Le potentiel de la thérapie génique pour le traitement de maladies a engendré beaucoup d'espoirs et d'importants efforts ont été réalisés dans ce domaine de recherche. A l'heure actuelle, les vecteurs viraux sont les plus efficaces pour transférer des gènes thérapeutiques dans les cellules humaines. Alors que différents vecteurs viraux sont en développement, les vecteurs rétroviraux dérivés du virus de la leucémie murine de Moloney (MLV) sont actuellement parmi les vecteurs les plus utilisés dans les essais cliniques. Le premier objectif de ce projet était d'étudier l'efficacité d'un nouveau vecteur d'encapsidation dérivé d'un autre retrovirus, le virus RDI 14. Nous avons démontré pour la première fois que des titres élevés pouvaient être obtenus avec des particules rétrovirales RDI 14. Ces vecteurs ont été aussi efficaces que les vecteurs MLV pour transduire des lymphocytes primaires et des cellules souches humaines CD34+. Par conséquent, les vecteurs rétroviraux dérivés du virus RDI 14 sont efficaces pour le transfert de gènes et peuvent être une alternative aux vecteurs MLV. La production de vecteurs rétroviraux pour des applications cliniques est difficile, dispendieuse et peu sécuritaire, car les lignées cellulaires qui les produisent poussent de façon adhérentes et en présence de sérum bovin. Le second objectif était de générer des nouvelles lignées d'encapsidation capables de répondre à ces limitations. Dans cette étude, nous rapportons la construction des premières lignées d'encapsidation produisant des vecteurs rétroviraux en suspension et en milieu sans sérum (MSS). Des cellules 293HEK ont été dans un premier temps modifiées pour exprimer des niveaux élevés de protéines gag-pol. Les gènes codant pour les protéines d'enveloppes Ampho, GALV et RDI 14 ont été par la suite utilisés pour générer trois lignées d'encapsidations différentes (293GP-A2, 293GP-GLV9 et 293GP-RD30). Les titres obtenus avec les clones 293GP-A2, 293GP-GLV9 et 293GP-RD30 en suspension et en MSS étaient respectivement de 4 x IO7, IO6 et 5 x IO6 particules virales infectieuses par ml (PVI/mL). La caractérisation des ces lignées a été réalisée par l'étude des dynamiques de croissance cellulaire, de la stabilité de production, de la stabilité des particules virales et de la capacité de transduction. Les résultats ont montré que les lignées 293GP-A2, 293GP-GLV9 et 293GP-RD30 ont un bon potentiel pour la production à grande échelle de vecteurs rétroviraux. Ces lignées d'encapsidations devraient améliorer l'efficacité des protocoles cliniques de thérapie génique de dernière phase qui font appel à un nombre élevé de patients.

Le microbiote intestinal humain est un important réservoir de gènes de résistance aux antibiotiques qui demeure toutefois méconnu. Dans cette étude, nous avons exploré les gènes de résistance du microbiote intestinal de participants sains avant et après une exposition à l’antibiotique cefprozil. Trois approches ont été utilisées pour caractériser ces gènes et examiner leur altération par les antimicrobiens : la métagénomique, la culturomique et la sélectomique recombinante. Le séquençage métagénomique et la culturomique ont permis d’identifier plusieurs gènes de résistance aux β-lactamines et à d’autres antibiotiques. Cependant, la culturomique a permis d’identifier ces gènes chez un plus grand nombre de participants. La culturomique a mis en évidence la présence de gènes de résistance à la vancomycine de type vanD dans les microbiotes de 46% des participants comparativement à 8% avec le séquençage métagénomique. La culturomique a aussi montré que l’exposition in vitro et in vivo à une β-lactamine stimule l’émergence des gènes vanD. La sélectomique recombinante, qui repose sur la construction de banques d’expression à partir de l’ADN des bactéries, a été utilisée pour caractériser de manière fonctionnelle les gènes de résistance aux β-lactamines chez les bactéries cultivables de l’intestin. Elle a permis d’identifier et caractériser cinq β-lactamases différentes dont deux montrant une activité à spectre étendu. La majorité des gènes de β-lactamases étaient associés à d’autres gènes de résistance et/ou des éléments mobiles. Ces travaux ont montré que la culture favorise l’identification de gènes non détectés par le séquençage métagénomique et que la sélectomique recombinante est un outil puissant pour caractériser