Orientadores: Eduardo Galembeck, Carmen Verissima Ferreira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-15T15:43:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Milani_Renato_M.pdf: 4434069 bytes, checksum: f6dd6ae86e6b3ac6b79f8c4b28828a91 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A atividade de proteínas quinases é responsável pela regulação de muitos processos biológicos através de cascatas de sinalização que levam a diferentes efeitos celulares. No entanto, a análise da reação de fosforilação reversível catalisada por estas enzimas e prejudicada pela complexidade inerente as interações entre proteínas neste sistema de sinalização. Consequentemente, o foco em uma única proteína quinase pode não ser suficiente para revelar completamente os mecanismos por trás dos fenótipos observados. Nesse sentido, em conjunto com outras técnicas de análise em larga-escala como chips de expressão de mRNA, arranjos de peptídios contendo substratos de proteínas quinases vem sendo cada vez mais utilizados por pesquisadores. No entanto, a falta de uniformidade na análise estatística desses chips tem sido um grande empecilho à obtenção de dados relevantes com o uso dessa técnica. Por conta disso, o objetivo desse trabalho foi desenvolver uma metodologia, chamada de PepMatrix, capaz de aplicar estatística básica de forma automatizada visando a seleção de replicações com baixa variabilidade e a obtenção da anotação das proteínas envolvidas nos eventos de fosforilação ocorridos no chip. Esse novo método foi aplicado em vários conjuntos de dados de diferentes experimentos biológicos e seus resultados revelaram atividades quinásicas significativamente alteradas, muitas das quais tiveram confirmação por Western blot. Alem disso, os resultados ressaltaram a importância da análise sistêmica dos eventos de sinalização celular em conjunto com uma análise crítica das replicações. O alto grau de uniformidade analítica obtido por esse método faz com que ele seja uma poderosa e confiável ferramenta na análise quinômica em larga-escala / Abstract: The activity of protein kinases governs many biological processes through signaling cascades that lead to distinct outputs, from homeostasis to disease. However, analysis of the reversible phosphorylation perpetrated by these enzymes is hindered by the inherent complexity of interactions in this signaling system. Consequently, focusing on a single kinase may not be enough to completely unfold the mechanisms behind observed phenomena. In this sense, together with other omics approaches like mRNA expression analysis, peptide arrays have shown increasing popularity, particularly ones containing kinase substrate sequences. The lack of uniformity in statistical analysis of these chips, though, has been a major issue for the field. In this paper, we propose PepMatrix, a fast and accurate method for selecting so called "reliable replicate spots" and automatically retrieving differential activity and annotation information about phosphorylation events identified in a peptide array of kinase substrates. Here, we present several cases where this new methodology was applied to biological datasets. We successfully identified putative up and down-regulated kinases, many of which were confirmed to have altered activity by Western blot. Moreover, the results emphasized the need for a true systems biology approach to the cellular signaling events alongside a critical replicate selection method. The high degree of analysis uniformity we achieved with this method provides a powerful and reliable addition for high-throughput kinome analysis / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Aldo Focesi Junior / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-18T01:57:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sekino_Tomhiko_D.pdf: 3085443 bytes, checksum: 87b6f74de5af9f66fb79a337fbe20342 (MD5) Previous issue date: 1974 / Resumo: Não informado / Abstract: Not informed / Doutorado / Doutor em Ciências

