Introdução. Quinolonas são antimicrobianos sintéticos que inibem as enzimas DNA-girase e topoisomerase IV resultando na morte bacteriana. São altamente eficazes no tratamento de infecções bacterianas, especialmente causadas por bactérias Gram negativas, e portanto amplamente utilizados na medicina humana e veterinária, na qual também são empregados como profiláticos. Porém, o uso indiscriminado e inadequado levou ao aumento de bactérias resistentes a estes compostos. Esta resistência pode ocorrer devido a mutações nas enzimas DNA-girase e topoisomerase IV, e também por genes contidos em plasmídeos. Estes últimos são os principais responsáveis pela disseminação e circulação da resistência entre o meio ambiente e o ambiente hospitalar. Objetivos. Pesquisar genes de resistência a antimicrobianos do grupo das quinolonas em bactérias Gram negativas de origem clínica e ambiental que apresentam resistência fenotípica a este grupo. Material e Métodos. 73 cepas de Enterobacteriaceae e Aeromonas sp. de origem clínica e ambiental foram selecionadas para o estudo, e avaliadas quanto à sensibilidade aos antimicrobianos do grupo das quinolonas e à pesquisa de genes de resistência a este mesmo grupo e mutações no gene que codifica a enzima DNA-girase por meio de PCR e sequenciamento. Resultados. Das 73 cepas previamente selecionadas para compor o estudo, 65 foram utilizadas, devido à exclusão de perfis clonais similares. Nestas, foram observados os genes, qnrS1 (1,5 por cento ), qnrS2 (26,2 por cento ), qnrB1 (3,1 por cento ), qnrB19 (12,3 por cento ), qnrD1 (1,5 por cento ), aac(6)-Ib-cr (10,8 por cento ), oqxA (43,1 por cento ) e oqxB (41,5 por cento ), e duas variantes determinadas qnrB-like (3,1 por cento ) e qnrB69-like (1,5 por cento ). Os genes qnrA, qnrC e qepA não foram identificados. Mutações na enzima DNA-girase foram observadas em 97,9 por cento das cepas positivas para algum dos genes pesquisados. Em 4 cepas foi possível estabelecer a associação do gene aac(6)-Ib-cr com integron de classe 1. Foi realizado sequenciamento e caracterização do plasmídeo completo onde estava inserido o gene qnrD1. Conclusões. Este estudo relata pela primeira vez no Brasil a ocorrência dos genes qnrS2, oqxA e oqxB, a associação entre o elemento genético integron de classe 1 e o gene aac(6)-Ib-cr, e o gene qnrD1 e a caracterização do plasmídeo completo onde este estava inserido. Os genes qnrB1, qnrB19, e aac(6)-Ib-cr, anteriormente apenas relatados em cepas clínicas, foram observados em cepas ambientais. Os resultados deste estudo mostram alta frequência de genes de resistência a quinolonas tanto em isolados clínicos quanto em isolados ambientais, alertando quanto à disseminação da resistência entre fontes diferentes, e possível manutenção destes genes por cepas ambientais. / Introduction. Quinolones are synthetic antimicrobial agents that inhibit DNA gyrase and topoisomerase IV enzymes resulting in bacterial death. They are highly effective in the treatment of bacterial infections, especially the ones caused by Gram negative bacteria, as well as for prophylaxy. Therefore they are widely used in human and veterinary medicine. However, indiscriminate and improper use led to an increase of bacteria resistance to these compounds. This resistance can be due to mutations in DNA gyrase and topoisomerase IV enzymes and also by genes contained in plasmids, which are mainly responsible for the spread and transmission of resistance between the environment and the hospital set. Objectives. To search for genes of resistance to quinolone antimicrobial agents in Gram-negative bacteria from clinical and environmental strains that present phenotypic resistance to this group. Material and Methods. 73 strains of Enterobacteriaceae and Aeromonas spp., from clinical and environmental origin, were selected for this study, and evaluated for antimicrobial susceptibility of quinolone and search of resistance genes in this same group and also for mutations in the gene encoding the enzyme DNA gyrase by PCR and sequencing. Results. Of the 73 strains previously selected to compose this study, 65 were used, due to the exclusion of similar clonal profiles. In these, genes qnrS1 (1.5 per cent ), qnrS2 (26.2 per cent ) qnrB1 (3.1 per cent ), qnrB19 (12.3 per cent ) qnrD1 (1.5 per cent ) aac(6\')-Ib-cr (10.8 per cent ) oqxA (43.1 per cent ) and oqxB (41.5 per cent ) were observed, and two variants were named as qnrB-like (3.1 per cent ) and qnrB69-like (1.5 per cent ). The qnrA, qnrC and qepA genes were not identified. Mutations in DNA gyrase enzyme were observed in 97.9 per cent of the positive strains for at least one of the genes studied. It was possible to establish the association of aac(6\')-Ib-cr with class 1 integron gene in four strains. Complete sequencing and characterization of plasmid qnrD1, where the gene was inserted, was performed. Conclusions. This study reports, for the first time in Brazil, the occurrence of qnrS2, oqxA and oqxB genes, the association between genetic element integron class 1 gene and the aac (6 \')-Ib-cr, and qnrD1 gene and the characterization of the complete plasmid where this was inserted. qnrB1, qnrB19, and aac(6\')-Ib-cr genes, previously only reported in clinical strains, were observed in environmental strains. The results of this study show a high frequency of quinolone-resistance genes for both clinical and environmental isolates, warning about the spread of resistance through different sources, and the possible maintenance of these genes by environmental strains.

La tesis doctoral esta compuesta por 10 artículos, con sus correspondientes 10 resúmenes. En todos los casos que fue posible, se realizó un estudio cruzado y el método de determinación de todas las quinolonas fue cromatografía liquida de alta resolución (HPLC) con un detector de fluorescencia:1. El objetivo fue estudiar la farmacocinética de difloxacino (5 mg/kg) en el caballo (n=6). Difloxacino puede ser efectivo para el tratamiento de infecciones por bacterias sensibles en caballos.2. El objetivo fue estudiar la farmacocinética de danofloxacino en el caballo (n=6), a dosis de 1.25 mg/kg. Danofloxacino en caballos puede ser efectivo para el tratamiento de infecciones por bacterias sensibles.3. La farmacocinética de moxifloxacino en el conejo (n=6) fue evaluada. Moxifloxacino puede ser efectivo en conejos.4. El comportamiento farmacocinético de ibafloxacino (15 mg/kg) fue estudiado en cabras lactantes. La penetración de ibafloxacino desde la sangre a la leche fue pobre. 5. La farmacocinética de difloxacino fue estudiada en cabras lactantes (n=6), a dosis de 5 mg/kg. La penetración de difloxacino desde el plasma a la leche fue amplia y rápida. 6. La farmacocinética/farmacodinámica de danofloxacino fue estudiada en conejos (n=6), a dosis de 6 mg/kg. No se recomienda el uso de danofloxacino en el conejo, contra las cepas de Staphylococcus aureus testadas en este estudio, por el riesgo de aparición de resistencias. 7. Se ha desarrollado un método de cromatografía liquida de alta resolución con detector de fluorescencia simple, rápido y sensible para la determinación de ibafloxacino en plasma de conejo. 8. La farmacocinética de difloxacino fue estudiada en ovejas (n=6), a dosis de 5 mg/kg. Difloxacino puede ser efectivo en las ovejas.9. La farmacocinética de orbifloxacino fue estudiada en cabras lactantes (n=6), a dosis de 2.5 mg/kg. La penetración de orbifloxacino en la leche fue rápida, alcanzando altas concentraciones. 10. La farmacocinética/farmacodinámica de orbifloxacino fue estudiada en conejos (n=6), a dosis de 5 mg/kg. No se recomienda el uso de orbifloxacino,contra las cepas de Staphylococcus aureus testadas en este estudio, por el riesgo de aparición de resistencias. / The present PhD work is composed of 10 manuscripts and 10 summaries: 1. The pharmacokinetics of difloxacin (5 mg/kg) were determined in healthy horses (n=6). Difloxacin in horses indicate that it is likely to be effective for treating sensitive equine bacterial infections.2. The pharmacokinetics of danofloxacin (1.25 mg/kg) were determined in healthy horses (n=6). Danofloxacin in horses indicate that it is likely to be effective for treating sensitive equine bacterial infections.3. The pharmacokinetics (PK) of moxifloxacin in healthy white New Zealand rabbits was studied. The favourable PK parameters indicate that it is likely to be effective in rabbits.4. The pharmacokinetic behavior of ibafloxacin was studied (15 mg/kg) to 6 healthy lactating goats. Ibafloxacin penetration from the blood to the milk was poor. 5. The single-dose disposition kinetics of difloxacin (5 mg/kg) were determined in clinically normal lactating goats (n = 6). Difloxacin penetration from the blood into the milk was extensive and rapid.6. The pharmacokinetics of danofloxacin (6 mg/kg) was studied in healthy rabbits. In consideration of the low AUC/MIC indices obtained, its use cannot be recommended given the risk for selection of first mutant subpopulations.7. A simple, rapid, and sensitive high-performance liquid chromatographic method is developed for the determination of ibafloxacin in rabbit plasma..8. The disposition kinetics of difloxacin, a fluoroquinolone antibiotic, were determined in sheep at a single dose of 5mg/kg. Difloxacin is likely to be effective in sheep.9. The single-dose disposition kinetics of orbifloxacin (2.5 mg/kg) were determined in clinically normal lactating goats (n = 6). Orbifloxacin penetration from the blood into the milk was rapid and showed high levels of concentrations in milk secretion. 10. The single-dose disposition kinetics of orbifloxacin (5 mg/kg) were determined in clinically normal rabbits (n=6). Its use against the S. aureus strains assayed in this study cannot be recommended given the risk of selection of resistant populations.

