A proteína gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) é uma enzima essencial na via da glicólise e da gliconeogênese, catalisando a fosforilação oxidativa do substrato gliceraldeído-3-fosfato em 1,3- bifosfoglicerato na presença de NAD+ e fosfato inorgânico, sendo também capaz de catalisar a reação inversa. A enzima é um homotetrâmero, tendo monômeros com massa de 36 kDa. Além desta atividade, a proteína pode ainda desempenhar outras funções importantes em vários processos celulares. A partir da descrição da expressão diferencial do gene gpdh1 (GAPDH) do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae em condições que mimetizam a infecção, desenvolvemos este estudo para caracterizar a sua possível participação em outros processos celulares. Diversas análises foram realizadas para caracterizar o gene gpdh1 e sua proteína cognata. Os padrões de expressão, tanto em nível transcricional como em nível protéico foram avaliados sob condições de regulação fisiológica, evidenciando um padrão de regulação hierárquico em resposta às diferentes fontes de carbono adicionadas a culturas do fungo. Utilizando 2D-SDS-PAGE, anti-soro anti GAPDH e espectrometria de massas, identificamos isoformas de GAPDH sendo expressas pelo fungo, sendo uma majoritária. Com base nos relatos encontrados na literatura de localização da proteína GAPDH na superfície celular de diferentes patógenos, direcionamos o trabalho no sentido de verificar a localização sub-celular da GAPDH em Metarhizium. Utilizando técnicas de imuno-microscopia, mostramos a localização na superfície celular dos diferentes estágios de desenvolvimento do fungo. Mostramos também que a GAPDH localizada na superfície celular mantém a sua atividade enzimática. Utilizando ensaios de adesão de conídios de M. anisopliae em asas de insetos (Dysdercus peruvianus), mostramos que a GAPDH pode desempenhar uma função importante no processo de adesão do fungo na superfície do hospedeiro. Este trabalho descreve pela primeira vez a presença de isoformas de GAPDH, a sua localização na superfície celular e sua possível participação na adesão ao hospedeiro. / GAPDH is essential in glycolysis and gluconeogenesis pathways and catalyzes the oxidative phosphorylation of glyceraldehyde-3-phosphate into 1,3- biphosphoglycerate in the presence of nicotinamide adenine nucleotide (NAD+) and inorganic phosphate, as well as the reverse reaction. The enzyme is an homotetramer of 36 kDa subunits. GAPDH has other important roles in various cellular processes. The gene gpdh1 (GAPDH) was found to display differential expression during growth of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae cultured in conditions mimicking host infection. This led us to search for other possible functions of the GAPDH in the fungus. Therefore, we characterized the expression patterns of GAPDH, both at the transcription and protein level; we characterized isoforms of the protein; we immunolocalized GAPDH in different cell types and assayed its participation in adhesion to host surface. The expression of transcripts and GAPDH is hierarchily regulated by the carbon source available in the cultures (glucose, glycerol, ethanol and complex substrates, such as chitin and cuticle). By using 2D-SDS-PAGE, anti- GAPDH serum and mass spectrometry, isoforms of the protein were detected. As GAPDH has been reported at cell surface of pathogenic microorganisms, we directed efforts to localize GAPDH in Metarhizium. By using immunomicroscopy we showed the presence of GAPDH at the surface of the different developmental cell types of the fungus. We have also shown that the GAPDH at cell surface has enzyme activity. In adhesion assays, using Metarhizium conidia and insect wings (Dysdercus peruvianus), we showed that the GAPDH may be important during the adhesion step of the fungus to the host during infection. In this work, for the first time, we show that GAPDH from Metarhizium anisopliae has isoforms; that the active GAPDH is present at the fungal cell surface and is probably important for fungal to host adhesion.

