Águas residuárias são continuamente contaminadas por fármacos. Dentre estes fármacos, os antimicrobianos causam grande preocupação pelos impactos sobre o desenvolvimento de resistência bacteriana. As principais fontes de contaminação destes fármacos são efluentes urbanos, hospitalares, de fazendas e de algumas indústrias. A complexidade das matrizes ambientais tais como águas residuárias é uma das principais dificuldades para extrair e detectar fármacos, fazendo-se necessário o uso de técnicas de preparo de amostra para a extração destes compostos de interesse. Técnicas clássicas como a extração líquido-líquido (LLE) e a extração em fase sólida (SPE) são largamente usadas para extração de fármacos nesse tipo de matriz, porém estas técnicas não atendem amplamente aos princípios da química verde. Dessa forma, novas técnicas, mais alinhadas à responsabilidade ambiental, têm sido desenvolvidas. Neste âmbito apresenta-se o desenvolvimento e a validação de um método de microextração líquido-líquido para extração e detecção de sulfonamidas e o desenvolvimento e otimização de um método utilizando planejamento experimental para a extração de fluoroquinolonas em águas residuárias. Foi possível obter-se o limite de detecção de 0,2 ng mL-1 para as sulfonamidas analisadas, este LD é relativamente baixo considerando que o detector que foi utilizado não possuía a possibilidade de fazer análises no modo MS/MS, o que certamente reduziria ainda mais o LD. Com os desenvolvimentos desse trabalho tornou-se possível a utilização de apenas 1 mL de solvente orgânico para a pré-concentração off-line, Esta etapa, adicionada a uma outra pré-concentração online (column switching) permitiu a extração dos analitos com a obtenção de um LD relativamente baixo, a partir de apenas 7 mL de amostra. / Drugs are continuously contaminating wastewater. Among these drugs antimicrobials cause great concern for the impacts on the development of bacterial resistance. The main sources of contamination by these drugs are urban effluents, hospitals, farms and some industries. The complexity of the environmental matrices such as wastewater is one of the main difficulties in extracting and detecting drugs, bringing up the need to use sample preparation techniques for the extraction of the interest compounds. Classical techniques such as liquid-liquid extraction (LLE) and solid phase extraction (SPE) are widely used for drug extraction in this type of matrix, but these techniques do not largely meet the principles of green chemistry. In this way, new techniques, more aligned with environmental responsibility, have been developed. In this context, this thesis presents the development and validation of a liquid-liquid microextraction method for sulfonamide extraction and detection and the development and optimization of a method using experimental design for the extraction of fluoroquinolones presented in wastewater. It was possible to obtain a limit of detection (LD) of 0.2 ng mL-1 for the sulfonamides analyzed, this LD is relatively low considering that the detector that was used did not have the possibility to perform analyzes in the MS/MS mode, which certainly would further reduce the LD. With the development of this thesis, it became possible to use only 1 mL of organic solvent for the off-line preconcentration of the analytes. This step, added to another online preconcentration (column switching) allowed the extraction of the analytes obtaining relatively low LDs, from just 7 mL of the sample.

[EN] Fluoroquinolones (FQ) are the antibiotics most used nowadays. Some of its derivatives have anti-tumor activity. Both in vitro and in vivo studies have shown anti-cancer property of these compounds. Its mechanism of action occurs through inhibition of the topoisomerases (I and II) and the DNA polymerase which triggers genotoxic effects in eukaryotic systems. UV radiation increases these effects which provide photochemotherapeutic properties to these molecules.This photoinduced genotoxicity has been detected in dihalogenated FQ such as fleroxacin (FLX), 3118BAY and lomefloxacin (LFX), proposed this last compound as a model to study the photomutagenic action of drugs. These FQ show an unusual photodehalogenation for the link C8-halogen heterolysis, being the generation of an aryl cation an intermediate key to analyze the photobinding properties of the FQ to biomolecules. It has been observed the formation of secondary species from their triplet excited states using (FDL) but the nature of this secondary intermediate has not been clearly established neither its participation in the photodegradation processes of the FQ. FDL studies were performed with NFX and some of its derivatives in the presence and absence PB at different pH. The results of our study allowed to discard the generation of FQ anionic radicals and as well us a deprotonated FQ triplet excited state as the secondary species (SS) detected. It was determined unequivocally the excimer nature of SS. Thus, using this LFP technique with ANFX and its methyl ester, it has been able to discard the involvement of protonation or deprotonation processes in the generation of the SS. Moreover, these results have contributed to understand the photophysical processes of the FQ and the role of phosphate buffer in them. The results showed that the triplet excimers of the FQ should not have any participation in the phototoxic effects associated with the FQ since they have triplet energies lower than their 3FQ and not involved in the process of photodegradation of the FQ. It has been addressed a new photochemical study on the lomefloxacin (LFX) and its N-acetylated derivative (ALFX) analyzing the reactivity of their intermediates including the characterization of the resulting photoproducts. Results have clearly evidenced the involvement of the singlet character of aryl cations of both molecules (1LFX+ and 1ALFX+) in their photodehalogenations processes at neutral pH. It has also been demonstrated that although their triplet aryl cations (3(A) LFX+) is also involved in their photodegradation processes, the detected intermediates using FDL are 1(A)LFX+. It was proceeded to assess, using various techniques the main processes involved in the photodehalogenation of FQ in the presence of biomolecules such as DNA or its deoxyguanosine base (dGuo) as well as albumin as a protein model and some of its amino acids more reactive. The photolysis of (A)LFX in the presence of dGuo give rise to photoproducts formed through the generation of covalent bonds between of union between these FQ and the purine base. By contrast, the photodegradation of these dihalogenated compound in the presence of DNA did not showed any type of covalent binding. This fact evidenced that different