les fonctions des gènes. Cette étude a aussi révélé que la prise d’une β-lactamine communément utilisée peut influencer l’abondance des bactéries qui contiennent des gènes de résistance à un antibiotique d’une autre classe, comme la vancomycine, un antibiotique de dernier recours dans l’arsenal des antimicrobiens. / The human intestinal microbiota is an important and poorly known antibiotic resistance genes reservoir. In this study, we explored resistance genes from the microbiota of healthy volunteers before and after exposure to the β-lactam cefprozil antibiotic. Three approaches were used to characterise resistance genes in the human microbiota and examine alteration by antimicrobials: metagenomics, culturomics and recombinant selectomics. Metagenomic and culturomic sequencing of intestinal microbiota enabled identification of several genes for resistance to β-lactams and other antibiotics. However, culturomics allowed identification of these genes in more participants than metagenomics. Culturomics highlighted the presence of the clinically important vancomycin resistance vanD-like genes in the microbiota of about 46% of participants compared to 8% with metagenomics. Culturomics also showed that in vitro and in vivo β-lactams exposition stimulates the emergence of vanD genes. Recombinant selectomics, which is based on the construction of expression libraries made with bacterial DNA, was also used to functionally characterise β-lactam resistance genes from the cultivable intestinal bacteria. It allowed identification and characterisation of five different β-lactamases including two with an extended-spectrum activity. The majority of β-lactamases genes was associated with other resistance genes and/or mobile elements. This study demonstrated that culture favors the identification of genes undetected by direct metagenomic sequencing and selectomics was a powerful tool to characterise gene functions. It also demonstrated that intake of a commonly used antibiotic of the β-lactam family can influence the abundance of bacteria containing resistance genes to an antibiotic from another class, such as vancomycin, which is a last resort antibiotic.

L'anémie de Fanconi (FA) est une maladie rare et les patients présentent des malformations congénitales, des problèmes hématologiques et une prédisposition à certains cancers. Jusqu'à maintenant, 13 protéines FA ont été identifiées, dont 8 (FANC- A, B, C, E, F, G, L, M) s'associent pour former un complexe qui permet l'ubiquitination de FANCD2 et FANCI. Les autres protéines FA sont impliquées au niveau de la réparation de l'ADN ce qui ne permet pas d'expliquer en totalité le phénotype des patients. Récemment, HES1, effecteur de la voie de Notch, a été identifié comme un partenaire essentiel à la formation du complexe FA. HES1 est connue pour être impliquée dans le développement et l'hématopoïèse. L'interaction d'HES1 avec le complexe FA altérée pourrait expliquer en partie le phénotype des patients. L'objectif principal est de créer un peptide inhibiteur visant à altérer la liaison d'HES1 avec le complexe FA, sans toutefois modifier les autres fonctions d'HES1 dans la cellule. Un deuxième objectif est d'identifier de nouveaux partenaires au complexe FA afin de mieux comprendre le lien génotype-phénotype. L'identification d'un peptide inhibiteur a été réalisée premièrement par la sélection de quatre régions d'HES1 (les acides aminés 90-123, 86-121, 76-111 et 152-190) et deuxièmement par le criblage d'une banque de peptides aléatoires avec FANCG¹⁻¹¹²⁺³⁹⁰⁻⁶²². Le système double hybride en levure a été utilisé pour vérifier les interactions directes entre les peptides et les membres du complexe FA et ces interactions ont été testées dans un modèle cellulaire par la technique de co-immunoprécipitation. L'identification de nouveau partenaire au complexe FA a été réalisée par le criblage d'une banque d'ADNc de moelle osseuse avec FANCE. Le criblage avec FANCG¹⁻¹¹²⁺³⁹⁰⁻⁶²² a permis d'identifier deux peptides, mais leur activité inhibitrice n'a pas été évaluée. Les quatre régions d'HES1 semblent n'avoir aucun effet sur la liaison entre HES1 et le complexe FA. Le criblage de la banque d'ADNc n'a pas permis d'identifier de nouveaux partenaires à FANCE. Des études approfondies sont nécessaires pour confirmer les effets des peptides sur la liaison entre HES1 et le complexe FA.