As quinases dependentes de ciclinas são proteínas que podem ser divididas de acordo com a sua atuação no ciclo celular ou no controle transcricional, elas se tornam ativas em determinadas etapas do ciclo celular dependendo do seu grau de fosforilação e de sua ligação com ciclinas e proteínas inibitórias, e exercem sua função fosforilando outras proteínas envolvidas no ciclo de divisão celular e transcrição influenciando suas atividades, garantindo que cada processo do ciclo ocorra em uma sequência ordenada. A CDK13 faz parte da família de proteínas quinases dependentes de ciclina, pode se ligar a ciclinas do tipo L ou K, regula os eventos de \"splicing\" alternativo, e interage com a proteína Tat do vírus HIV atuando como um possível fator de restrição, sendo que sua superexpressão diminui a produção de algumas proteínas virais suprimindo a produção do vírus. O DNA referente à CDK13 é replicado em células cancerosas, principalmente dos tipos hepático e cólon e reto, sendo um alvo para inibidores para tratamento de câncer. A fim de contribuir para o estudo dessa proteína, o projeto tem como objetivo expressá-la utilizando métodos de tecnologia de DNA recombinante. A sequência de DNA referente à CDK13 foi amplificada pela reação em cadeia da polimerase, após sua purificação, foi inserida no vetor pCR-Blunt e clonada em células de E. coli DH5α competentes. Porém, o DNA não foi liberado pela reação com as enzimas de restrição BamHI e NdeI. As bactérias Rosetta(DE3) transformadas com um plasmídeo sintético e crescidas em meio de auto-indução expressaram a CDK13. Após lise celular e purificação em coluna de Ni2+, a proteína foi detectada por Western Blot. Já as bactérias Rosetta(DE3) transformadas com o plasmídeo sintético modificado (o qual compreende a região do DNA que expressa o bolsão de ligação da CDK13), e induzidas em meio LB expressaram a CDK13, porém não foi possível purificá-la em coluna de afinidade ao Ni2+. / The cyclin-dependent kinases are proteins that can be classified by their function in the cell cycle or transcriptional control. They are activated in particular steps of the cell cycle depending on their phosphorylation degree, cyclin binding and inhibitory proteins. They act phosphorylating other proteins involved in the cell cycle and transcriptional control, influencing in their activities, ensuring that each step of the cell cycle occur in an ordered sequence. The CDK13 is one of the cyclin-dependent kinases family member, it can bind to L or K cyclins, regulates the alternative splicing and interact with HIV Tat protein, acting as a possible restriction factor, its overexpression decreases the production of some viral proteins, and suppresses the virus production. The DNA corresponding to CDK13 is replicated in cancer cells, mainly of hepatic and colon rectal types; therefore it is a target for inhibitors for cancer therapy. In order to contribute for the studies of this protein, the goal of the project is to express it using methods of recombinant DNA technology. The DNA sequence corresponding to CDK13 was amplified by polymerase chain reaction, after its purification, it was inserted to pCR-Blunt vector and cloned into E. coli DH5α competent cells. However, the DNA wasn\'t released by the BamHI and NdeI restriction enzymes. The Rosetta(DE3) cells transformed with a synthetic plasmid pET28a::CDK13 and grown in auto-induction media expressed the CDK13. After cell lysis and purification by Ni2+ affinity colum, the protein was identified by Western Blot. However, the Rosetta(DE3) cells transformed with the modified synthetic plasmid (that comprehends the DNA region which expresses the binding pocket region) induced in LB media, expressed the CDK13. Yet, it wasn\'t possible to purify the protein in the Ni2+ affinity column.