Objetivo: O objetivo geral deste trabalho foi estabelecer modelo farmacocinéticofarmacodinâmico (modelo PK/PD) para descrever o perfil temporal do efeito bactericida do levofloxacino e do gatifloxacino contra Streptococcus pneumoniae. Método: Para alcançar este objetivo as seguintes etapas foram realizadas: i) foram validadas metodologias analíticas de SPE-HPLC para o gatifloxacino e HPLC para o levofloxacino e o gatifloxacino para quantificação destes em amostras de plasma, microdialisado tecidual e caldo de cultura; ii) foi avaliada a farmacocinética do gatifloxacino em roedores nas doses de 6 e 12 mg/kg via oral e 6 mg/kg via intravenosa (i.v.) e a biodisponibilidade oral foi determinada; iii) foram estabelecidas as condições ideais para microdiálise do gatifloxacino e as taxas de recuperação in vitro, por diálise (EE), retrodiálise (RD) e fluxo líquido zero (NNF) e in vivo, em tecido pulmonar e muscular, por retrodiálise e fluxo líquido zero. Essas recuperações foram utilizadas para determinar a penetração pulmonar do gatifloxacino após a administração i.v. bolus de 6 mg/kg a ratos Wistar sadios; iv) foram simuladas as concentrações livres pulmonares esperadas para humanos após tratamento com diferentes regimes de dosagem para o levofloxacino e o gatifloxacino em modelo de infecção in vitro frente a Streptococcus pneumoniae ATCC® 49619. Simulações de concentrações constantes múltiplas do MIC de cada fármaco também foram realizadas. As curvas de morte bacteriana por tempo obtidas foram modeladas com modelo PK/PD de Emax modificado, com auxílio do programa Scientist® v 2.01. Resultados e Conclusões: i) Os métodos analíticos por SPE-HPLC e HPLC para quantificação do gatifloxacino e do levofloxacino foram validados. As curvas foram lineares na faixa de 20 a 600 ng/mL para plasma e microdialisado tecidual de gatifloxacino e na faixa de 250 a 6000 ng/mL para caldo de cultura para ambos os fármacos, com r > 0,99, independente do método desenvolvido. Em plasma e microdialisado, a exatidão foi ≥ 94,3 %. A recuperação do gatifloxacino dos cartuchos de extração em fase sólida variou entre 95,6 e 99,7 %. A precisão não excedeu 5,8 % do CV. Em caldo de cultura, a exatidão foi ≥ 92,0 % e 93,4 % para o gatifloxacino e o levofloxacino, respectivamente. A precisão não excedeu 3,2 % e 4,2 % do CV para o levofloxacino e o gatifloxacino, respectivamente; ii) A avaliação farmacocinética demonstrou que os modelos abertos de dois compartimentos e de um compartimento com absorção de primeira ordem descreveram adequadamente os perfis plasmáticos após administração do gatifloxacino pelas vias i.v. e oral nas doses de 6 e 12 mg/kg, com CL de 0,9 ± 0,2 e 1,0 ± 0,3 L/h/kg, t½ de 3,3 ± 0,8 e 3,7 ± 0,3 h e Vd de 2,8 ± 0,4 e 3,1 ± 1,0 L/kg, respectivamente. Os parâmetros determinados por abordagem compartimental e não compartimental não diferiram significativamente para as duas vias investigadas (α = 0,05). A ASC0-∞ foi de 4,1 ± 1,6 e 6,6 ± 1,3 μg.h/mL após administração oral e i.v. das doses de 12 e 6 mg/kg, respectivamente, levando a uma biodisponibilidade de 31%. A constante de velocidade de absorção foi alta (5,0 ± 1,8 h-1) e a farmacocinética mostrou-se linear na faixa de doses investigada; iii) A recuperação das sondas de microdiálise in vitro por EE e RD para 80, 160 e 400 ng/mL de gatifloxacino foi de 33,5 ± 1,3%, 33,1 ± 1,2%, 31,8 ± 2,7% e 31,4 ± 2,6%, 33,1 ± 2,2%, 30,6 ± 3,3%, respectivamente. In vivo a recuperação por RD no músculo esquelético e pulmão de ratos Wistar foi de 29,1 ± 1,0% e 30,7 ± 1,4%, respectivamente. A recuperação por NNF in vitro e in vivo foi de 30,9 ± 2,9% e 29,0 ± 0,8%, respectivamente. Desse modo, concluiu-se que a recuperação foi constante e independente do método ou meio utilizado. Os perfis de concentração livre no músculo, pulmão e plasma de ratos Wistar foram virtualmente superpostos após dose de 6 mg/kg i.v., resultando em ASC similares de 3888 ± 734 ng.h/mL, 4138 ± 1071 ng.h/mL e 3805 ± 577 ng.h/mL, respectivamente (α = 0,05). O fator de distribuição tecidual foi de 1,02 e 1,08 para músculo e pulmão, respectivamente; iv) O modelo PK/PD empregado foi capaz de descrever o efeito do levofloxacino e do gatifloxacino contra o Streptococcus pneumoniae in vitro para todas as simulações investigadas. O EC50 médio para o levofloxacino (3,57 ± 2,16 mg/L) foi significativamente maior que o do gatifloxacino (0,95 ± 0,56 mg/L) quando regimes de doses múltiplas foram simulados. O mesmo foi observado para concentrações constantes, sendo o EC50,levofloxacino = 2,75 ± 0,45 mg/L e EC50,gatifloxacino = 1,03 ± 0,52 mg/L. O kmax foi estatisticamente semelhante para ambos os fármacos independente se foram simuladas concentrações flutuantes (kmax,levofloxacino = 0,40 ± 0,19 h-1; kmax,gatifloxacino = 0,48 ± 0,15 h-1) ou concentrações constantes (kmax,levofloxacino = 0,34 ± 0,06 h-1; kmax,gatifloxacino = 0,39 ± 0,23 h-1). Nenhum dos índices PK/PD foi capaz de prever o desfecho da infecção para todas as situações investigadas. O modelo PK/PD desenvolvido permitiu a comparação entre as duas fluorquinolonas e de diferentes posologias para cada fármaco, podendo ser utilizado para simular o efeito temporal de regimes de dosagem alternativos bem como para otimização da posologia desses fármacos para o tratamento da pneumonia adquirida na comunidade. / Objective: The aim of this work was to establish a pharmacokinetic-pharmacodynamic model (PK/PD model) to describe the profile of bactericidal effect over time of levofloxacin and gatifloxacin against Streptococcus pneumoniae. Method: To achieve this goal the following steps were carried out: i) an analytical method of SPE-HPLC to quantify gatifloxacin in plasma and tissue microdialysates, and an HPLC method for measuring levofloxacin and gatifloxacin in culture broth samples were developed and validated; ii) the pharmacokinetics of gatifloxacin in rodents after intravenous (6 mg/kg) and oral (6 and 12 mg/kg) administration was assessed as well as the oral bioavailability of the drug was determined; iii) microdialysis conditions for gatifloxacin were established and the recovery rates in vitro by dialysis (EE), retrodialysis (RD) and no-net-flux (NNF), and in vivo in lung and skeletal muscle tissue by RD and NNF were determined. Gatifloxacin tissue penetration in lung after intravenous administration (6 mg/kg) to healthy Wistar rats was determined; iv) levofloxacin and gatifloxacin free lung concentrations expected in humans following different dosing regimens of the drugs were simulated using Streptococcus pneumoniae ATCC® 49619 in vitro model of infection. The effect of constant concentrations multiples of MIC were also investigated. The time-kill curves obtained were modeled using an Emax modified model using Scientist® v. 2.01 software. Results and Conclusions: i) The analytical methods by SPE-HPLC and HPLC for quantifying gatifloxacin and levofloxacin were validated. Calibration curves were linear between 20-600 ng/mL for gatifloxacin in plasma and tissue microdialysate samples and between 250-6000 ng/mL for broth media for both drugs, with r > 0.99 independently of the method considered. The accuracy was ≥ 94.3 % for plasma and microdialysate. Gatifloxacin recovery from the solid phase extraction cartridges ranged from 95.6 to 99.7%. The precision did not exceed 5.8% of the CV. In broth media the accuracy was ≥ 92.0% and 94.3% for gatifloxacin and levofloxacin, respectively. The precision did not exceed 3.2% and 4.2% of the CV for levofloxacin and gatifloxacin, respectively; ii) Gatifloxacin experimental plasma profiles in rats were adequately fitted to a two-compartment model after intravenous and to a one compartment model with first order absorption after oral dosing. The total clearance (0.9 ± 0.2 and 1.0 ± 0.3 L/h/kg), the terminal half-life (3.3 ± 0.8 and 3.7 ± 0.3 h) and the apparent volume of distribution (2.8 ± 0.4 and 3.1 ± 1.0 L/kg) were statistically similar (α = 0.05) after i.v. and oral administration, by both model independent and compartmental approaches. The area under the curve was reduced after oral dosing (4.1 ± 1.6 μg.h/mL) in comparison to i.v. dosing (6.6 ± 1.3 μg.h/mL) leading to an oral bioavailability of 31%. The absorption was fast, with a constant rate of 5.0 ± 1.8 h-1. The results evidenced the linear pharmacokinetics of gatifloxacin in rodents in the dose range investigated; iii) Microdialysis recoveries determined in vitro by EE and RD at 80, 160 and 400 ng/mL resulted in 33.5 ± 1.3%, 33.1 ± 1.2%, 31.8 ± 2.7% and 31.4 ± 2.6%, 33.1 ± 2.2%, 30.6 ± 3.3%, respectively. In vivo recovery by RD in Wistar rat’s skeletal muscle and lung were 29.1 ± 1.0% and 30.7 ± 1.4%, respectively. Recoveries by no-net-flux in vitro and in vivo resulted in recoveries of 30.9 ± 2.9% and 