photodegradation pathways are involved in DNA. Using small structural changes in FQ is possible to modulate photoreactivity, their pharmacological properties as well as their affinity for DNA and its photogenotoxicity. Finally we have analysed the phototoxic and photoallergic properties of the FQ through the study of the photoreactions between (A)LFX and albumin (ASH) as a protein model and in the presence of Tyr, Trp. An electron transfer reaction between the singlet excited state of (A)LFX and amino acids of ASH was responsible for the FQ-protein covalent binding processes. It has also been observed that the affinity of the FQ for ASH is modified by the effect of the N-replacement. / [ES] Las fluoroquinolonas (FQ) son los antibióticos más utilizados en la actualidad. Tanto en estudios in vitro como in vivo se ha demostrado la propiedad anticancerígena de éstos compuestos. Su mecanismo de acción se produce mediante la inhibición de las topoisomerasas (I y II) y de la ADN polimerasa lo que desencadena efectos genotóxicos. Radiaciones UV incrementan estos efectos lo que confiere a estas moléculas propiedades fotoquimioterapéuticas. Las FQ muestran una inusual fotodeshalogenación por heterólisis del enlace C8-halógeno, siendo la generación de un catión arilo el intermedio clave para estudiar las propiedades de fotounión de las FQ a biomoléculas. Se ha observado por fotolisis de destello laser (FDL) que además de detectarse los estados excitados triplete de las FQ se observa la formación de una especie secundaria proveniente de sus estados excitados triplete pero la naturaleza de esta especie secundaria no parecía estar muy clara y tampoco su participación en los procesos de degradación. Para esclarecer estas incertidumbres se realizaron estudios de FDL con NFX y algunos de sus derivados en presencia y ausencia PB a diferentes pHs. Se pudo determinar de manera inequívoca la naturaleza excímera de SS. Así, mediante el uso de esta técnica con ANFX y su éster metílico se ha podido descartar la participación de procesos de protonación o desprotonación en la generación de las SS. Además, estos resultados han contribuido a entender los procesos fotofisicos de las FQ y el papel del tampón fosfato en ellos. Por otro lado, desde el punto de vista biológico, los resultados obtenidos evidenciaron que los excímeros triplete de las FQ no deben tener ninguna participación en los efectos fototóxicos asociados con las FQ ya que tienen energías de triplete menores que las sus 3FQ y no intervienen en los procesos de fotodegradación de las FQ. Se abordó un nuevo estudio fotoquímico sobre el lomefloxacino (LFX) y su derivado N-acetilado (ALFX). En él se estudiaron las propiedades fotofísicas y fotoquímicas de las citadas moléculas y sus intermedios de reacción y se analizaron conjuntamente con sus procesos de fotodegradación, incluyendo la caracterización de los fotoproductos resultantes. Los resultados mostraron la intervención de los cationes arilo con carácter singlete de ambas moléculas (1LFX+ y 1ALFX+)en sus fotodeshalogenaciones a pHs neutros. Se pudo demostrar que aunque sus cationes arilo con carácter triplete (3(A)LFX+) también intervienen en sus procesos de fotodegradación, los intermedios detectados mediante FDL son 1(A)LFX+. Una vez establecida la naturaleza excímera de las especies secundarias (SS) de las FQ y determinadas las propiedades del intermedio reactivo resultante de la fotodeshalogenación de 6,8-difluoroquinolonas, se procedió a evaluar mediante diversas técnicas los principales procesos implicados en la fotodeshalogenación de FQ en presencia de biomoléculas como el ADN o su base deoxiguanosina (dGuo) la albumina y alguno de sus aminoácidos más reactivos. La fotolisis de (A)LFX en presencia de dGuo dio lugar a la formación de fotoproductos de unión entre estos compuestos y la base púrica . Sin embargo por la presencia de ADN no se detectó ningún tipo de unión covalente. La participación del complejo (A)LFX--ADN en las fotodegradaciones de estas fluoroquinolonas justificaba las diferencias obtenidas mediante una reacción de transferencia electrónica entre el estado singlete de (A)LFX y ADN. También se observó una disminución en el valor de la constante de asociación entre FQ y ADN cuando la FQ estaba N-acetilada. Se analizaron las propiedades fototóxicas y fotoalérgicas de las FQ mediante el estudio de las fotoreacciones entre (A)LFX y la albumina (ASH) como proteína modelo y también en presencia de algunos de sus aminoácidos más reactivos (Tyr, Trp). Una transferencia electrónica entre el estado excitado singlete de (A)LFX y / [CA] Les fluoroquinolones (FQ) son els antibiòtics més utilitzats en la actualitat. El seu mecanisme d'acció es produeix mitjançant la inhibició de les topoisomerases (I y II) i de l'ADN polimerasa el que desencadena efectes genotòxics. Radiacions UV incrementen aquests efectes el que confereix a aquestes molècules propietats fotoquimioterapèutiques. Esta genotoxicitat fotoinduïda va ser detectada en FQ dihalogenades com fleroxací (FLX), 3118BAY i lomefloxací (LFX), proposant-se aquest últim compost com model per a estudiar l'acció fotomutagènica de fàrmacs. Aquestes FQ mostren una inusual fotodeshalogenació per heteròlisi de l'enllaç C8-halógen, sent la generació d'un catió arilo l'intermedi clau per a estudiar les propietats de fotounió de les FQ a biomolècules. S'ha observat per fotòlisi de centelleig làser (FDL), a més de detectar-se els estats excitats triplet de les FQ, la formació d'una espècie secundària provinent dels seus estats excitats triplet. Amb el propòsit de poder clarificar aquestes incerteses es realitzaren estudis de FDL amb NFX i alguns dels seus derivats en presencia i absència de PB a diferents pHs. Els resultats descartaren la generació dels seus radicals aniònics i la desprotonació dels seus estats excitats triplet com les especies secundaries (SS) detectades. A més es va poder determinar de forma inequívoca la natura excímera de SS. Es va abordar un nou estudi fotoquímic sobre el lomefloxací (LFX) i el seu derivat N-acetilat (ALFX). En ell s'estudiaren las propietats fotofísiques i fotoquímiques de les citades molècules i el seus intermedis de reacció i s'analitzaren conjuntament amb els seus processos de fotodegradació, incloent la caracterització dels fotoproductes resultants. Els resultats van mostrar clarament la intervenció dels cations aril amb caràcter singlet de ambdues molècules (1LFX+ y 1ALFX+) en els seues fotodeshalogenacions a pHs neutres. També es va poder demostrar que els intermedis detectats mitjançant FDL son de caràcter 1(A)LFX+. A més es va evidenciar la gran importància que tenen substituents perifèrics N-alquílics sobre les propietats fotoquímiques i fotofísiques de les