As proteínas fosfatases desempenham um papel fundamental na modificação pós-traducional reversível de proteínas por fosforilação, ao atuarem na remoção do grupo fosforil estável de resíduos de serina, treonina e tirosina. Embora predominem em eucariotos, as serina/treonina fosfatases (STPs) também existem em bactérias, nas quais atuam controlando diversos aspectos fisiológicos e de virulência. Neste trabalho investigamos o papel das STPs na virulência e fisiologia de Chromobacterium violaceum, uma ?-proteobactéria que atua como um patógeno ocasional de humanos e é amplamente encontrada em água e solos de regiões tropicais e subtropicais. Análises in silico revelaram a presença de quatro STPs no genoma de C. violaceum, sendo que duas possuem apenas o domínio de fosfatase (CV_0881 e CV_3848) e duas possuem um domínio adicional de regulador de resposta (CV_2644 e CV_3505). Mutantes nulos foram construídos para as quatro STPs e todas estas linhagens apresentaram crescimento semelhante ao da linhagem selvagem em meio rico e meio mínimo. As linhagens mutantes ?0881, ?2644 e ?3505 não apresentaram alteração de virulência em camundongos. Os mutantes ?2644 e ?3505 apresentaram menor formação de biofilme, o que sugere papel dessas fosfatases neste processo. Uma caracterização mais aprofundada da linhagem ?3848 por diferentes técnicas de microscopia revelou que este mutante apresenta células de tamanho diminuído, irregularidades no envelope celular e problemas na distribuição do DNA. Estes dados sugerem que CV_3848 tem papel em divisão celular, condensação do material genético e manutenção da parede celular. Nos ensaios de virulência o mutante ?3848 mostrou menor capacidade de causar morte e manter-se no fígado de camundongos, indicando que a STP CV_3848 é importante na patogenicidade de C. violaceum. / Protein phosphatases play a key role in reversible post-translational modification of proteins through phosphorylation since they act removing the stable phosphoryl group of serine, threonine and tyrosine residues. Although dominant in eukaryotes, the serine/threonine phosphatases (STPs) also exist in bacteria, in which they act by controlling various physiological and virulence traits. In this work we investigated the role of STPs on the virulence and physiology of Chromobacterium violaceum, a ?-proteobacterium that occasionally acts as a pathogen of humans and it is widely found in water and soil of tropical and subtropical regions. In silico analyzes revealed the presence of four STPs in the genome of C. violaceum, two of which have only the phosphatase domain (CV_0881 and CV_3848) and two that possess an additional domain of response regulator (CV_2644 and CV_3505). Null mutants were constructed for the four STPs and all of them showed similar growth to the wild type strain on rich and minimal medium. The mutant strains ?0881, ?2644 and ?3505 did not show any change in virulence in mice. The ?2644 and ?3505 mutants had lower biofilm formation, suggesting the role of these phosphatases in this process. Further characterization of ?3848 by different microscopy techniques revealed that this mutant presents cells of diminished size, irregularities in the cellular envelope and problem on the DNA distribution. These data suggest that CV_3848 has role in cell division, condensation of the genetic material and cell wall maintenance. In virulence assays the ?3848 mutant showed a lower ability to cause death and to remain in the liver of mice, indicating that the STP CV_3848 is important for the pathogenicity of C. violaceum.

Orientador: Maria Célia Bertolini / Banca: Cleslei Fernando Zanelli / Banca: Ana Paula Ulian de Araújo / Banca: Maria Teresa Marques Novo Mansur / Banca: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Resumo: O fungo Neurospora crassa tem sido amplamente usado como um organismo modelo para os aspectos fundamentais da biologia dos eucariotos. Neste trabalho, foi investigado o papel funcional de uma ciclina de N. crassa (PCL-1), codificada pela ORF NCU08772 e ortóloga a Pcl10 de Saccharomyces cerevisiae. Na levedura, a proteína Pcl10, em conjunto com a proteína quinase dependente de ciclina Pho85, fosforila a enzima glicogênio sintase, a enzima regulatória da síntese de glicogênio. A fosforilação resulta na inativação da enzima e, portanto, em diminuição do acúmulo de glicogênio. A linhagem pcl-1 de N. crassa apresentou um atraso na germinação dos conídios e um retardo na progressão do ciclo celular quando comparado com a linhagem selvagem, sugerindo que esta ciclina pode regular