A homocistinúria (HHCY) é uma desordem metabólica causada algum tipo de deficiência no metabolismo da metionina, folato ou vitamina B12, resultando no acúmulo tecidual de homocisteína (Hcy) e de metionina. Os pacientes afetados por essa doença apresentam principalmente retardo mental, isquemia cerebral, convulsões e aterosclerose. Vários mecanismos têm sido propostos para explicar a relação entre HHCY e desordens no sistema nervoso, entre eles podemos destacar mecanismos glutamatérgicos, mobilização de Ca+2 e envolvimento de espécies reativas de oxigênio (ROS). Considerando que o citoesqueleto é um importante alvo para a sinalização celular em inúmeras doenças neurodegenerativas, nosso estudo investigou os possíveis efeitos tóxicos da Hcy sobre alguns parâmetros bioquímicos do citoesqueleto neural. Ratos submetidos a um tratamento crônico com Hcy apresentam uma marcada seletividade na alteração da expressão gênica das subunidades dos filamentos intermediários (FIs) estudados, tanto no extrato tecidual total como na fração citoesquelética de hipocampo e córtex cerebral, refletindo uma maior susceptibilidade do hipocampo nessas alterações. Estudos in vitro mostraram que a Hcy 100 e 500 μM, relacionadas a homocistinuria (HHCY) moderada e grave respectivamente, são capazes de causar hiper (Hcy 100 μM) ou hipofosforilação (Hcy 500 μM) das subunidades dos neurofilamentos e da proteina glial fibrilar ácida, FIs do citoesqueleto de neurônios e astrócitos respectivamente. Estes efeitos são dependentes da idade dos ratos e da estrutura cerebral, manifestando-se em hipocampo de ratos de 17 dias de idade. Resultados em fatias de hipocampo mostraram que a ação das duas concentrações de Hcy é mediada por mecanismos dependentes do influxo de Ca2+ por receptores NMDA e por canais de Ca2+ dependentes de voltagem, assim como da liberação de Ca2+ dos estoques intracelulares, enfatizando a alta suscetibilidade e complexidade das vias de sinalização ativadas por Ca2+ no hipocampo. Além disso, estudos morfológicos em astrócitos e células de glioma C6 mostraram que células glias em cultura também são alvo para as ações da Hcy, reorganizando seu citoesqueleto e alterando o sistema fosforilante associado ao mesmo através de mecanismos envolvendo excitotoxicidade, estresse oxidativo e mecanismos glutamatérgicos. Estes estudos mostram que a integridade estrutural do citoesqueleto é da maior importância para o funcionamento neuronal e qualquer distúrbio na dinâmica desta estrutura poderia ativar processos de reparação plástica manifestados como alterações na expressão, localização e metabolismo das proteínas do citoesqueleto. No entanto, os mecanismos através dos quais o desequilíbrio do citoesqueleto é capaz de induzir a disfunção neural ainda não foram esclarecidos e a exata dimensão destas alterações precisa ser determinada. / The homocystinuria (HHCY) is a metabolic disorder caused by deficiency in the metabolism of methionine, vitamin B12 or folate, which leads to tissue accumulation of homocysteine (Hcy) and methionine. Homocystinuric patients usually present mental retardation, cerebral ischemia, seizures, and atherosclerosis. Several mechanisms have been proposed to explain the relationship between HHCY and nervous system disorders, among them we can highlight glutamatergic mechanisms, mobilization of Ca+2 and involvement of reactive oxygen species (ROS). Considering that the cytoskeleton is an important target for cellular signaling in many neurodegenerative diseases, our study investigated the possible toxic effects of Hcy on some biochemical parameters of the neural cytoskeleton. Initially, we demonstrated that rats subjected to chronic model of Hcy showed a marked selectivity in alterations of gene expression, total immunocontent and cytoskeletal fraction of subunits of intermediate filaments (IFs) studied, reflecting a greater susceptibility of the hippocampus in these changes. In vitro studies showed that 100 and 500 μM Hcy associated with moderate and severe HHCY respectively, was able to induced hyperphosphorylation (Hcy 100 μM) and hypophosphorylation (Hcy 500 μM) of neurofilaments subunits and glial fibrillary acidic protein, IFs of neuronal and astrocytic cytoskeleton. These effects are dependentents of age and cerebral structure of rats: hippocampus of 17 day old rats are sensible. Results in slices of hippocampus showed that the action of Hcy is mediated by mechanisms dependent of influx of Ca2+ by NMDA receptors and Ca2+ channels voltage-dependent and release of Ca2+ from intracellular stores, emphasizing the high susceptibility and complexity of signaling pathways activated by Ca2+ in the hippocampus. In addition, glial cells were also target for the actions of Hcy, reorganizing their cytoskeleton and changing the phosphorylation system associated to cytoskeleton through mechanisms involving excitotoxicity, oxidative stress and glutamatergic mechanisms. The cytoskeleton may represent a target to HHCY and your dysfunction can have an important role in neurodegeneration characteristic of the disease. However, the mechanisms by which disruption of the cytoskeleton proteins is able to induce neural dysfunction have not yet been clarified and the exact extent of these changes need to be determined.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-07-13Bitstream added on 2014-06-13T20:10:34Z : No. of bitstreams: 1 candido_ts_me_araiq_parcial.pdf: 929806 bytes, checksum: e0eb6ae6bd716ab4fe86de16a7032888 (MD5) Bitstreams deleted on 2014-08-22T14:57:04Z: candido_ts_me_araiq_parcial.pdf,Bitstream added on 2014-08-22T15:02:07Z : No. of bitstreams: 1 000713117.pdf: 3856340 bytes, checksum: eac0f3890cdcdcf0aec970764ebd55b6 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Neste trabalho, uma coleção de linhagens mutantes de N. crassa em proteínas quinases foi adquirida pelo nosso laboratório e estas linhagens foram utilizadas a fim de identificar as proteínas envolvidas no controle do metabolismo do glicogênio no fungo. Estas proteínas foram anotadas como pertencentes a diferentes classes de proteínas quinases devido às características dos seus domínios quinases. Inicialmente foram identificadas as quinases que estão envolvidas no controle do metabolismo do carboidrato através da quantificação do conteúdo de glicogênio, tanto em uma situação de crescimento vegetativo (30 °C), como sob a condição de estresse térmico (45 °C). Nesta parte, as linhagens mutantes que mostraram perfis de acúmulo de glicogênio diferente da linhagem selvagem, nas condições avaliadas foram selecionadas. Posteriormente, foram realizadas quantificações de atividade da enzima glicogênio sintase de N. crassa (GSN), sob as mesmas condições experimentais, na presença e ausência do modulador alostérico glicose-6-fosfato (G6P). Foi verificado que a enzima GSN presente em algumas linhagens mutantes provavelmente estaria diferentemente fosforilada, quando comparada à proteína presente na linhagem selvagem. Por este motivo, uma análise das diferentes isoformas de fosforilação foi realizada