Le facteur de transcription Staf et son orthologue humain ZNF143 sont impliqués dans l'activation de la transcription de gènes d'ARN non codants transcrits par l'ARN polymérase II et III et dans celle de 7 gènes de protéines. L'objectif de ma thèse était de caractériser de nouveaux gènes cibles de ce facteur chez l'homme. Par une approche bioinformatique couplée à des expériences de ChIP, nous avons montré qu'environ 10% des promoteurs de gènes de protéines humaines fixent hStaf/ZNF143. Ceci suggère que le site de liaison de hStaf/ZNF143 (SBS) est l'un des plus abondants dans les génomes de mammifères. En parallèle, nous avons étudié les promoteurs des gènes TFAM, BUB1B et SCARNA2 dans lesquels nous avons identifié des éléments conservés dont des sites SBS. Nous avons montré l'importance de ces éléments dans la transcription. Ces résultats mettent en évidence que Staf régule l'activité de gènes impliqués dans des processus cellulaires divers via des promoteurs à architectures variées.

La différenciation des lymphocytes T dans le thymus est strictement contrôlée par le réarrangement des gènes codants pour les chaînes du TCR et leur expression en surface dans le cadre du pré-TCR ou du TCR. Les souris incapables d'assembler un pré-TCR présentent un blocage précoce du développement des thymocytes. Nous avons montré que l'irradiation de souris CD3ε-/-, qui sont déficientes en pré-TCR, restaure la différenciation des thymocytes par des voies différentes selon que p53 soit présente ou non. En réponse à l'irradiation, il existe une dissociation temporelle de l'activation des voies de signalisations contrôlant plusieurs événements co-régulés durant le développement des thymocytes. Ces voies sont cependant toutes deux centralisées au niveau de LAT. L'irradiation induit donc des voies de signalisations mimant les effets de l'activation du pré-TCR.<br />La différenciation radio-induite des thymocytes immatures s'accompagne du réarrangement de novo des gènes TCRA. L'étude des jonctions signal (JS) formées lors du réarrangement des gènes TCRA ne montre pas de différences de structure entre les JS de souris sauvages ou les JS formées suite à l'irradiation. Le réarrangement TCRA radio-induit est donc probablement l'œuvre de la machinerie de recombinaison traditionnelle. Contrairement au modèles actuels de recombinaison V(D)J les JS de souris sauvages analysées présentent des modifications, quels que soient les gènes réarrangés. Nous avons pu montrer une influence de plusieurs protéines impliquées dans la réparation de l'ADN et le maintient de la stabilité du génome sur la structure des JS. Nous proposons que ces modifications ne sont pas le résultat d'un processus de recombinaison aberrant mais constituent une propriété intrinsèque de la recombinaison. <br />Nos travaux permettent donc une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires de la recombinaison V(D)J.

Les processus de l'évolution des génomes, particulièrement des génomes de primates, font l'objet de cette thèse. Ont été ainsi creusées les questions de la conservation ou non de séquences nucléiques de précurseurs peptidiques dans la lignée des primates, et de la mise en place, de l'évolution et de l'expression de deux familles de gènes spécifiques des primates. <br /><br />Brassages d'exons, rétrotransposition, duplications... sont impliqués dans la création de nouveaux gènes. L'étude de la création et des premiers temps d'un gène nécessite la mise en évidence de gènes récents, ayant conservé les caractéristiques de leur mise en place. <br /> Deux familles de gènes ont retenu mon attention:<br />1. Les gènes PMCHL ont été créés récemment par des processus de rétroposition, remaniements, insertions/délétions et accumulation de mutations. Des analyses de structure et phylogénétique permettent une meilleure compréhension de l'origine de ces gènes spécifiques des Primates. Les gènes PMCHL sont transcrits, de façon tissu-spécifique, et présentent de nombreux épissages alternatifs. Enfin, l'expression des ARN messagers PMCHL est comparée dans le cerveau de l'Homme et du Macaque. <br />2. Les gènes dérivés de GUSB ont été identifies par hybridation in situ fluorescente chez les Primates. Une recherche systématique dans le génome humain a permis la découverte et la caractérisation d'une grande famille de gènes comptant plus de quinze paralogues chez l'Homme. L'analyse structurale et phylogénétique de ces séquences a permis de préciser l'histoire de leur mise en place et de leur évolution. Certains des membres de cette famille de gènes ont en outre acquis une capacité transcriptionnelle.