o desenvolvimento e a divisão celular. Além disto, a linhagem nocauteada acumulou níveis mais elevados de glicogênio que a linhagem selvagem indicando o papel na regulação do metabolismo deste carboidrato. A fosforilação da enzima glicogênio sintase de N. crassa (GSN) foi analisada na linhagem nocaute através de análises de atividade enzimática, e os resultados mostraram que a GSN apresentou baixo índice de fosforilação, portanto alta atividade durante o crescimento, um resultado que pode explicar o alto acúmulo de glicogênio observado. Este resultado foi confirmado por análise de 2D-PAGE seguida por western blot, utilizando anticorpos anti-GSN. GSN apresentou na linhagem mutante isoformas m... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

As quinases dependentes de ciclinas são proteínas que podem ser divididas de acordo com a sua atuação no ciclo celular ou no controle transcricional, elas se tornam ativas em determinadas etapas do ciclo celular dependendo do seu grau de fosforilação e de sua ligação com ciclinas e proteínas inibitórias, e exercem sua função fosforilando outras proteínas envolvidas no ciclo de divisão celular e transcrição influenciando suas atividades, garantindo que cada processo do ciclo ocorra em uma sequência ordenada. A CDK13 faz parte da família de proteínas quinases dependentes de ciclina, pode se ligar a ciclinas do tipo L ou K, regula os eventos de \"splicing\" alternativo, e interage com a proteína Tat do vírus HIV atuando como um possível fator de restrição, sendo que sua superexpressão diminui a produção de algumas proteínas virais suprimindo a produção do vírus. O DNA referente à CDK13 é replicado em células cancerosas, principalmente dos tipos hepático e cólon e reto, sendo um alvo para inibidores para tratamento de câncer. A fim de contribuir para o estudo dessa proteína, o projeto tem como objetivo expressá-la utilizando métodos de tecnologia de DNA recombinante. A sequência de DNA referente à CDK13 foi amplificada pela reação em cadeia da polimerase, após sua purificação, foi inserida no vetor pCR-Blunt e clonada em células de E. coli DH5α competentes. Porém, o DNA não foi liberado pela reação com as enzimas de restrição BamHI e NdeI. As bactérias Rosetta(DE3) transformadas com um plasmídeo sintético e crescidas em meio de auto-indução expressaram a CDK13. Após lise celular e purificação em coluna de Ni2+, a proteína foi detectada por Western Blot. Já as bactérias Rosetta(DE3) transformadas com o plasmídeo sintético modificado (o qual compreende a região do DNA que expressa o bolsão de ligação da CDK13), e induzidas em meio LB expressaram a CDK13, porém não foi possível purificá-la em coluna de afinidade ao Ni2+. / The cyclin-dependent kinases are proteins that can be classified by their function in the cell cycle or transcriptional control. They are activated in particular steps of the cell cycle depending on their phosphorylation degree, cyclin binding and inhibitory proteins. They act phosphorylating other proteins involved in the cell cycle and transcriptional control, influencing in their activities, ensuring that each step of the cell cycle occur in an ordered sequence. The CDK13 is one of the cyclin-dependent kinases family member, it can bind to L or K cyclins, regulates the alternative splicing and interact with HIV Tat protein, acting as a possible restriction factor, its overexpression decreases the production of some viral proteins, and suppresses the virus production. The DNA corresponding to CDK13 is replicated in cancer cells, mainly of hepatic and colon rectal types; therefore it is a target for inhibitors for cancer therapy. In order to contribute for the studies of this protein, the goal of the project is to express it using methods of recombinant DNA technology. The DNA sequence corresponding to CDK13 was amplified by polymerase chain reaction, after its purification, it was inserted to pCR-Blunt vector and cloned into E. coli DH5α competent cells. However, the DNA wasn\'t released by the BamHI and NdeI restriction enzymes. The Rosetta(DE3) cells transformed with a synthetic plasmid pET28a::CDK13 and grown in auto-induction media expressed the CDK13. After cell lysis and purification by Ni2+ affinity colum, the protein was identified by Western Blot. However, the Rosetta(DE3) cells transformed with the modified synthetic plasmid (that comprehends the DNA region which expresses the binding pocket region) induced in LB media, expressed the CDK13. Yet, it wasn\'t possible to purify the protein in the Ni2+ affinity column.