Made available in DSpace on 2011-12-27T14:14:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 000421417-0.pdf: 1029774 bytes, checksum: b13be7b63536734c3e35db63b16fc0db (MD5) license.txt: 581 bytes, checksum: 44ea52f0b7567232681c6e3d72285adc (MD5) / Concerning the necessity of form and function restoration from bone structures which had been lost through pathologies, traumas or iatrogenicity has been widely studied. The researches have been trying to develop new materials in order to recover or maintain the bone volume as well as quality into regions which have lost their proper anatomic conformations, being biomaterials the most suitable ones as a viable alternative as bone substitutes. β- tricalcium phosphate granule (β-TCP) is an inorganic composite which combines active biodegradability with osteoconductivity properties. The present study aims to develop a histological descriptive analysis on the repair of bone defects filled with β-TCP associated to pure titanium implants into cavities prepared in the calvarium bone of rats. Eighteen male adult rats were randomly selected and divided into three groups of six rats each, according to their period of death: 15, 30 and 60 days. Four bone defects were made into the calvarium bone of the rats and filled with: (a) β-TCP, (b) clot, (c) β-TCP + pure titanium screw and (d) pure titanium screw. The samples were cut and histologically evaluated. The analysis moved through the presence and volume of connective tissue and newly formed bone, as well as the presence or absence of remaining material (β-TCP) into the defect. It was verified an acceleration of the new bone formation process in the presence of β-TCP. The results suggest the biocompatibility and osteoconductivity of the biomaterial, even when associated to pure titanium implantes. / A necessidade de restabelecimento da forma e da função de estruturas ósseas perdidas por patologias, traumas ou iatrogenias tem sido amplamente estudada. As pesquisas têm procurado desenvolver novos materiais com o intuito de recuperar ou manter volume e qualidade óssea em regiões que perderam suas conformações anatômicas adequadas, sendo os biomateriais uma alternativa viável como substitutos ósseos. O grânulo β- trifosfato de cálcio (β-TCP) é um composto inorgânico que combina a propriedade de biodegradabilidade ativa com a osteocondutividade. O presente trabalho tem como objetivo fazer uma análise histológica descritiva do reparo de defeitos ósseos preenchidos com β-TCP associado a implantes de titânio puro, em cavidades confeccionadas em calotas cranianas de ratos. Foram selecionados randomicamente 18 ratos, machos adultos e a seguir divididos em três grupos de seis ratos cada, de acordo com o período de morte: 15, 30 e 60 dias. Na calota craniana de cada rato foram confeccionados quatro defeitos ósseos preenchidos com: (a) β-TCP, (b) coágulo, (c) β-TCP + parafuso de titânio puro e (d) parafuso de titânio puro. As amostras foram cortadas e avaliadas histologicamente. Foi analisada a presença e volume de tecido conjuntivo frouxo e de tecido ósseo imaturo, bem como a presença ou ausência de material remanescente (β-TCP) no defeito. Verificou-se a aceleração do processo de neoformação óssea na presença do β- TCP. Os resultados sugerem a biocompatibilidade e osteocondutividade do biomaterial, mesmo quando associado a implantes de titânio puro.

Neste trabalho, a influência da incorporação de inibidores de oxidação a base de fosfatos ácidos de alumínio na resistência a oxidação de grafites naturais foi avaliada em função do seu teor e da sua razão molar P:Al, através de análise termogravimétrica dinâmica e isotérmica, em uma atmosfera de O2 99,9%. Inibidores de oxidação a base de fosfatos ácidos de alumínio com razões molares P:Al de 1:1, 3:1, 9:1, 12:1 e 23:1 foram produzidos através da reação entre ácido fosfórico e hidróxido de alumínio, e incorporadas em dois tipos diferentes de grafites naturais em flocos. O comportamento térmico e estrutural do inibidor puro e das amostras de grafite contendo o inibidor incorporado foi avaliado através de ensaios termogravimétricos, e por técnicas analíticas como espectroscopia Raman, espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier, difração