La thérapie génique est envisagée pour le traitement de nombreuses maladies du <br />système nerveux. Le transfert de gène peut être utilisé pour compenser l'absence ou le <br />dysfonctionnement d'un gène déficient, coder une protéine thérapeutique, ou inhiber un <br />gène par ARN interférence. L'utilisation de vecteurs lentiviraux pour transférer un gène <br />thérapeutique, est une approche prometteuse pour de futures applications thérapeutiques. <br />Cependant, pour une utilisation sécurisée de ces vecteurs, il est nécessaire de contrôler <br />l'expression des gènes thérapeutiques. Ceci permettra d'adapter le traitement aux besoins <br />du patient ou de l'arrêter en cas de complications graves. Dans ce contexte, mon travail a <br />porté sur la mise au point de systèmes de régulation de l'expression de gènes thérapeutiques <br />inductibles par la tétracycline (Tet-on) au sein d'un seul vecteur lentiviral. <br /><br />Dans une première approche, le système Tet-on a été incorporé au sein d'un vecteur <br />lentiviral unique. Des vecteurs codant la luciférase et la tyrosine hydroxylase (TH) ont été <br />produits et caractérisés in vitro et in vivo. Ces vecteurs ont permis d'exprimer de façon <br />régulée les transgènes avec une expression induite d'un facteur 100 en présence de <br />doxycycline. Le vecteur TH inductible a été par la suite validé dans un modèle de rat de la <br />maladie de Parkinson pour démontrer son efficacité et la possibilité de réguler un gène <br />thérapeutique in vivo. <br /><br />Le deuxième volet de mon travail a porté sur le développement d'un système <br />inductible d'expression des shARN utilisant un nouveau transactivateur dépendant de la <br />doxycycline capable d'induire la transcription de shARN à partir d'un promoteur d'ARN <br />polymérase III minimal. Après intégration dans un vecteur lentiviral, ce système a permis <br />de contrôler efficacement et de manière réversible l'expression de la GFP et de la protéine <br />p53 in vitro. En présence de doxycycline, une extinction de 90 % de l'expression des deux <br />gènes cibles a été obtenue. Cette expression a été réinduite après retrait de la doxycycline. <br />L'efficacité de ce système est dépendante de la dose et du temps de traitement avec la <br />doxycycline. <br /><br />L'intégration de systèmes de régulations efficaces au sein d'un vecteur lentiviral <br />unique constitue une étape cruciale pour une utilisation sécurisée de ces vecteurs en <br />thérapeutique humaine.