Orientador: Fábio Erminio Mingatto / Banca: Andréa Fontes Garcia / Banca: Sérgio Diniz Garcia / Resumo: Fipronil é um inseticida e acaricida altamente efetivo pertencente à família dos fenilpirazóis e ultimamente vem sendo extensivamente utilizado para combater infestações parasitárias tais como pulgas, formigas, cupins, carrapatos e piolhos de cães, gatos e bovinos. De acordo com relatos apresentados na literatura científica, existem casos de intoxicação hepática em mamíferos devido à sua exposição acidental ou utilização equivocada. O fígado desempenha função central no metabolismo, recebe nutrientes e xenobióticos que são por ele absorvidos, transformados, armazenados e liberados no sangue. A mitocôndria é responsável pela síntese de quase a totalidade do ATP necessário à manutenção da estrutura e função celular. Neste trabalho foram avaliados os efeitos do fipronil sobre a bioenergética de mitocôndrias isoladas de fígado de rato. Nas concentrações testadas (5 a 25 μM), o fipronil inibiu a respiração no Estado 3 da respiração em mitocôndrias energizadas com glutamato + malato, substratos do complexo I da cadeia respiratória, além de dissipar o potencial de membrana mitocondrial, acarretando a inibição da síntese de ATP pelas mitocôndrias. O efeito inibidor do fipronil sobre o complexo I foi confirmado pela inibição da atividade da enzima NADH desidrogenase. Esse efeito apresentado pelo fipronil sobre a bioenergética mitocondrial pode estar relacionado ao efeito tóxico apresentado pelo inseticida no fígado. / Abstract: Fipronil is a highly effective insecticide and acaricide that belongs to the phenylpyrazole chemical family and it has been extensively used to control fleas, ticks and lice of dogs, cats and bovines.As reported by literature, there are intoxication cases due to the accidental exposure or mistaken fipronil application in mammals, it might affect including the liver that performs essencial functions related to metabolism, due to the liver receives nutrients and xenobiotics that are absorbed, converted, stored and released into the blood. The mitochondria is responsible for almost entirety ATP synthase required to maintaining cellular structure and function. In this paper were evaluated the fipronil effects on bioenergetic of isolated rat-liver mitochondria. In the tested concentrations (5 to 25 μM), the fipronil inhibited State III of respiration to mitochondria energized with glutamate + malate, complex I substrates of respiratory chain, besides dissipate mitochondrial membrane potential, resulting in mitochondrial ATP synthase inhibition. The fipronil inhibitor effect about the complex I was confirmed by the inhibiting enzyme NADH dehydrogenase activity. The effect presented by fipronil about the mitochondrial bioenergetic may be related to the toxic effect showed by the insecticide on liver / Mestre

Made available in DSpace on 2016-03-28T12:39:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 patricia_ferrao_ioc_dout_2014.pdf: 5118660 bytes, checksum: d25122b18e1bcb82dee22e425b2ed062 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Estudos recentes mostraram que TGF-\03B2 esta envolvido na cardiopatia chagásica aguda e crônica. O aumento de seus níveis plasmáticos e a ativação da sua via de sinalização celular são aspectos peculiares da doença chagásica crônica. Além do seu relevante papel na patologia chagásica, também se observou que esta citocina está intimamente associada ao T. cruzi como um regulador de diferentes etapas de seus ciclo de vida. Trabalhos anteriores demostraram que T. cruzi é capaz de ativar TGT-\03B2 latente, utilizando-o na invação às células hospedeiras e que amastigotas de T. cruzi se ligam e internalizam TGF-\03B2 recombinante, estando este evento relacionado à capacidade de proliferação de amastigotas e sua diferenciação em tripomastigotas no final do ciclo intracelular. Este conjunto de informações nos levou ao questionamento de quais moléculas de T. cruzi poderiam estar envolvidas nos processos de proliferação e diferenciação celular frente ao estímulo por TGF-\03B2. Neste sentido, o presente projeto tem por principal objetivo a caracterização de moléculas responsivas ao estimulo de TGF-\03B2 através de uma abordagem fosfoproteômica. Para tal, extratos de proteínas