators through their inhibitory action on the stimulation-induced translocation of the PLD1. Contrariwise, AA permits the stimulation-induced migration of PLD1 to the plasma membrane and increases the activity of both PLD isoforms. Therefore, LNA, EPA, DHA and LA but not AA inhibit the release of mast cell inflammatory mediators upon stimulation. / Mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFA) können mit einigem Erfolg zur Behandlung der caninen atopischen Dermatitis (CAD) eingesetzt werden. In vitro-Studien zeigten, dass PUFA eine entscheidende Rolle in der Exozytose von Mastzellen spielen. N-3-PUFA wie α-Linolensäure (LNA), Eicosapentaensäure (EPA), Docosahexaensäure (DHA) sowie die n-6-PUFA Linolsäure (LA) können die Sekretion von Entzündungsmediatoren vermindern. Arachidonsäure (AA) als n-6 mehrfach ungesättigte Fettsäure hingegen fördert die Entzündungsmediatoren-Freisetzung aus den Mastzellen. Eine vollständige Aufklärung der Wirkungsweise fehlt aber weiterhin. Das Ziel dieser Arbeit war eine weitergehende Charakterisierung der modulierenden Effekte einer PUFA-Supplementierung auf die Lipidzusammensetzung der Plasmamembran von Mastzellen. Darüber hinaus wurden die Auswirkungen von PUFA auf die Lokalisation und Aktivität des Membran-gebundenen Enzyms Phospholipase D (PLD) untersucht. Canine Mastozytom-Zellen (C2) wurden mit einer der folgenden PUFA kultiviert: LNA, EPA, DHA, LA oder AA. Um den Einfluss von PUFA auf die Lipidzusammensetzung der Membran-Mikrodomänen zu untersuchen, konnten sowohl Lipid Raft als auch Nicht-Raft Plasmamembran-Anteile von Mastzellen zum ersten Mal mittels einer Detergenzien-freien Isolationsmethode getrennt werden. Hervorzuheben ist, dass PUFA signifikant vermehrt in Raft- sowie in Nicht-Raft Membranmikrodomänen eingelagert werden (Publikation 1). Die Integration von PUFA in die Membran geht mit einer Steigerung der Doppelbindungsanzahl und der Fluidität der Membran einher. Diese Erhöhung der Membranfluidität kann zu einer Reorganisation von membranären Signalmolekülen und Enzymen wie der PLD führen. Um die Auswirkungen einer PUFA-Supplementierung auf den intrazellulären Transport der PLD in C2 zu bestimmen, wurden die Zellen mit PLD1- oder PLD2-codierenden grün fluoreszierenden Protein-(GFP-)Fusionsplasmiden transfiziert. Da die Transfektionsfähigkeit der Suspensions-Zelllinie C2 begrenzt ist, wurde ein für nicht-adhärente Zelllinien geeignetes Transfektionsprotokoll etabliert. Mit Hühnereiweiß als Beschichtungsmaterial für die Zellkultur-Platten stieg die Transfektionseffizienz auf 50% im Vergleich zu 5% bei unbeschichteten Platten. Neben der deutlichen Erhöhung der Transfektionseffizienz ist die neu etablierte Technik einfach durchzuführen sowie wirtschaftlich und kann für eine Vielzahl von Suspension-Zelllinien geeignet sein (Publikation 2). Unter Verwendung dieses optimierten Protokolls wurde der Einfluss von PUFA auf die Translokation der PLD-Isoformen untersucht. LNA, EPA, DHA und LA, nicht aber AA verhindern die stimulationsinduzierte Translokation der PLD1 an die Plasmamembran. Die Translokation der PLD1 ist wichtig für die Mastzell-Exozytose. LNA, EPA, DHA und LA haben hier eine hemmende Wirkung auf die stimulationsinduzierte Freisetzung von proinflammatorischen Mediatoren. Alle getesteten PUFA verstärken die Gesamt-PLD-Aktivität. Um zu unterscheiden, welche PLD-Isoform durch PUFA beeinflusst ist, wurden die Mastzellen mit DHA oder AA in Gegenwart von PLD-Isoform-Inhibitoren supplementiert. DHA hebt die inhibitorische Wirkung des PLD1-Inhibitors vollständig auf, zeigte aber keinen Einfluss auf die hemmende Wirkung des PLD2-Inhibitors. Andererseits unterdrückt AA die hemmende Wirkung des PLD1- als auch des PLD2-Inhibitors (Publikation 3). Zusammenfassend bietet die Studie eine mechanistische Basis für die Rolle von PUFA bei Exozytose-Prozessen von Mastzellen. PUFA der n-3- und n-6-Familie beeinflussen die Lipidzusammensetzung von membranären Mikrodomänen, was wiederum zu einer Modulation der physikalisch-chemischen Eigenschaften der Membran führt. LNA, EPA, DHA und LA verhindern die Freisetzung von Entzündungsmediatoren durch ihre hemmende Wirkung auf die stimulationsinduzierte Translokation der PLD1. Umgekehrt erlaubt AA eine stimulationsinduzierte Migration der PLD1 zur Plasmamembran und steigert die Aktivität der beiden Isoformen der PLD. Somit hemmen LNA, EPA, DHA und LA, aber nicht AA die Freisetzung von Mastzell-Entzündungsmediatoren nach Stimulation.