de raios X, e microscopia eletrônica de varredura. A energia de ativação aparente foi determinada através de ensaios termogravimétricos isotérmicos para a avaliação do mecanismo de inibição da oxidação. Os resultados mostraram uma relação entre o teor de inibidor incorporado e o aumento da temperatura para inicio do processo de oxidação (temperatura onset) das amostras avaliadas. Este comportamento é atribuído ao bloqueio físico dos sítios ativos para quimisorção de oxigênio por uma camada de fosfato de alumínio, e ao envenenamentode sítios ativos por compostos de fósforo presentes no inibidor. A ação de um mecanismo de bloqueio dos sítios ativos pode ser visto também através do aumento da energia de ativação aparente para o início do processo de oxidação. A taxa de oxidação é significativamente reduzida em temperaturas de até 1000ºC, porém o efeito inibitório cessa em temperaturas superiores a esta. A análise do comportamento térmico do inibidor mostra uma mudança química e estrutural que ocorre nesta faixa de temperaturas, que pode ser responsável pela cessão do efeito inibitório. É atribuída à transformação do metafosfato Al(PO3)3 para o ortofosfato AlPO4, com consequente liberação de P2O5, o mecanismo responsável pelo término do efeito inibitório de oxidação. / In this thesis, the influence of oxidation inhibitors based on acid aluminum phosphate in oxidation resistance of natural graphites was evaluated in terms of its content and P: Al molar ratio through dynamic and isothermal thermogravimetric analysis in an O2 99.9%.atmosphere test. Oxidation inhibitors based in acid aluminum phosphates with P:Al molar ratio of 1:1, 3:1, 9:1, 12:1 and 23:1 were synthesized by reacting phosphoric acid and aluminum hydroxide, and mixing the inhibitor with two different grades of natural graphite flakes. The thermal and structural behavior of pure inhibitor, and the graphite mixed with inhibitor, were evaluated by thermal analysis and other analytical techniques like Raman Spectroscopy, Fourier-transformed Infrared Spectroscopy, X-ray Diffraction e Scanning Electron Microscopy. The apparent activation energy was measured by isothermal thermogravimetric analysis for oxidation inhibition mechanism evaluation. The results show a relationship between the inhibitor content and the increase of oxidation start temperature (onset temperature) in the evaluated samples. That behavior are attributed to blocking the active sites for O2 chemisorption by a aluminum phosphate layer, and the poisoning of active sites by phosphorus compounds coming from the inhibitor. The active site blocking mechanism can be seen through an increase of apparent activation energy for oxidation. The oxidation rate is significantly reduced up to 1000ºC, but the inhibition effect stops at higher temperatures. The thermal and spectroscopic analysis of oxidation inhibitor show a chemical and structural change that can be related to the end of inhibitory effect in temperatures higher than 1000ºC. The transformation of metaphosphate Al(PO3)3 to a orthophosphate AlPO4, with gaseous P2O5 emission, is attributed to the end of oxidation inhibition effect.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2007. / Submitted by wesley oliveira leite (leite.wesley@yahoo.com.br) on 2009-10-16T19:31:17Z No. of bitstreams: 1 Tese_Monica Santiago Barbosa.pdf: 382811 bytes, checksum: 4328a0b06b613d225acef72a46b938f6 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2009-10-20T15:42:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_Monica Santiago Barbosa.pdf: 382811 bytes, checksum: 4328a0b06b613d225acef72a46b938f6 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-10-20T15:42:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Monica Santiago Barbosa.pdf: 382811 bytes, checksum: 4328a0b06b613d225acef72a46b938f6 (MD5) Previous issue date: 2007 / Paracoccidioides brasiliensis é um importante patógeno humano que causa a paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica com ampla distribuição na América Latina. A adesão e a invasão de células são eventos essenciais envolvidos na infecção e disseminação do patógeno. Além disso, patógenos utilizam suas moléculas de superfície para se ligar a componentes