29.0 ± 0.8%, respectively. In this way, it was shown that gatifloxacin recovery was constant and independent of the method or media used. Free skeletal muscle, lung and plasma profiles were virtually superimposed after i.v. administration of gatifloxacin 6 mg/kg dose resulting in similar area under the curve of 3888 ± 734 ng.h/mL, 4138 ± 1071 ng.h/mL and 3805 ± 577 ng.h/mL, respectively (α = 0.05). The tissue distribution factors were determined to be 1.02 and 1.08 for muscle and lung, respectively; iv) The PK/PD model used was able to describe the effect of levofloxacin and gatifloxacin against Streptococcus pneumoniae in vitro for all the regimens investigated. Levofloxacin EC50 (3.57 ± 2.16 mg/L) was higher than gatifloxacin (0.95 ± 0.56 mg/L) when multiple dosing regimens where simulated. Using constant concentrations, levofloxacin EC50 was also higher than gatifloxacin (EC50,levofloxacin = 2.75 ± 0.45 mg/L; EC50,gatifloxacin = 1.03 ± 0.52 mg/L). The kmax was statistically similar for both drugs independent of whether fluctuating (kmax,levofloxacin = 0.40 ± 0.19 h-1; kmax,gatifloxacin = 0.48 ± 0.15 h-1) or constant concentrations (kmax,levofloxacin = 0.34 ± 0.06 h-1; kmax,gatifloxacin = 0.39 ± 0.23 h-1) were simulated. None of the PK/PD indices was capable of predicting the infection outcome for all the situations investigated. The PK/PD model developed allowed not only the comparison between the fluoroquinolones effect but also the comparison of different dosing regimes for the same drug and can be used for simulating alternative regimens and optimizing therapy of these drugs to treat community-acquired pneumonia.

Objetivo: O objetivo geral deste trabalho foi desenvolver um modelo farmacocinético/farmacodinâmico (PK/PD) para descrever o efeito bactericida in vitro das fluoroquinolonas levofloxacino (LEV) e moxifloxacino (MXF)contra Escherichia coli, baseando-se em dados in vivo de concentração livre prostática. Métodos: Ratos Wistar machos foram utilizados nos experimentos in vivo para determinação da farmacocinética plasmática e prostática do LEV (7 mg/kg) e MXF (6 e 12 mg/kg) após dose i.v. bolus. As concentrações livres prostáticas foram determinadas por microdiálise. A coleta das amostras de plasma e dialisado de tecido foi realizada simultaneamente nos animais previamente anestesiados com uretano para determinação do fator de distribuição tecidual (fT). Para a quantificação do LEV e MXF nas amostras de plasma e dialisado, métodos analíticos foram validados. Análise farmacocinética não-compartimental e modelagem compartimental dos dados foram realizadas utilizando o WinNonlin® e NONMEM® v. 6, respectivamente. Os experimentos de farmacodinâmica in vitro foram executados utilizando sistema composto de caldo de cultura Mueller-Hinton no qual a bactéria teste (Escherichia coli ATCC 25922) foi exposta a concentrações constantes e flutuantes dos antimicrobianos. O número de colônias bacterianas viáveis (CFU/mL) foi determinado em função do tempo e utilizado como parâmetro farmacodinâmico para construção das curvas de morte bacteriana (time-kill curves). Nos experimentos de time-kill curves estáticos, concentrações baseadas em múltiplos da MIC na faixa de 0.008–2 mg/L foram utilizadas, enquanto que no dinâmico a meia-vida de eliminação do LEV em humanos foi simulada no sistema in vitro através de diluição constante do caldo de cultura. Resultados e Discussão: Um método analítico por HPLC-fluorescência foi desenvolvido e validado para a quantificação do MXF nas amostras biológicas. Método analítico também foi validado para quantificação do LEV nas amostras. Os perfis plasmáticos e teciduais das duas fluoroquinolonas foram modelados simultaneamente utilizando modelo de três compartimentos considerando transporte linear (difusão passiva) e saturável (cinética de Michaelis-Menten). O modelo, que foi o mais adequado para descrever os dados experimentais, sugere a presença de transportadores de efluxo na próstata. A penetração prostática média do MXF foi significativamente maior que a do LEV (fT = 1.24 vs. 0.78) e foi independente da dose. Em ratos, não foi observada diferença na meia-vida plasmática média entre LEV (5.0 h) e MXF (4.9 h), embora a meia-vida tecidual foi ligeiramente maior para o MXF (3.3 vs. 2.3 h). Usando a abordagem populacional de modelagem PK/PD, modelo de Emax sigmoidal foi utilizado para descrever o efeito das duas quinolonas frente a E. coli tanto nos experimentos de concentração estática quanto dinâmica. A comparação dos parâmetros PK/PD estimados mostrou que o MXF apresenta potência superior ao LEV contra a cepa através da comparação dos valores de EC50, embora ambos tenham apresentado eficácia comparável (Emax de 1.85 e 1.83 h-1 para MXF e LEV, respectivamente). Para o LEV, os esquemas posológicos de 500 mg q12 h e 1000 mg q24 h apresentaram maior eficácia no período de 24 h, pois promoveram a inibição completa do recrescimento bacteriano observado nos outros dois regimes de dose testados. Conclusões: A correlação dos dados de farmacocinéticain vivo com os experimentos de farmacodinâmica in vitro, seguida da construção do modelo PK/PD de efeito máximo, possibilitou explorar a relação do efeito antimicrobiano em função do tempo baseada em concentrações livres esperadas na prostatite. / Objective: The aim of this study was to develop a pharmacokinetic/pharmacodynamic (PK/PD) model to describe the in vitro bactericidal effect of the fluoroquinolones levofloxacin (LEV) and moxifloxacin (MXF) against Escherichia coli based on free concentrations in prostate tissue measured in vivo. Methods: Pharmacokinetic experiments were conducted in male Wistar rats for the determination of plasma and free prostate concentrations of LEV (7 mg/kg) and MXF (6 and 12 mg/kg) after i.v. bolus administration. Blood and tissue dialysate samples were collected simultaneously in the group of rats previously anesthetized with urethane to determine the tissue distribution factor (fT). To quantify MXF and LEV in plasma and dialysate samples obtained after administration of the quinolones, analytical methods based on HPLC-fluorescence were developed and validated accordingly. Non-compartmental analysis and compartmental PK modeling of the data was performed in WinNonlin® and NONMEM® v. 6, respectively. The in vitro pharmacodynamic experiments were executed by using a system composed of Mueller-Hinton growth medium in which the test bacterial strain (Escherichia coli ATCC 25922) was exposed to constant and fluctuating antimicrobial concentrations. The number of viable colony-forming units (CFU/mL) was determined as a function of time and used as the pharmacodynamic parameter for construction of bacterial time-kill curves. In the static time-kill curves, concentrations in the range of 0.008-2 mg/L were tested based on multiples of the MIC, whereas in the dynamic time-kill curves the half-life of LEV in humans was simulated in the in vitro system by stepwise dilution of the growth medium. Results and Discussion: An HPLC-fluorescence method was developed and fully validated to quantify MXF in biological fluids. A method was also validated to determine LEV in the samples. Plasma and prostate concentrations of both drugs were simultaneously fitted using a three-compartment model considering linear (passive diffusion) and saturable transport (Michaelis-Menten kinetics), suggesting the presence of efflux transporters in the prostate. The average tissue penetration of MXF in the prostate was significantly higher than that of LEV (fT = 1.24 vs. 0.78) and was independent of the dose. In rats, differences in average plasma half-life between plasma LEV (5.0 h) and MXF (4.9 h) were not observed, even though the tissue half-life was slightly longer for MXF (3.3 vs. 2.3 h). Using a population PK/PD modeling approach, a sigmoidal Emax model was used to describe the effect of the two quinolones against E. coli both in the static as well as in the dynamic time-kill curves. Comparison of the PK/PD parameter estimates showed that the in vitro potency of MXF is higher than LEV against the strain tested as shown by EC50 values, but both presented equivalent efficacy (Emax of 1.85 and 1.83 h-1 for MXF and LEV, respectively). For LEV, the dosing regimens of 500 mg q12 h and 1,000 mg q24 h showed overall greater efficacy over the 24 h period as they resulted in complete inhibition of bacterial regrowth observed in the other two dosing regimens tested. Conclusions: The correlation of in vivo pharmacokinetic data with in vitro pharmacodynamic experiments, followed by the development of an Emax PK/PD model, allowed determining the relationship between the bactericidal effect as a function of time based on free tissue concentrations expected in the site of infection.