quinolones 6,8-dihalogenades. Una vegada establerta la naturalesa excímera de les especies secundàries (SS) de les FQ i determinades les propietats de l'intermedi reactiu resultant de la fotodeshalogenació de 6,8-difluoroquinolones, es va procedir a evaluar mitjançant diverses tècniques els principals processos implicats en la fotodeshalogenació de FQ en presencia de biomolècules com l'ADN o la seua base deoxiguanosina (dGuo) i amb una proteïna com l'albúmina i algun dels seus aminoàcids mes reactius. La fotòlisis de (A)LFX en presencia de dGuo va donar lloc a la formació de fotoproductes d'unió entre aquests compostos i la base púrica. No obstant per la presencia d'ADN no es va detectar cap tipus d'unió covalent. Aquest fet evidenciava la participació de diferents processos en les fotodegradacions de (A)LFX en presencia d'ADN i amb la seua base mes reactiva. Ha quedat demostrat que canviant substituents de les FQ es possible modular no tan sols les propietats farmacològiques i de fotoreactivitat, sinó també l'afinitat per l'ADN i la seua fotogenotoxicitat. Per últim es van analitzar les propietats fototòxiques i fotoal¿lèrgiques de les FQ mitjançant l'estudi de les fotoreaccions entre (A)LFX i l'albúmina (ASH) i també en presència d'alguns dels seus aminoàcids més reactius (Tyr, Trp). Una reacció de transferència electrònica entre l'estat excitat singlet de (A)LFX i aminoàcids de ASH era el procés responsable de les unions covalents FQ-Proteïna. / Soldevila Serrano, S. (2015). ESTUDIO DE LA FOTOREACTIVIDAD DE LAS FLUOROQUINOLONAS CON SUS BIOMOLÉCULAS DIANA [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/59430

Bacteria of the Arcobacter genus are microorganisms belonging to the Campylobacteraceae family. Currently, the Arcobacter genus comprises 23 species, isolated from a variety of hosts and ecological niches. Although most of the pathogenic species are from fecal origin, seawater is considered to be the habitat for most of them. The transmission to humans seems to be associated to the consumption of raw food or not entirely-cooked. In this regard, the presence of pathogenic Arcobacter species in food of marine origin and vegetables has not been deeply studied. When the detection and identification of Arcobacter is performed exclusively using conventional culture-based methods, the process is slow, tedious and rarely effective many times, originating frequently false negatives. Molecular biology-based methods analyzing nucleic acids with the use of the Polymerase Chain Reaction (PCR), are alternative procedure characterized by being reliable, faster, more sensitive. In this thesis we have analysed the presence of Arcobacter spp in 100 samples from shellfish and another 100 samples from vegetables using both approaches, on one side through the isolation and characterization by plate culture in and on the other side by PCR. The results obtained by both methods confirm the presence of Arcobacter spp. in the samples. An enrichment period followed by PCR has proved to be more sensitive than culture for the detection of the microorganism in the samples. In this study, Arcobacter contamination has been detected in 71 % of the shellfish samples and 20 % of vegetable samples. The obtained Arcobacter isolates have been identified to the species level analyzing the 16 rRNA gene by PCR-RFLP. This technique has allowed the identification of the species A. butzleri, A. cryaerophilus and A. defluvii in the shellfish isolates, being the first time that A. defluvii is identified in clams. Additionally, it is also the first time that Arcobacter spp. is detected in cockles. A. butzleri and A. cryaerophilus have been isolated in vegetables being the last one the first time in this type of samples. The sensitivity of the obtained isolates to ciprofloxacin and levofloxacin has also been studied. 2 % in analysed shellfish and 1 % in vegetables were contaminated with resistant strains. Three isolates from shellfish and 2 from vegetables, previously identified as A. butzleri, have shown resistance to both fluoroquinolones. In all of them, a mutation in the 254 position (C normal to T mutant) in the Quinolone Resistance-Determining Region (QRDR) of the gyrA gene has been detected. Our results regarding the presence of the pathogen in both types of samples are sufficiently relevant as to consider that the consumption of these contaminated foods with Arcobacter, especially A. butzleri, could suppose a risk for human health. In addition, in this thesis the analisys of Helicobacter spp. and H. pylori by conventional PCR and real-time PCR has been carried out. The Helicobacter genus comprises a large number of species considered pathogenic. The most studied specie is H. pylori, one of the most common pathogens in humans and responsible of 90 % of peptic ulcers and closely related to the development of gastric cancer. Although it seems clear that H. pylori is transmited by fecal-oral route through the water, its presence in food is poorly known. Therefore, another objective of the present study has been to study the presence of these organisms in shellfish and vegetable samples. Helicobacter spp. or H. pylori could not be detected by conventional PCR. However, the real-time PCR technique allowed the detection of H. pylori in a sample from vegetables (lettuce). / Las bacterias del género Arcobacter son microorganismos pertenecientes a la familia Campylobacteraceae. Actualmente, el género Arcobacter comprende 23 especies, aisladas de una gran diversidad de hospedadores y nichos ecológicos. Las aguas de mar son consideradas el hábitat natural para muchas de ellas, aunque la mayor parte de las especies patógenas son de origen fecal. La transmisión al hombre parece estar asociada al consumo de alimentos crudos o poco cocidos. Sin embargo, la presencia de especies patógenas de Arcobacter en alimentos de origen marino y vegetales ha sido muy poco estudiada. Cuando la detección e identificación de Arcobacter, se establece exclusivamente en función de métodos convencionales de cultivo, el proceso resulta lento, tedioso y poco efectivo en muchas ocasiones, originando frecuentes falsos negativos. Los métodos de detección molecular basados en el análisis de ácidos nucleicos, como la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), pueden suponer una alternativa más rápida, sensible y fiable. Por todo ello, en este trabajo se ha realizado la detección de Arcobacter spp. mediante aislamiento por cultivo en placa y PCR, a partir de 100 muestras de moluscos y 100 de verduras. Los resultados obtenidos por ambos métodos confirman la existencia de Arcobacter en las muestras. La PCR, realizada tras un periodo de enriquecimiento, ha resultado ser más sensible que el cultivo para la detección