L'électrotransfert est une solution prometteuse aux problèmes posés par les méthodes de transfert virales, aussi bien en termes d'applications thérapeutiques qu'en tant qu'outil de recherche. Cependant des progrès doivent encore être réalisés pour augmenter l'efficacité de transfection dans les divers types cellulaires, pour améliorer la connaissance des mécanismes impliqués ainsi que pour confirmer l'innocuité de l'électrotransfert. Dans une étude préliminaire, nous avons démontré que l'efficacité de transfert par injection locale d'ADN seule augmentait avec la vitesse d'injection, impliquant probablement de l'endocytose médiée par récepteur, mais aussi une faible perméabilisation membranaire. Nous avons ensuite confirmé in vivo le rôle perméabilisant des impulsions courtes de fort voltage (HVs) et le rôle électrophorétique des impulsions longues de bas voltage (LVs), lors de l'électrotransfert. Nous avons aussi montré l'influence d'un délai entre le HV et le LV sur l'efficacité et la toxicité des impulsions électriques appliquées. Notre étude de l'impulsion HV semble montrer également que le tissu n'a pas besoin d'être complètement perméabilisé dans le cadre de l'électrotransfert. Nous avons aussi pu confirmer in vivo que plus les cellules du tissu étaient petites, plus le champ électrique à appliquer pour le HV devait être fort, conformément à l'équation de Schwan :

La scoliose idiopathique de l’adolescent (SIA) est la déformation la plus fréquente en orthopédie pédiatrique. C'est une maladie qui génère des déformations complexes du rachis, du thorax et du bassin affectant plus sévèrement et majoritairement les filles à la puberté. Malgré de nombreuses années de recherches approfondies dans le domaine de la SIA, la cause n'a toujours pas été résolue. OBJECTIFS : Il a été démontré qu’il existe une dysfonction de la signalisation de la mélatonine par les protéines G inhibitrices (Gi) dans les ostéoblastes isolés de patients atteints de SIA. Ceci a conduit à une stratification des patients en trois groupes fonctionnels. Le but de ce projet de maîtrise est d’établir les profils d’expression moléculaire correspondant à chacun des groupes fonctionnels. Les objectifs spécifiques sont d’identifier les gènes responsables de l’initiation de la SIA et du défaut différentiel observé dans la signalisation des récepteurs couplés aux protéines Gi. MÉTHODES : Des ARNs ont été préparés à partir d’ostéoblastes isolés de patients atteints de SIA sélectionnés pour chaque groupe fonctionnel et comparés aux ARNs obtenus d’ostéoblastes de sujets sains. En plus, des cellules sanguines (PBMCs) isolées d’une paire de jumelles monozygotes discordantes pour la scoliose ont été étudiées pour comparer leur profil d’expression génétique. Nous avons utilisé des biopuces à ADN contenant un ensemble de 54,000 sondes permettant l’analyse du niveau d’expression de plus de 47,000 transcrits représentant 30,000 gènes humains bien caractérisés (Affymetrix, GeneChip® Human gene 1.0 ST array). Les gènes retenus ont par la suite été validés par qPCR sur un plus grand nombre de patients afin de tester la spécificité des profils d’expression pour chaque groupe de patients à partir des cellules osseuses dérivées lors de la chirurgie. RÉSULTATS: Le profilage moléculaire proposé permettra d’établir les fondements moléculaires de la SIA selon le test fonctionnel développé par le Dr Moreau et son équipe et d’identifier de nouveaux gènes associés à la SIA. Ce projet a permis de mettre en évidence des gènes possiblement impliqués dans le défaut de signalisation associé aux protéines Gi communs aux trois groupes, ainsi que des gènes spécifiques à certains groupes, pouvant contribuer au développement de certaines co-morbidités et/ou au risque d’aggravation des déformations rachidiennes. L’étude préliminaire des jumelles monozygotes discordantes pour la scoliose a mis en évidence un nombre limité de gènes possiblement associés au défaut de signalisation observé chez la jumelle scoliotique, gènes dont l’expression pourrait être influencée par des modifications d’ordre épigénétique liées à l’environnement. CONCLUSION: Les données obtenues par des approches de transcriptomiques dans le cadre de ce projet soutiennent notre méthode de stratification fonctionnelle des patients SIA et ont conduit à l’identification de nouveaux gènes associés à la SIA. Ces résultats jettent un éclairage nouveau sur la SIA et contribuent à une meilleure compréhension des mécanismes et facteurs impliqués dans l’étiologie de la SIA. À cet égard, nos résultats permettront éventuellement d’identifier des cibles thérapeutiques potentielles et des traitements personnalisés compte tenu des profils moléculaires distincts observés pour chaque groupe de patients. / The adolescent idiopathic scoliosis (AIS) is the most common deformity in paediatric orthopaedics. It is a disease that generates complex deformations of the spine, thorax and pelvis and severely affecting mainly girls at puberty. Despite many years extensive research into the field of