em algumas das linhagens mutantes combinando os ensaios 2D-PAGE e Western blot. Através destas análises foi possível verificar quais proteínas quinases estão envolvidas no controle do metabolismo do glicogênio e que atuam mais especificamente na regulação por fosforilação da enzima GSN. Das 55 linhagens inicialmente utilizadas, 6 linhagens apresentaram diferenças no acúmulo de glicogênio, na atividade GSN e no estado de fosforilação da enzima GSN, quando comparadas com a selvagem. Portanto, caracterizam proteínas... / In this work, a collection of N. crassa strains mutated in genes encoding protein kinases was used to identify proteins involved in the control of glycogen metabolism in this fungus. These proteins were annotated as belonging to different classes of protein kinases due to their kinase domains. Initially, we identified the proteins involved in the metabolism control by quantifying the glycogen accumulated under vegetative growth (30 °C) and under a stress condition such as heat stress (45 °C). The mutant strains showing glycogen accumulation profiles different from the wild-type strain under the conditions evaluated were selected. The selected mutant strains were used to quantify glycogen synthase activity (GSN), under the same experimental conditions, in the presence and absence of the allosteric modulator glucose-6-phosphate (G6P). From this assays, it was observed that GSN in some mutant strains would be differently phosphorylated when compared to the enzyme present in the wild-type strain. Therefore, an analysis of the GSN phosphorylation isoforms was performed in such mutant strains by combining 2D-PAGE and Western blot. Through these analysis, it was possible to identify which protein kinases are involved in the control of glycogen metabolism and specifically act in the GSN phosphorylation. Of the 55 strains initially used six strains showed differences in the glycogen accumulation, in the GSN activity, and in the state of GSN phosphorylation, compared to the wild-type strain. Therefore, they characterize putative protein kinases that regulate glycogen metabolism by regulating the GSN enzyme. The strain knocked-out in the ORF encoding the protein PHO85-like (a cyclin-dependent protein kinase) showed differences in the glycogen content, increased -/+ G6P ratio, and changes in the GSN phosphorylation... (Complete abstract click electronic access below)

Uma elevação da concentração de amônia no sangue é tóxica e pode levar a convulsões, coma e morte. A suscetibilidade do cérebro em desenvolvimento a alterações neurológicas é maior do que no adulto. O citoesqueleto e, em particular, os filamentos intermediários (FIs) são um alvo de neurotoxinas e metabólitos tóxicos. No SNC temos os FIs neuronais, representados pelos neurofilamentos de alto, médio e baixo peso molecular (NF-H, NF-M, NF-L), e os astrocitários, proteína glial fibrilar ácida e vimentina (GFAP e VIM), entre outros. A fosforilação é uma modificação pós-traducional bem descrita como um dos principais mecanismos de regulação da dinâmica dos FIs. No presente trabalho, estudamos os efeitos de concentrações tóxicas de amônia sobre o citoesqueleto, com ênfase na homeostase do sistema fosforilante direcionado para os FIs e alguns mecanismos moleculares envolvidos nesses efeitos. Para tanto, utilizamos dois modelos experimentais de hiperamonemia aguda em animais de 10 e 21 dias de idade: in vivo e in vitro. No modelo in vivo, os animais foram injetados intraperitonealmente com acetato de amônio (7 mmol/Kg) e o nível de fosforilação das proteínas do citoesqueleto foi analisado no córtex cerebral e no hipocampo. No modelo in vitro, fatias de córtex cerebral e hipocampo de ratos nas mesmas idades foram incubadas com diferentes concentrações de NH4Cl. Nos dois modelos experimentais utilizados as alterações no sistema fosforilante foram dependentes da idade e da estrutura cerebral. A injeção de acetato de amônio não alterou o nível de fosforilação dos FIs no córtex cerebral de ratos de 10 dias, 30 e 60 min após a injeção. No entanto, observamos hipofosforilação dos FIs astrocitários (GFAP e VIM) e neuronais (NF-L, NF-M e NF-H) 30 min após a injeção, sendo que esse efeito foi revertido 60 min após a injeção. O sistema fosforilante associado aos FIs das células neurais de hipocampo não foi alterado com relação aos controles nas duas idades e nos dois tempos estudados. No modelo in vitro a resposta ao NH4Cl foi estrutura-dependente e dose-dependente para as concentrações de 0,5, 1 e 5 mM. Fatias de hipocampo de ratos de 10 dias de idade apresentaram hipofosforilação de GFAP, VIM e NFL em resposta à incubação com 5 mM de NH4Cl, sem alteração na homeostase do citoesqueleto nas células neurais de córtex cerebral. Por outro lado, fatias de córtex cerebral de ratos de 21 dias de idade apresentaram hipofosforilação dos FIs astrocitários (GFAP e VIM) sem alteração no sistema fosforilante direcionado aos FIs de hipocampo. A hipofosforilação em resposta a sinais celulares está frequentemente associada à ativação de proteínas fosfatases. Portanto, em uma tentativa de estudar as vias de sinalização buscamos identificar as fosfatases envolvidas no efeito do NH4Cl, utilizando fatias de córtex cerebral. As proteínas fosfatases 1 (PP1) e 2B (PP2B) foram ativadas em resposta a 5 mM de NH4Cl aos 30 min e esse evento envolveu alterações nos níveis intra e extracelulares de Ca2+ via ativação do sistema glutamatérgico por receptores N-metil-D-aspartato (NMDA). O conjunto dos nossos dados evidenciam a neurotoxicidade da amônia por meio de um desequilíbrio no sistema fosforilante direcionado para os FIs tanto neuronais quanto astrocitários e de uma desregulação nos mecanismos de sinalização celular envolvidos na homeostase do citoesqueleto de astrócitos. Essas alterações podem ser parte integrante dos danos neurológicos associados à hiperamonemia aguda, principalmente no cérebro em desenvolvimento, como retardo mental e paralisia cerebral. Acreditamos que esses resultados são relevantes para a compreensão das bases moleculares envolvidas com a toxicidade da amônia no SNC. / High ammonia levels in the blood are toxic to brain and can lead to seizures, coma and death. The susceptibility of the developing brain to neurological abnormalities is greater than in adults. The cytoskeleton and, in particular, the intermediate filaments (IFs) are a target of neurotoxins and toxic metabolites. The intermediate dilaments (IFs) in the CNS are mainly represented by neurofilaments of high, medium and light molecular weight (NF-H, NF-M, NF-L) in neurons, glial fibrillary acidic protein and vimentin (GFAP and VIM), in astrocytes. Phosphorylation is a post-translational modification described as one of the major mechanisms regulating the dynamics of IFs. In the present work, we studied the effects of toxic concentrations of ammonia on the cytoskeleton, with emphasis in the homeostasis of the phosphorylating system directed to the IFs and we focused in some molecular mechanisms involved in these effects. For this, we use