del microorganismo en las muestras. En este trabajo se ha detectado contaminación por Arcobacter en el 71 % de las muestras de moluscos y el 20 % de las muestras de verduras. Los aislados de Arcobacter obtenidos han sido identificados a nivel de especie mediante un análisis PCR-RFLP del gen 16 ARNr. Esta técnica ha permitido identificar las especies A. butzleri, A. cryaerophilus y A. defluvii de los aislados de moluscos, siendo la primera vez que es identificada A. defluvii de muestras de almejas. También es la primera vez que se detecta Arcobacter spp. en berberechos. En el caso de las verduras, se han aislado A. butzleri y A. cryaerophilus. Esta última especie ha sido identificada por primera vez en este tipo de muestras. También se ha estudiado la sensibilidad de los aislados obtenidos a ciprofloxacino y levofloxacino. El porcentaje de muestras contaminadas con cepas resistentes fue del 2 % en moluscos y del 1 % en verduras. Tres aislados procedentes de moluscos y 2 de verduras, identificados previamente como A. butzleri, han mostrado resistencia a ambas fluoroquinolonas. En todos ellos se ha detectado la existencia de una mutación en la posición 254 (C normal por T mutante) en la Región Determinante de Resistencia a Quinolonas (QRDR) del gen gyrA. Nuestros resultados sobre la presencia del patógeno en ambos tipos de muestras son lo suficientemente relevantes como para considerar que el consumo de estos alimentos contaminados con Arcobacter, especialmente A. butzleri, podría suponer un riesgo para la salud humana. Adicionalmente, en este trabajo se ha realizado un análisis de detección de Helicobacter spp. y H. pylori mediante PCR convencional y PCR a tiempo real. El género Helicobacter comprende un gran número de especies consideradas patógenas. La especie más estudiada es H. pylori, uno de los patógenos más comunes en humanos, responsable del 90 % de las úlceras pépticas y relacionado estrechamente con el desarrollo de cáncer gástrico. Aunque parece claro que H. pylori se transmite por la vía fecal-oral a través del agua, su presencia en los alimentos es poco conocida. Por lo tanto, en este estudio se tomó como objetivo estudiar la presencia de estos microorganismos en las muestras de moluscos y verduras. El análisis mediante PCR convencional no mostró resultados positivos para la detección de Helicobacter spp. ni H. pylori. La técnica PCR a tiempo real, sin embargo, ha permitido la detección de H. pylori en una muestra procedente de verduras (lechuga). / Els bacteris del gènere Arcobacter són microorganismes pertanyents a la família Campylobacteraceae. Actualment, el gènere Arcobacter comprèn 23 espècies, aïllades d'una gran diversitat d'hostes i nínxols ecològics. Les aigües de la mar són considerades l'hàbitat natural per a moltes d'aquestes espècies, encara que la major part de les patògenes són d'origen fecal. La transmissió a l'home sembla estar associada al consum d'aliments crus o poc cuits. No obstant això, la presència d'espècies patògenes d'Arcobacter en aliments d'origen marí i vegetals ha sigut molt poc estudiada. Quan la detecció i identificació d'Arcobacter s'estableix exclusivament en funció de mètodes convencionals de cultiu, el procés resulta lent, tediós i sovint poc efectiu, i origina amb freqüència falsos negatius. Els mètodes de detecció molecular basats en l'anàlisi d'àcids nucleics, com la reacció en cadena de la polimerasa (PCR), poden suposar una alternativa més ràpida, sensible i fiable. Per tot això, en aquest treball s'ha realitzat la detecció d'Arcobacter spp. mitjançant aïllament per cultiu en placa i PCR, a partir de 100 mostres de mol·luscos i 100 de verdures. Els resultats obtinguts pels dos mètodes confirmen l'existència d'Arcobacter en les mostres. La PCR, després d'un període d'enriquiment, ha resultat ser més sensible que el cultiu per a la detecció del microorganisme en mostres de mol·luscos. En aquest treball, s'ha detectat contaminació per Arcobacter en el 71 % de les mostres de mol·luscos i el 20 % de les mostres de verdures. Els aïllats d'Arcobacter obtinguts han sigut identificats a nivell d'espècie mitjançant una anàlisi PCR-RFLP del gen 16 ARNr. Aquesta tècnica ha permès identificar les espècies A. butzleri, A. cryaerophilus i A. defluvii en els aïllats de mol·luscos. Aquesta és la primera vegada que A. defluvii és identificada en mostres de cloïsses. També és la primera vegada que es detecta Arcobacter spp. en catxels. En el cas de les verdures, s'han aïllat A. butzleri i A. cryaerophilus. Aquesta última espècie ha sigut identificada per primera vegada en aquest tipus de mostres. També s'ha estudiat la sensibilitat dels aïllats obtinguts a la ciprofloxacina i la levofloxacina. El percentatge de mostres contaminades amb soques resistents va ser del 2 % en mol·luscos i de l'1 % en verdures. 3 aïllats procedents de mol·luscos i 2 de verdures, identificats prèviament com A. butzleri, han mostrat resistència a ambdues fluoroquinolones. En tots aquests s'ha detectat l'existència d'una mutació en la posició 254 (C normal per T mutant) en la regió determinant de resistència a quinolones (QRDR) del gen gyrA. Els nostres resultats sobre la presència del patogen en els dos tipus de mostres són prou rellevants per a considerar que el consum d'aquests aliments contaminats amb Arcobacter, especialment A. butzleri, podria suposar un risc per a la salut humana. Addicionalment, en aquest treball s'ha fet una anàlisi de detecció d'Helicobacter spp. i H. pylori mitjançant PCR convencional i PCR a temps real. El gènere Helicobacter comprèn un gran nombre d'espècies considerades patògenes. L'espècie més estudiada és H. pylori, un dels patògens més comuns en humans, responsable del 90% de les úlceres pèptiques i relacionada estretament amb el desenvolupament de càncer gàstric. Encara que sembla clar que H. pylori es transmet per la via fecal-oral a través de l'aigua, la presència d'aquest bacteri en els aliments és poc coneguda. Per tant, en aquest estudi es va definir com a objectiu estudiar la presència d'aquests microorganismes en les mostres de mol·luscos i verdures. L'anàlisi mitjançant PCR convencional no va mostrar resultats positius per a la detecció d'Helicobacter spp. ni d'H. pylori. La tècnica PCR a temps real, en canvi, ha permès la detecció d'H. pylori en una mostra procedent de verdures (encisam). / Bayas Morejón, IF. (2016). Aportaciones a la epidemiología de Arcobacter y Helicobacter spp.: Aplicación de métodos moleculares a su detección e identificación en alimentos [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/75087