Descrever a prevalência das espécies bacterianas isoladas nas infecções urinárias comunitárias. Descrever os perfis de susceptibilidade aos antibióticos de uso oral utilizado frente às bactérias isoladas nas infecções urinárias comunitárias. Avaliar a prevalência de fenótipos de resistência bacterianos através dos resultados dos testes de susceptibilidade e dos rastreamentos específicos utilizados. Amostras colhidas exclusivamente no atendimento ambulatorial com contagens de unidades formadoras de colônias entre 100.000 a ≥1.000.000 por mililitro (UCF/ml) Com ou sem piúria no exame de elementos anormais na urina e sedimentoscopia (EAS). Foram analisados retrospectivamente os resultados de urinoculturas e dos testes de susceptibilidade a antimicrobianos, realizados em um Laboratório da rede privada na cidade do Rio de janeiro, de pacientes atendidos em ambulatórios e com quadros de ITU. As amostras de urina coletadas englobavam basicamente os seguintes bairros: Botafogo, Barra da Tijuca, Ipanema, Copacabana, Tijuca e Centro. Foram analisados um total de 8.475 culturas de urina divididas em 7.286 urinas de pacientes femininos e 1.189 de pacientes masculinos entre Janeiro de 2006 a Dezembro de 2012. As amostras foram todas coletadas na Cidade do Rio de Janeiro e englobavam basicamente os seguintes bairros: Botafogo, Barra da Tijuca, Ipanema, Copacabana, Tijuca e Centro. Encontramos um percentual de resistência de 27% para ciprofloxacina frente à Escherichia coli que com 68.23% é a principal etiologia encontrada na ITU na comunidade os resultados das três fluoroquinolonas avaliadas no estudo, ciprofloxacina (2 geração), levofloxacina (3 geração) e norfloxacina (2 geração), acharemos respectivamente 27%, 25% e 20% de resistência em Escherichia coli. O uso de fluoroquinolonas em infecções urinárias comunitárias e consequentemente os achados de padrões de resistência neste estudo, reforçam o que já foi descrito em outros trabalhos. A cefalosporina de 2 geração (cefuroxima), demonstrou percentuais de resistência bastante satisfatórios frente as principais etiologias. Em Escherichia coli o percentual foi de 2%, em Klebsiella pneumoniae 3% e em Proteus mirabilis não houve nenhum achado de resistência. Uma das vantagens da cefuroxima é ser ativa quanto à produção de beta lactamase, conferindo um espectro maior frente a possíveis produtoras desta enzima. Seu esquema posológico é de 250mg duas vezes ao dia por 7 dias para infecções urinárias não complicadas. O meio mais eficaz de melhorar a administração antimicrobiana provavelmente envolverá um programa abrangente que incorpora múltiplas estratégias e colaboração entre as diversas especialidades dentro de uma determinada instituição de saúde. Neste contexto, a observação periódica da incidência bacteriana com seus respectivos índices de resistência aos antimicrobianos por sitio de infecção e correlação com os antibióticos mais comumente utilizados, é mandatória para o sucesso terapêutico. / Describe the prevalence of bacterial species isolated from community acquired urinary tract infections and to describe the bacterial susceptibility profiles to oral antimicrobials. The prevalence of resistant phenotypes was also evaluated. Samples were taken from outpatients whose urine cultures showed >= 100,000 Colony Forming Units per milliliter (CFU/ml) with or without pyuria on direct examination of urine sediment samples. Urine culture results were retrospectively reviewed and antimicrobial susceptibility testing performed in a private clinical laboratory located in Rio de Janeiro. A total of 8475 urine cultures performed between January 2006 and December 2012 were analyzed. Female urine samples represented 7286 samples while male samples represented 1189 samples. Escherichia coli was found as the main etiology among urinary tract infections, (68,23%) showing 27% of ciprofloxaxin resistance, 25% Levofloxacin resistance and 20% Norfloxacin resistance. The use of fluoroquinolones in community acquired urinary tract infections and the resistance patterns found in this present study reinforces what has been described by other authors. A second generation cephalosporin (cefuroxime) showed resistance in main etiologies - E. coli 2% and K. pneumoniae 3%, while Proteus mirabilis showed no resistance at all. Among the main advantages of cefuroxime is the activity against the production of beta lactamases. The regimen dosage is 250mg twice a day for 7 days to treat uncomplicated urinary tract infections. The most effective way to improve antimicrobials administration is to develop a comprehensive program that incorporates multiple strategies and collaborative work between different medical specialties inside a healthcare institution. In such a context, the bacterial incidence rates and antimicrobial resistance rates should be closely observed and correlated to infection sites for better achievement of success in antimicrobial therapy.

Objetivo: O objetivo geral deste trabalho foi estabelecer modelo farmacocinéticofarmacodinâmico (modelo PK/PD) para descrever o perfil temporal do efeito bactericida do levofloxacino e do gatifloxacino contra Streptococcus pneumoniae. Método: Para alcançar este objetivo as seguintes etapas foram realizadas: i) foram validadas metodologias analíticas de SPE-HPLC para o gatifloxacino e HPLC para o levofloxacino e o gatifloxacino para quantificação destes em amostras de plasma, microdialisado tecidual e caldo de cultura; ii) foi avaliada a farmacocinética do gatifloxacino em roedores nas doses de 6 e 12 mg/kg via oral e 6 mg/kg via intravenosa (i.v.) e a biodisponibilidade oral foi determinada; iii) foram estabelecidas as condições ideais para microdiálise do gatifloxacino e as taxas de recuperação in vitro, por diálise (EE), retrodiálise (RD) e fluxo líquido zero (NNF) e in vivo, em tecido pulmonar e muscular, por retrodiálise e fluxo líquido zero. Essas recuperações foram utilizadas para determinar a penetração pulmonar do gatifloxacino após a administração i.v. bolus de 6 mg/kg a ratos Wistar sadios; iv) foram simuladas as concentrações livres pulmonares esperadas para humanos após tratamento com diferentes regimes de dosagem para o levofloxacino e o gatifloxacino em modelo de infecção in vitro frente a Streptococcus pneumoniae ATCC® 49619. Simulações de concentrações constantes múltiplas do MIC de cada fármaco também foram realizadas. As curvas de morte bacteriana por tempo obtidas foram modeladas com modelo PK/PD de Emax modificado, com auxílio do programa Scientist® v 2.01. Resultados e Conclusões: i) Os métodos analíticos por SPE-HPLC e HPLC para quantificação do gatifloxacino e do levofloxacino foram validados. As curvas foram lineares na faixa de 20 a 600 ng/mL para plasma e microdialisado tecidual de gatifloxacino e na faixa de 250 a 6000 ng/mL para caldo de cultura para ambos os fármacos, com r > 0,99, independente do método desenvolvido. Em plasma e microdialisado, a exatidão foi ≥ 94,3 %. A recuperação do gatifloxacino dos cartuchos de extração em fase sólida variou entre 95,6 e 99,7 %. A precisão não excedeu 5,8 % do CV. Em caldo de cultura, a exatidão foi ≥ 92,0 % e 93,4 % para o gatifloxacino e o levofloxacino, respectivamente. A precisão não excedeu 3,2 % e 4,2 % do CV para o levofloxacino e o gatifloxacino, respectivamente; ii) A avaliação farmacocinética demonstrou que os modelos abertos de dois compartimentos e de um compartimento com absorção de primeira ordem descreveram adequadamente os perfis plasmáticos após administração do gatifloxacino pelas vias i.v. e oral nas doses de 6 e 12 mg/kg, com CL de 0,9 ± 0,2 e 1,0 ± 0,3 L/h/kg, t½ de 3,3 ± 0,8 e 3,7 ± 0,3 h e Vd de 2,8 ± 0,4 e 