AIS, the cause of this disorder has still not been resolved. OBJECTIFS: We have demonstrated a differential melatonin signaling dysfunction through G inhibitory (Gi) proteins in osteoblasts isolated from AIS patients. This led to a stratification of AIS patients into three distinct functional groups. The goal of this project is to establish molecular expression profiles corresponding to each functional group. The specific objective is to identify genes responsible for the initiation of the AIS and the differential dysfunction in the signaling of Gi protein-coupled receptors. METHODES: Osteoblasts isolated from AIS patients of each functional subgroup were selected and compared to osteoblasts obtained from healthy controls. In addition, blood cells (PBMCs) isolated from a pair of monozygotic discordant twins of scoliosis was studied to compare their gene expression profiles. We used DNA chips with 54,000 probe sets that allow analysis of expression level of over 47,000 transcripts and variants from over 30,000 well-characterized human genes (Affymetrix, GeneChip® Human gene 1.0 ST array). The identified genes were subsequently validated by qPCR in a larger number of patients in order to test the specificity of expression profiles for each group of patients using bone cells derived during surgery. RESULTS: The molecular profiling will establish the molecular basis of AIS according to the functional test developed by Moreau et al., and identify new genes associate with AIS. This project may allow us to identify genes involved in the dysfunction of Gi protein signaling which present in all three groups of patients. Also genes associated specifically with a particular group, can contribute to the development of certain AIS co-morbidities and/or to a risk of aggravation of spine deformities. The preliminary study of monozygotic discordant twins of scoliosis revealed a limited number of genes potentially associated with the signaling defect observed in the scoliotic twin, the gene expression could be influenced by epigenetic changes related to the environment. CONCLUSION: The data obtained by transcriptomic approaches further support our functional method of AIS patients’ stratification, also allowed the identification of novel genes associated with AIS. Such results would provide us a better understanding of the mechanisms and factors involved in the etiology of AIS. In this regard, our results would help to identify potential and specific therapeutic targets and personalized treatments based on the distinct molecular profiles observed in each patient group.

Les mitochondries sont les organites qui produisent la quasi-totalité de l'énergie consommée par les cellules animales. Une de leurs particularités est de posséder leur propre génome (ADN mitochondrial ou ADNmt) qui, avec la collaboration indispensable du génome du noyau (ADNnu), code pour les enzymes responsables de la production d'énergie. Pour que ces organites fonctionnent adéquatement, la co-adaptation des génomes nucléaire et mitochondrial a donc été fortement sélectionnée au cours de l'évolution. Chez les animaux, l'ADNmt est, contrairement à l'ADNnu, transmis uniquement par la mère. L'hypothèse principale pour expliquer cette transmission maternelle est qu'en ayant un seul type d'ADNmt, la cellule évite un conflit génomique dans l'association intime entre les protéines codées par l'ADNnu et l'ADNmt. Autrement dit, la sélection naturelle doit nécessairement prévenir toute modification du dialogue entre les mitochondries et le noyau, ce qui risquerait de provoquer l'apparition de phénotypes indésirables. Exceptionnellement, un seul système mitochondrial «défie» les lois naturelles de transmission des mitochondries chez les animaux, soit celui observé chez les moules marines et d'eau douce. Les espèces possédant ce système atypique, qui est désigné sous le nom de double transmission uniparentale (doubly uniparental inheritance ou DUI), sont caractérisées par la présence de 2 ADNmt distincts qui sont hérités de façon maternelle (ADNmt F) ou paternelle (ADNmt M). Généralement, les femelles ne contiennent que le génome F, tandis que les mâles contiennent le génome F dans leurs tissus somatiques et le génome M dans leur gonade. Les divergences observées entre les ADNmt F et M chez les moules peuvent atteindre plus de 20%. Les produits des deux différents ADN mitochondriaux peuvent-ils interagir normalement avec les protéines d'un seul système génétique nucléaire (en raison de la co-adaptation intergénomique), ou certaines fonctions mitochondriales ont-elles été compromises dans une ou l'autre des lignées (c'est-à-dire, lignée paternelle M ou maternelle F)? Le grand attrait du système de double transmission uniparentale est qu'il est le seul modèle animal où deux variantes mitochondriales fortement divergentes coexistent et s'adaptent simultanément à un génome nucléaire. Cette situation se traduit probablement par la conservation d'une intégrité relative de certaines portions du génome mitochondrial afin de maintenir