[pt] Neste trabalhou desenvolveu-se métodos analíticos baseados na fosforimetria em temperatura ambiente em substrato sólido (FTASS) para determinação seletiva de fluorquinolonas. Mais especificamente, avaliou-se a viabilidade do uso do nitrato de tório como sal de átomo pesado indutor de fosforescência visando a determinação seqüencial de norfloxacino (NOR) e levofloxacino (LEV), determinação seletiva de NOR em presença de ciprofloxacino (CIP), assim como a determinação seletiva de CIP em presença de gatifloxacino (GAT) ou moxifloxacino (MOX). Realizou-se uma cuidadosa comparação entre o sinal fosforescente obtido com o uso do nitrato de tório e os obtidos pelos sais indutores tradicionalmente utilizados na FTASS. Estudou-se univariadamente o efeito da quantidade de sal indutor de átomo pesado depositado no substrato sólido, a quantidade de um surfactante modificador de superfície e a concentração hidrogeniônica da solução carreadora de analito na magnitude do sinal fosforescente. Também foram avaliadas possíveis interações entre esses fatores experimentais por meio de um planejamento fatorial 23. Com a estratégia de análise bem definida, desenvolveram-se metodologias para a determinação de NOR, LEV e CIP em formulações farmacêuticas comerciais e simuladas e em urina enriquecida sem que se fosse aplicado procedimentos de separação do analito de interesse das outras substâncias concomitantes. Para tal, a estratégia de varredura sincronizada foi fundamental. Os parâmetros analíticos de mérito obtidos com o uso do nitrato de tório foram comparados com os obtidos com o do acetato de cádmio (átomo pesado indutor de fosforescência de fluorquinolonas já descrito na literatura). Em todos os casos estudados, a resposta analítica apresentou comportamento linear em função da massa depositada de NOR, LEV e CIP no substrato (R2>0,99), com boa repetitividade e sensibilidade (avaliada pelos limites de detecção e quantificação absolutos na ordem de ng). Tanto nas formulações farmacêuticas quanto em urina enriquecida, os resultados obtidos com o método desenvolvido com o uso do sal de tório na determinação seqüencial de NOR/LEV e na determinação seletiva de NOR/CIP foram mais vantajosos que os obtidos com o uso do sal de cádmio. Em ambos os casos, o método desenvolvido com o uso do Th(NO3) 4 mostrou-se válido desde que a proporção molar das misturas NOR/LEV e NOR/CIP não ultrapassem a condição de 1 (analito) para 5 (interferente). Para o método desenvolvido na determinação seletiva de CIP em misturas contendo GAT, o Th(NO3)4 também mostrou-se mais adequado que o acetato de cádmio, Cd(OAc)2, sendo obtidos resultados satisfatórios, desde que a proporção molar CIP/GAT não ultrapassasse 1 para 2. No entanto, interferências do tipo nãoespectral foram observadas na presença de quantidades maiores de GAT (até 10 vezes mais), as quais podem ser facilmente corrigidas utilizando o método de adição do analito. Já nas misturas contendo CIP/MOX, o método desenvolvido para a determinação seletiva de CIP com o uso do sal de tório foi muito favorável em proporções equimolares e em quantidades contendo duas vezes mais MOX. Em misturas contendo maiores quantidades de MOX, observou- se interferências do tipo espectral que não puderam ser contornadas por sincronização, devido seus (Lambda)sinc.muito próximos. Porém, utilizando Cd(OAc) 2 nas misturas contendo CIP/MOX em razões molares maiores que 1:2 se observou interferências apenas do tipo não-espectral, que podem ser corrigidas por procedimento adequado de calibração. Esse caso foi o único cujo sal de cádmio mostrou-se superior ao método desenvolvido com o uso do sal de tório. / [en] In this work, analytical methods based on solid surface room-temperature phosphorimetry were developed aiming the selective determination of fluorquinolones. More spectilly, thorium nitrate was evaluated as phosphorescence inducer aiming the sequential determination of norfloxacin (NOR) and levofloxacin (LEV), selective determination of NOR in presence of ciprofloxacin (CIP), as well as the selective determination of CIP in the presence gatifloxacin (GAT) or moxifloxacin (MOX). In order to that, the phosphorescence induced by thorium nitrate was compared with the ones achieved using other traditionally employed heavy atom enhancers in solid surface room-temperature phosphorimetry (SSRTP). Univariated studies were made in order to evaluate the effect of the amounts of heavy atom salt and surface modifier present in the substrate as well as the influence of the pH of the analyte carrier solution. The interaction among these factors were also studied through experimental factorial desings (23). After the definition of the analytical strategy to be employed, analytical methods were developed for the determination of NOR, LEV and CIP in simulated mistures and analyte spiked urine without employing any procedure to physically separate the analyte from the others components of the sample. In order to do that, the use of syncronized scanning was fundamental. The analytical figures of merit achieved using thorium nitrate and cadmium acetate (heave atom inducer already reported in the literature for fluorquinolones) were campared. In both cases, linear analytical responses in function of the amount of analyted present in the substrate were achieved (R2>0,99). Good repetitivity of results and sensibility (evaluated through the estimation of the limits of detection and quantification) were in the ng order. When testing pharmaceutical formulations and spiked urine, the use of Th(NO3)4 showed clear advantage over Cd(OAc)2, allowing the sequential determination of NOR/LEV and the selective determination of NOR in the presence of CIP. The selective determination of NOR using Th(NO3)4 could be made for mixtures containing up to five times more LEV or CIP in molar proportion. For the developed method aiming the determination of CIP in mistures containing GAT, Th(NO3)4 was found to be more adequate heavy atom enhancer than Cd(OAc)2. The method was free from interferences for samples containing two times more GAT than CIP (in molar proportion). However, interferences observed for mixtures containing higher amounts of GAT could be easily corrected by the using of the standard addition method for quantification. In mixtures containing CIP and MOX, the developed method using Th(NO3)4 was suitable for mixtures containing equimolar proportions of these two fluorquinolones. Spectral interferences were observed for higher amounts of MOX. Such interference could not be resolved due to close (lambda) values characteristic for the two FQs. However, for the method using Cd(OAc)2 in mixtures containing CIP/MOX in molar proportion more them 1:2 only non spectral interferences were observed, but this interferences can be corrected by the use of proper calibration strategy. This was the only situation where Cd(OAc)2 demonstrate better results than Th(NO3)4.