two experimental models of acute hyperammonemia in animals of 10 and 21 days of age: in vivo and in vitro models. In the in vivo model, animals were injected intraperitoneally with ammonium acetate (7 mmol/Kg) and the phosphorylation level of the cytoskeletal proteins was analyzed in the cerebral cortex and hippocampus.The injected acetate did not alter the phosphorylation level of IFs in the cerebral cortex of 10 day-old rats, 30 and 60 min after injection. However, we noted hypophosphorylation of the astrocytic (GFAP and VIM) as well as neuronal IFs (NF-L, NF-M and NF-H) 30 min after injection, and this effect was reversed 60 min after injection. The phosphorylating system associated with IFs of neural cells of the hippocampus was not altered as compared with controls at both ages and in the two studied times. In the in vitro model, the response to NH4Cl was structure-dependent and dose-dependent at the concentrations of 0.5, 1 and 5 mM. Hippocampal slices of 10-day-old rats showed hypophosphorylation of GFAP VIM and NFL in response to incubation with 5 mM NH4Cl, and unaltered homeostasis of the phosphorylating system directed to the cytoskeleton in the neural cells of the cerebral cortex. On the other hand, slices of cerebral cortex of 21-day-old rats showed hypophosphorylation of astrocytic IFs (GFAP and VIM) without altering the phosphorylating system directed to hippocampal IFs. The hypophosphorylation in response to cellular signals is often associated with activation of protein phosphatases. Therefore, in an attempt to study the signaling pathways we seek identify phosphatases involved in the effect of NH4Cl, using cerebral cortex slices. The protein phosphatases 1 (PP1) and 2B (PP2B) were activated in response to 5 mM NH4Cl 30 min after injection and this event was associated with in intra and extracellular Ca2+ levels via activation of glutamate N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors. Taken together, our data show that the neurotoxicity of ammonia is directed to the phosphorylating imbalance of both neuronal as astrocytic IFs through disruption of the homeostasis of the NMDA-mediated signaling mechanisms of cortical astrocytes of 21-day-old rats. These changes may be part of the neurological damage associated with acute hyperammonemia, in the developing brain, as mental retardation and cerebral palsy. We believe that these results are relevant for understanding the molecular basis involved in the toxicity of ammonia in the CNS.

O telúrio é um elemento raro usado como componente industrial de muitas ligas. Estudos in vivo e in vitro demonstraram que compostos orgânicos do telúrio são neurotóxicos, entre eles podemos destacar o ditelureto de difenila [(PhTe)2]. Os efeitos provocados por esse organotelureto nos diferentes sistemas são importantes, no entanto, os observados no SNC são particularmente marcantes. Relatos têm demonstrado que o (PhTe)2 pode causar alterações no estado de fosforilação dos filamentos intermediários (FIs) neuronais e gliais, sendo os neurônios e astrócitos importantes alvos desse neurotoxicante. Considerando que o citoesqueleto é um importante alvo de neurotoxinas, nosso trabalho estudou o efeito do (PhTe)2 sobre alguns parâmetros bioquímicos do citoesqueleto neural. Ratos submetidos a uma injeção subcutânea de (PhTe)2 apresentaram alteração na fosforilação e/ou expressão das subunidades dos neurofilamentos (NF-H, NF-M e NF-L), da GFAP e da vimentina, bem como ativação das vias das MAPK e da PKA. Essas modificações são dependentes da estrutura estudada (cerebelo ou estriado) e da idade do animal. Além disso, uma única administração de (PhTe)2 em ratos jovens provocou morte neuronal e astrogliose. Quando o (PhTe)2 é administrado nas ratas mães durante os primeiros 14 dias de lactação verificamos que ocorre uma modificação no sistema fosforilante associado aos FIs nos filhotes, novamente de uma maneira estrutura (córtex cerebral, hipocampo, estrido ou cerebelo) e idade dependente. Além disso, verificou-se que esse organocalcogênio injetado nas ratas mães também age sobre as vias das MAPK e da PKA. Estudos in vitro mostraram que esse composto orgânico do telúrio causa hipofosforilação dos FIs neuronais e gliais no córtex cerebral. Esse efeito é mediado por alteração homeostase do cálcio e do glutamato, bem como pela inibição da PKA, alteração da fosforilação da proteína DARPP-32(Thr34) e ativação da PP1. No hipocampo temos uma ativação dos receptores glutamatérgicos ionotrópicos e metabotrópicos, acarretando uma alteração na homeostase do cálcio e ativação da PKC, PKCaMII e via das MAPK, conduzindo a um aumento de fosforilação dos FIs neuronais e gliais. Nossos resultados mostraram, portanto, que o (PhTe)2 altera a homeostase do citoesqueleto cerebral e que essa modificação é dependente do desenvolvimento do animal, da estrutura cerebral estudada, bem como da maneira de contato com esse neurotoxicante. Além disso, verificou-se o envolvimento de várias vias de sinalização nas ações desencadeadas pelo composto orgânico do telúrio sobre os FIs, estando elas muitas vezes interligadas. Esses resultados podem contribuir para o melhor entendimento dos mecanismos envolvidos em uma intoxicação com compostos de telúrio, sendo que o desequilíbrio do citoesqueleto pode estar associado à neurotoxicidade desse organotelureto. / Tellurium is a rare element used as a component of many industrial alloys. In vivo and in vitro studies have demonstrated that organic tellurium compounds are neurotoxic. We can highlight the organic coumpoud diphenyl ditelluride [(PhTe)2]. The effects caused by this organoteluride in different systems are important, however, the effects observed in the CNS are particularly striking. Reports have shown that (PhTe)2 can induces changes in the phosphorylation state of neuronal and glial intermediate filaments (IFs). The neurons and astrocytes are important targets of this neurotoxin. Considering that the cytoskeleton is an important target for neurotoxins, the aim of the present study was studied the effect of (PhTe)2 on some biochemical parameters of the neural cytoskeleton. Rats treated with a single subcutaneous (s.c.) injection of (PhTe)2 showed changes in the phosphorylation and / or expression of neurofilament subunit (NF-H, NF-M and NF-L), GFAP and vimentin, as well as activation of the MAPK pathway and PKA. These changes are dependent on the structure studied (cerebellum or striatum) and age of the animal. Furthermore, a single administration (PhTe)2 in young rats caused neuronal death and astrogliosis. When (PhTe)2 is administered in dams during the first 14 days of lactation we observed a change in the phosphorylating system associated with IFs in pups. This effect is dependent of the structure studied and the developmental stages of the pups. Furthermore, it was found that (PhTe)2 is administered in dams during the first 14 days of lactation also acts on the MAPK pathway and in the PKA. In vitro studies showed that the organic tellurium causes hipophosphorylation of the neuronal and glial IFs proteins in the cerebral cortex. This effect is mediated by change in calcium and glutamate homeostasis, inhibition of PKA, desphosphorylation of the protein DARPP-32 (Thr34) and activation of PP1. In the hippocampus have an activation of ionotropic and metabotropic glutamatergic receptors, causing an alteration in calcium homeostasis and activation of PKC, PKCaMII and MAPK pathway, leading to increased phosphorylation of neuronal and glial IFs. The results of this work showed that the (PhTe)2 changes cytoskeletal homeostasis in brain. This modification is dependent of the animal development, the brain structure studied, as well as the way of contact with the neurotoxin. Moreover, there is the involvement of different signaling pathways in the action of (PhTe)2 and they are often interconnected. These results may contribute to a better understanding of mechanisms involved in intoxication with tellurium compounds. The imbalance of the cytoskeleton may be associated with neurotoxicity of this organochalcogenide.