Les gènes Hox codent pour des facteurs de transcription essentiels durant l’embryogénèse. Les études antérieures menées chez les femelles Hoxa5-/- ont démontré une désorganisation de la morphologie de leurs glandes mammaires se reflétant par une incapacité à allaiter leur progéniture. Ce travail consistait à déterminer le rôle du gène Hoxa5 dans la composition du stroma mammaire de femelles à quatre et dix mois et au 12.5ème jour de gestation. Pour cela cinq gènes ont été analysés, soient le collagène, la fibronectine, la décorine, le lumican et UCP-1 (Uncoupling protein 1). Les transcrits et protéines de ces gènes étaient modulés dans les glandes mammaires Hoxa5-/-. Il a été démontré que la fonction du gène Hoxa5 est nécessaire à quatre et à dix mois au cours du cycle œstral pour l’établissement et le maintien de l’intégrité du stroma mammaire, et au 12.5ème jour de gestation pour la différenciation terminale des structures épithéliales. / Hox genes encode transcriptional factors essential for embryogenesis. Previous studies on Hoxa5 mutant female mice have demonstrated a disorganization of the mammary gland morphology causing incapacity to feed the pups. This study consists to determine the implication of Hoxa5 gene in mammary stroma composition by using four and ten month old female mice as well as 12.5 days pregnant mice. Our investigation consists in analyzing the expression of five proteins: collagen, fibronectin, decorin, lumican, and UCP-1 (Uncoupling protein-1). Both transcript and protein genes’ levels were modulated in mammary gland of Hoxa5-/- mice. I have shown that Hoxa5 gene expression in mammary gland is necessary to establish and maintain stroma integrity during oestrus cycle in four and ten month old mice and for the terminal differentiation of mammary gland epithelial structures at 12.5 days of gestation.

HIP1R (Huntingtin interacting protein 1-related) a des rôles dans l’endocytose médiée par la clathrine, l’apoptose et la mitose. Elle induit l’assemblage de la clathrine, régule la polymérisation de l’actine, contribue au clivage de la caspase-9 et aide l’ancrage des chromosomes sur les microtubules lors de la métaphase. Les domaines protéiques responsables de ces contributions et les facteurs permettant à HIP1R de changer de rôle ne sont pas encore bien connus. Nous avons utilisé la technique du knock-down et nous avons réintroduit des versions mutées ou tronquées d’HIP1R pour caractériser ses rôles en modifiant ses liaisons avec ses partenaires. Les résultats indiqueraient qu’HIP1R participe principalement à l’internalisation des plaques de clathrine et qu’HIP1R n’induit pas l’activation de la caspase-3. Finalement, nous avons montré que la liaison d’HIP1R avec la clathrine lui confère son rôle lors de la mitose lui permettant ainsi de se localiser sur les microtubules pendant la métaphase.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'alternance de production est définie comme la charge en fruit d'un arbre irrégulière sur plusieurs années consécutives. La principale hypothèse en soulignant l'alternance est que la charge en fruits d'une année en cours inhibe la formation de fleurs pour l'année suivante. Ce phénomène génère d'importants problèmes agronomiques pour les espèces fruitières comme le pommier, en réduisant la production de fruits au cours des années 'OFF' et la qualité des fruits au cours des années 'ON', tout en augmentant les coûts de gestion des vergers, en particulier pour l'éclaircissage des fruits. Une stratégie pour atténuer l'alternance est de développer de nouvelles variétés avec une production régulière. Les principaux objectifs de ma thèse étaient: (i) d'améliorer les stratégies de phénotypage et les méthodes pour caractériser l'alternance de production, (ii) de disséquer le contrôle génétique de l'alternance de production en utilisant une descendance de pommier en ségrégation et d'identifier les principales régions génétiques responsables de la variation du caractère, et (iii) d'étudier les processus physiologiques sous-jacents à l'alternance de production. J'ai combiné des méthodes comme la modélisation, la génétique quantitative, la détection de Quantitative Trait Loci (QTL) et de gènes candidats ainsi que la cartographie et l'expression de gènes.Mon étude a utilisé une population de pommier ségrégation obtenue à partir d'un croisement entre des parents contrastés pour les caractéristiques architecturales et de floraison (‘Starkrimson' x 'Granny Smith'). Le phénotypage de la population pour l'alternance de production a été réalisée à l'échelle d'arbres entiers, en observant les occurrences de floraison pendant six années consécutives, et à l'échelle locale, en observant la succession de méristèmes floraux vs végétative en position terminale de rameaux. De ces données, de nouveaux modèles ont été développés afin de quantifier l'alternance de la production, en tenant compte