3,1 ± 1,0 L/kg, respectivamente. Os parâmetros determinados por abordagem compartimental e não compartimental não diferiram significativamente para as duas vias investigadas (α = 0,05). A ASC0-∞ foi de 4,1 ± 1,6 e 6,6 ± 1,3 μg.h/mL após administração oral e i.v. das doses de 12 e 6 mg/kg, respectivamente, levando a uma biodisponibilidade de 31%. A constante de velocidade de absorção foi alta (5,0 ± 1,8 h-1) e a farmacocinética mostrou-se linear na faixa de doses investigada; iii) A recuperação das sondas de microdiálise in vitro por EE e RD para 80, 160 e 400 ng/mL de gatifloxacino foi de 33,5 ± 1,3%, 33,1 ± 1,2%, 31,8 ± 2,7% e 31,4 ± 2,6%, 33,1 ± 2,2%, 30,6 ± 3,3%, respectivamente. In vivo a recuperação por RD no músculo esquelético e pulmão de ratos Wistar foi de 29,1 ± 1,0% e 30,7 ± 1,4%, respectivamente. A recuperação por NNF in vitro e in vivo foi de 30,9 ± 2,9% e 29,0 ± 0,8%, respectivamente. Desse modo, concluiu-se que a recuperação foi constante e independente do método ou meio utilizado. Os perfis de concentração livre no músculo, pulmão e plasma de ratos Wistar foram virtualmente superpostos após dose de 6 mg/kg i.v., resultando em ASC similares de 3888 ± 734 ng.h/mL, 4138 ± 1071 ng.h/mL e 3805 ± 577 ng.h/mL, respectivamente (α = 0,05). O fator de distribuição tecidual foi de 1,02 e 1,08 para músculo e pulmão, respectivamente; iv) O modelo PK/PD empregado foi capaz de descrever o efeito do levofloxacino e do gatifloxacino contra o Streptococcus pneumoniae in vitro para todas as simulações investigadas. O EC50 médio para o levofloxacino (3,57 ± 2,16 mg/L) foi significativamente maior que o do gatifloxacino (0,95 ± 0,56 mg/L) quando regimes de doses múltiplas foram simulados. O mesmo foi observado para concentrações constantes, sendo o EC50,levofloxacino = 2,75 ± 0,45 mg/L e EC50,gatifloxacino = 1,03 ± 0,52 mg/L. O kmax foi estatisticamente semelhante para ambos os fármacos independente se foram simuladas concentrações flutuantes (kmax,levofloxacino = 0,40 ± 0,19 h-1; kmax,gatifloxacino = 0,48 ± 0,15 h-1) ou concentrações constantes (kmax,levofloxacino = 0,34 ± 0,06 h-1; kmax,gatifloxacino = 0,39 ± 0,23 h-1). Nenhum dos índices PK/PD foi capaz de prever o desfecho da infecção para todas as situações investigadas. O modelo PK/PD desenvolvido permitiu a comparação entre as duas fluorquinolonas e de diferentes posologias para cada fármaco, podendo ser utilizado para simular o efeito temporal de regimes de dosagem alternativos bem como para otimização da posologia desses fármacos para o tratamento da pneumonia adquirida na comunidade. / Objective: The aim of this work was to establish a pharmacokinetic-pharmacodynamic model (PK/PD model) to describe the profile of bactericidal effect over time of levofloxacin and gatifloxacin against Streptococcus pneumoniae. Method: To achieve this goal the following steps were carried out: i) an analytical method of SPE-HPLC to quantify gatifloxacin in plasma and tissue microdialysates, and an HPLC method for measuring levofloxacin and gatifloxacin in culture broth samples were developed and validated; ii) the pharmacokinetics of gatifloxacin in rodents after intravenous (6 mg/kg) and oral (6 and 12 mg/kg) administration was assessed as well as the oral bioavailability of the drug was determined; iii) microdialysis conditions for gatifloxacin were established and the recovery rates in vitro by dialysis (EE), retrodialysis (RD) and no-net-flux (NNF), and in vivo in lung and skeletal muscle tissue by RD and NNF were determined. Gatifloxacin tissue penetration in lung after intravenous administration (6 mg/kg) to healthy Wistar rats was determined; iv) levofloxacin and gatifloxacin free lung concentrations expected in humans following different dosing regimens of the drugs were simulated using Streptococcus pneumoniae ATCC® 49619 in vitro model of infection. The effect of constant concentrations multiples of MIC were also investigated. The time-kill curves obtained were modeled using an Emax modified model using Scientist® v. 2.01 software. Results and Conclusions: i) The analytical methods by SPE-HPLC and HPLC for quantifying gatifloxacin and levofloxacin were validated. Calibration curves were linear between 20-600 ng/mL for gatifloxacin in plasma and tissue microdialysate samples and between 250-6000 ng/mL for broth media for both drugs, with r > 0.99 independently of the method considered. The accuracy was ≥ 94.3 % for plasma and microdialysate. Gatifloxacin recovery from the solid phase extraction cartridges ranged from 95.6 to 99.7%. The precision did not exceed 5.8% of the CV. In broth media the accuracy was ≥ 92.0% and 94.3% for gatifloxacin and levofloxacin, respectively. The precision did not exceed 3.2% and 4.2% of the CV for levofloxacin and gatifloxacin, respectively; ii) Gatifloxacin experimental plasma profiles in rats were adequately fitted to a two-compartment model after intravenous and to a one compartment model with first order absorption after oral dosing. The total clearance (0.9 ± 0.2 and 1.0 ± 0.3 L/h/kg), the terminal half-life (3.3 ± 0.8 and 3.7 ± 0.3 h) and the apparent volume of distribution (2.8 ± 0.4 and 3.1 ± 1.0 L/kg) were statistically similar (α = 0.05) after i.v. and oral administration, by both model independent and compartmental approaches. The area under the curve was reduced after oral dosing (4.1 ± 1.6 μg.h/mL) in comparison to i.v. dosing (6.6 ± 1.3 μg.h/mL) leading to an oral bioavailability of 31%. The absorption was fast, with a constant rate of 5.0 ± 1.8 h-1. The results evidenced the linear pharmacokinetics of gatifloxacin in rodents in the dose range investigated; iii) Microdialysis recoveries determined in vitro by EE and RD at 80, 160 and 400 ng/mL resulted in 33.5 ± 1.3%, 33.1 ± 1.2%, 31.8 ± 2.7% and 31.4 ± 2.6%, 33.1 ± 2.2%, 30.6 ± 3.3%, respectively. In vivo recovery by RD in Wistar rat’s skeletal muscle and lung were 29.1 ± 1.0% and 30.7 ± 1.4%, respectively. Recoveries by no-net-flux in vitro and in vivo resulted in recoveries of 30.9 ± 2.9% and 29.0 ± 0.8%, respectively. In this way, it was shown that gatifloxacin recovery was constant and independent of the method or media used. Free skeletal muscle, lung and plasma profiles were virtually superimposed after i.v. administration of gatifloxacin 6 mg/kg dose resulting in similar area under the curve of 3888 ± 734 ng.h/mL, 4138 ± 1071 ng.h/mL and 3805 ± 577 ng.h/mL, respectively (α = 0.05). The tissue distribution factors were determined to be 1.02 and 1.08 for muscle and lung, respectively; iv) The PK/PD model used was able to describe the effect of levofloxacin and gatifloxacin against Streptococcus pneumoniae in vitro for all the regimens investigated. Levofloxacin EC50 (3.57 ± 2.16 mg/L) was higher than gatifloxacin (0.95 ± 0.56 mg/L) when multiple dosing regimens where simulated. Using constant concentrations, levofloxacin EC50 was also higher than gatifloxacin (EC50,levofloxacin = 2.75 ± 0.45 mg/L; EC50,gatifloxacin = 1.03 ± 0.52 mg/L). The kmax was statistically similar for both drugs independent of whether fluctuating (kmax,levofloxacin = 0.40 ± 0.19 h-1; kmax,gatifloxacin = 0.48 ± 0.15 h-1) or constant concentrations (kmax,levofloxacin = 0.34 ± 0.06 h-1; kmax,gatifloxacin = 0.39 ± 0.23 h-1) were simulated. None of the PK/PD indices was capable of predicting the infection outcome for all the situations investigated. The PK/PD model developed allowed not only the comparison between the fluoroquinolones effect but also the comparison of different dosing regimes for the same drug and can be used for simulating alternative regimens and optimizing therapy of these drugs to treat community-acquired pneumonia.