A Doença do Xarope do Bordo (DXB) é uma desordem hereditária causada pela deficiência do complexo enzimático desidrogenase dos cetoácidos de cadeia ramificada, e como conseqüência ocorre o acúmulo dos aminoácidos de cadeia ramificada (AACR) leucina (Leu), isoleucina (Ile) e valina (Val), e seus respectivos cetoácidos α- cetoisocapróico (CIC), α-ceto-β-metilvalérico (CMV) e α-cetoisovalérico (CIV), que caracteriza a doença. Os pacientes afetados apresentam sintomas neurológicos graves, tais como convulsões, coma, retardo psicomotor e retardo mental. Entretanto, os mecanismos fisiopatológicos da doença ainda não estão esclarecidos. Em estudos anteriores, realizados em nosso laboratório, observamos que os α-cetoácidos de cadeia ramificada modificaram a fosforilação dos filamentos intermediários em córtex cerebral de ratos wistar em diferentes idades, alteraram a morfologia de células gliais e provocaram estresse oxidativo em células de glioma C6. Neste estudo, nós investigamos o efeito in vitro dos aminoácidos de cadeia ramificada, nas concentrações encontradas nos pacientes afetados por DXB, sobre a fosforilação dos filamentos intermediários de córtex cerebral de ratos durante o desenvolvimento. Fatias de córtex cerebral de ratos wistar de 9, 12,17 e 21 dias foram incubadas com os aminoácidos Leu, Ile e Val na presença de 32P-ortofosfato, a fração citoesquelética foi extraída e a radioatividade incorporada pelas subunidades dos filamentos intermediários foi medida. Os resultados obtidos não demonstraram alterações significativas no parâmetro estudado. Também foram realizados estudos morfológicos em cultura de células C6 através de microscopia de contraste de fase e técnicas de imunocitoquímica. As células foram incubadas por 3, 12 ou 24 horas na presença ou na ausência dos AACR. Os resultados demonstraram que os AACR alteraram a morfologia das células de redondas para fusiformes com a presença de vários processos de um modo dependente do tempo e do tipo de AACR. A imunocitoquímica com anticorpos anti-actina e anti-proteína glial fibrilar ácida (GFAP) demonstrou que estes metabólitos induziram uma reorganização do citoesqueleto. Além disso, observamos morte celular intensa na presença dos AACR. Por outro lado, verificamos que não houve alteração de fosforilação da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) nas células C6, mas observamos que houve diminuição da glutationa e aumento da produção de óxido nítrico quando as células C6 foram incubadas por 3h com os AACR. Quando as células C6 foram tratadas com glutationa ou L-NAME e com os AACR estes antioxidantes foram capazes de prevenir as alterações metabólicas causadas por estes metabólitos, sugerindo o envolvimento do estresse oxidativo nas alterações causadas pelos AACR. Considerando que as células astrogliais são de fundamental importância para o desenvolvimento e o funcionamento do cérebro é provável que as alterações provocadas pelos AACR possam ter importantes conseqüências para a neurodegeneração característica dos pacientes portadores de DXB. / Maple syrup urine disease (MSUD) is a inherited disorder caused by a deficiency of the enzyme complex branched-chain α-keto acid dehydrogenase (BCKD), and consequently occurs the accumulation of branched-chain amino acids (BCAAs) leucine (Leu), isoleucina (Ile) and valine (Val), and theirs corresponding branched-chain α-keto acids (BCKAs) α-keto-isocaproic acid (KIC), α-keto-β-methyvaleric acid (CMV) and α- keto-isovaleric (KIV), that characterize the disease. Affected patients present severe neurological symptoms such as coma, psychomotor delay and mental retardation. However, the physiopathologic mechanisms are unknown. In previous studies carried through in our laboratory we observed that the BCKAs had modified the phosphorylation of the intermediate filaments (IF) in cerebral cortex of rats wistar in different ages. We also verified that these metabolites altered the morphology of glial cells and provoked oxidative stress in C6 cells. In this study, we investigate the in vitro effect of BCAAs, in the concentrations found in the patients affected with MSUD, on the phosphorylation of the IF from cerebral cortex of rats during development. Slices from cerebral cortex of wistar rats of 9, 12, 17 and 21 days were incubated with the amino acids Leu, Ile and Val in the presence of 32P-ortophosphate, the cytoskeleton fraction was extracted and the radioactivity incorporated into the subunits of the IF was measured. The results obtained do not demonstrate significant alterations in this studied parameter. We also performed morphologic studies in C6 cells through analyses of imunocitochemistry and phase contrast microscopy. The cells had been incubated for 3, 12 or 24 hours in the presence or the absence of the BCAAs. The results demonstrate that the BCAAs alter the morphology of the cells from rounded to fusiformes with the presence of some processes in a dependent way of the time and the type of BCAAs. The imunocitochemistry with anti-actin and antiglial fibrilary acid protein (GFAP) antibodies demonstrates that these metabolites induce a reorganization of cytoskeleton. Moreover, we observe intense cellular death in the presence of the BCAAs. On the other hand, we verify that it does not involve an alteration of the phosphorylation of GFAP in C6 cells. We also observe a reduction of glutathione and a increase of nitric oxide production when the cells were incubated for 3 hours with the BCAAs. When the C6 cells were treated with glutathione or L-NAME in the presence of the BCAAs these antioxidants were capable to prevent the metabolic alterations caused by these metabolites, suggesting the involvement of oxidative stress in the alterations caused by the BCAAs. Considering that the astroglials cells are have fundamental importance on the development and functioning of the brain it is feasible that the alterations provoked by the BCAAs have important consequences for the neurodegeneration characteristic of MSUD patients.