Nesta dissertação são apresentadas a síntese e caracterização de duas novas substâncias, consideradas aqui como metalo-fármacos em potencial: o composto iônico (C17H19FN3O3)3[RuCl6].3H2O e o complexo [Ru(C17H17FN3O3)3].4H2O, obtidos através da reação entre RuIII e a fluoroquinona ciprofloxacina em diferentes condições de síntese (meio ácido ou neutro e refluxo, respectivamente). O espectro ESI MS em modo positivo de (C17H19FN3O3)3[RuCl6].3H2O exibiu um pico principal em m/z = 994,6 que foi atribuído ao aduto (ciprofloxacina)3.H+ em fase gasosa, enquanto [Ru(C17H17FN3O3)3].4H2O apresentou picos m/z em 1093,3 e 547,1, atribuídos aos íons [Ru(C17H17FN3O3)3].H+ e [Ru(C17H17FN3O3)3].2H+, respectivamente. Os resultados de análise térmica estão em concordância com os conteúdos de água propostos para as duas substâncias. Os espectros de absorção em meio aquoso são dominados pelas transições da ciprofloxacina na região UV. Não obstante, duas bandas foram observadas em 421 e 496 nm no caso de (C17H19FN3O3)3[RuCl6].3H2O, e atribuídas à transição de transferência de carga e à transição d-d, respectivamente; no caso de [Ru(C17H17FN3O3)3].4H2O, apenas um ombro largo em torno de 450 nm foi observado na região do Visível, tendo sido atribuído à uma transição d-d. O voltamograma cíclico deste complexo exibiu um processo quase-reversível em 0,25 V (versus EPH) enquanto o composto iônico apresentou o mesmo processo em 0,11 V, sugerindo que, neste caso, o íon central de rutênio é estabilizado no estado de oxidação III através da coordenação dos átomos de oxigênio das três unidades de ciprofloxacina. O complexo de coordenação é estável por mais de 48 horas em pH fisiológico, estomacal e intestinal. Ambos foram incubados nas condições estomacais (pH = 1,5 e temperatura = 370C) e não causaram diminuições significativas nos valores de pH. / This work presents the synthesis and characterization of two potential new metallodrugs, the ionic (C17H19FN3O3)3[RuCl6].3H2O and the coordination [Ru(C17H17FN3O3)3].4H2O compounds, by combining ruthenium (III) and the fluoroquinolone ciprofloxacin in different synthetic conditions (acid media or neutral and reflux conditions, respectively). The ESI MS (positive mode) spectrum of the ionic compound displayed a main peak at m/z = 994.6, which was assigned to the gaseous phase adduct (ciprofloxacin)3.H+, while the coordination compound featured peaks at m/z 1093.3 and 547.1 ascribed to the singly and doubly charged ions [Ru(C17H17FN3O3)3].H+ and [Ru(C17H17FN3O3)3].2H+, respectively. Thermal analysis corroborated the proposed water content for both complexes. The absorption spectra of the compounds in aqueous medium are dominated by the ciprofloxacin transitions in the UV region but two bands were observed at 421nm and 496nm for the ionic compound, assigned to a charge transfer and d-d transitions. In the case of the coordination compound only a broad shoulder around 450 nm was observed in the visible region, also assigned to a ligand field transition The cyclic voltammograms of the [Ru(C17H17FN3O3)3] complex exhibited a quasi-reversible process ascribed to the Ru(II) / (III) redox pair at -0.25 V (vs SHE) while compound (C17H19FN3O3)3[RuCl6] displayed this process at -0.11V, showing that the central ruthenium ion is stabilized in the (III) oxidation state by the coordination to the hard oxygen atoms of the ciprofloxacin ligand. The coordination compound is stable under physiological, stomachal and intestinal pH over 48 hours. Both compounds are stable incubated under stomachal conditions (pH=1.5 and 37oC) without significant pH lowering.

Nesta dissertação são apresentadas a síntese e caracterização de duas novas substâncias, consideradas aqui como metalo-fármacos em potencial: o composto iônico (C17H19FN3O3)3[RuCl6].3H2O e o complexo [Ru(C17H17FN3O3)3].4H2O, obtidos através da reação entre RuIII e a fluoroquinona ciprofloxacina em diferentes condições de síntese (meio ácido ou neutro e refluxo, respectivamente). O espectro ESI MS em modo positivo de (C17H19FN3O3)3[RuCl6].3H2O exibiu um pico principal em m/z = 994,6 que foi atribuído ao aduto (ciprofloxacina)3.H+ em fase gasosa, enquanto [Ru(C17H17FN3O3)3].4H2O apresentou picos m/z em 1093,3 e 547,1, atribuídos aos íons [Ru(C17H17FN3O3)3].H+ e [Ru(C17H17FN3O3)3].2H+, respectivamente. Os resultados de análise térmica estão em concordância com os conteúdos de água propostos para as duas substâncias. Os espectros de absorção em meio aquoso são dominados pelas transições da ciprofloxacina na região UV. Não obstante, duas bandas foram observadas em 421 e 496 nm no caso de (C17H19FN3O3)3[RuCl6].3H2O, e atribuídas à transição de transferência de carga e à transição d-d, respectivamente; no caso de [Ru(C17H17FN3O3)3].4H2O, apenas um ombro largo em torno de 450 nm foi observado na região do Visível, tendo sido atribuído à uma transição d-d. O voltamograma cíclico deste complexo exibiu um processo quase-reversível em 0,25 V (versus EPH) enquanto o composto iônico apresentou o mesmo processo em 0,11 V, sugerindo que, neste caso, o íon central de rutênio é estabilizado no estado de oxidação III através da coordenação dos átomos de oxigênio das três unidades de ciprofloxacina. O complexo de coordenação é estável por mais de 48 horas em pH fisiológico, estomacal e intestinal. Ambos foram incubados nas condições estomacais (pH = 1,5 e temperatura = 370C) e não causaram diminuições significativas nos valores de pH. / This work presents the synthesis and characterization of two potential new metallodrugs, the ionic (C17H19FN3O3)3[RuCl6].3H2O and the coordination [Ru(C17H17FN3O3)3].4H2O compounds, by combining ruthenium (III) and the fluoroquinolone ciprofloxacin in different synthetic conditions (acid media or neutral and reflux conditions, respectively). The ESI MS (positive mode) spectrum of the ionic compound displayed a main peak at m/z = 994.6, which was assigned to the gaseous phase adduct (ciprofloxacin)3.H+, while the coordination compound featured peaks at m/z 1093.3 and 547.1 ascribed to the singly and doubly charged ions [Ru(C17H17FN3O3)3].H+ and [Ru(C17H17FN3O3)3].2H+, respectively. Thermal analysis corroborated the proposed water content for both complexes. The absorption spectra of the compounds in aqueous medium are dominated by the ciprofloxacin transitions in the UV region but two bands were observed at 421nm and 496nm for the ionic compound, assigned to a charge transfer and d-d transitions. In the case of the coordination compound only a broad shoulder around 450 nm was observed in the visible region, also assigned to a ligand field transition The cyclic voltammograms of the [Ru(C17H17FN3O3)3] complex exhibited a quasi-reversible process ascribed to the Ru(II) / (III) redox pair at -0.25 V (vs SHE) while compound (C17H19FN3O3)3[RuCl6] displayed this process at -0.11V, showing that the central ruthenium ion is stabilized in the (III) oxidation state by the coordination to the hard oxygen atoms of the ciprofloxacin ligand. The coordination compound is stable under physiological, stomachal and intestinal pH over 48 hours. Both compounds are stable incubated under stomachal conditions (pH=1.5 and 37oC) without significant pH lowering.