de la croissance ontogénétique de la production et la présence / absence de floraison entre les années successives le long des pousses courtes. Ceci nous a conduits à proposer de nouveaux descripteurs de la tendance d'un génotype à l'alternance de production dans les premiers stades de développement des arbres et ouvre des possibilités pour une évaluation plus rapide et plus précoce de ce caractère dans les programmes de sélection de fruits à pépins.Pour identifier les régions génomiques impliquées dans l'alternance, une détection de QTL a été réalisée sur la base des données phénotypiques et des valeurs de BLUP obtenues à partir des modèles. J'ai démontré que la régularité de la production est sous contrôle polygénique. J'ai extrait une liste de gènes qui sont présents au sein de ces QTL en utilisant la séquence du génome du pommier. Les principaux gènes candidats identifiés sont liés aux gibbérellines, aux auxines, et à la floraison. J'ai étudié l'expression des gènes candidats co-localisant avec des QTLs par PCR quantitative en utilisant les méristèmes prélevés sur les arbres portant une forte charge en fruits vs une faible charge. Une analyse microarray m'a permis d'obtenir un aperçu global des processus biologiques et de l'expression des gènes qui sont modulés dans le méristème lorsque des fruits sont présents. Certains gènes liés à la floraison, au développement du méristème, aux gibbérellines et aux auxines ont montré un profil d'expression affectée par la présence de fruits.Mes résultats fournissent des éclaircissements sur le contrôle physiologique et génétique de ce caractère complexe qui est l'alternance et ouvrent la perspective d'inclure la régularité de production dans les schémas de sélection de pommier et d'autres espèces fruitières / Biennial bearing is defined as the irregular crop load of a tree over consecutive years. The main assumption underlining biennial bearing is that the fruit load of a given year inhibits flower formation for the following year. This phenomenon generates major agronomic problems for fruit species such as apple, by reducing fruit production during ‘OFF' years and fruit quality during ‘ON' years, while increasing orchard management costs, especially for fruit thinning. A strategy to attenuate biennial bearing is to develop new varieties with regular production. The main objectives of my project were (i) to improve phenotyping strategy and methodology for biennial bearing characterisation, (ii) to dissect the genetic control of biennial bearing using an apple segregating progeny and to identify key genetic regions responsible for the trait variation, and (iii) to investigate physiological processes underlying biennial bearing. I combined methodologies such as modelling, quantitative genetics, candidate gene and Quantitative Trait Loci (QTL) mapping and gene expression.My study used an apple segregating population issued from a cross between contrasting parents for architectural and flowering features (‘Starkrimson' x ‘Granny Smith'). Phenotyping of the population for biennial bearing was achieved at whole tree scale by observing flowering occurrence for six consecutive years, and at local scale, by observing the succession of floral vs. vegetative meristems in terminal position of shoots. From this data, new models were constructed to quantify the alternation of production, taking into account the ontogenetic increasing trend of production and the presence/absence of flowering between successive years along short shoots. This led us to propose new descriptors of the tendency of a genotype to biennial bearing in the early stages of tree development and opens possibilities for a faster and earlier evaluation of this character in pipfruit breeding programmes and for orchard management.To identify genomic regions involved in biennial bearing, a QTL detection was performed on the basis of phenotypic data and BLUP values obtained from the models. I demonstrated that the regularity of production is under polygenic control. I mined a list of genes that are present within these QTLs using the apple genome sequence. The main candidate genes identified are related to gibberellins, auxins, and flowering.I investigated the expression of candidate genes co-locating with QTLs by quantitative PCR using meristems collected on trees bearing heavy fruit load vs. light crop. A microarray analysis enabled me to obtain a global overview of biological processes and gene expression that are modulated in the meristem when fruits are present. Some genes related to flowering, meristem development, gibberellins and auxins showed an expression profile affected by the presence of fruit.My results provide elucidation on the physiological and genetic control of the complex trait that is biennial bearing and open up the perspective of including regular bearing in breeding schemes for apple and other fruit species.