da matriz extracelular para estabelecer a infecção. Uma proteína antigênica de P. brasiliensis foi isolada de gel de eletroforese bidimensional de proteínas totais do fungo e caracterizada. Peptídeos foram obtidos da proteína de 36 kDa e pI 6.8 e mostraram homologia com gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH: EC 1.2.1.12) de diversos organismos. O cDNA completo e o gene que codificam para PbGAPDH foram obtidos e ambos contém uma ORF que codifica para uma proteína com 338 aminoácidos que apresenta todos os peptídeos caracterizados na PbGAPDH nativa. O gene Pbgapdh contém 5 exons interrompidos por 4 introns. Análises realizadas com a PbGAPDH deduzida sugerem sua utilidade em prover relações filogenéticas, como também evidenciaram a correlação entre a filogenia e as posições dos introns nos genes cognatos. A expressão de Pbgapdh foi analisada e uma única espécie de mRNA de 2.0 Kb, preferencialmente expressa na fase leveduriforme de P. brasiliensis foi detectada em concordância com os altos níveis de expressão da proteína. A proteína recombinante GAPDH foi utilizada para produção de anticorpo policlonal em coelho. Por microscopia imunoeletrônica e análises por Western blot, foi detectada a presença da GAPDH, na parede celular de leveduras de P. brasiliensis e no citoplasma. A GAPDH recombinante foi capaz de se ligar a fibronectina, laminina e colágeno do tipo I. Uma observação importante, é que tanto o tratamento de P. brasiliensis com anticorpo anti-GAPDH, quanto de pneumócitos tratados com a GAPDH recombinante, promoveram a inibição da aderência e internalização de P. brasiliensis à células cultivadas in vitro (pneumócitos). Essas observações indicam que a GAPDH possivelmente contribui para a adesão do microrganismo aos tecidos do hospedeiro e para a disseminação da infecção. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Paracoccidioides brasiliensis, an important human pathogen causing paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis with broad distribution in Latin America. Adhesion to and invasion of host cells are essential steps involved in the infection and dissemination of pathogens. Furthermore, pathogens use their surface molecules to bind to host extracellular matrix components to establish infection. An adhesin of P. brasiliensis was isolated from gel after two dimensional electrophoresis and characterized. Endoproteinase Lys-C-digest peptides of the purified protein, which presented a molecular mass of 36 kDa and pI 6.8, were subjected to sequence analysis of their amino acids, that revealed strong homology to glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH: EC 1.2.1.12) from several sources. The complete cDNA and gene encoding PbGAPDH were obtained and both contained an open reading frame predicted to encode a 338 amino acid protein that presented all the peptides characterized in the native PbGAPDH. The Pbgapdh gene contained 5 exons interrupted by 4 introns. Analysis performed with the deduced PbGAPDH suggested its usefulness in providing phylogenetic relatedness, as well as evidenced the correlation between the phylogeny provided by the deduced proteins and introns positions in the cognate genes. The expression of Pbgapdh was analyzed and a single species of mRNA, of 2.0 Kb, preferentially expressed in the yeast parasitic phase of P. brasiliensis, was detected in agreement to the high levels of the GAPDH expression in the yeast cells of P. brasiliensis. The purified recombinant GAPDH was used to produce policlonal antibody in rabbit. By immunoelectron microscopy and Western blot analysis, GAPDH was detected in the cell wall and the cytoplasm of the yeast phase of P. brasiliensis. The recombinant GAPDH was found to bind to fibronectin, laminin, and type I collagen in ligand far-Western blot assays. Of special note, the treatment of P. brasiliensis yeast cells with anti-GAPDH polyclonal antibody and the incubation of pneumocytes with the recombinant protein promoted inhibition of adherence and internalization of P. brasiliensis to those in vitro cultured cells. These observations indicate that GAPDH could be contribute to the adhesion of the microorganism to host tissues and to the dissemination of infection.