totais de epimastigotas de T. cruzi (cepa Y), incubadas ou não com TGF-\03B2, foram preparados durante a fase exponencial de crescimento do parasito. Evidenciamos que a dose ótima de TGF-\03B2 para maior indução de fosforilação seria de 5 ng/ml. em seguida, o tempo ótimo de indução com TGF-\03B2 (1,5,15,30 e 60 minutos) foi testado e concluímos que as diferenças entre os padrões de fosforilação são muitos sutis em géis unidimensionais, nos fazendo optar pela análise exclusiava dos perfins em géis bidimensionais de 7 cm com faiza de PH 3-10 não-linear. A avaliação dos perfis bidimensionais demonstrou diferenças nos padrões de fosforilação entre os tempos estudados, nos levando a manter um estudo de cinética de tempo. As imagens dos géis foram analisadas e algumas das proteínas consideradas responsivas a TGF-\03B2 foram identificadas por espectrometria de massas. Observamos que as proteínas de choque térmico, tubulinas, desidrogenases, enolases, ciclofilina A, GrpE, cruzipaína, fator de elongamento 1-\03B1, fator de iniciação eucariótica 5a, entre outras, têm sua fosforilação e/ou expressão moduladas em resposta a TGF-\03B2. Buscamos correlacionar a função já descrita na literatura para cada proteína com seu possível papel na sinalização intracelular dsparada por TGF-\03B2, em concordância com o comportamento de fosforilação e/ou expressão apresentado em novas análises. Por último, foi avaliado se a adição de TGF-\03B2 a culturas de epimastigotas teria algum efeito sobre a proliferação dos parasitos. Verificamos que a adição de TGF-\03B2 promoveu um aumento de até 73% no crescimento dos parasitos nas primeiras 24 horas de estudo. O conjunto de dados obtidos contribui para a elucidação dos mecanismos moleculares relacionados à sinalização de TGF-\03B2, proporcionando uma fonte para detecção de novos alvos terapêuticos para a doença de Chagas / Recent studies show that TGF - β is involved in the acute and chronic chagasic cardiopathy. High levels of TGF - β and the activation of its signaling pathway were shown to be peculiar aspects of patients with chron ic Chagas disease. Besides its relevant role in the pathology of Chagas dis ease, this cytokine was also observed to be intimately associated with Trypanosoma cruzi as a regulator of different stages of the parasite ́s life cycle. Previous works have show n that T. cruzi , using it in the process of h ost cell invasion. In addition, amastigote forms are able to bind and internalize recombinant TGF - β , and this event is related to their capacity to proliferate and differentiate int o trypomastigote forms at the end of the intracellular cycle. Taken togethe r, this set of information raises the question as molecules are involved in the processe of cellular proliferation and differentiation stimulated by TGF - β . Therefore, this work aims to characterize TGF responsive molecules through a pho sphoproteomic approach. For this purpose, total T. cruzi epimastigotes (Y strain), incubated or not with TGF were prepared from parasites in the exponential gro wth phase. We determined that 5 was the dose that induce d the highest number of phosphorylation events. Next, the optimal induction time (1, 5, 15, 30 and 60 minutes) was evaluated and we concluded that the phosphorylation patterns from the studied times showed only subtle differences using 1 -DE analysis, leadi ng us to evaluate these profiles DE gels (7cm pH 3 -10 non- linear). The profiles obtained showed differences in phosphorylation patterns duri ng the time - which led us to maintain a time - kinetics study. Gel images wer responsive proteins were identified by mass spectr ometry. We observed that heat shock proteins, tubulins, dehydr ogenases, enolases, cyclophilin A, GrpE, cruzipain, elongation factor - 1 α , eukaryotic initiation factor their phosphorylation and/or expression levels modu lated by TGF correlate the function already described in the lit erature for each protein with their possible role in intracellular signaling triggered by TGF - β , in agreement with thei phosphorylation and/or expression behavior shown in our analysis. Finally, we assessed whether the addition of TGF - β to epimastigotes cultures would have some effect on parasite proliferation. We found that TGF - β addition led to an increase of up