Les années 2000 ont vu l'apparition des technologies de séquençage haut-débit permettant de faire chuter le coût en temps et argent du séquençage du génome complet et ouvrant la perspective à des analyses de la phylogénie des espèces à l'échelle de génome entiers. Dans cette optique des méthodes pour l'inférence de l'histoire évolutive de l'ordre de marqueurs génomiques le long d'un phylogénie ont été développées. Cependant, les assemblages d'une majorité des grands génomes d'eucaryotes demeurent incomplètement résolues et ne permettent donc pas, en tant que tel, leur exploitation pour la reconstruction de l'histoire évolutive de l'ordre des gènes de ces espèces. C'est dans ce contexte que nous avons développé l'algorithme adseq qui permet de conjointement reconstruire l'histoire évolutive de l'ordre de gènes en considérant la fragmentation des génomes actuels et améliorant l'assemblage de ceux-ci par génomique comparative / The early 2000s saw the emergence of high-throughput sequencing technologies that would bring down the time and cost of sequencing the entire genome and opening the perspective to whole genome-scale species phylogeny. In this perspective, methods for the inference of evolutionary history of the order of genomic markers along a phylogeny have been developed. However, assemblies of a majority of the large eukaryotic genomes remain incompletely resolved and therefore do not, as such, allow their exploitation for the reconstruction of evolutionary history of the order of the genes of these species. It is in this context that we have developed the algorithm ADseq which allows to jointly reconstruct the evolutionary history of the order of genes by considering the fragmentation of the extant genomes and improve the assembly of these by comparative genomics

Dans les cancers, la transcription des gènes peut être altérée par des mécanismes génétiques ou épigénétiques. En 2011, mon laboratoire a montré que la progression des cancers de la vessie pouvait être liée à un mécanisme épigénétique appelé MRES (« Mutiple Regional Epigenetic Silencing »). Les tumeurs possédant ce phénotype présentent une inactivation simultanée de gènes voisins dans 7 régions du génome. A l’aide d’une nouvelle approche bio-informatique : « SegCorr », nous avons identifié plus de 400 régions du génome dont l’expression des gènes est corrélée indépendamment du nombre de copie du gène. Ces régions se répartissent en 7 groupes et sont associées à 6 phénotypes de cancer de la vessie. De plus, l’extinction de l’expression des gènes d’une faible proportion de régions est associée à la méthylation de l’ADN et/ou une perte sur les histones de de marques d’activation de la transcription : H3K9ac et H3K4me3 ou des gains de marques de répression de la transcription : H3K27me3 et H3K9me3. Grâce au nouvel algorithme « Musette », J’ai montré que le phénotype MRES n’était probablement pas dû à des altérations génétiques. Enfin, pour comprendre à quel stade de la progression tumorale du cancer de la vessie le phénotype MRES pourrait apparaître, j’ai montré que les tumeurs de cancer de vessie induites chez les souris par ingestion d’un carcinogène (N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine) pouvait être un bon modèle d’étude. / In cancers, gene transcription can be altered by genetic or epigenetic mechanisms. In 2011, my laboratory showed that the progression of bladder cancer could be linked to an epigenetic mechanism called MRES ("Mutiple Regional Epigenetic Silencing"). Tumors with this phenotype exhibit simultaneous inactivation of neighboring genes in 7 regions of the genome. Using a new bioinformatics approach: "SegCorr", we have identified more than 400 genomic regions in which gene expression is correlated. These regions fall into 7 groups and are associated with 6 phenotypes of bladder cancer. In addition, the extinction of gene expression from a small proportion of regions is associated with DNA methylation and / or loss of histone marks associated with active transcription: H3K9ac and H3K4me3 or gains of histone marks associated with transcription repression: H3K27me3 and H3K9me3. Using a new algorithm “Musette”, I have shown that the MRES phenotype is probably not due to genetic alterations. Finally, to understand at which stage of tumor progression of bladder cancer the MRES phenotype might appear, I have shown that bladder cancer tumors induced in mice by ingestion of a carcinogen (N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine) could be a good model.