A proteína gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) é uma enzima essencial na via da glicólise e da gliconeogênese, catalisando a fosforilação oxidativa do substrato gliceraldeído-3-fosfato em 1,3- bifosfoglicerato na presença de NAD+ e fosfato inorgânico, sendo também capaz de catalisar a reação inversa. A enzima é um homotetrâmero, tendo monômeros com massa de 36 kDa. Além desta atividade, a proteína pode ainda desempenhar outras funções importantes em vários processos celulares. A partir da descrição da expressão diferencial do gene gpdh1 (GAPDH) do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae em condições que mimetizam a infecção, desenvolvemos este estudo para caracterizar a sua possível participação em outros processos celulares. Diversas análises foram realizadas para caracterizar o gene gpdh1 e sua proteína cognata. Os padrões de expressão, tanto em nível transcricional como em nível protéico foram avaliados sob condições de regulação fisiológica, evidenciando um padrão de regulação hierárquico em resposta às diferentes fontes de carbono adicionadas a culturas do fungo. Utilizando 2D-SDS-PAGE, anti-soro anti GAPDH e espectrometria de massas, identificamos isoformas de GAPDH sendo expressas pelo fungo, sendo uma majoritária. Com base nos relatos encontrados na literatura de localização da proteína GAPDH na superfície celular de diferentes patógenos, direcionamos o trabalho no sentido de verificar a localização sub-celular da GAPDH em Metarhizium. Utilizando técnicas de imuno-microscopia, mostramos a localização na superfície celular dos diferentes estágios de desenvolvimento do fungo. Mostramos também que a GAPDH localizada na superfície celular mantém a sua atividade enzimática. Utilizando ensaios de adesão de conídios de M. anisopliae em asas de insetos (Dysdercus peruvianus), mostramos que a GAPDH pode desempenhar uma função importante no processo de adesão do fungo na superfície do hospedeiro. Este trabalho descreve pela primeira vez a presença de isoformas de GAPDH, a sua localização na superfície celular e sua possível participação na adesão ao hospedeiro. / GAPDH is essential in glycolysis and gluconeogenesis pathways and catalyzes the oxidative phosphorylation of glyceraldehyde-3-phosphate into 1,3- biphosphoglycerate in the presence of nicotinamide adenine nucleotide (NAD+) and inorganic phosphate, as well as the reverse reaction. The enzyme is an homotetramer of 36 kDa subunits. GAPDH has other important roles in various cellular processes. The gene gpdh1 (GAPDH) was found to display differential expression during growth of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae cultured in conditions mimicking host infection. This led us to search for other possible functions of the GAPDH in the fungus. Therefore, we characterized the expression patterns of GAPDH, both at the transcription and protein level; we characterized isoforms of the protein; we immunolocalized GAPDH in different cell types and assayed its participation in adhesion to host surface. The expression of transcripts and GAPDH is hierarchily regulated by the carbon source available in the cultures (glucose, glycerol, ethanol and complex substrates, such as chitin and cuticle). By using 2D-SDS-PAGE, anti- GAPDH serum and mass spectrometry, isoforms of the protein were detected. As GAPDH has been reported at cell surface of pathogenic microorganisms, we directed efforts to localize GAPDH in Metarhizium. By using immunomicroscopy we showed the presence of GAPDH at the surface of the different developmental cell types of the fungus. We have also shown that the GAPDH at cell surface has enzyme activity. In adhesion assays, using Metarhizium conidia and insect wings (Dysdercus peruvianus), we showed that the GAPDH may be important during the adhesion step of the fungus to the host during infection. In this work, for the first time, we show that GAPDH from Metarhizium anisopliae has isoforms; that the active GAPDH is present at the fungal cell surface and is probably important for fungal to host adhesion.