A Doença do Xarope do Bordo (DXB) é uma desordem hereditária causada pela deficiência do complexo enzimático desidrogenase dos cetoácidos de cadeia ramificada, e como conseqüência ocorre o acúmulo dos aminoácidos de cadeia ramificada (AACR) leucina (Leu), isoleucina (Ile) e valina (Val), e seus respectivos cetoácidos α- cetoisocapróico (CIC), α-ceto-β-metilvalérico (CMV) e α-cetoisovalérico (CIV), que caracteriza a doença. Os pacientes afetados apresentam sintomas neurológicos graves, tais como convulsões, coma, retardo psicomotor e retardo mental. Entretanto, os mecanismos fisiopatológicos da doença ainda não estão esclarecidos. Em estudos anteriores, realizados em nosso laboratório, observamos que os α-cetoácidos de cadeia ramificada modificaram a fosforilação dos filamentos intermediários em córtex cerebral de ratos wistar em diferentes idades, alteraram a morfologia de células gliais e provocaram estresse oxidativo em células de glioma C6. Neste estudo, nós investigamos o efeito in vitro dos aminoácidos de cadeia ramificada, nas concentrações encontradas nos pacientes afetados por DXB, sobre a fosforilação dos filamentos intermediários de córtex cerebral de ratos durante o desenvolvimento. Fatias de córtex cerebral de ratos wistar de 9, 12,17 e 21 dias foram incubadas com os aminoácidos Leu, Ile e Val na presença de 32P-ortofosfato, a fração citoesquelética foi extraída e a radioatividade incorporada pelas subunidades dos filamentos intermediários foi medida. Os resultados obtidos não demonstraram alterações significativas no parâmetro estudado. Também foram realizados estudos morfológicos em cultura de células C6 através de microscopia de contraste de fase e técnicas de imunocitoquímica. As células foram incubadas por 3, 12 ou 24 horas na presença ou na ausência dos AACR. Os resultados demonstraram que os AACR alteraram a morfologia das células de redondas para fusiformes com a presença de vários processos de um modo dependente do tempo e do tipo de AACR. A imunocitoquímica com anticorpos anti-actina e anti-proteína glial fibrilar ácida (GFAP) demonstrou que estes metabólitos induziram uma reorganização do citoesqueleto. Além disso, observamos morte celular intensa na presença dos AACR. Por outro lado, verificamos que não houve alteração de fosforilação da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) nas células C6, mas observamos que houve diminuição da glutationa e aumento da produção de óxido nítrico quando as células C6 foram incubadas por 3h com os AACR. Quando as células C6 foram tratadas com glutationa ou L-NAME e com os AACR estes antioxidantes foram capazes de prevenir as alterações metabólicas causadas por estes metabólitos, sugerindo o envolvimento do estresse oxidativo nas alterações causadas pelos AACR. Considerando que as células astrogliais são de fundamental importância para o desenvolvimento e o funcionamento do cérebro é provável que as alterações provocadas pelos AACR possam ter importantes conseqüências para a neurodegeneração característica dos pacientes portadores de DXB. / Maple syrup urine disease (MSUD) is a inherited disorder caused by a deficiency of the enzyme complex branched-chain α-keto acid dehydrogenase (BCKD), and consequently occurs the accumulation of branched-chain amino acids (BCAAs) leucine (Leu), isoleucina (Ile) and valine (Val), and theirs corresponding branched-chain α-keto acids (BCKAs) α-keto-isocaproic acid (KIC), α-keto-β-methyvaleric acid (CMV) and α- keto-isovaleric (KIV), that characterize the disease. Affected patients present severe neurological symptoms such as coma, psychomotor delay and mental retardation. However, the physiopathologic mechanisms are unknown. In previous studies carried through in our laboratory we observed that the BCKAs had modified the phosphorylation of the intermediate filaments (IF) in cerebral cortex of rats wistar in different ages. We also verified that these metabolites altered the morphology of glial cells and provoked oxidative stress in C6 cells. In this study, we investigate the in vitro effect of BCAAs, in the concentrations found in the patients affected with MSUD, on the phosphorylation of the IF from cerebral cortex of rats during development. Slices from cerebral cortex of wistar rats of 9, 12, 17 and 21 days were incubated with the amino acids Leu, Ile and Val in the presence of 32P-ortophosphate, the cytoskeleton fraction was extracted and the radioactivity incorporated into the subunits of the IF was measured. The results obtained do not demonstrate significant alterations in this studied parameter. We also performed morphologic studies in C6 cells through analyses of imunocitochemistry and phase contrast microscopy. The cells had been incubated for 3, 12 or 24 hours in the presence or the absence of the BCAAs. The results demonstrate that the BCAAs alter the morphology of the cells from rounded to fusiformes with the presence of some processes in a dependent way of the time and the type of BCAAs. The imunocitochemistry with anti-actin and antiglial fibrilary acid protein (GFAP) antibodies demonstrates that these metabolites induce a reorganization of cytoskeleton. Moreover, we observe intense cellular death in the presence of the BCAAs. On the other hand, we verify that it does not involve an alteration of the phosphorylation of GFAP in C6 cells. We also observe a reduction of glutathione and a increase of nitric oxide production when the cells were incubated for 3 hours with the BCAAs. When the C6 cells were treated with glutathione or L-NAME in the presence of the BCAAs these antioxidants were capable to prevent the metabolic alterations caused by these metabolites, suggesting the involvement of oxidative stress in the alterations caused by the BCAAs. Considering that the astroglials cells are have fundamental importance on the development and functioning of the brain it is feasible that the alterations provoked by the BCAAs have important consequences for the neurodegeneration characteristic of MSUD patients.