O presente estudo visou determinar a prevalência de bactérias Gram-negativas produtoras de produzem b-lactamases de amplo espectro (ESBL) e resistência adquirida a quinolonas mediada por plasmídeos (PMQR) em animais de estimação, investigando o potencial papel destes hospedeiros como portadores assintomáticos. Em 2012, foram coletadas 216 amostras (fezes e saliva) de 108 animais de companhia (29 gatos e 79 cães) abrigados em casas de família, um centro de acolhimento de animais abandonados, e no Centro de Controle de Zoonoses da Cidade de São Paulo. Do total de cepas estudadas, 85% apresentaram fenótipo sugestivo de PMQR; enquanto que 62% dos isolados exibiram um fenótipo característico e sugestivo para produção de ESBL, sendo na sua maioria identificadas como E. coli. Dentre os isolados, 14 carregaram variantes do gene blaCTX-M, 9 foram positivos para o gene blaTEM, e 6 foram positivos para blaSHV. Em relação às cepas resistentes às Q/FQ, 56% (n= 43) foram positivas para a presença do gene qnr, o qual foi identificado em 11 espécies diferentes. Os resultados apresentados demostram que animais de companhia podem ser portadores assintomáticos de cepas produtoras de ESBL e PMQR. / The present study aimed to determine the prevalence of Gram-negative bacteria producing b-lactamases producing broad-spectrum (ESBL) and acquired resistance to quinolones mediated by plasmids (PMQR) in pets, investigating the potential role of these hosts as asymptomatic carriers. In 2012, 216 samples (feces and saliva) of 108 companion animals (29 cats and 79 dogs) housed in shelters or a Zoonosis Control Center were collected from São Paulo city. Of the total strains studied, 85% had a phenotype suggestive for PMQR; while 62 % of the isolates exhibited a characteristic phenotype and suggestive for ESBL-producing genes, with the most identified as E. coli. Among the isolates, 14 carried variants blaCTX -M gene 9 were positive for blaTEM gene, and 6 were positive for blaSHV. Regarding resistant Q/FQ isolates, 56% (n = 43) were positive for the presence of qnr gene, which was identified on 11 different species. The results presented demonstrate that pets can be asymptomatic carriers of ESBL producing strains and PMQR.

Introdução. Quinolonas são antimicrobianos sintéticos que inibem as enzimas DNA-girase e topoisomerase IV resultando na morte bacteriana. São altamente eficazes no tratamento de infecções bacterianas, especialmente causadas por bactérias Gram negativas, e portanto amplamente utilizados na medicina humana e veterinária, na qual também são empregados como profiláticos. Porém, o uso indiscriminado e inadequado levou ao aumento de bactérias resistentes a estes compostos. Esta resistência pode ocorrer devido a mutações nas enzimas DNA-girase e topoisomerase IV, e também por genes contidos em plasmídeos. Estes últimos são os principais responsáveis pela disseminação e circulação da resistência entre o meio ambiente e o ambiente hospitalar. Objetivos. Pesquisar genes de resistência a antimicrobianos do grupo das quinolonas em bactérias Gram negativas de origem clínica e ambiental que apresentam resistência fenotípica a este grupo. Material e Métodos. 73 cepas de Enterobacteriaceae e Aeromonas sp. de origem clínica e ambiental foram selecionadas para o estudo, e avaliadas quanto à sensibilidade aos antimicrobianos do grupo das quinolonas e à pesquisa de genes de resistência a este mesmo grupo e mutações no gene que codifica a enzima DNA-girase por meio de PCR e sequenciamento. Resultados. Das 73 cepas previamente selecionadas para compor o estudo, 65 foram utilizadas, devido à exclusão de perfis clonais similares. Nestas, foram observados os genes, qnrS1 (1,5 por cento ), qnrS2 (26,2 por cento ), qnrB1 (3,1 por cento ), qnrB19 (12,3 por cento ), qnrD1 (1,5 por cento ), aac(6)-Ib-cr (10,8 por cento ), oqxA (43,1 por cento ) e oqxB (41,5 por cento ), e duas variantes determinadas qnrB-like (3,1 por cento ) e qnrB69-like (1,5 por cento ). Os genes qnrA, qnrC e qepA não foram identificados. Mutações na enzima DNA-girase foram observadas em 97,9 por cento das cepas positivas para algum dos genes pesquisados. Em 4 cepas foi possível estabelecer a associação do gene aac(6)-Ib-cr com integron de classe 1. Foi realizado sequenciamento e caracterização do plasmídeo completo onde estava inserido o gene qnrD1. Conclusões. Este estudo relata pela primeira vez no Brasil a ocorrência dos genes qnrS2, oqxA e oqxB, a associação entre o elemento genético integron de classe 1 e o gene aac(6)-Ib-cr, e o gene qnrD1 e a caracterização do plasmídeo completo onde este estava inserido. Os genes qnrB1, qnrB19, e aac(6)-Ib-cr, anteriormente apenas relatados em cepas clínicas, foram observados em cepas ambientais. Os resultados deste estudo mostram alta frequência de genes de resistência a quinolonas tanto em isolados clínicos quanto em isolados ambientais, alertando quanto à disseminação da resistência entre fontes diferentes, e possível manutenção destes genes por cepas ambientais. / Introduction. Quinolones are synthetic antimicrobial agents that inhibit DNA gyrase and topoisomerase IV enzymes resulting in bacterial death. They are highly effective in the treatment of bacterial infections, especially the ones caused by Gram negative bacteria, as well as for prophylaxy. Therefore they are widely used in human and veterinary medicine. However, indiscriminate and improper use led to an increase of bacteria resistance to these compounds. This resistance can be due to mutations in DNA gyrase and topoisomerase IV enzymes and also by genes contained in plasmids, which are mainly responsible for the spread and transmission of resistance between the environment and the hospital set. Objectives. To search for genes of resistance to quinolone antimicrobial agents in Gram-negative bacteria from clinical and environmental strains that present phenotypic resistance to this group. Material and Methods. 