Du fait de l’apparition de microorganismes pathogènes ayant une résistance aux antibiotiques actuels, la recherche de nouvelles molécules bioactives possédant une application médicale est devenue une préoccupation mondiale. Saccharothrix algeriensis, une bactérie filamenteuse de l’ordre des actinomycètes a montré une étonnante capacité à produire des molécules bioactives qui appartiennent aux dithiolopyrrolones, ayant de remarquables propriétés à la fois antibiotiques et anticancéreuses. Lors de ce projet de thèse, l’identification du cluster de gènes de la voie de biosynthèse des dithiolopyrrolones chez Sa. algeriensis est envisagée. Suite au séquençage du génome de Sa. algeriensis, une approche génomique ou « genome mining » est suivie, cette approche a révélé un cluster thi potentiellement responsable de la voie de biosynthèse des dithiolopyrrolones chez Sa. algeriensis. Ce cluster contient 12 gènes, dont 8 gènes de biosynthèse, 3 gènes régulateurs et un gène transporteur. Les analyses in silico des gènes ont montré que la cystéine est le substrat d’une NRPS. Les analyses transcriptionelles ont montré que les trois gènes clés codent pour une NRPS, une thiorédoxine et une thioestérase qui pourraient être impliquées dans la biosynthèse des dithiolopyrrolones. Deux gènes actA et actB codant pour des acyltransférases putatives ont été identifiés. Les analyses transcriptionelles suggèrent qu’actA et actB pourraient être responsables de l’acylation de la pyrrothine. Finalement, la caractérisation de deux activités enzymatiques, acétyltransférase et benzoyltransférase, présentes dans l’extrait brut de Sa. algeriensis, ont permis de déterminer les paramètres optimaux (pH et T °C) de la réaction enzymatique. Enfin, les paramètres cinétiques de ces activités ont des valeurs complètements différentes, ce qui confirme la présence d’au moins deux activités différentes chez Sa. algeriensis. / Due to the emergence in the last decades of new and old infectious diseases to existing antibiotics, the research for new bioactive molecules which possess medical applications become a global occupation. Saccharothrix algeriensis, filamentous bacteria of actinomycetes order showed a surprising ability to produce bioactive molecules belongs to dithiolopyrrolones with remarkable properties of both antibiotics and anticancer. In this thesis, the identification of dithiolopyrrolones biosynthetic gene cluster in Sa. algeriensis was investigated. Through S. algeriensis genome sequencing, a genomics approach "genome mining" was followed, this approach has revealed a potentially thi cluster responsible for dithiolopyrrolones biosynthesis pathway in Sa algeriensis. This cluster contains 12 genes, including 8 biosynthesis genes, three regulatory genes and one transporter gene. The in silico analysis of this cluster showed that the cysteine is the substrate of the NRPS. The transcriptional analyzes showed that the three key genes which encode for NRPS, thioredoxin and thioesterase could be involved in dithiolopyrrolone biosyntheses. Two genes, actA and actB, encode for two putative acyltransferases were identified, the transcriptional analyzes suggests that these genes may be responsible for the acylation of pyrrothine core. The characterizations of two activities, acetyltransferase and benzoyltransferase, in the crude extract of Sa. algeriensis led the determination of the optimal parameters (pH and T °C) to detect these activities. Moreover, the effect of temperature and pH on these activities was determined. Finally, the kinetic parameters of these activities showed different values, which confirm the presence of, at least, two activities in Sa. algeriensis.