Descrever a prevalência das espécies bacterianas isoladas nas infecções urinárias comunitárias. Descrever os perfis de susceptibilidade aos antibióticos de uso oral utilizado frente às bactérias isoladas nas infecções urinárias comunitárias. Avaliar a prevalência de fenótipos de resistência bacterianos através dos resultados dos testes de susceptibilidade e dos rastreamentos específicos utilizados. Amostras colhidas exclusivamente no atendimento ambulatorial com contagens de unidades formadoras de colônias entre 100.000 a ≥1.000.000 por mililitro (UCF/ml) Com ou sem piúria no exame de elementos anormais na urina e sedimentoscopia (EAS). Foram analisados retrospectivamente os resultados de urinoculturas e dos testes de susceptibilidade a antimicrobianos, realizados em um Laboratório da rede privada na cidade do Rio de janeiro, de pacientes atendidos em ambulatórios e com quadros de ITU. As amostras de urina coletadas englobavam basicamente os seguintes bairros: Botafogo, Barra da Tijuca, Ipanema, Copacabana, Tijuca e Centro. Foram analisados um total de 8.475 culturas de urina divididas em 7.286 urinas de pacientes femininos e 1.189 de pacientes masculinos entre Janeiro de 2006 a Dezembro de 2012. As amostras foram todas coletadas na Cidade do Rio de Janeiro e englobavam basicamente os seguintes bairros: Botafogo, Barra da Tijuca, Ipanema, Copacabana, Tijuca e Centro. Encontramos um percentual de resistência de 27% para ciprofloxacina frente à Escherichia coli que com 68.23% é a principal etiologia encontrada na ITU na comunidade os resultados das três fluoroquinolonas avaliadas no estudo, ciprofloxacina (2 geração), levofloxacina (3 geração) e norfloxacina (2 geração), acharemos respectivamente 27%, 25% e 20% de resistência em Escherichia coli. O uso de fluoroquinolonas em infecções urinárias comunitárias e consequentemente os achados de padrões de resistência neste estudo, reforçam o que já foi descrito em outros trabalhos. A cefalosporina de 2 geração (cefuroxima), demonstrou percentuais de resistência bastante satisfatórios frente as principais etiologias. Em Escherichia coli o percentual foi de 2%, em Klebsiella pneumoniae 3% e em Proteus mirabilis não houve nenhum achado de resistência. Uma das vantagens da cefuroxima é ser ativa quanto à produção de beta lactamase, conferindo um espectro maior frente a possíveis produtoras desta enzima. Seu esquema posológico é de 250mg duas vezes ao dia por 7 dias para infecções urinárias não complicadas. O meio mais eficaz de melhorar a administração antimicrobiana provavelmente envolverá um programa abrangente que incorpora múltiplas estratégias e colaboração entre as diversas especialidades dentro de uma determinada instituição de saúde. Neste contexto, a observação periódica da incidência bacteriana com seus respectivos índices de resistência aos antimicrobianos por sitio de infecção e correlação com os antibióticos mais comumente utilizados, é mandatória para o sucesso terapêutico. / Describe the prevalence of bacterial species isolated from community acquired urinary tract infections and to describe the bacterial susceptibility profiles to oral antimicrobials. The prevalence of resistant phenotypes was also evaluated. Samples were taken from outpatients whose urine cultures showed >= 100,000 Colony Forming Units per milliliter (CFU/ml) with or without pyuria on direct examination of urine sediment samples. Urine culture results were retrospectively reviewed and antimicrobial susceptibility testing performed in a private clinical laboratory located in Rio de Janeiro. A total of 8475 urine cultures performed between January 2006 and December 2012 were analyzed. Female urine samples represented 7286 samples while male samples represented 1189 samples. Escherichia coli was found as the main etiology among urinary tract infections, (68,23%) showing 27% of ciprofloxaxin resistance, 25% Levofloxacin resistance and 20% Norfloxacin resistance. The use of fluoroquinolones in community acquired urinary tract infections and the resistance patterns found in this present study reinforces what has been described by other authors. A second generation cephalosporin (cefuroxime) showed resistance in main etiologies - E. coli 2% and K. pneumoniae 3%, while Proteus mirabilis showed no resistance at all. Among the main advantages of cefuroxime is the activity against the production of beta lactamases. The regimen dosage is 250mg twice a day for 7 days to treat uncomplicated urinary tract infections. The most effective way to improve antimicrobials administration is to develop a comprehensive program that incorporates multiple strategies and collaborative work between different medical specialties inside a healthcare institution. In such a context, the bacterial incidence rates and antimicrobial resistance rates should be closely observed and correlated to infection sites for better achievement of success in antimicrobial therapy.

Objetivo: O objetivo geral deste trabalho foi desenvolver um modelo farmacocinético/farmacodinâmico (PK/PD) para descrever o efeito bactericida in vitro das fluoroquinolonas levofloxacino (LEV) e moxifloxacino (MXF)contra Escherichia coli, baseando-se em dados in vivo de concentração livre prostática. Métodos: Ratos Wistar machos foram utilizados nos experimentos in vivo para determinação da farmacocinética plasmática e prostática do LEV (7 mg/kg) e MXF (6 e 12 mg/kg) após dose i.v. bolus. As concentrações livres prostáticas foram determinadas por microdiálise. A coleta das amostras de plasma e dialisado de tecido foi realizada simultaneamente nos animais previamente anestesiados com uretano para determinação do fator de distribuição tecidual (fT). Para a quantificação do LEV e MXF nas amostras de plasma e dialisado, métodos analíticos foram validados. Análise farmacocinética não-compartimental e modelagem compartimental dos dados foram realizadas utilizando o WinNonlin® e NONMEM® v. 6, respectivamente. Os experimentos de farmacodinâmica in vitro foram executados utilizando sistema composto de caldo de cultura Mueller-Hinton no qual a bactéria teste (Escherichia coli ATCC 25922) foi exposta a concentrações constantes e flutuantes dos antimicrobianos. O número de colônias bacterianas viáveis (CFU/mL) foi determinado em função do tempo e utilizado como parâmetro farmacodinâmico para construção das curvas de morte bacteriana (time-kill curves). Nos experimentos de time-kill curves estáticos, concentrações baseadas em múltiplos da MIC na faixa de 0.008–2 mg/L foram utilizadas, enquanto que no dinâmico a meia-vida de eliminação do LEV em humanos foi simulada no sistema in vitro através de diluição constante do caldo de cultura. Resultados e Discussão: Um método analítico por HPLC-fluorescência foi desenvolvido e validado para a quantificação do MXF nas amostras biológicas. Método analítico também foi validado para quantificação do LEV nas amostras. Os perfis plasmáticos e teciduais das duas fluoroquinolonas foram modelados simultaneamente utilizando modelo de três compartimentos considerando transporte linear (difusão passiva) e saturável (cinética de Michaelis-Menten). O modelo, que foi o mais adequado para descrever os dados experimentais, sugere a presença de transportadores de efluxo na próstata. A penetração prostática média do MXF foi significativamente maior que a do LEV (fT = 1.24 vs. 0.78) e foi independente da dose. Em ratos, não foi observada diferença na meia-vida plasmática média entre LEV (5.0 h) e MXF (4.9 h), embora a meia-vida tecidual foi ligeiramente maior para o MXF (3.3 vs. 2.3 h). Usando a abordagem populacional de modelagem PK/PD, modelo de Emax sigmoidal foi utilizado para descrever o efeito das duas quinolonas frente a E. coli tanto nos experimentos de concentração estática quanto dinâmica. A comparação dos parâmetros PK/PD estimados mostrou que o MXF apresenta potência superior ao LEV contra a cepa através da comparação dos valores de EC50, embora ambos tenham apresentado eficácia comparável (Emax de 1.85 e 1.83 h-1 para MXF e LEV, respectivamente). Para o LEV, os esquemas posológicos de 500 mg q12 h e 1000 mg q24 h apresentaram maior eficácia no período de 24 h, pois promoveram a inibição completa do recrescimento bacteriano observado nos outros dois regimes de dose testados. Conclusões: A correlação dos dados de farmacocinéticain vivo com os experimentos de farmacodinâmica in vitro, seguida da construção do modelo PK/PD de efeito máximo, possibilitou explorar a relação do efeito antimicrobiano em função do tempo baseada em concentrações livres esperadas na prostatite. / Objective: The aim of this study was to develop a pharmacokinetic/pharmacodynamic (PK/PD) model to describe the in vitro bactericidal effect of the fluoroquinolones levofloxacin (LEV) and moxifloxacin (MXF) against Escherichia coli based on free concentrations in prostate tissue measured in vivo. Methods: Pharmacokinetic experiments were conducted in male Wistar rats for the determination of plasma and free prostate concentrations of LEV (7 mg/kg) and MXF (6 and 12 mg/kg) after i.v. bolus administration. Blood and tissue dialysate samples were collected simultaneously in the group of rats previously anesthetized with urethane to determine the tissue distribution factor (fT). To quantify MXF and LEV in plasma and dialysate samples obtained after administration of the quinolones, analytical methods based on HPLC-fluorescence were developed and validated accordingly. Non-compartmental analysis and compartmental PK modeling of the data was performed in WinNonlin® and NONMEM® v. 6, respectively. The in vitro pharmacodynamic experiments were executed by using a system composed of Mueller-Hinton growth medium in which the test bacterial strain (Escherichia coli ATCC 25922) was exposed to constant and fluctuating antimicrobial concentrations. The number of viable colony-forming units (CFU/mL) was determined as a function of time and used as the pharmacodynamic parameter for construction of bacterial time-kill curves. In the static time-kill curves, concentrations in the range of 0.008-2 mg/L were tested based on multiples of the MIC, whereas in the dynamic time-kill curves the half-life of LEV in humans was simulated in the in vitro system by stepwise dilution of the growth medium. Results and Discussion: An HPLC-fluorescence method was developed and fully validated to quantify MXF in biological fluids. A method was also validated to determine LEV in the samples. Plasma and prostate concentrations of both drugs were simultaneously fitted using a three-compartment model considering linear (passive diffusion) and saturable transport (Michaelis-Menten kinetics), suggesting the presence of efflux transporters in the prostate. The average tissue penetration of MXF in the prostate was significantly higher than that of LEV (fT = 1.24 vs. 0.78) and was independent of the dose. In rats, differences in average plasma half-life between plasma LEV (5.0 h) and MXF (4.9 h) were not observed, even though the tissue half-life was slightly longer for MXF (3.3 vs. 2.3 h). Using a population PK/PD modeling approach, a sigmoidal Emax model was used to describe the effect of the two quinolones against E. coli both in the static as well as in the dynamic time-kill curves. Comparison of the PK/PD parameter estimates showed that the in vitro potency of MXF is higher than LEV against the strain tested as shown by EC50 values, but both presented equivalent efficacy (Emax of 1.85 and 1.83 h-1 for MXF and LEV, respectively). For LEV, the dosing regimens of 500 mg q12 h and 1,000 mg q24 h showed overall greater efficacy over the 24 h period as they resulted in complete inhibition of bacterial regrowth observed in the other two dosing regimens tested. Conclusions: The correlation of in vivo pharmacokinetic data with in vitro pharmacodynamic experiments, followed by the development of an Emax PK/PD model, allowed determining the relationship between the bactericidal effect as a function of time based on free tissue concentrations expected in the site of infection.