une cohésion fonctionnelle dans les interactions structurales entre les peptides mitochondriaux et nucléaires. L'objectif principal de mon doctorat était d'étudier l'évolution moléculaire des génomes mitochondriaux F et M chez les espèces du genre Mytilus et de vérifier si les gènes nucléaires et les gènes F et M mitochondriaux qui interagissent pour former le système de la phosphorylation oxydative co-évoluent. Spécifiquement, l'objectif premier du chapitre 1 a été d'analyser les ADNmt M et F complets chez trois espèces de moules marines (Mytilus edulis, M trossulus, et M galloprovincialis) afin de vérifier si leur évolution dans un environnement nucléaire commun (ou différent) se traduit par la conservation (ou non) de certaines de leurs portions (c'est-à-dire, évolution congruente des génomes M et F). Pour ce faire, les ADNmt ont été amplifiés par PCR et séquencés à l'aide d'un séquenceur d'ADN automatique. Les principaux résultats ont effectivement démontré que le fait de co-exister dans un même environnement nucléaire contraint les ADNmt F et M à expérimenter des pressions sélectives similaires, ce qui se traduit par une évolution congruente des différentes portions des ADNmt M et F (c'est-à-dire la corrélation positive des patrons de taux de substitution protéiniques). L'objectif du chapitre 2 a été de déterminer, chez les spermatozoïdes, si le remplacement d'un génome M par un génome F avait un effet sur les capacités métaboliques des mitochondries. L'étude visait à déterminer si la co-évolution du génome nucléaire avec deux types d'ADNmt différents avait été favorisée dans une où l'autre des lignées. Pour ce faire, des dosages enzymatiques (activité des complexes mitochondriaux I+Ill, II et IV et de la citrate synthase) ont été réalisés par spectrophotométrie. Les résultats ont démontré que la combinaison «ADNmt récemment-masculinisé -ADNnu» (qui est essentiellement une combinaison ADNmtF -ADNnu) performe mieux au niveau enzymatique que la combinaison «ADNmt M -ADNnu». Le troisième volet a été consacré à l'étude de l'évolution moléculaire des protéines interactives du système énergétique (c'est-à-dire, produits nucléaires et mitochondriaux en contact physique) afin de vérifier si les portions génétiques qui interagissent co-évoluent. Pour ce faire, le gène nucléaire codant pour le transporteur mobile d'électron cytochrome c (CYC) et des gènes mitochondriaux et nucléaires codant pour des sous-unités protéiques des complexes III (ADNmt = CYTB; ADNnu = C3S6) et IV (ADNmt = COX1 et COX2; ADNnu = COX4) du système de la phosphorylation oxydative ont été amplifiés par PCR et séquencés à l'aide d'un séquenceur d'ADN automatique. Les données moléculaires semblent démontrer que la co-évolution entre le génome F et le génome nucléaire est mieux couplée, ce qui vient appuyer les résultats enzymatiques du chapitre 2. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : ADN mitochondrial, Génomique comparative, ADN nucléaire, Mytilus, Co-évolution intergénomique.

Les bactériophages (i.e., virus de bactéries) constituent l'un des groupes d'organismes les plus abondants dans la biosphère. Ils jouissent d'une très grande biodiversité. Nos connaissances partielles de ces microorganismes sont sans cesse remises en cause par de nouvelles découvertes et le recensement est loin d'être terminé. Il existe bien des classifications basées sur les critères de morphologie et d'homologie génétique, mais celles-ci ne tiennent pas compte de l'évolution caractéristique des virus qui comprend à la fois la transmission verticale (évolution classique) et horizontale (évolution réticulée) de l'information. De plus, ces classifications ne disent rien à propos des ancêtres communs des espèces. Il y a donc beaucoup de possibilités d'affiner la taxonomie virale existante. Dans cette étude, nous présentons une nouvelle approche de classification des bactériophages, basée sur des méthodes heuristiques tirées des sciences cognitives de la catégorisation. Cette approche originale vise à reconstruire l'histoire évolutive des organismes viraux, en tenant compte de l'hypothèse d'évolution classique ainsi que l'hypothèse d'évolution réticulée, i.e., les transferts horizontaux de gènes (THG). En d'autres termes, la classification proposée prend en considération d'une part, l'approche traditionnelle d'analyse phylogénétique qui inclut la reconstruction d'arbres d'espèces par les méthodes de distances et d'inférence bayésienne et la reconstruction de séquences de protéines ancestrales par la méthode Tree-HMM en tenant compte des substitutions, des insertions et des délétions de caractères génétiques [Diallo et al. 2006 ; Felsenstein 1981], et d'autre part, l'approche de détection des transferts horizontaux par la méthode de réconciliation topologique de l'arbre d'espèces et l'arbre de gène [Makarenkov et al. 2008]. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Classification, Catégorisation, Phylogénie, Taxonomie, Virus, Bactériophages, Transferts horizontaux de gènes, Reconstruction ancestrale.