in parasite growth in the first 24 hours of culture . The data presented here contributes to the elucidation of the molecular mec hanisms related to TGF , providing a source of new potential therapeutic t argets against in response to TGF - β is involved in the acute and chronic chagasic and the activation of its signaling pathway were shown to be peculiar aspects of patients with chron ic Chagas disease. Besides its ease, this cytokine was also observed to as a regulator of different stages of T. cruzi is able to activate ost cell invasion. In addition, amastigote , and this event is related to their capacity to proliferate and differentiate int o trypomastigote forms at the end of r, this set of information raises the question as molecules are involved in the processe of cellular proliferation and . Therefore, this work aims to characterize TGF - β sphoproteomic approach. For this purpose, total epimastigotes (Y strain), incubated or not with TGF - β , were prepared from parasites in the exponential gro wth phase. We determined that 5 d the highest number of phosphorylation events. Next, the optimal induction time (1, 5, 15, 30 and 60 minutes) was evaluated and we concluded that the phosphorylation patterns from the studied times showed ng us to evaluate these profiles linear). The profiles obtained - course under study, kinetics study. Gel images wer e analyzed and responsive proteins were identified by mass spectr ometry. We observed that heat shock proteins, tubulins, dehydr ogenases, enolases, cyclophilin , eukaryotic initiation factor -5a and others had their phosphorylation and/or expression levels modu lated by TGF - β . We tried to correlate the function already described in the lit erature for each protein with their , in agreement with thei r phosphorylation and/or expression behavior shown in our analysis. Finally, we to epimastigotes cultures would have some addition led to an increase of up in parasite growth in the first 24 hours of culture . The data presented here contributes to the elucidation of the molecular mec hanisms related to TGF - β , providing a source of new potential therapeutic t argets against Chagas disease

Made available in DSpace on 2015-10-06T13:03:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-06-27. Added 1 bitstream(s) on 2015-10-06T13:18:36Z : No. of bitstreams: 1 000849993.pdf: 250584 bytes, checksum: ce29b95f47fab82e09fbb2be942af1ab (MD5) / Fipronil é um inseticida e acaricida altamente efetivo pertencente à família dos fenilpirazóis e ultimamente vem sendo extensivamente utilizado para combater infestações parasitárias tais como pulgas, formigas, cupins, carrapatos e piolhos de cães, gatos e bovinos. De acordo com relatos apresentados na literatura científica, existem casos de intoxicação hepática em mamíferos devido à sua exposição acidental ou utilização equivocada. O fígado desempenha função central no metabolismo, recebe nutrientes e xenobióticos que são por ele absorvidos, transformados, armazenados e liberados no sangue. A mitocôndria é responsável pela síntese de quase a totalidade do ATP necessário à manutenção da estrutura e função celular. Neste trabalho foram avaliados os efeitos do fipronil sobre a bioenergética de mitocôndrias isoladas de fígado de rato. Nas concentrações testadas (5 a 25 μM), o fipronil inibiu a respiração no Estado 3 da respiração em mitocôndrias energizadas com glutamato + malato, substratos do complexo I da cadeia respiratória, além de dissipar o potencial de membrana mitocondrial, acarretando a inibição da síntese de ATP pelas mitocôndrias. O efeito inibidor do fipronil sobre o complexo I foi confirmado pela inibição da atividade da enzima NADH desidrogenase. Esse efeito apresentado pelo fipronil sobre a bioenergética mitocondrial pode estar relacionado ao efeito tóxico apresentado pelo inseticida no fígado. / Fipronil is a highly effective insecticide and acaricide that belongs to the phenylpyrazole chemical family and it has been extensively used to control fleas, ticks and lice of dogs, cats and bovines.As reported by literature, there are intoxication cases due to the accidental exposure or mistaken fipronil application in mammals, it might affect including the liver that performs essencial functions related to metabolism, due to the