Objetivo: O objetivo geral deste trabalho foi estabelecer modelo farmacocinéticofarmacodinâmico (modelo PK/PD) para descrever o perfil temporal do efeito bactericida do levofloxacino e do gatifloxacino contra Streptococcus pneumoniae. Método: Para alcançar este objetivo as seguintes etapas foram realizadas: i) foram validadas metodologias analíticas de SPE-HPLC para o gatifloxacino e HPLC para o levofloxacino e o gatifloxacino para quantificação destes em amostras de plasma, microdialisado tecidual e caldo de cultura; ii) foi avaliada a farmacocinética do gatifloxacino em roedores nas doses de 6 e 12 mg/kg via oral e 6 mg/kg via intravenosa (i.v.) e a biodisponibilidade oral foi determinada; iii) foram estabelecidas as condições ideais para microdiálise do gatifloxacino e as taxas de recuperação in vitro, por diálise (EE), retrodiálise (RD) e fluxo líquido zero (NNF) e in vivo, em tecido pulmonar e muscular, por retrodiálise e fluxo líquido zero. Essas recuperações foram utilizadas para determinar a penetração pulmonar do gatifloxacino após a administração i.v. bolus de 6 mg/kg a ratos Wistar sadios; iv) foram simuladas as concentrações livres pulmonares esperadas para humanos após tratamento com diferentes regimes de dosagem para o levofloxacino e o gatifloxacino em modelo de infecção in vitro frente a Streptococcus pneumoniae ATCC® 49619. Simulações de concentrações constantes múltiplas do MIC de cada fármaco também foram realizadas. As curvas de morte bacteriana por tempo obtidas foram modeladas com modelo PK/PD de Emax modificado, com auxílio do programa Scientist® v 2.01. Resultados e Conclusões: i) Os métodos analíticos por SPE-HPLC e HPLC para quantificação do gatifloxacino e do levofloxacino foram validados. As curvas foram lineares na faixa de 20 a 600 ng/mL para plasma e microdialisado tecidual de gatifloxacino e na faixa de 250 a 6000 ng/mL para caldo de cultura para ambos os fármacos, com r > 0,99, independente do método desenvolvido. Em plasma e microdialisado, a exatidão foi ≥ 94,3 %. A recuperação do gatifloxacino dos cartuchos de extração em fase sólida variou entre 95,6 e 99,7 %. A precisão não excedeu 5,8 % do CV. Em caldo de cultura, a exatidão foi ≥ 92,0 % e 93,4 % para o gatifloxacino e o levofloxacino, respectivamente. A precisão não excedeu 3,2 % e 4,2 % do CV para o levofloxacino e o gatifloxacino, respectivamente; ii) A avaliação farmacocinética demonstrou que os modelos abertos de dois compartimentos e de um compartimento com absorção de primeira ordem descreveram adequadamente os perfis plasmáticos após administração do gatifloxacino pelas vias i.v. e oral nas doses de 6 e 12 mg/kg, com CL de 0,9 ± 0,2 e 1,0 ± 0,3 L/h/kg, t½ de 3,3 ± 0,8 e 3,7 ± 0,3 h e Vd de 2,8 ± 0,4 e 3,1 ± 1,0 L/kg, respectivamente. Os parâmetros determinados por abordagem compartimental e não compartimental não diferiram significativamente para as duas vias investigadas (α = 0,05). A ASC0-∞ foi de 4,1 ± 1,6 e 6,6 ± 1,3 μg.h/mL após administração oral e i.v. das doses de 12 e 6 mg/kg, respectivamente, levando a uma biodisponibilidade de 31%. A constante de velocidade de absorção foi alta (5,0 ± 1,8 h-1) e a farmacocinética mostrou-se linear na faixa de doses investigada; iii) A recuperação das sondas de microdiálise in vitro por EE e RD para 80, 160 e 400 ng/mL de gatifloxacino foi de 33,5 ± 1,3%, 33,1 ± 1,2%, 31,8 ± 2,7% e 31,4 ± 2,6%, 33,1 ± 2,2%, 30,6 ± 3,3%, respectivamente. In vivo a recuperação por RD no músculo esquelético e pulmão de ratos Wistar foi de 29,1 ± 1,0% e 30,7 ± 1,4%, respectivamente. A recuperação por NNF in vitro e in vivo foi de 30,9 ± 2,9% e 29,0 ± 0,8%, respectivamente. Desse modo, concluiu-se que a recuperação foi constante e independente do método ou meio utilizado. Os perfis de concentração livre no músculo, pulmão e plasma de ratos Wistar foram virtualmente superpostos após dose de 6 mg/kg i.v., resultando em ASC similares de 3888 ± 734 ng.h/mL, 4138 ± 1071 ng.h/mL e 3805 ± 577 ng.h/mL, respectivamente (α = 0,05). O fator de distribuição tecidual foi de 1,02 e 1,08 para músculo e pulmão, respectivamente; iv) O modelo PK/PD empregado foi capaz de descrever o efeito do levofloxacino e do gatifloxacino contra o Streptococcus pneumoniae in vitro para todas as simulações investigadas. O EC50 médio para o levofloxacino (3,57 ± 2,16 mg/L) foi significativamente maior que o do gatifloxacino (0,95 ± 0,56 mg/L) quando regimes de doses múltiplas foram simulados. O mesmo foi observado para concentrações constantes, sendo o EC50,levofloxacino = 2,75 ± 0,45 mg/L e EC50,gatifloxacino = 1,03 ± 0,52 mg/L. O kmax foi estatisticamente semelhante para ambos os fármacos independente se foram simuladas concentrações flutuantes (kmax,levofloxacino = 0,40 ± 0,19 h-1; kmax,gatifloxacino = 0,48 ± 0,15 h-1) ou concentrações constantes (kmax,levofloxacino = 0,34 ± 0,06 h-1; kmax,gatifloxacino = 0,39 ± 0,23 h-1). Nenhum dos índices PK/PD foi capaz de prever o desfecho da infecção para todas as situações investigadas. O modelo PK/PD desenvolvido permitiu a comparação entre as duas fluorquinolonas e de diferentes posologias para cada fármaco, podendo ser utilizado para simular o efeito temporal de regimes de dosagem alternativos bem como para otimização da posologia desses fármacos para o tratamento da pneumonia adquirida na comunidade. / Objective: The aim of this work was to establish a pharmacokinetic-pharmacodynamic model (PK/PD model) to describe the profile of bactericidal effect over time of levofloxacin and gatifloxacin against Streptococcus pneumoniae. Method: To achieve this goal the following steps were carried out: i) an analytical method of SPE-HPLC to quantify gatifloxacin in plasma and tissue microdialysates, and an HPLC method for measuring levofloxacin and gatifloxacin in culture broth samples were developed and validated; ii) the pharmacokinetics of gatifloxacin in rodents after intravenous (6 mg/kg) and oral (6 and 12 mg/kg) administration was assessed as well as the oral bioavailability of the drug was determined; iii) microdialysis conditions for gatifloxacin were established and the recovery rates in vitro by dialysis (EE), retrodialysis (RD) and no-net-flux (NNF), and in vivo in lung and skeletal muscle tissue by RD and NNF were determined. Gatifloxacin tissue penetration in lung after intravenous administration (6 mg/kg) to healthy Wistar rats was determined; iv) levofloxacin and gatifloxacin free lung concentrations expected in humans following different dosing regimens of the drugs were simulated using Streptococcus pneumoniae ATCC® 49619 in vitro model of infection. The effect of constant concentrations multiples of MIC were also investigated. The time-kill curves obtained were modeled using an Emax modified model using Scientist® v. 2.01 software. Results and Conclusions: i) The analytical methods by SPE-HPLC and HPLC for quantifying gatifloxacin and levofloxacin were validated. Calibration curves were linear between 20-600 ng/mL for gatifloxacin in plasma and tissue microdialysate samples and between 250-6000 ng/mL for broth media for both drugs, with r > 0.99 independently of the method considered. The accuracy was ≥ 94.3 % for plasma and microdialysate. Gatifloxacin recovery from the solid phase extraction cartridges ranged from 95.6 to 99.7%. The precision did not exceed 5.8% of the CV. In broth media the accuracy was ≥ 92.0% and 94.3% for gatifloxacin and levofloxacin, respectively. The precision did not exceed 3.2% and 4.2% of the CV for levofloxacin and gatifloxacin, respectively; ii) Gatifloxacin experimental plasma profiles in rats were adequately fitted to a two-compartment model after intravenous and to a one compartment model with first order absorption after oral dosing. The total clearance (0.9 ± 0.2 and 1.0 ± 0.3 L/h/kg), the terminal half-life (3.3 ± 0.8 and 3.7 ± 0.3 h) and the apparent volume of distribution (2.8 ± 0.4 and 3.1 ± 1.0 L/kg) were statistically similar (α = 0.05) after i.v. and oral administration, by both model independent and compartmental approaches. The area under the curve was reduced after oral dosing (4.1 ± 1.6 μg.h/mL) in comparison to i.v. dosing (6.6 ± 1.3 μg.h/mL) leading to an oral bioavailability of 31%. The absorption was fast, with a constant rate of 5.0 ± 1.8 h-1. The results evidenced the linear pharmacokinetics of gatifloxacin in rodents in the dose range investigated; iii) Microdialysis recoveries determined in vitro by EE and RD at 80, 160 and 400 ng/mL resulted in 33.5 ± 1.3%, 33.1 ± 1.2%, 31.8 ± 2.7% and 31.4 ± 2.6%, 33.1 ± 2.2%, 30.6 ± 3.3%, respectively. In vivo recovery by RD in Wistar rat’s skeletal muscle and lung were 29.1 ± 1.0% and 30.7 ± 1.4%, respectively. Recoveries by no-net-flux in vitro and in vivo resulted in recoveries of 30.9 ± 2.9% and 29.0 ± 0.8%, respectively. In this way, it was shown that gatifloxacin recovery was constant and independent of the method or media used. Free skeletal muscle, lung and plasma profiles were virtually superimposed after i.v. administration of gatifloxacin 6 mg/kg dose resulting in similar area under the curve of 3888 ± 734 ng.h/mL, 4138 ± 1071 ng.h/mL and 3805 ± 577 ng.h/mL, respectively (α = 0.05). The tissue distribution factors were determined to be 1.02 and 1.08 for muscle and lung, respectively; iv) The PK/PD model used was able to describe the effect of levofloxacin and gatifloxacin against Streptococcus pneumoniae in vitro for all the regimens investigated. Levofloxacin EC50 (3.57 ± 2.16 mg/L) was higher than gatifloxacin (0.95 ± 0.56 mg/L) when multiple dosing regimens where simulated. Using constant concentrations, levofloxacin EC50 was also higher than gatifloxacin (EC50,levofloxacin = 2.75 ± 0.45 mg/L; EC50,gatifloxacin = 1.03 ± 0.52 mg/L). The kmax was statistically similar for both drugs independent of whether fluctuating (kmax,levofloxacin = 0.40 ± 0.19 h-1; kmax,gatifloxacin = 0.48 ± 0.15 h-1) or constant concentrations (kmax,levofloxacin = 0.34 ± 0.06 h-1; kmax,gatifloxacin = 0.39 ± 0.23 h-1) were simulated. None of the PK/PD indices was capable of predicting the infection outcome for all the situations investigated. The PK/PD model developed allowed not only the comparison between the fluoroquinolones effect but also the comparison of different dosing regimes for the same drug and can be used for simulating alternative regimens and optimizing therapy of these drugs to treat community-acquired pneumonia.