73 strains of Enterobacteriaceae and Aeromonas spp., from clinical and environmental origin, were selected for this study, and evaluated for antimicrobial susceptibility of quinolone and search of resistance genes in this same group and also for mutations in the gene encoding the enzyme DNA gyrase by PCR and sequencing. Results. Of the 73 strains previously selected to compose this study, 65 were used, due to the exclusion of similar clonal profiles. In these, genes qnrS1 (1.5 per cent ), qnrS2 (26.2 per cent ) qnrB1 (3.1 per cent ), qnrB19 (12.3 per cent ) qnrD1 (1.5 per cent ) aac(6\')-Ib-cr (10.8 per cent ) oqxA (43.1 per cent ) and oqxB (41.5 per cent ) were observed, and two variants were named as qnrB-like (3.1 per cent ) and qnrB69-like (1.5 per cent ). The qnrA, qnrC and qepA genes were not identified. Mutations in DNA gyrase enzyme were observed in 97.9 per cent of the positive strains for at least one of the genes studied. It was possible to establish the association of aac(6\')-Ib-cr with class 1 integron gene in four strains. Complete sequencing and characterization of plasmid qnrD1, where the gene was inserted, was performed. Conclusions. This study reports, for the first time in Brazil, the occurrence of qnrS2, oqxA and oqxB genes, the association between genetic element integron class 1 gene and the aac (6 \')-Ib-cr, and qnrD1 gene and the characterization of the complete plasmid where this was inserted. qnrB1, qnrB19, and aac(6\')-Ib-cr genes, previously only reported in clinical strains, were observed in environmental strains. The results of this study show a high frequency of quinolone-resistance genes for both clinical and environmental isolates, warning about the spread of resistance through different sources, and the possible maintenance of these genes by environmental strains.

Atividades antropogênicas relacionadas ao uso massivo de antibacterianos tem favorecido para que ambientes aquáticos sejam importantes locais para seleção e/ou disseminação de bactérias multirresistentes (MR). O objetivo do estudo foi monitorar a ocorrência de bactérias MRs em ambientes aquáticos públicos no estado de SP, caracterizando genótipos de resistência adquirida. Foram analisados 50 isolados de bactérias gram-negativas, recuperadas de amostras de água, sendo que 70% dos isolados apresentaram perfil de MR, identificando-se os genes blaCTX-M-2 (n= 5), blaCTX-M-9 (n= 1), blaCTX-M-15 (n= 2), blaKPC-2 (n= 3), qnrB (n= 1), oqxA (n= 3), oqxB (n= 3) e, aac(6)1b-cr (n= 7). Destaca-se a primeira detecção de A. calcoaceticus produtora de KPC-2. Ambientes aquáticos de acesso público podem ser importantes fontes para a disseminação e/ou transmissão de uma ampla variedade de espécies bacterianas MRs tanto para seres humanos como para ecossistemas associados, sendo que a presença de genótipos endêmicos sugere contaminação por esgoto doméstico e/ou hospitalar. / Anthropogenic activities related to the massive use of antibacterial has contributed to the selection and spread of multidrug-resistant (MDR) into the aquatic environment. This study aimed to monitor the occurrence of MDR bacteria in public aquatic environments, in the state of São Paulo, characterizing genotypes of acquired resistance. Of the 50 gram-negative isolates, recovered of water samples, 70% exhibited a MDR profile. Indeed, blaCTX-M-2 (n= 5), blaCTX-M-9 (n= 1), blaCTX-M-15 (n= 2)-, blaKPC-2 (n= 3)-, qnrB (n= 1)-, oqxA (n= 3)-, oqxB (n= 3)- and aac(6)-1b-cr (n = 7) genes were identified. Noteworthy is the first the detection of KPC-2-producing Acinetobacter calcoaceticus. Aquatic environments, with public access, may be important sources for the dissemination and/or transmission of a wide variety of MDR bacterial species to both humans and associated ecosystems. Moreover, the presence of endemic genotypes suggests contamination by domestic and/or hospital sewage.

Atividades antropogênicas relacionadas ao uso massivo de antibacterianos tem favorecido para que ambientes aquáticos sejam importantes locais para seleção e/ou disseminação de bactérias multirresistentes (MR). O objetivo do estudo foi monitorar a ocorrência de bactérias MRs em ambientes aquáticos públicos no estado de SP, caracterizando genótipos de resistência adquirida. Foram analisados 50 isolados de bactérias gram-negativas, recuperadas de amostras de água, sendo que 70% dos isolados apresentaram perfil de MR, identificando-se os genes blaCTX-M-2 (n= 5), blaCTX-M-9 (n= 1), blaCTX-M-15 (n= 2), blaKPC-2 (n= 3), qnrB (n= 1), oqxA (n= 3), oqxB (n= 3) e, aac(6)1b-cr (n= 7). Destaca-se a primeira detecção de A. calcoaceticus produtora de KPC-2. Ambientes aquáticos de acesso público podem ser importantes fontes para a disseminação e/ou transmissão de uma ampla variedade de espécies bacterianas MRs tanto para seres humanos como para ecossistemas associados, sendo que a presença de genótipos endêmicos sugere contaminação por esgoto doméstico e/ou hospitalar. / Anthropogenic activities related to the massive use of antibacterial has contributed to the selection and spread of multidrug-resistant (MDR) into the aquatic environment. This study aimed to monitor the occurrence of MDR bacteria in public aquatic environments, in the state of São Paulo, characterizing genotypes of acquired resistance. Of the 50 gram-negative isolates, recovered of water samples, 70% exhibited a MDR profile. Indeed, blaCTX-M-2 (n= 5), blaCTX-M-9 (n= 1), blaCTX-M-15 (n= 2)-, blaKPC-2 (n= 3)-, qnrB (n= 1)-, oqxA (n= 3)-, oqxB (n= 3)- and aac(6)-1b-cr (n = 7) genes were identified. Noteworthy is the first the detection of KPC-2-producing Acinetobacter calcoaceticus. Aquatic environments, with public access, may be important sources for the dissemination and/or transmission of a wide variety of MDR bacterial species to both humans and associated ecosystems. Moreover, the presence of endemic genotypes suggests contamination by domestic and/or hospital sewage.