Actinobacillus pleuropneumoniae (App) est l’agent étiologique de la pleuropneumonie porcine, une infection pulmonaire contagieuse chez les porcs. Parmi les nombreux mécanismes de virulence retrouvés chez les bactéries, la formation de biofilms joue souvent un rôle important dans la pathogenèse. Il a été récemment démontré qu’App avait la capacité de former des biofilms in vitro. Dans notre laboratoire, la formation de biofilms par App a été évaluée en microplaques dans différents milieux de culture. Nous avons démontré que la souche de référence de sérotype 1 est capable de former des biofilms. Le but de ce travail est d’identifier des gènes impliqués dans la biosynthèse et dans la régulation de l’expression des biofilms chez App. L’objectif de cette étude était de générer une banque de mutants d’App 4074NalR à l’aide du transposon mini-Tn10. Cette banque de 1200 mutants a été criblée à l’aide du modèle in vitro de formation de biofilms en microplaques et en tubes : 24 mutants démontrant une formation de biofilms modifiée par rapport à la souche mère App 4074NalR ont été sélectionnés et identifiés, nous permettant ainsi de localiser le site d’insertion du transposon. Une analyse a permis d’identifier de nouveaux gènes impliqués dans la biosynthèse et dans la régulation de l’expression des biofilms chez App. Notre criblage a permis d’identifier 16 gènes connus impliqués dans la formation de biofilms chez App (hns) ou chez d’autres pathogènes (potD2, ptsI, tig and rpmF) mais également de nouveaux gènes impliqués dans la formation de biofilm (APL_0049, APL_0637 and APL_1572). Une caractérisation plus poussée de ces gènes nous permettra d’améliorer la compréhension des mécanismes impliqués dans la formation de biofilm chez App. / A. pleuropneumoniae (App) is the causative agent of porcine pleuropneumonia, a contagious pulmonary infection in swine. Among the numerous virulence mechanisms found in bacteria, the formation of biofilms often plays an important role in pathogenesis. It has been recently demonstrated that App has the ability to form biofilms in vitro. In our laboratory, the formation of biofilms by App has been evaluated in microplates under different growth conditions. We showed that the reference strain of serotype 1 is capable of forming biofilms when cultured in a specific growth medium. The objective of this work is to identifiy genes implicated in the biosynthesis and regulation of biofilm formation in App. The objective of this study was to generate a mutant library of App using the mini-Tn10 transposon. A total of 1200 mutants has been screened with the help of in vitro models for biofilm formation which use microtiter plates or test tubes; 24 mutants exhibited modified biofilm formation when compared to the parental strain 4074NalR. The selection and identification of these mutants allowed the identification of the insertion site of the transposon. Analysis revealed novel genes implicated in biosynthesis and regulation of the biofilm formation in App. Our screen allowed the identification of genes already associated in biofilm formation of App (hns) or other pathogens (potD2, ptsI, tig and rpmF). Genes (APL_0049, APL_0637 and APL_1573) that have not yet been associated with biofilm formation were also identified. Further characterization of the genes mentioned above would permit a greater understanding of the mechanisms implicated in biofilm formation of App.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal