As proteínas fosfatases desempenham um papel fundamental na modificação pós-traducional reversível de proteínas por fosforilação, ao atuarem na remoção do grupo fosforil estável de resíduos de serina, treonina e tirosina. Embora predominem em eucariotos, as serina/treonina fosfatases (STPs) também existem em bactérias, nas quais atuam controlando diversos aspectos fisiológicos e de virulência. Neste trabalho investigamos o papel das STPs na virulência e fisiologia de Chromobacterium violaceum, uma ?-proteobactéria que atua como um patógeno ocasional de humanos e é amplamente encontrada em água e solos de regiões tropicais e subtropicais. Análises in silico revelaram a presença de quatro STPs no genoma de C. violaceum, sendo que duas possuem apenas o domínio de fosfatase (CV_0881 e CV_3848) e duas possuem um domínio adicional de regulador de resposta (CV_2644 e CV_3505). Mutantes nulos foram construídos para as quatro STPs e todas estas linhagens apresentaram crescimento semelhante ao da linhagem selvagem em meio rico e meio mínimo. As linhagens mutantes ?0881, ?2644 e ?3505 não apresentaram alteração de virulência em camundongos. Os mutantes ?2644 e ?3505 apresentaram menor formação de biofilme, o que sugere papel dessas fosfatases neste processo. Uma caracterização mais aprofundada da linhagem ?3848 por diferentes técnicas de microscopia revelou que este mutante apresenta células de tamanho diminuído, irregularidades no envelope celular e problemas na distribuição do DNA. Estes dados sugerem que CV_3848 tem papel em divisão celular, condensação do material genético e manutenção da parede celular. Nos ensaios de virulência o mutante ?3848 mostrou menor capacidade de causar morte e manter-se no fígado de camundongos, indicando que a STP CV_3848 é importante na patogenicidade de C. violaceum. / Protein phosphatases play a key role in reversible post-translational modification of proteins through phosphorylation since they act removing the stable phosphoryl group of serine, threonine and tyrosine residues. Although dominant in eukaryotes, the serine/threonine phosphatases (STPs) also exist in bacteria, in which they act by controlling various physiological and virulence traits. In this work we investigated the role of STPs on the virulence and physiology of Chromobacterium violaceum, a ?-proteobacterium that occasionally acts as a pathogen of humans and it is widely found in water and soil of tropical and subtropical regions. In silico analyzes revealed the presence of four STPs in the genome of C. violaceum, two of which have only the phosphatase domain (CV_0881 and CV_3848) and two that possess an additional domain of response regulator (CV_2644 and CV_3505). Null mutants were constructed for the four STPs and all of them showed similar growth to the wild type strain on rich and minimal medium. The mutant strains ?0881, ?2644 and ?3505 did not show any change in virulence in mice. The ?2644 and ?3505 mutants had lower biofilm formation, suggesting the role of these phosphatases in this process. Further characterization of ?3848 by different microscopy techniques revealed that this mutant presents cells of diminished size, irregularities in the cellular envelope and problem on the DNA distribution. These data suggest that CV_3848 has role in cell division, condensation of the genetic material and cell wall maintenance. In virulence assays the ?3848 mutant showed a lower ability to cause death and to remain in the liver of mice, indicating that the STP CV_3848 is important for the pathogenicity of C. violaceum.

A fosforilação de proteínas é o tipo de modificação pós-traducional mais recorrente nas vias de sinalização, desempenhando papel central numa vasta gama de eventos celulares. Um completo entendimento das circunstâncias que coordenam o evento de fosforilação permanece como um desafio para a ciência, a despeito do crescente número de abordagens e estudos realizados no assunto. Um mecanismo largamente descrito e aceito como essencial para coordenar a fosforilação de proteínas é a existência de sequências de aminoácidos que facilitam a fosforilação, conhecidos como consensos de fosforilação. Nesse modelo, cada proteína quinase reconhece sítios de fosforilação se os mesmos estiverem inseridos em uma sequência específica de resíduos na estrutura primária do substrato. Porém, com o crescente volume de dados sobre fosforilação, é possível notar a existência de sítios que são validados experimentalmente como fosforilados por uma determinada proteína quinase, que não apresentam o consenso de fosforilação. Neste trabalho, foi testada e comprovada a hipótese de que estes sítios de fosforilação sem consenso sequencial apresentam resíduos localizados em regiões da estrutura terciária adjacentes ao sítio de fosforilação, cuja as características estereoquímicas mimetizam um peptídeo substrato contendo o consenso de fosforilação. Para essa avaliação, utilizando substratos da PKA, foi constatado que mais de 90% dos sítios de fosforilação que não apresentam o consenso na estrutura primária, apresentam essa disposição na estrutura terciária. Resíduos distantes na estrutura primária se apresentam próximos espacialmente na estrutura tridimensional, em uma conformação semelhante a de um sítio com o consenso de fosforilação. Com isso nós propomos a existência de sítios conformacionais de fosforilação. Para confirmar que esses sítios conformacionais poderiam ser cruciais no reconhecimento do substrato, foram construídos modelos da interação da proteína quinase com os substratos, visando demonstrar a viabilidade da interação dos resíduos formadores do consenso conformacional com a proteína quinase de maneira análoga a de um substrato com o consenso de fosforilação. Para a comprovação experimental do fenômeno, foi utilizado o modelo de fosforilação da -Tubulina, no qual foi constatada uma fosforilação no resíduo T253 que depende da atuação dos resíduos K163 e K164 para a interação com a proteína quinase, confirmando a coerência do modelo proposto. Diante da novidade da proposta, dos estudos computacionais feitos e da validação conseguida, torna-se clara a relevância de se estudar a estrutura tridimensional dos substratos de fosforilação, não só como uma forma de aprofundar os conhecimentos gerais na área de fosforilação, mas também como uma alternativa com potencial de ser explorada no desenvolvimento de novas tecnologias / Protein phosphorylation is the most frequent type of post-translational modification in signaling pathway, developing a key role in a wide range of cell events. The full understanding of the circumstances that coordinate the phosphorylation event remains a challenge for science, despite the growing number of approaches and studies on the subject. A broadly described and accepted mechanism as essential for the coordination of protein phosphorylation is the existence of amino acids sequences that contribute to phosphorylation occurrence, known as phosphorylation consensus. In this model, each protein kinase is able to recognize phosphorylation sites inserted in a specific sequence on the primary structure. However, as the data about phosphorylation sites increases, it is possible to notice that there are sites that are validated experimentally as phosphorylated by a particular protein kinase, which do not have the consensus phosphorylation. In this work, it was tested and proved that phosphorylation sites without the sequence consensus presents anchors residues, that are close to the phosphorylation site on the tertiary structure, creating a structural conformation that mimics the stereochemical features of a substrate peptide containing the phosphorylation consensus. For this evaluation, using substrates of PKA, it was found that more than 90% of phosphorylation sites that have no consensus on the primary structure, presented this kind of disposition on the tertiary structure. Distant residues in the primary structure are spatially close on the three-dimensional structure, in a conformation similar to a phosphorylation site containing the consensus. Thus we proposed the existence of conformational phosphorylation sites. To confirm that these conformational sites could be crucial in substrate recognition, it was built kinase-substrate models, aiming to demonstrate the feasibility of residues forming the conformational consensus on the substrate to interact with the kinase analogously to a substrate with consensus phosphorylation. For experimental verification of this phenomenon, we used the phosphorylation model of -Tubulin, in which we observed a phosphorylation at residue T253 that depends of residues K163 and K164 to interact with the protein kinase, confirming the consistency of proposed model. Faced with the novelty of the proposal, the computational data and the experimental validation, it becomes clear the importance of studying the three dimensional structure of phosphorylation sites, not only as a way of achieving deeper knowledge on phosphorylation field, but also as a potential prospect to be explored on the development of new technologies

A fosforilação de proteínas é o tipo de modificação pós-traducional mais recorrente nas vias de sinalização, desempenhando papel central numa vasta gama de eventos celulares. Um completo entendimento das circunstâncias que coordenam o evento de fosforilação permanece como um desafio para a ciência, a despeito do crescente número de abordagens e estudos realizados no assunto. Um mecanismo largamente descrito e aceito como essencial para coordenar a fosforilação de proteínas é a existência de sequências de aminoácidos que facilitam a fosforilação, conhecidos como consensos de fosforilação. Nesse modelo, cada proteína quinase reconhece sítios de fosforilação se os mesmos estiverem inseridos em uma sequência específica de resíduos na estrutura primária do substrato. Porém, com o crescente volume de dados sobre fosforilação, é possível notar a existência de sítios que são validados experimentalmente como fosforilados por uma determinada proteína quinase, que não apresentam o consenso de fosforilação. Neste trabalho, foi testada e comprovada a hipótese de que estes sítios de fosforilação sem consenso sequencial apresentam resíduos localizados em regiões da estrutura terciária adjacentes ao sítio de fosforilação, cuja as características estereoquímicas mimetizam um peptídeo substrato contendo o consenso de fosforilação. Para essa avaliação, utilizando substratos da PKA, foi constatado que mais de 90% dos sítios de fosforilação que não apresentam o consenso na estrutura primária, apresentam essa disposição na estrutura terciária. Resíduos distantes na estrutura primária se apresentam próximos espacialmente na estrutura tridimensional, em uma conformação semelhante a de um sítio com o consenso de fosforilação. Com isso nós propomos a existência de sítios conformacionais de fosforilação. Para confirmar que esses sítios conformacionais poderiam ser cruciais no reconhecimento do substrato, foram construídos modelos da interação da proteína quinase com os substratos, visando demonstrar a viabilidade da interação dos resíduos formadores do consenso conformacional com a proteína quinase de maneira análoga a de um substrato com o consenso de fosforilação. Para a comprovação experimental do fenômeno, foi utilizado o modelo de fosforilação da -Tubulina, no qual foi constatada uma fosforilação no resíduo T253 que depende da atuação dos resíduos K163 e K164 para a interação com a proteína quinase, confirmando a coerência do modelo proposto. Diante da novidade da proposta, dos estudos computacionais feitos e da validação conseguida, torna-se clara a relevância de se estudar a estrutura tridimensional dos substratos de fosforilação, não só como uma forma de aprofundar os conhecimentos gerais na área de fosforilação, mas também como uma alternativa com potencial de ser explorada no desenvolvimento de novas tecnologias / Protein phosphorylation is the most frequent type of post-translational modification in signaling pathway, developing a key role in a wide range of cell events. The full understanding of the circumstances that coordinate the phosphorylation event remains a challenge for science, despite the growing number of approaches and studies on the subject. A broadly described and accepted mechanism as essential for the coordination of protein phosphorylation is the existence of amino acids sequences that contribute to phosphorylation occurrence, known as phosphorylation consensus. In this model, each protein kinase is able to recognize phosphorylation sites inserted in a specific sequence on the primary structure. However, as the data about phosphorylation sites increases, it is possible to notice that there are sites that are validated experimentally as phosphorylated by a particular protein kinase, which do not have the consensus phosphorylation. In this work, it was tested and proved that phosphorylation sites without the sequence consensus presents anchors residues, that are close to the phosphorylation site on the tertiary structure, creating a structural conformation that mimics the stereochemical features of a substrate peptide containing the phosphorylation consensus. For this evaluation, using substrates of PKA, it was found that more than 90% of phosphorylation sites that have no consensus on the primary structure, presented this kind of disposition on the tertiary structure. Distant residues in the primary structure are spatially close on the three-dimensional structure, in a conformation similar to a phosphorylation site containing the consensus. Thus we proposed the existence of conformational phosphorylation sites. To confirm that these conformational sites could be crucial in substrate recognition, it was built kinase-substrate models, aiming to demonstrate the feasibility of residues forming the conformational consensus on the substrate to interact with the kinase analogously to a substrate with consensus phosphorylation. For experimental verification of this phenomenon, we used the phosphorylation model of -Tubulin, in which we observed a phosphorylation at residue T253 that depends of residues K163 and K164 to interact with the protein kinase, confirming the consistency of proposed model. Faced with the novelty of the proposal, the computational data and the experimental validation, it becomes clear the importance of studying the three dimensional structure of phosphorylation sites, not only as a way of achieving deeper knowledge on phosphorylation field, but also as a potential prospect to be explored on the development of new technologies

O receptor P2X4 (canal iônico controlado por adenosina-5\'-trifosfato-ATP) está amplamente distribuído no sistema nervoso central e, após sua ativação, pode regular os níveis de cálcio intracelulares via permeação direta e por ativação de canais de cálcio voltagem-dependentes. Tem sido proposto que a atividade do receptor pode ser importante na plasticidade sináptica. Tendo em vista a importância do receptor P2X4, sobretudo na fisiologia do sistema nervoso central, é útil caracterizá-lo farmacologicamente e entender os mecanismos moleculares que regulam sua atividade. Examinamos o papel que resíduos específicos N- e C-terminais desempenham na atividade do receptor P2X4 humano, combinando técnicas de biologia molecular, bioquímica e patch-clamp em células de rim de embrião humano (células HEK-293T). Células HEK-293T expressando o receptor P2X4 wild-type apresentaram correntes iônicas, cujas amplitudes dependeram da concentração de ATP, fornecendo um valor de EC50 de 1,37 ± 0,21 µM. Os receptores mutantes E14A e D16A exibiram respostas ao ATP equiparáveis àquelas do receptor selvagem, ao passo que os mutantes Y15A e T17A não foram funcionais, apesar de serem expressos na membrana plasmática das células. A inibição de tirosina fosfatases por pervanadato diminuiu fortemente correntes induzidas por ATP. Subsequente análise de citometria de fluxo na presença de um anticorpo contra resíduos de fosfotirosina indicaram que, entre as células que expressam o receptor P2X4, a percentagem de células fosfo-tirosina-positivas é a mesma para os mutantes Y372A (86 ± 10%) e Y378A (79 ± 6.9%), mas substancialmente menor para os mutantes Y15A (35 ± 12%), Y367A (48 ± 6.4%) e Y372F (31 ± 1.7%), quando comparados com células que expressam o receptor wild-type (76 ± 5.6%). Resultados semelhantes foram obtidos quando quantificamos a expressão relativa de proteínas fosforiladas em resíduos de tirosina e expressamos através dos valores de intensidade de fluorescência média. Ensaios de western-blot revelaram que mesmo o mutante T17A é fosforilado em resíduos de treonina, sugerindo que o receptor P2X4 contém outros sítios de fosforilação. Entretanto, nenhum sinal de fosfotirosina foi detectado no receptor wild-type e nos mutantes, em que resíduos de tirosina foram substituídos por alanina ou fenilalanina. Não parece ser o resíduo Y15 o alvo de tal fosforilação, cabendo a ele um papel estrutural mais importante. Nossos dados também sugerem que a fosforilação em resíduos de tirosina de proteínas intermediárias regula a atividade do receptor P2X4. / The human P2X4 receptor (ATP-gated ion channel) is widely distributed in the CNS and, after activation, participates in regulation of levels of intracellular calcium through direct permeation and activation of voltage-dependent calcium channels with well-defined functions including synaptic plasticity. Given the importance of the P2X4 receptor, especially in CNS physiology, we investigated the role that specific N- and C-termini residues play in human P2X4 receptor activity, by combining techniques of molecular biology, biochemistry and patch-clamping in human embryonic kidney cells (HEK-293T cells). HEK-293T cells expressing the wild-type P2X4 receptor showed ionic currents whose amplitudes depended on the ATP concentration, providing an EC50 value of 1.37 ± 0.21 mM. E14A and D16A receptor mutants exhibited responses to ATP comparable to those ones of wild-type receptor, whereas Y15A and T17A mutants were not functional, despite being expressed in the plasma membrane of cells. The inhibition of tyrosine phosphatases by pervanadate decreased strongly ATP-induced currents. Subsequent flow cytometry analysis in the presence of an antibody against phosphotyrosine residues indicated that, among the cells that express the P2X4 receptor, the percentage of phosphotyrosine-positive cells was the same for Y372A (86 ± 10%) and Y378A (79 ± 6.9%) mutants, however, substantially lower for Y15A (35 ± 12%), Y367A (48 ± 6.4%) and Y372F (31 ± 1.7%) mutants when compared with cells expressing the wild-type receptor (76 ± 5.6%). Similar results were obtained by quantifying the relative expression of phosphotyrosine proteins. Western blot assays revealed that even the T17A mutant was phosphorylated at threonine residues, suggesting that the human P2X4 receptor also contains further phosphorylation sites. However, no phosphotyrosine-antibody signal was detected in the wild-type receptor and mutants in which tyrosine residues were replaced by alanine or phenylalanine. The residue Y15 is supposedly not the target of such phosphorylation, despite its important structural role. However, the present work indicates that tyrosine phosphorylation of intermediate signaling proteins regulates P2X4 receptor activity.

Estudos têm demonstrado a importância da mitocôndria para a funcionalidade do espermatozoide, referindo-a como a principal fonte de energia para a motilidade e a homeostase celular. No entanto, para algumas espécies animais, estudos recentes indicam que a glicólise parece ser o principal mecanismo de produção de ATP para a motilidade espermática, superior à fosforilação oxidativa. Em ovinos estudos envolvendo o metabolismo energético do espermatozoide são necessários não apenas pelo seu interesse zootécnico, mas também como modelo experimental para bovino, espécie na qual este mecanismo é também pouco conhecido. Apesar da importância da mitocôndria para o metabolismo celular durante a fosforilação oxidativa, são produzidos metabólitos denominados Espécies Reativas de Oxigênio, as quais possuem um papel fundamental em diversos processos fisiológicos. No entanto, um eventual desequilíbrio entre a produção de EROs e os mecanismos antioxidantes caracteriza o estresse oxidativo, que pode ser letal para as células espermáticas. Ademais, estudos anteriores relacionam as disfunções mitocondriais causadas pela criopreservação espermática ao estresse oxidativo e a diminuição da atividade mitocondrial. Desta forma, acreditamos que injúrias mitocondriais durante a criopreservação são a origem da produção excessiva de fatores pró-oxidativos e, em última análise, causadores dos danos espermáticos pós-descongelação e diminuição da motilidade. Em face do exposto, a hipótese central do presente experimento é que o espermatozoide ovino, após despolarização mitocondrial por desacoplamento da fosforilazação oxidativa e suplementação para a glicólise, é capaz de manter a produção de ATP e, consequentemente, a motilidade espermática. Ainda, um leve desacoplamento mitocondrial é benéfico para os espermatozoides durante a criopreservação por diminuir as crioinjúrias mediadas por disrupções mitocondriais. Em relação aos nossos estudos de fisiologia, observamos no experimento 1 que os espermatozoides ovinos, mesmo apresentando suas mitocôndrias despolarizadas são capazes de manter a motilidade total. Este resultado nos sugere que a via glicolítica possivelmente é capaz de manter a motilidade espermática. Por outro lado, o desacolpamento mitocondrial alterou os padrões do movimento espermático, nos sugerindo que a mitocôndria possui um papel mais importante na qualidade do movimento espermático do que na motilidade total. Ainda, no experimento 2 observamos que a via glicolítica, após ser estimulada, é capaz de manter os níveis de ATP, os padrões de cinética espermática e a homeostase oxidativa dos espermatozoides epididimários bovinos submetidos ao desacoplamento mitocondrial. Em relação ao nosso estudo aplicado (experimento 3), observamos que os espermatozoides ovinos criopreservados submetidos à um leve desacoplamento mitocondrial concomitantemente à estimulação da via glicolítica apresentaram maior motilidade, menor peroxidação lipídica, menor susceptibilidade da cromatina à denaturação ácida e maior potencial de membrana mitocondrial. Estes resultados nos indicam que um leve desacoplamento mitocondrial durante a criopreservação espermática é capaz de proteger as mitocôndrias contra as crioinjúrias e consequentemente melhorar a qualidade espermática pós-descongelação. / Studies have demonstrated the importance of mitochondria in the sperm functionality, referring to it as the main source of energy for motility and cellular homeostasis. However, for some animal species, recent studies indicate that glycolysis seems to be the main mechanism ATP production for sperm motility, higher than the oxidative phosphorylation. In ovine studies involving energy metabolism of sperm are required not only for their livestock interest, but also as an experimental model for bovine species in which this mechanism is also unknown. Despite the importance of mitochondria for cellular metabolism during oxidative phosphorylation, they are produced metabolites called reactive oxygen species, which have a key role in many physiological processes. However, any imbalance between ROS and antioxidant mechanisms characterizes oxidative stress, which may be lethal for the sperm cells. Moreover, previous studies relate to mitochondrial dysfunction caused by oxidative stress on sperm cryopreservation and decreased mitochondrial activity. Thus, we believe that mitochondrial injury during cryopreservation are the source of excessive production of pro-oxidative factors and ultimately, causing the post-thaw sperm damage and decrease in motility. In view of the above, the central hypothesis of this experiment is that the ovine sperm after mitochondrial depolarization by uncoupling of oxidative phosphorylation and glycolysis supplementation is capable of maintaining the ATP production and consequently sperm motility. Additionally, a mild mitochondrial uncoupling is beneficial for spermatozoa during cryopreservation by decreasing the cryoinjuries mediated by mitochondrial disruption. Regarding our physiology studies, we observed in experiment 1 that the ovine sperm, even with their depolarized mitochondria are able to maintain total motility. This result suggests that the glycolytic pathway is possibly able to maintain motility. Moreover, the fact that mitochondrial uncoupling altered sperm movement patterns suggests that mitochondria has a more important role in the quality of sperm kinetic than the total motility. Furthermore, in the experiment 2 we observed that glycolytic pathway, after being stimulated, is able to maintain ATP levels, sperm kinetics patterns and oxidative homeostasis of bovine epididymal spermatozoa submitted to mitochondrial uncoupling. Regarding our applied study (Experiment 3), we observed that cryopreserved ovine sperm submitted to mild mitochondrial uncoupling concurrently with glycolysis stimulation showed increased motility, lower lipid peroxidation, lower susceptibility of chromatin to acid denaturation and higher mitochondrial membrane potential. These results indicate that a slight mitochondrial uncoupling during sperm cryopreservation can protect mitochondria against cryoinjuries and hence improve the post-thaw spermatozoa quality.

A cana-de-açúcar é uma gramínea C4 da família das Poaceae. Sua principal característica é a capacidade de estocar altas concentrações de sacarose no colmo. Devido à sua alta atividade fotossintética, ela consegue converter uma boa parte da radiação solar em biomassa. Assim, ela pode ser considerada um dos melhores modelos para os estudos da relação fonte-dreno. O Brasil é um dos maiores produtores e exportadores de álcool do mundo, e por isso a cana-de-açúcar é considerada uma das principais culturas atuais. A ausência de informações sobre a sua sequência genômica levou à criação do programa SUCEST no final de 1990, onde foram disponibilizadas aproximadamente 240,000 sequências denominadas ESTs (Expression Sequence Tags), uma cobertura de quase 90% do genoma expresso da cana-de-açúcar. Desta forma, foi possível desenvolver uma plataforma de microarranjo Agilent de oligonucleotídeos com componentes do SUCEST. Por meio do programa de melhoramento da RIDESA e a análise por microarranjos, foi possível a identificação de vias metabólicas que podem estar relacionadas com a regulação do acúmulo de sacarose em cana-de-açúcar, principalmente aquelas que envolvem os fitormônios auxina e etileno. A obtenção de dados agrotecnológicos e de fisiologia permitiu a observação de um trade off metabólico, onde o acúmulo de sacarose parece ocorrer em detrimento do acúmulo de fibra. A obtenção de plantas silenciadas e superexpressando uma quinase da família da SnRK1 levou, através da análise de microrarranjos, a identificação de genes diferencialmente expressos envolvidos no estresse por seca como uma PP2C e deidrina. Nas plantas superexpressando uma SnRK1, há um aumento do conteúdo de sacarose na planta 88, que talvez indique que a superexpressão dessa quinase leve a um aumento do conteúdo de sacarose em cana. Com a obtenção de sequências genômicas acima do sítio de início da transcrição dessa mesma SnRK1, e de uma subunidade regulatória Akinβγ, foi possível identificar por análise computacional sequências conservadas envolvidas na regulação hormonal, resposta à seca e reações de luz, indicando que a transcrição desse gene pode resultar de diferentes respostas da planta. Esse trabalho permitiu novas diretrizes no estudo do acúmulo de sacarose no colmo, indicando que vias de transdução de sinais conservadas, mediadas por hormônios e fosforilação, podem ser as principais responsáveis por esse fenômeno em cana-de-açúcar. / The sugarcane is a C4 grass of the Poaceae family. Its main feature is the ability to store high sucrose concentrations in the culm. Due to the elevated photosynthetic activity, it can convert a great portion of solar radiation into biomass. Thus, it can be considered one of the best models for studies of source-sink relationship. Brazil is one of the largest alcohol producers and exporters in the world, and sugarcane is considered one of the main current cultivars. The absence of information about its genome sequence led to the creation of the SUCEST program in late 1990, from which approximately 240,000 sequences called ESTs (Expression Sequence Tags) were made available, with a coverage of almost 90% of the sugarcane expressed genome. Thus, it was possible to develop a microarray platform with Agilent oligonucleotide with SUCEST components. Through the RIDESA improvement program and microarray analysis, it was possible to identify metabolic pathways that may be related to the regulation of sugarcane sucrose accumulation, especially those involving the plant hormones auxin and ethylene. The agro-technological and physiology data allowed the observation of a metabolic trade-off, where the sucrose accumulation appears to occur at the expense of fiber accumulation. The production of plants that are silenced or overexpressing a kinase from SnRK1 family, led by microrarray analysis, allowed the identification of differentially expressed genes that are involved in drought stress, such as a PP2C and dehydrin. In plants overexpressing a SnRK1, there is an increased sucrose content in the plant 88, which may indicate that overexpression of this kinase leads to an increase in leaf sucrose content. After obtaining the genomic sequence above the transcription start site of the same SnRK1, and a regulatory subunit Akinβγ, it was possible to identify by computer analysis conserved sequences involved in regulating hormonal response to dry and light responses, indicating that the gene transcription may arise from different plant responses. This work allowed new guidelines in the study of sucrose accumulation in the culm, suggesting that conserved signal transduction pathways and hormone mediated phosphorylation may be the main reason for this phenomenon in sugarcane.

O receptor P2X4 (canal iônico controlado por adenosina-5\'-trifosfato-ATP) está amplamente distribuído no sistema nervoso central e, após sua ativação, pode regular os níveis de cálcio intracelulares via permeação direta e por ativação de canais de cálcio voltagem-dependentes. Tem sido proposto que a atividade do receptor pode ser importante na plasticidade sináptica. Tendo em vista a importância do receptor P2X4, sobretudo na fisiologia do sistema nervoso central, é útil caracterizá-lo farmacologicamente e entender os mecanismos moleculares que regulam sua atividade. Examinamos o papel que resíduos específicos N- e C-terminais desempenham na atividade do receptor P2X4 humano, combinando técnicas de biologia molecular, bioquímica e patch-clamp em células de rim de embrião humano (células HEK-293T). Células HEK-293T expressando o receptor P2X4 wild-type apresentaram correntes iônicas, cujas amplitudes dependeram da concentração de ATP, fornecendo um valor de EC50 de 1,37 ± 0,21 µM. Os receptores mutantes E14A e D16A exibiram respostas ao ATP equiparáveis àquelas do receptor selvagem, ao passo que os mutantes Y15A e T17A não foram funcionais, apesar de serem expressos na membrana plasmática das células. A inibição de tirosina fosfatases por pervanadato diminuiu fortemente correntes induzidas por ATP. Subsequente análise de citometria de fluxo na presença de um anticorpo contra resíduos de fosfotirosina indicaram que, entre as células que expressam o receptor P2X4, a percentagem de células fosfo-tirosina-positivas é a mesma para os mutantes Y372A (86 ± 10%) e Y378A (79 ± 6.9%), mas substancialmente menor para os mutantes Y15A (35 ± 12%), Y367A (48 ± 6.4%) e Y372F (31 ± 1.7%), quando comparados com células que expressam o receptor wild-type (76 ± 5.6%). Resultados semelhantes foram obtidos quando quantificamos a expressão relativa de proteínas fosforiladas em resíduos de tirosina e expressamos através dos valores de intensidade de fluorescência média. Ensaios de western-blot revelaram que mesmo o mutante T17A é fosforilado em resíduos de treonina, sugerindo que o receptor P2X4 contém outros sítios de fosforilação. Entretanto, nenhum sinal de fosfotirosina foi detectado no receptor wild-type e nos mutantes, em que resíduos de tirosina foram substituídos por alanina ou fenilalanina. Não parece ser o resíduo Y15 o alvo de tal fosforilação, cabendo a ele um papel estrutural mais importante. Nossos dados também sugerem que a fosforilação em resíduos de tirosina de proteínas intermediárias regula a atividade do receptor P2X4. / The human P2X4 receptor (ATP-gated ion channel) is widely distributed in the CNS and, after activation, participates in regulation of levels of intracellular calcium through direct permeation and activation of voltage-dependent calcium channels with well-defined functions including synaptic plasticity. Given the importance of the P2X4 receptor, especially in CNS physiology, we investigated the role that specific N- and C-termini residues play in human P2X4 receptor activity, by combining techniques of molecular biology, biochemistry and patch-clamping in human embryonic kidney cells (HEK-293T cells). HEK-293T cells expressing the wild-type P2X4 receptor showed ionic currents whose amplitudes depended on the ATP concentration, providing an EC50 value of 1.37 ± 0.21 mM. E14A and D16A receptor mutants exhibited responses to ATP comparable to those ones of wild-type receptor, whereas Y15A and T17A mutants were not functional, despite being expressed in the plasma membrane of cells. The inhibition of tyrosine phosphatases by pervanadate decreased strongly ATP-induced currents. Subsequent flow cytometry analysis in the presence of an antibody against phosphotyrosine residues indicated that, among the cells that express the P2X4 receptor, the percentage of phosphotyrosine-positive cells was the same for Y372A (86 ± 10%) and Y378A (79 ± 6.9%) mutants, however, substantially lower for Y15A (35 ± 12%), Y367A (48 ± 6.4%) and Y372F (31 ± 1.7%) mutants when compared with cells expressing the wild-type receptor (76 ± 5.6%). Similar results were obtained by quantifying the relative expression of phosphotyrosine proteins. Western blot assays revealed that even the T17A mutant was phosphorylated at threonine residues, suggesting that the human P2X4 receptor also contains further phosphorylation sites. However, no phosphotyrosine-antibody signal was detected in the wild-type receptor and mutants in which tyrosine residues were replaced by alanine or phenylalanine. The residue Y15 is supposedly not the target of such phosphorylation, despite its important structural role. However, the present work indicates that tyrosine phosphorylation of intermediate signaling proteins regulates P2X4 receptor activity.

Maspina é uma proteína supressora de tumor e metástase e sua localização subcelular está relacionada ao prognóstico do câncer de mama. Nosso grupo mostrou em MCF-10A que quando fosforilada maspina se acumula no citoplasma. Porém, esta correlação ainda não foi relatada in vivo. Aqui investigamos a expressão, fosforilação e localização subcelular de maspina ao longo do desenvolvimento da glândula mamária murina. Maspina foi detectada no estágio mais tardio da gestação, na lactação e na involução. Os níveis de fosforilação de maspina são maiores no período de lactação do que na involução. Interessantemente, a porcentagem de células que apresenta maspina no núcleo é maior na fase de involução do que na fase de lactação Estes dados mostram que a correlação entre níveis de fosforilação de maspina e localização subcelular também é observada in vivo e que esses processos são reguladas ao longo do desenvolvimento na glândula mamária murina. / Maspin is a protein with tumor and metastasis suppressing activity and its subcellular localization is related to breast cancer prognosis. Using MCF-10A cells as a model system, our group demonstrated a correlation between maspin phosphorylation and cytoplasmic accumulation. Here we investigated maspin expression, phosphorylation levels and subcellular localization in vivo during the murine mammary gland development. Maspin was detected in late pregnancy, during lactation and involution. Maspin phosphorylation levels is higher during lactation than during involution. Interestingly, the percentage of cells which present nuclear maspin is higher in the involution than in lactation. These data show that the correlation between maspin phosphorylation and subcellular localization is also observed in vivo and these processes are regulated during murine mammary gland development.

O câncer é a segunda doença com maior índice de mortalidade no Brasil e ainda é responsável por um elevado número de óbitos em todo o mundo. Durante a tumorigênese ocorrem diversas alterações no genoma, transcriptoma, proteoma, e interatoma que permitem o desenvolvimento da célula maligna. Alterações descritas na via de sinalização PI3K-Akt, tais como ganho de função da quinase PI3K ou perda de função da fosfatase PTEN, levam ao aumento de PIP3 com ativação constitutiva dos alvos downstream, como da quinase Akt. A regulação negativa da Akt pode ser realizada pela fosfatase PP2A, que é inibida pela proteína SET (ou inibidor 2 da PP2A). Existem diversos mecanismos que podem contribuir para a desregulação da sinalização celular e o aumento na quantidade de uma única proteína pode levar ao desequilíbrio no processo. Recentemente, nosso grupo identificou o aumento da proteína SET em diversas amostras de pacientes com carcinoma bucal, que foi associado à ativação da Akt. Sendo assim, o objetivo geral deste trabalho foi caracterizar os potenciais mecanismos de regulação da fosfatase PTEN pelas proteínas SET e PP2A e o papel de PTEN na predisposição ao carcinoma bucal. Para isso, através de vetores de expressão foi identificada dentre outras, a subunidade B56? da PP2A capaz de reduzir os níveis de PTEN fosforilado no resíduo de S380; a interação das proteínas PTEN e PP2A foi confirmada por co-imunoprecipitação (co-IP) e imunofluorescência; a atividade de PP2A e PTEN foram avaliadas frente a expressão de SET e regiões da SET na presença ou não de mutações sítio-específicas; e os níveis de expressão de PTEN foram relacionados ao acúmulo ou silenciamento (siRNA e shRNA) de SET em CECPs e no tratamento com agente hiperacetilante (TSA) e desmetilante (5aza-deoxicitidina). Também foi avaliado o papel de PTEN na expressão de BMAL1 in vitro e in vivo, utilizando animais geneticamente modificados com deleção de PTEN tecido-condicional ao epitélio. Os resultados obtidos sugerem a participação da SET em mecanismos de controle da expressão gênica de PTEN e a participação de PTEN no controle da expressão de BMAL. / Cancer is the second cause of death in Brazil and the oral cancer is among the most predominant cancers worldwide. During tumorigenesis several changes occur in the genome, transcriptome, proteome and interatoma leading to malignant cells development. Some of the more important modifications occur in the PI3K-Akt pathway, such as the loss of PTEN phosphatase function, which increase PIP3 and results in the constitutive activation of downstream targets, including the kinase Akt. PP2A is responsible for the negative regulation of Akt and is inhibited by SET (or Inhibitor 2 of PP2A). Many mechanisms can lead to deregulation of these signaling pathways and the increase in one protein can result in pathway loss of balance. Recently Leopoldino et.al. (2009) identified SET levels increased in oral cancer tissue samples, associate to Akt activation. The main objective of this project is evaluating how PP2A and SET regulate PTEN and its relation to cancer predisposition. For this, expression vectors were used to identify, among others, B56? subunit of PP2A reducing levels of p-PTEN S380; the interaction between PP2A and PTEN was confirmed by co-immunoprecipitation (co-IP) and immunofluorescence; PP2A and PTEN activity were evaluated against expression of SET and SET regions in the presence or not of site-specific mutations; and PTEN expression levels were related to the accumulation or silencing (siRNA and shRNA) of SET in CECPs and the treatment with agents for hyperacetylation (TSA) and demethylation (5-aza-deoxycytidine). The role of PTEN on BMAL1 expression was evaluated in vitro and in vivo, using transgenic animals with tissue-specific deletion of PTEN for epithelium. The results suggest the involvement of SET in control of PTEN gene expression and participation of PTEN in the control of BMAL expression.

Maspina, uma proteína supressora de tumor de 42 kDa, pertence à superfamília das serpinas (inibidores de serina protease), no entanto, seu mecanismo de ação independe da inibição de proteases. Maspina é expressa por epitélio de diferentes órgãos e apresenta regulação diferencial durante a progressão tumoral. Entre suas atividades biológicas, foram descritas a regulação da adesão celular, migração, morte, expressão gênica e resposta ao estresse oxidativo. A localização subcelular de maspina está relacionada a regulação de suas funções biológicas. Estudos clínicos recentes indicam que é a localização nuclear de maspina, ao invés de seus níveis de expressão, correlaciona-se com bons fatores prognósticos e sobrevida global em alguns tipos de câncer, incluindo câncer de mama. No entanto, pouco se sabe sobre como a localização subcelular de maspina é regulada. A maioria dos estudos sobre maspina é conduzido em linhagens de células tumorais, que apresentam uma grande variabilidade no contexto celular. Portanto, é importante usar uma linhagem celular não transformada para esta abordagem. Nesse trabalho investigamos fatores solúveis, interação célula-célula e interação célula-substrato como possíveis reguladores da localização de maspina na célula e as vias de sinalização envolvidas nesta regulação. Usando a linhagem celular epitelial mamária não transformada MCF10A como modelo, observamos por experimentos de imunofluorescência que o Fator de Crescimento Epidermal (EGF) promove a localização nuclear de maspina. EGF também altera a fosforilação da proteína conforme mostram nossos experimentos de 2D-SDS-PAGE e gel contendo Phostag. A fosforilação ocorre em resíduos de serina e a desfosforilação em resíduos de tirosina. À procura por vias de sinalização a jusante de do receptor de EGF envolvidas na regulação da localização subcelular de maspina, identificamos as vias de PI3K e Stat3 . Além disso, a adesão célula-célula parece bloquear a localização nuclear de maspina. Na tentativa de investigar funções celulares relacionadas à regulação de maspina por EGFR, identificamos proteínas que co-imunoprecipitam com maspina após o tratamento com EGF. O agrupamento funcional dessas proteínas sugere que a maspina pode estar envolvida em metabolismo de RNA, adesão celular e citoesqueleto. Desta forma, este trabalho identificou diferentes mecanismos que regulam a localização subcelular de maspina, que dependem da ativação das vias de PI3K e AKT pela via de EGFR. / Maspin, a 42 kDa tumor suppressor protein, belongs to the serpin (serine protease inhibitors) superfamily, however, its mechanism of action does not depend on protease inhibition. Maspin is expressed by epithelium of different organs and presents differential regulation during tumor progression. Among its biological activities, regulation of cell adhesion, migration, death, gene expression and oxidative stress response were described. Subcellular localization of maspin is related to the regulation of its biological functions. Recent clinical studies indicate that nuclear localization of maspin, not its expression levels, correlates with good prognostic factors and overall survival in some types of cancer, including breast cancer. However, little is known about how maspin subcellular localization is regulated. Most studies on maspin are conducted in tumor cell lines, which show great variability in cell context. Therefore, it is important to use a nontransformed cell line for this approach. Here we investigated soluble factors, cell-cell interaction and cell-substrate interaction as possible regulators of maspin subcellular localization and the signaling pathways involved. Using the MCF10A untransformed mammary epithelial cell line as a model system, we observed by immunofluorescence experiments that the Epidermal Growth Factor (EGF) promotes nuclear localization of maspin. EGF also alters the phosphorylation of the protein as observed by 2D-SDSPAGE and gel containing Phos-tag. Phosphorylation occurs on serine residues and dephosphorylation, on tyrosine residues. Looking for signaling pathways downstream of EGF receptor involved in regulation of maspin subcelular localization, we identified the PI3K and STAT3 pathways. On the other hand, cell-cell adhesion seems to block nuclear localization of maspin. In an attempt to investigate cellular functions related to regulation of maspin by EGFR, we identified proteins that co-immunoprecipitate with maspin in EGF-treated cells. The functional grouping of these proteins suggests that maspin may be involved with RNA metabolism, cell adhesion and cytoskeleton. Thus, this study identified different mechanisms that regulate subcellular localization of maspin, which depends on PI3K and STAT3 activation downstream of EGFR pathway.