A enzima indol-3-glicerol fosfato sintase (IGPS) catalisa a formação irreversível do anel do composto 1-o-carboxifenilamino desoxiribulose-5-fosfato (CdRP), através de uma decarboxilação e de uma desidratação, liberando o composto indol-3-glicerol fosfato (IGP), o quinto passo na via de biossíntese do triptofano. Neste trabalho, é descrita a clonagem, expressão, purificação e caracterização cinética da IGPS, além da identificação de um intermediário reacional. Para a realização destes estudos, o substrato da enzima (CdRP) foi sintetizado quimicamente, purificado e caracterizado espectroscopicamente e espectrometricamente. A fluorescência do CdRP mostrou-se dependente de pH, possivelmente devido ao efeito de transferência intramolecular de prótons no estado excitado (ESIPT). Efeitos de temperatura foram analisados, indicando uma energia de ativação de 8.4 kcal mol-1 para a reação catalisada pela IGPS. Efeitos isotópicos de solvente mostraram que a transferência de próton é apenas modestamente limitante para a reação, e estudos de inventário de prótons demonstraram que apenas um próton é responsável pelo efeito isotópico de solvente observado. Perfis de pH foram realizados para avaliar a presença de catálise ácido-base, mostrando que um resíduo desprotonado de pKa aparente igual a 6.0 é necessário para a catálise e que um resíduo com pKa aparente igual a 6.8 é necessário para a ligação do CdRP. Sugerimos que ambos os pKa estejam reportando para um mesmo resíduo, que poderia ser um glutamato conservado em todas as IGPS caracterizadas até o presente. Um modelo é proposto para explicar o ESIPT, assim como uma seqüência cinética baseada nos perfis de pH. Para identificar possíveis intermediários reacionais, a técnica de ESI-MS foi empregada para estudar a reação catalisada pela IGPS, e um intermediário químico foi interceptado e caracterizado. / The enzyme indole-3-glycerol phosphate synthase (IGPS) catalyzes the irreversible ring closure of 1-o-carboxyphenylamino deoxyribulose-5-phosphate (CdRP), through a decarboxylation and a dehydration, releasing indole-3-glycerol phosphate (IGP), the fifth step in the biosynthesis of tryptophan. In the present work, we describe cloning, expression, purification, and kinetic characterization of IGPS. In order to perform kinetic studies, CdRP was chemically synthesized, purified, and espectroscopically and spectrometrically characterized. CdRP fluorescence was pH-dependent, probably owing to excited-state intramolecular proton transfer (ESIPT) effect. Temperature effects were analyzed, indicating an activation energy of 8.4 kcal mol-1 for the IGPS catalyzed reaction. Solvent isotope effects showed that a proton transfer is only modestly limiting for the reaction, and proton inventory studies pointed to a single proton responsible for the observed solvent isotope effect. pH-rate profiles were carried out to probe for acid/base catalysis, showing that a deprotonated residue with an apparent pKa of 6.0 is required for catalysis and a deprotonated residue with an apparent pKa of 6.8 is necessary for CdRP binding. It was suggested that both apparent pKa report on the same residue, which might be a glutamate conserved amongst all IGPS characterized so far. A model is proposed to explain the ESIPT, and a kinetic sequence is suggested based on the pH-rate profiles. ESIMS was employed to identify possible chemical intermediates of the IGPS catalyzed reaction, and one chemical intermediate was intercepted and characterized.

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-03-12T14:44:36Z No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Clarissa de França Oliveira Silva.pdf: 1540230 bytes, checksum: 96a55739b70a00b546e928e6e76833d8 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-12T14:44:36Z (GMT). No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Clarissa de França Oliveira Silva.pdf: 1540230 bytes, checksum: 96a55739b70a00b546e928e6e76833d8 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2014-02-26 / FACEPE / As micorrizas arbusculares (MAs) são simbioses mutualistas, formadas entre fungos do Filo Glomeromycota e as raízes da maioria das plantas. Para o hospedeiro vegetal essas associações proporcionam maior disponibilidade de nutrientes minerais e resistência contra patógenos, entre outros benefícios. O tomateiro é uma solanácea herbácea com ampla capacidade adaptativa, sendo o Brasil um dos maiores produtores mundiais. Essa cultura vem sendo utilizada como modelo vegetal para o estudo da regulação micorrízica, em