liver receives nutrients and xenobiotics that are absorbed, converted, stored and released into the blood. The mitochondria is responsible for almost entirety ATP synthase required to maintaining cellular structure and function. In this paper were evaluated the fipronil effects on bioenergetic of isolated rat-liver mitochondria. In the tested concentrations (5 to 25 μM), the fipronil inhibited State III of respiration to mitochondria energized with glutamate + malate, complex I substrates of respiratory chain, besides dissipate mitochondrial membrane potential, resulting in mitochondrial ATP synthase inhibition. The fipronil inhibitor effect about the complex I was confirmed by the inhibiting enzyme NADH dehydrogenase activity. The effect presented by fipronil about the mitochondrial bioenergetic may be related to the toxic effect showed by the insecticide on liver

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:25:35Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-06-21Bitstream added on 2014-06-13T18:53:43Z : No. of bitstreams: 1 maioli_ma_me_araca.pdf: 632437 bytes, checksum: d05e4a92f3dceafab2048112e9537174 (MD5) / Abamectina (ABA), pertencente à família das avermectinas é utilizada mundialmente como parasiticida, porém a intoxicação por ABA pode prejudicar o funcionamento hepático. Existem substâncias que quando metabolizadas exercem atividade tóxica, afetando a função de importantes organelas como a mitocôndria, responsável por uma variedade de processos bioquímicos, como a produção de ATP e morte celular. O objetivo desse estudo foi caracterizar o mecanismo de toxicidade da ABA em hepatócitos isolados de ratos e avaliar se esse efeito é dependente do seu metabolismo. A toxicidade da ABA foi avaliada monitorando o consumo de oxigênio e o potencial de membrana mitocondrial, concentração intracelular de ATP, viabilidade celular por meio da liberação das enzimas ALT e AST, homeostase intracelular Ca2+, liberação de citocromo c, atividade da caspase 3 e morte celular por necrose. A ABA reduz a respiração celular, tanto em células energizadas com glutamato mais malato quanto com succinato. O metabolismo da ABA reduz sua toxicidade, uma vez que hepatócitos previamente incubados com proadifen apresentam maior sensibilidade ao composto, sendo isto observado pelo rápido decréscimo da formação do potencial de membrana mitocondrial acompanhado pelas reduções das concentrações de ATP, viabilidade celular e ruptura da homeostase intracelular de Ca2+ com estabelecimento de necrose. Nossos resultados indicam que a toxicidade da ABA diminui com a sua biotransformação, e sua ação tóxica está relacionada com a inibição da atividade mitocondrial, levando à diminuição da síntese de ATP seguida pela morte da célula / Abamectin (ABA), which belongs to the family of avermectinas, used worldwide as a parasiticide, but the ABA poisoning can impair the functioning liver. There are substances which exert toxic activity when metabolized, thus affecting the function of important organelles such as mitochondria, responsible for a variety of biochemical processes, such as ATP production and cell death. The aim of this study was to characterize the mechanism of toxicity of ABA in isolated rat hepatocytes and to evaluate whether this effect is dependent on your metabolism. The toxicity of ABA was assessed by monitoring oxygen consumption and mitochondrial membrane potential, intracellular concentration of ATP, cell viability by releasing enzymes ALT and AST, homeostasis intracellular Ca2+, release of cytochrome c, activity of caspase 3 and cell death necrosis. The ABA reduces cellular respiration, both in cells energized with glutamate and succinate over malate. The metabolism of ABA reduces its toxicity, since hepatocytes pre-incubated with proadifen are more sensitive to the compound, this being observed by the formation of rapidly decreasing mitochondrial membrane potential accompanied by reductions in concentrations of ATP, cell viability and rupture of the intracellular homeostasis Ca2+ with the establishment of necrosis. Our results indicate that the toxicity decreases as the ABA its biotransformed and its toxic action is related to the inhibition of mitochondrial activity, leading to decreased synthesis of ATP followed by cell death