Objetivo: O objetivo geral deste trabalho foi desenvolver um modelo farmacocinético/farmacodinâmico (PK/PD) para descrever o efeito bactericida in vitro das fluoroquinolonas levofloxacino (LEV) e moxifloxacino (MXF)contra Escherichia coli, baseando-se em dados in vivo de concentração livre prostática. Métodos: Ratos Wistar machos foram utilizados nos experimentos in vivo para determinação da farmacocinética plasmática e prostática do LEV (7 mg/kg) e MXF (6 e 12 mg/kg) após dose i.v. bolus. As concentrações livres prostáticas foram determinadas por microdiálise. A coleta das amostras de plasma e dialisado de tecido foi realizada simultaneamente nos animais previamente anestesiados com uretano para determinação do fator de distribuição tecidual (fT). Para a quantificação do LEV e MXF nas amostras de plasma e dialisado, métodos analíticos foram validados. Análise farmacocinética não-compartimental e modelagem compartimental dos dados foram realizadas utilizando o WinNonlin® e NONMEM® v. 6, respectivamente. Os experimentos de farmacodinâmica in vitro foram executados utilizando sistema composto de caldo de cultura Mueller-Hinton no qual a bactéria teste (Escherichia coli ATCC 25922) foi exposta a concentrações constantes e flutuantes dos antimicrobianos. O número de colônias bacterianas viáveis (CFU/mL) foi determinado em função do tempo e utilizado como parâmetro farmacodinâmico para construção das curvas de morte bacteriana (time-kill curves). Nos experimentos de time-kill curves estáticos, concentrações baseadas em múltiplos da MIC na faixa de 0.008–2 mg/L foram utilizadas, enquanto que no dinâmico a meia-vida de eliminação do LEV em humanos foi simulada no sistema in vitro através de diluição constante do caldo de cultura. Resultados e Discussão: Um método analítico por HPLC-fluorescência foi desenvolvido e validado para a quantificação do MXF nas amostras biológicas. Método analítico também foi validado para quantificação do LEV nas amostras. Os perfis plasmáticos e teciduais das duas fluoroquinolonas foram modelados simultaneamente utilizando modelo de três compartimentos considerando transporte linear (difusão passiva) e saturável (cinética de Michaelis-Menten). O modelo, que foi o mais adequado para descrever os dados experimentais, sugere a presença de transportadores de efluxo na próstata. A penetração prostática média do MXF foi significativamente maior que a do LEV (fT = 1.24 vs. 0.78) e foi independente da dose. Em ratos, não foi observada diferença na meia-vida plasmática média entre LEV (5.0 h) e MXF (4.9 h), embora a meia-vida tecidual foi ligeiramente maior para o MXF (3.3 vs. 2.3 h). Usando a abordagem populacional de modelagem PK/PD, modelo de Emax sigmoidal foi utilizado para descrever o efeito das duas quinolonas frente a E. coli tanto nos experimentos de concentração estática quanto dinâmica. A comparação dos parâmetros PK/PD estimados mostrou que o MXF apresenta potência superior ao LEV contra a cepa através da comparação dos valores de EC50, embora ambos tenham apresentado eficácia comparável (Emax de 1.85 e 1.83 h-1 para MXF e LEV, respectivamente). Para o LEV, os esquemas posológicos de 500 mg q12 h e 1000 mg q24 h apresentaram maior eficácia no período de 24 h, pois promoveram a inibição completa do recrescimento bacteriano observado nos outros dois regimes de dose testados. Conclusões: A correlação dos dados de farmacocinéticain vivo com os experimentos de farmacodinâmica in vitro, seguida da construção do modelo PK/PD de efeito máximo, possibilitou explorar a relação do efeito antimicrobiano em função do tempo baseada em concentrações livres esperadas na prostatite. / Objective: The aim of this study was to develop a pharmacokinetic/pharmacodynamic (PK/PD) model to describe the in vitro bactericidal effect of the fluoroquinolones levofloxacin (LEV) and moxifloxacin (MXF) against Escherichia coli based on free concentrations in prostate tissue measured in vivo. Methods: Pharmacokinetic experiments were conducted in male Wistar rats for the determination of plasma and free prostate concentrations of LEV (7 mg/kg) and MXF (6 and 12 mg/kg) after i.v. bolus administration. Blood and tissue dialysate samples were collected simultaneously in the group of rats previously anesthetized with urethane to determine the tissue distribution factor (fT). To quantify MXF and LEV in plasma and dialysate samples obtained after administration of the quinolones, analytical methods based on HPLC-fluorescence were developed and validated accordingly. Non-compartmental analysis and compartmental PK modeling of the data was performed in WinNonlin® and NONMEM® v. 6, respectively. The in vitro pharmacodynamic experiments were executed by using a system composed of Mueller-Hinton growth medium in which the test bacterial strain (Escherichia coli ATCC 25922) was exposed to constant and fluctuating antimicrobial concentrations. The number of viable colony-forming units (CFU/mL) was determined as a function of time and used as the pharmacodynamic parameter for construction of bacterial time-kill curves. In the static time-kill curves, concentrations in the range of 0.008-2 mg/L were tested based on multiples of the MIC, whereas in the dynamic time-kill curves the half-life of LEV in humans was simulated in the in vitro system by stepwise dilution of the growth medium. Results and Discussion: An HPLC-fluorescence method was developed and fully validated to quantify MXF in biological fluids. A method was also validated to determine LEV in the samples. Plasma and prostate concentrations of both drugs were simultaneously fitted using a three-compartment model considering linear (passive diffusion) and saturable transport (Michaelis-Menten kinetics), suggesting the presence of efflux transporters in the prostate. The average tissue penetration of MXF in the prostate was significantly higher than that of LEV (fT = 1.24 vs. 0.78) and was independent of the dose. In rats, differences in average plasma half-life between plasma LEV (5.0 h) and MXF (4.9 h) were not observed, even though the tissue half-life was slightly longer for MXF (3.3 vs. 2.3 h). Using a population PK/PD modeling approach, a sigmoidal Emax model was used to describe the effect of the two quinolones against E. coli both in the static as well as in the dynamic time-kill curves. Comparison of the PK/PD parameter estimates showed that the in vitro potency of MXF is higher than LEV against the strain tested as shown by EC50 values, but both presented equivalent efficacy (Emax of 1.85 and 1.83 h-1 for MXF and LEV, respectively). For LEV, the dosing regimens of 500 mg q12 h and 1,000 mg q24 h showed overall greater efficacy over the 24 h period as they resulted in complete inhibition of bacterial regrowth observed in the other two dosing regimens tested. Conclusions: The correlation of in vivo pharmacokinetic data with in vitro pharmacodynamic experiments, followed by the development of an Emax PK/PD model, allowed determining the relationship between the bactericidal effect as a function of time based on free tissue concentrations expected in the site of infection.