alternativa à Arabdopsis thaliana, pois possui ciclo de vida curto e genoma relativamente pequeno (950Mb), além disso são facilmente micorrizáveis. O estabelecimento das MAs envolve uma série de eventos bioquímicos e moleculares regulados por ambos simbiontes, ainda não totalmente esclarecidos. O estudo da expressão gênica em raízes colonizadas permitirá melhor compreensão dos mecanismos envolvidos no desenvolvimento da simbiose, contribuindo para melhor aplicabilidade desta. O objetivo deste trabalho foi analisar a expressão diferencial dos genes Chi3, BGL2, CAT2 e APX1, envolvidos na resposta de defesa do tomateiro em função da colonização com Glomus etunicatum e do nível de P no solo, através de RT-qPCR. Plântulas de tomateiro foram transferidas para sacos de polietileno com areia e vermiculita esterilizadas e inoculadas com G. etunicatum. O delineamento experimental consistiu de tratamentos com e sem inoculação e solução nutritiva com 3 níveis de fósforo (3, 8 e 15 mg/dm³). As raízes foram coletadas 8, 15 e 30 dias após a inoculação (d.a.i.) para análise do percentual de colonização e expressão gênica. Apesar da presença de estruturas micorrízicas na maioria das amostras, os percentuais de colonização foram menores aos 8 d.a.i. e aumentaram ao longo do tempo de cultivo, atingindo o máximo aos 30 d.a.i. Sabe-se que o teor de P é de grande importância para o estabelecimento das micorrizas, nesse sentido, os maiores valores de colonização foram encontrados nas amostras com baixa concentração de P na solução nutritiva aplicada, enquanto que no tratamento com alto nível de P a colonização foi reduzida ou inibida. Os primers para amplificação dos genes BGL2, CAT2 e APX1 não foram eficientes nas reações de RT-qPCR e por isso estes genes não puderam ser validados no presente trabalho. Entretanto, os ensaios para o alvo Chi3 foi eficiente e mostrou-se adequado para o experimento. A análise da expressão gênica mostrou que o gene Chi3 sofreu influência da concentração de fósforo e tempo de micorrização (T0, T1, T2). Dessa forma, as amostras cultivadas em condições de baixo fósforo, tiveram a expressão da quitinase aumentada na primeira semana de cultivo e reduzida nas semanas seguintes, indicando que durante os primeiros estágios da micorrização pode haver uma indução temporária desse gene de defesa seguido de supressão após o reconhecimento entre os simbiontes. Entretanto, apenas na primeira semana a variação de P interferiu no acúmulo de transcritos da quitinase. A análise da expressão de genes que codificam enzimas do sistema defensivo vegetal é necessária para compreensão dos mecanismos do desenvolvimento da micorriza arbuscular. Assim, os dados obtidos neste trabalho fornecerão subsídios para um melhor entendimento do papel de genes de defesa nesta simbiose.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:51:22Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3089_1.pdf: 770384 bytes, checksum: 9c54cc6a2a126071254fd185f79c29bd (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As colagenases são enzimas, obtidas a partir de procariotos e eucariotos, que clivam a cadeia protéica do colágeno em pH e temperatura fisiológicos. Estas enzimas são empregadas em diversas aplicações industriais com destaque para a indústria farmacêutica, onde são aplicadas no tratamento médico de feridas, cicatrizes e queimaduras. A proposta para a utilização do sistema de duas fases aquosas (SDFA) é devido à alta relação custo-benefício, baixa tensão interfacial, fácil escalonamento e a sua capacidade de purificar uma proteína em um ambiente rico em água (80-90%), o que favorece a estrutura protéica e retém assim a sua atividade biológica após purificação. Este trabalho visa à purificação de colagenase produzida por Penicillium aurantiogriseum (URM-4622) utilizando SDFA PEG/fosfato. O planejamento experimental (23) foi usado para selecionar as variáveis significativas no processo de purificação, e a massa molar do PEG (MMPEG), concentração do PEG (CPEG) e concentração do fosfato (CFOS) foram as variáveis estudadas. O sistema de duas fases aquosas foi composto de PEG 550, 1500 e 4000 g/mol nas concentrações de 15, 17,5 e 20% (m/m) e concentrações de fosfato de 12,5, 15 e 17,5% (m/m). As variáveis de resposta escolhidas foram: coeficiente de partição (K), rendimento de atividade (Y) e fator de purificação (PF). Os dados e gráficos obtidos passaram por análise estatística. Observou-se que PEG de massa molar 550 (g/mol) em concentração de 20% (p/p), concentração de fosfato 17,5% (p/p) e pH 6.0 foram as melhores condições para purificação de colagenase. Estas condições geraram um coeficiente de partição de 1,01, um rendimento de atividade de 242% e fator de purificação de 23,5. Os resultados mostraram que SDFA foi seletivo para colagenase e esta enzima particionou para a fase rica em polímero