Uma elevação da concentração de amônia no sangue é tóxica e pode levar a convulsões, coma e morte. A suscetibilidade do cérebro em desenvolvimento a alterações neurológicas é maior do que no adulto. O citoesqueleto e, em particular, os filamentos intermediários (FIs) são um alvo de neurotoxinas e metabólitos tóxicos. No SNC temos os FIs neuronais, representados pelos neurofilamentos de alto, médio e baixo peso molecular (NF-H, NF-M, NF-L), e os astrocitários, proteína glial fibrilar ácida e vimentina (GFAP e VIM), entre outros. A fosforilação é uma modificação pós-traducional bem descrita como um dos principais mecanismos de regulação da dinâmica dos FIs. No presente trabalho, estudamos os efeitos de concentrações tóxicas de amônia sobre o citoesqueleto, com ênfase na homeostase do sistema fosforilante direcionado para os FIs e alguns mecanismos moleculares envolvidos nesses efeitos. Para tanto, utilizamos dois modelos experimentais de hiperamonemia aguda em animais de 10 e 21 dias de idade: in vivo e in vitro. No modelo in vivo, os animais foram injetados intraperitonealmente com acetato de amônio (7 mmol/Kg) e o nível de fosforilação das proteínas do citoesqueleto foi analisado no córtex cerebral e no hipocampo. No modelo in vitro, fatias de córtex cerebral e hipocampo de ratos nas mesmas idades foram incubadas com diferentes concentrações de NH4Cl. Nos dois modelos experimentais utilizados as alterações no sistema fosforilante foram dependentes da idade e da estrutura cerebral. A injeção de acetato de amônio não alterou o nível de fosforilação dos FIs no córtex cerebral de ratos de 10 dias, 30 e 60 min após a injeção. No entanto, observamos hipofosforilação dos FIs astrocitários (GFAP e VIM) e neuronais (NF-L, NF-M e NF-H) 30 min após a injeção, sendo que esse efeito foi revertido 60 min após a injeção. O sistema fosforilante associado aos FIs das células neurais de hipocampo não foi alterado com relação aos controles nas duas idades e nos dois tempos estudados. No modelo in vitro a resposta ao NH4Cl foi estrutura-dependente e dose-dependente para as concentrações de 0,5, 1 e 5 mM. Fatias de hipocampo de ratos de 10 dias de idade apresentaram hipofosforilação de GFAP, VIM e NFL em resposta à incubação com 5 mM de NH4Cl, sem alteração na homeostase do citoesqueleto nas células neurais de córtex cerebral. Por outro lado, fatias de córtex cerebral de ratos de 21 dias de idade apresentaram hipofosforilação dos FIs astrocitários (GFAP e VIM) sem alteração no sistema fosforilante direcionado aos FIs de hipocampo. A hipofosforilação em resposta a sinais celulares está frequentemente associada à ativação de proteínas fosfatases. Portanto, em uma tentativa de estudar as vias de sinalização buscamos identificar as fosfatases envolvidas no efeito do NH4Cl, utilizando fatias de córtex cerebral. As proteínas fosfatases 1 (PP1) e 2B (PP2B) foram ativadas em resposta a 5 mM de NH4Cl aos 30 min e esse evento envolveu alterações nos níveis intra e extracelulares de Ca2+ via ativação do sistema glutamatérgico por receptores N-metil-D-aspartato (NMDA). O conjunto dos nossos dados evidenciam a neurotoxicidade da amônia por meio de um desequilíbrio no sistema fosforilante direcionado para os FIs tanto neuronais quanto astrocitários e de uma desregulação nos mecanismos de sinalização celular envolvidos na homeostase do citoesqueleto de astrócitos. Essas alterações podem ser parte integrante dos danos neurológicos associados à hiperamonemia aguda, principalmente no cérebro em desenvolvimento, como retardo mental e paralisia cerebral. Acreditamos que esses resultados são relevantes para a compreensão das bases moleculares envolvidas com a toxicidade da amônia no SNC. / High ammonia levels in the blood are toxic to brain and can lead to seizures, coma and death. The susceptibility of the developing brain to neurological abnormalities is greater than in adults. The cytoskeleton and, in particular, the intermediate filaments (IFs) are a target of neurotoxins and toxic metabolites. The intermediate dilaments (IFs) in the CNS are mainly represented by neurofilaments of high, medium and light molecular weight (NF-H, NF-M, NF-L) in neurons, glial fibrillary acidic protein and vimentin (GFAP and VIM), in astrocytes. Phosphorylation is a post-translational modification described as one of the major mechanisms regulating the dynamics of IFs. In the present work, we studied the effects of toxic concentrations of ammonia on the cytoskeleton, with emphasis in the homeostasis of the phosphorylating system directed to the IFs and we focused in some molecular mechanisms involved in these effects. For this, we use two experimental models of acute hyperammonemia in animals of 10 and 21 days of age: in vivo and in vitro models. In the in vivo model, animals were injected intraperitoneally with ammonium acetate (7 mmol/Kg) and the phosphorylation level of the cytoskeletal proteins was analyzed in the cerebral cortex and hippocampus.The injected acetate did not alter the phosphorylation level of IFs in the cerebral cortex of 10 day-old rats, 30 and 60 min after injection. However, we noted hypophosphorylation of the astrocytic (GFAP and VIM) as well as neuronal IFs (NF-L, NF-M and NF-H) 30 min after injection, and this effect was reversed 60 min after injection. The phosphorylating system associated with IFs of neural cells of the hippocampus was not altered as compared with controls at both ages and in the two studied times. In the in vitro model, the response to NH4Cl was structure-dependent and dose-dependent at the concentrations of 0.5, 1 and 5 mM. Hippocampal slices of 10-day-old rats showed hypophosphorylation of GFAP VIM and NFL in response to incubation with 5 mM NH4Cl, and unaltered homeostasis of the phosphorylating system directed to the cytoskeleton in the neural cells of the cerebral cortex. On the other hand, slices of cerebral cortex of 21-day-old rats showed hypophosphorylation of astrocytic IFs (GFAP and VIM) without altering the phosphorylating system directed to hippocampal IFs. The hypophosphorylation in response to cellular signals is often associated with activation of protein phosphatases. Therefore, in an attempt to study the signaling pathways we seek identify phosphatases involved in the effect of NH4Cl, using cerebral cortex slices. The protein phosphatases 1 (PP1) and 2B (PP2B) were activated in response to 5 mM NH4Cl 30 min after injection and this event was associated with in intra and extracellular Ca2+ levels via activation of glutamate N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors. Taken together, our data show that the neurotoxicity of ammonia is directed to the phosphorylating imbalance of both neuronal as astrocytic IFs through disruption of the homeostasis of the NMDA-mediated signaling mechanisms of cortical astrocytes of 21-day-old rats. These changes may be part of the neurological damage associated with acute hyperammonemia, in the developing brain, as mental retardation and cerebral palsy. We believe that these results are relevant for understanding the molecular basis involved in the toxicity of ammonia in the CNS.

O telúrio é um elemento raro usado como componente industrial de muitas ligas. Estudos in vivo e in vitro demonstraram que compostos orgânicos do telúrio são neurotóxicos, entre eles podemos destacar o ditelureto de difenila [(PhTe)2]. Os efeitos provocados por esse organotelureto nos diferentes sistemas são importantes, no entanto, os observados no SNC são particularmente marcantes. Relatos têm demonstrado que o (PhTe)2 pode causar alterações no estado de fosforilação dos filamentos intermediários (FIs) neuronais e gliais, sendo os neurônios e astrócitos importantes alvos desse neurotoxicante. Considerando que o citoesqueleto é um importante alvo de neurotoxinas, nosso trabalho estudou o efeito do (PhTe)2 sobre alguns parâmetros bioquímicos do citoesqueleto neural. Ratos submetidos a uma injeção subcutânea de (PhTe)2 apresentaram alteração na fosforilação e/ou expressão das subunidades dos neurofilamentos (NF-H, NF-M e NF-L), da GFAP e da vimentina, bem como ativação das vias das MAPK e da PKA. Essas modificações são dependentes da estrutura estudada (cerebelo ou estriado) e da idade do animal. Além disso, uma única administração de (PhTe)2 em ratos jovens provocou morte neuronal e astrogliose. Quando o (PhTe)2 é administrado nas ratas mães durante os primeiros 14 dias de lactação verificamos que ocorre uma modificação no sistema fosforilante associado aos FIs nos filhotes, novamente de uma maneira estrutura (córtex cerebral, hipocampo, estrido ou cerebelo) e idade dependente. Além disso, verificou-se que esse organocalcogênio injetado nas ratas mães também age sobre as vias das MAPK e da PKA. Estudos in vitro mostraram que esse composto orgânico do telúrio causa hipofosforilação dos FIs neuronais e gliais no córtex cerebral. Esse efeito é mediado por alteração homeostase do cálcio e do glutamato, bem como pela inibição da PKA, alteração da fosforilação da proteína DARPP-32(Thr34) e ativação da PP1. No hipocampo temos uma ativação dos receptores glutamatérgicos ionotrópicos e metabotrópicos, acarretando uma alteração na homeostase do cálcio e ativação da PKC, PKCaMII e via das MAPK, conduzindo a um aumento de fosforilação dos FIs neuronais e gliais. Nossos resultados mostraram, portanto, que o (PhTe)2 altera a homeostase do citoesqueleto cerebral e que essa modificação é dependente do desenvolvimento do animal, da estrutura cerebral estudada, bem como da maneira de contato com esse neurotoxicante. Além disso, verificou-se o envolvimento de várias vias de sinalização nas ações desencadeadas pelo composto orgânico do telúrio sobre os FIs, estando elas muitas vezes interligadas. Esses resultados podem contribuir para o melhor entendimento dos mecanismos envolvidos em uma intoxicação com compostos de telúrio, sendo que o desequilíbrio do citoesqueleto pode estar associado à neurotoxicidade desse organotelureto. / Tellurium is a rare element used as a component of many industrial alloys. In vivo and in vitro studies have demonstrated that organic tellurium compounds are neurotoxic. We can highlight the organic coumpoud diphenyl ditelluride [(PhTe)2]. The effects caused by this organoteluride in different systems are important, however, the effects observed in the CNS are particularly striking. Reports have shown that (PhTe)2 can induces changes in the phosphorylation state of neuronal and glial intermediate filaments (IFs). The neurons and astrocytes are important targets of this neurotoxin. Considering that the cytoskeleton is an important target for neurotoxins, the aim of the present study was studied the effect of (PhTe)2 on some biochemical parameters of the neural cytoskeleton. Rats treated with a single subcutaneous (s.c.) injection of (PhTe)2 showed changes in the phosphorylation and / or expression of neurofilament subunit (NF-H, NF-M and NF-L), GFAP and vimentin, as well as activation of the MAPK pathway and PKA. These changes are dependent on the structure studied (cerebellum or striatum) and age of the animal. Furthermore, a single administration (PhTe)2 in young rats caused neuronal death and astrogliosis. When (PhTe)2 is administered in dams during the first 14 days of lactation we observed a change in the phosphorylating system associated with IFs in pups. This effect is dependent of the structure studied and the developmental stages of the pups. Furthermore, it was found that (PhTe)2 is administered in dams during the first 14 days of lactation also acts on the MAPK pathway and in the PKA. In vitro studies showed that the organic tellurium causes hipophosphorylation of the neuronal and glial IFs proteins in the cerebral cortex. This effect is mediated by change in calcium and glutamate homeostasis, inhibition of PKA, desphosphorylation of the protein DARPP-32 (Thr34) and activation of PP1. In the hippocampus have an activation of ionotropic and metabotropic glutamatergic receptors, causing an alteration in calcium homeostasis and activation of PKC, PKCaMII and MAPK pathway, leading to increased phosphorylation of neuronal and glial IFs. The results of this work showed that the (PhTe)2 changes cytoskeletal homeostasis in brain. This modification is dependent of the animal development, the brain structure studied, as well as the way of contact with the neurotoxin. Moreover, there is the involvement of different signaling pathways in the action of (PhTe)2 and they are often interconnected. These results may contribute to a better understanding of mechanisms involved in intoxication with tellurium compounds. The imbalance of the cytoskeleton may be associated with neurotoxicity of this organochalcogenide.

A homocistinúria (HHCY) é uma desordem metabólica causada algum tipo de deficiência no metabolismo da metionina, folato ou vitamina B12, resultando no acúmulo tecidual de homocisteína (Hcy) e de metionina. Os pacientes afetados por essa doença apresentam principalmente retardo mental, isquemia cerebral, convulsões e aterosclerose. Vários mecanismos têm sido propostos para explicar a relação entre HHCY e desordens no sistema nervoso, entre eles podemos destacar mecanismos glutamatérgicos, mobilização de Ca+2 e envolvimento de espécies reativas de oxigênio (ROS). Considerando que o citoesqueleto é um importante alvo para a sinalização celular em inúmeras doenças neurodegenerativas, nosso estudo investigou os possíveis efeitos tóxicos da Hcy sobre alguns parâmetros bioquímicos do citoesqueleto neural. Ratos submetidos a um tratamento crônico com Hcy apresentam uma marcada seletividade na alteração da expressão gênica das subunidades dos filamentos intermediários (FIs) estudados, tanto no extrato tecidual total como na fração citoesquelética de hipocampo e córtex cerebral, refletindo uma maior susceptibilidade do hipocampo nessas alterações. Estudos in vitro mostraram que a Hcy 100 e 500 μM, relacionadas a homocistinuria (HHCY) moderada e grave respectivamente, são capazes de causar hiper (Hcy 100 μM) ou hipofosforilação (Hcy 500 μM) das subunidades dos neurofilamentos e da proteina glial fibrilar ácida, FIs do citoesqueleto de neurônios e astrócitos respectivamente. Estes efeitos são dependentes da idade dos ratos e da estrutura cerebral, manifestando-se em hipocampo de ratos de 17 dias de idade. Resultados em fatias de hipocampo mostraram que a ação das duas concentrações de Hcy é mediada por mecanismos dependentes do influxo de Ca2+ por receptores NMDA e por canais de Ca2+ dependentes de voltagem, assim como da liberação de Ca2+ dos estoques intracelulares, enfatizando a alta suscetibilidade e complexidade das vias de sinalização ativadas por Ca2+ no hipocampo. Além disso, estudos morfológicos em astrócitos e células de glioma C6 mostraram que células glias em cultura também são alvo para as ações da Hcy, reorganizando seu citoesqueleto e alterando o sistema fosforilante associado ao mesmo através de mecanismos envolvendo excitotoxicidade, estresse oxidativo e mecanismos glutamatérgicos. Estes estudos mostram que a integridade estrutural do citoesqueleto é da maior importância para o funcionamento neuronal e qualquer distúrbio na dinâmica desta estrutura poderia ativar processos de reparação plástica manifestados como alterações na expressão, localização e metabolismo das proteínas do citoesqueleto. No entanto, os mecanismos através dos quais o desequilíbrio do citoesqueleto é capaz de induzir a disfunção neural ainda não foram esclarecidos e a exata dimensão destas alterações precisa ser determinada. / The homocystinuria (HHCY) is a metabolic disorder caused by deficiency in the metabolism of methionine, vitamin B12 or folate, which leads to tissue accumulation of homocysteine (Hcy) and methionine. Homocystinuric patients usually present mental retardation, cerebral ischemia, seizures, and atherosclerosis. Several mechanisms have been proposed to explain the relationship between HHCY and nervous system disorders, among them we can highlight glutamatergic mechanisms, mobilization of Ca+2 and involvement of reactive oxygen species (ROS). Considering that the cytoskeleton is an important target for cellular signaling in many neurodegenerative diseases, our study investigated the possible toxic effects of Hcy on some biochemical parameters of the neural cytoskeleton. Initially, we demonstrated that rats subjected to chronic model of Hcy showed a marked selectivity in alterations of gene expression, total immunocontent and cytoskeletal fraction of subunits of intermediate filaments (IFs) studied, reflecting a greater susceptibility of the hippocampus in these changes. In vitro studies showed that 100 and 500 μM Hcy associated with moderate and severe HHCY respectively, was able to induced hyperphosphorylation (Hcy 100 μM) and hypophosphorylation (Hcy 500 μM) of neurofilaments subunits and glial fibrillary acidic protein, IFs of neuronal and astrocytic cytoskeleton. These effects are dependentents of age and cerebral structure of rats: hippocampus of 17 day old rats are sensible. Results in slices of hippocampus showed that the action of Hcy is mediated by mechanisms dependent of influx of Ca2+ by NMDA receptors and Ca2+ channels voltage-dependent and release of Ca2+ from intracellular stores, emphasizing the high susceptibility and complexity of signaling pathways activated by Ca2+ in the hippocampus. In addition, glial cells were also target for the actions of Hcy, reorganizing their cytoskeleton and changing the phosphorylation system associated to cytoskeleton through mechanisms involving excitotoxicity, oxidative stress and glutamatergic mechanisms. The cytoskeleton may represent a target to HHCY and your dysfunction can have an important role in neurodegeneration characteristic of the disease. However, the mechanisms by which disruption of the cytoskeleton proteins is able to induce neural dysfunction have not yet been clarified and the exact extent of these changes need to be determined.

Orientador : Laura Maria Mariscal Ottoboni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-28T10:28:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Machado_EdnaLobo_M.pdf: 8817376 bytes, checksum: b4419889c5d139f715652a53bb461fa3 (MD5) Previous issue date: 2001 / Mestrado