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:53:51Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5170_1.pdf: 2978125 bytes, checksum: 5a4a114e14e6f5c51a7242ab56c46d7d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2005 / Biocerâmicas de fostato de cálcio são importantes na Odontologia e na Medicina, no tocante aos processos de cárie e cálculo dentais, de preenchimento de feridas ósseas e de recobrimento de implantes metálicos. Este trabalho visa aprimorar o estudo da formação dessas biocerâmicas em modelos in situ de cárie dental em humanos. Aqui relatamos a formação concomitante de cárie e cálculo (biocerâmica de fosfato de cálcio) dentais em modelo in situ de cárie em intervalos de 2-14 dias, mostrando o potencial de se trabalhar com intervalos relativamente curtos de tempo para formar o cálculo dental. Estudando a fluorescência do cálculo dental, revelamos que sua fluorescência em soluções aquosas (em função da concentração de hidrogênio) é similar à da hematoporfirina, e que a fluorescência do cálculo dental sólido se assemelha mais com a de soluções com alta contração de hidrogênio, nas quais hematoporfirina bivalente é o principal cromóforo. Para aprimorar a análise do efeito da formação das biocerâmicas no esmalte dental, um modelo matemático, que conseguiu, pela primeira vez, apresentar consistência entre dados quantitativos teóricos e experimentais da birrefringência do esmalte ao microscópio de luz polarizada, foi proposto. Este modelo tem ampla aplicação na biologia do esmalte por poder analisar os conteúdos mineral, orgânico e de água

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:07:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo7522_1.pdf: 5933650 bytes, checksum: 67538ab6283f02a5a412916ad36eaa6e (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2007 / Agência Nacional do Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis / Os ostracodes cretáceos marinhos ocorrem de forma relativamente abundante nas bacias sedimentares marginais brasileiras, e estão sendo alvo de diversos trabalhos que permitirão estudos mais acurados em paleoecologia, interpretações paleoambientais, paleobigeografia e na bioestratigrafia. Neste trabalho foram estudados ostracodes marinhos de vinte amostras do testemunho IG03PE do Projeto Fosfato (CPRM) localizado na cidade de Igarassu-PE, no intervalo de transição entre a Formação Itamaracá e Gramame. O material também foi descrito do ponto de vista faciológico, contribuindo com as interpretações paleoambientais juntamente com os ostracodes que foram identificados, descritos e ilustrados. A faciologia foi feita de modo a discutir as formações Itamaracá e Gramame no testemunho, assim como suas respectivas relações com a microfauna das amostras analisadas. Na Formação Itamaracá foram individualizadas quatro fácies com altos valores de raio gama representando as camadas ricas em fosfato (A1, A2, A3 e C1), caracterizadas por siliciclastos com cimento dolomítico, variando das fácies A1 a A3 de arenitos grossos a finos e a fácies C1 que representa um wackstone. Na Formação Gramame foi identificada apenas uma fácies caracterizada por um mudstones/wackstones, bastante bioturbado. Foram identificadas 12 espécies, do total de 178 espécimes, todas pertencentes à Formação Gramame, na Formação Itamaracá não foi encontrado ostracode marinho. A maioria dos exemplares classificados pertence ao gênero Cytherella representando sete tipos diferentes de espécies, sendo a Cytherella aff. ovoidea mais abundante. Além destes ocorrem também Paracosta, Loxoconch, Protobutonia e Cythereis ? como formas mais raras. A presença dos ostracodes, associados aos outros microfósseis principalmente foraminíferos, forneceram dados paleoecológicos, paleoambientais e bioestratigráficos, que sugerem que as camadas fosfáticas da Formação Itamaracá foram depositadas em um ambiente marinho raso de alta energia, de idade Maastrichtiana, estando o nível do mar aumentando relativamente até a transição com a Formação Gramame. A Formação Gramame é constituída por uma fauna exclusivamente marinha, cuja associação microfossílifera indica um ambiente marinho relativamente profundo de zona nerítica externa de idade Maastrichtiana superior