Les domaines de la génomique et de la métagénomique ont apporté un support incommensurable à l'avancement de nos connaissances sur la génétique des bactéries. Les bactéries pathogènes sont maintenant séquencées et analysées pour identifier les facteurs causant leur virulence et/ou leur résistance aux antibiotiques ainsi que leur capacité à transmettre ces éléments génétiques qui sont d'un intérêt clinique. Les bactéries commensales, quant à elles, sont de plus en plus associées à la santé humaine et sont étudiées à l'aide de la métagénomique pour contrer les difficultés liées à leur culture étant donné leur grande diversité en matière de besoins métaboliques. Les nouvelles technologies de séquençages permettent donc de produire en masse ces séquences d'ADN à des fins de caractérisation et de comparaison dans le but d'élucider des questions souvent reliées à la santé humaine. Les avancées en génomique et en métagénomique requièrent des logiciels bio-informatiques capables de gérer et de s'adapter à la quantité massive et croissante des données biologiques. Les deux premières hypothèses de ce doctorat concernaient le développement de méthodes efficaces et flexibles pour l'analyse de génomes et de métagénomes bactériens. Plusieurs méthodes d'analyses bio-informatiques ont été explorées et ont mené à l'implémentation de deux logiciels pour supporter les hypothèses de recherche : Ray Surveyor et kAAmer. La première hypothèse de recherche consistait à vérifier s'il était possible d'obtenir une comparaison de génomes, depuis leur simple contenu en k-mers de séquences d'ADN, avec des résultats analogues aux comparaisons génomiques standards comme le pourcentage moyen d'identités ou les arbres phylogénétiques, mais sans nécessiter d'alignements de séquences. Nous avons démontré avec le logiciel Ray Surveyor et plusieurs analyses de génomique et de métagénomique bactérienne, qu'il était possible d'obtenir de tels comparaisons à l'aide de séquences d'ADN découpées en k-mer. Dans l'étude qui présenta les résultats de l'hypothèse de recherche, nous avons aussi estimé la propension génotypique de plusieurs espèces bactériennes à des phénotypes d'intérêt clinique à l'aide de bases de données de gènes spécialisées. La deuxième hypothèse était de tester s'il était possible de développer un logiciel pour l'identification de séquences protéiques, basé sur des k-mers d'acides aminés, qui serait plus performant que les logiciels existants, spécifiquement pour l'identification de protéines avec un haut degré d'homologie. Les travaux menèrent à l'implémentation de kAAmer, un logiciel permettant de créer des bases de données de protéines où la recherche de séquence se fait par association exacte de k-mers tout en supportant l'alignement de séquences. KAAmer s'est avéré très efficace pour la recherche de séquences de protéines avec des performances surpassant même, dans la majorité des scénarios, les aligneurs de séquences les plus rapides. D'autres fonctionnalités intéressantes sont aussi offertes par kAAmer, tel que la possibilité d'héberger une base de données en tant que service de manière permanente. Enfin, la troisième et dernière hypothèse de recherche visait à valider si les deux logiciels développés durant le projet de doctorat (Ray Surveyor et kAAmer) produiraient des résultats viables dans une analyse métagénomique du microbiote intestinal en lien avec l'obésité. Les profilages taxonomique et fonctionnel furent donc réalisés avec kAAmer et la comparaison de novo des métagénomes investiguée avec Ray Surveyor. Les résultats obtenus se sont avérés significatifs et ont démontrés, entre autres, une tendance vers une abondance relative plus élevée pour le phylum Bacteroidetes et moins élevée pour les phyla Firmicutes et Acinetobacteria chez les sujets obèses. Une multitude de fonctions métaboliques se sont aussi avérées significativement différentes dans les conditions normales et d'obésités des métagénomes, avec une mention particulière à celles reliées au métabolisme des acides gras à chaîne courte qui sont reconnues pour être associées à l'obésité. / The fields of genomics and metagenomics have provided immeasurable support to the advancement of our knowledge of bacterial genetics. Pathogenic bacteria are now routinely sequenced and analyzed to identify the factors causing their virulence or antibiotic resistance as well as their ability to transmit genetic elements. Commensal bacteria are increasingly associated with human health and are being studied using metagenomics to counter the issues associated with their culture due to their wide range of metabolic needs. Next generation sequencing enabled us to mass-produce these DNA sequences for characterization and comparison purposes in order to elucidate questions related to human health. Improvement in genomics and metagenomics studies required bio-informatics software that are able to manage and adapt to an increasing availability of biological sequences data. The first two hypotheses of this thesis include the development of efficient and flexible methods for the analysis of bacterial genomes and metagenomes. Several bio-informatics analysis methods were explored and led to the implementation of two software to support the research hypotheses: Ray Surveyor and kAAmer. The first research hypothesis was to test the possibility of obtaining a comparison of genomes, from their simple DNA k-mers content, with results analogous to standard genomic comparisons such as average nucleotide identity or phylogenetic trees, but without the need for sequence alignments. Using Ray Surveyor software and several bacterial genomic and metagenomic analyses, we have demonstrated that it is possible to obtain such comparisons using k-mers from DNA sequences. In the study that presented the results of the research hypothesis, we also estimated the genotypic propensity of several bacterial species to clinically relevant phenotypes using specialized gene databases. The second hypothesis was to test the possibility of developing a software for protein sequence identification, based on amino acid k-mers, which would be more efficient than existing software, specifically for the identification of proteins with a high degree of homology. The work led to the implementation of kAAmer, a software solution that allows the creation of protein databases where the sequence search is done by exact match of k-mers, while supporting sequence alignment. KAAmer has proven to be very efficient for protein sequence search with performances surpassing even the fastest sequence aligners in most scenarios. Other interesting features are also offered by kAAmer, such as the possibility to host a database as a service on a permanent basis. Finally, the third and last research hypothesis aimed to test the capacity the two software developed during the PhD project (Ray Surveyor and kAAmer) to produce viable results in a metagenomic analysis of the gut microbiota in relation to obesity. Taxonomic and functional profiling was performed with kAAmer as the de novo comparison of metagenomes with Ray Surveyor. The results obtained were significant and showed, among others, a trend towards higher relative abundance of the Bacteroidetes phylum and lower relative abundance of the Firmicutes and Acinetobacteria phyla in obese subjects. Several metabolic functions were also found to be significantly different in the normal and obese conditions, with a particular mention to the metabolism of short-chain fatty acids (SCFA) that are known to be associated with obesity.

La maladie osseuse de Paget (MOP) a changé de visage au cours des dernières années, augmentant le nombre d’individus atteints qui demeurent asymptomatiques. Étant donné le risque élevé de développer un ostéosarcome associé avec la MOP, cette maladie est une contre-indication à la prescription d’agents ostéoformateurs. Avec l’apparition prochaine de nouveaux agents ostéoformateurs pour le traitement de l’ostéoporose, il devient crucial de pouvoir dépister de façon fiable la présence de la MOP. Les objectifs de ce projet étaient (1) de mettre au point un test plus sensible permettant de détecter et d’évaluer la fréquence des mutations post-zygotiques SQSTM1/P392L chez les patients pagétiques, (2) de développer un test génétique de dépistage de la MOP incluant les mutations germinales et post-zygotiques dans SQSTM1, (3) et d’évaluer les performances diagnostiques de ce test intégré avec des marqueurs biochimiques dans une signature moléculaire spécifique à la maladie. Une technique de PCR sensible utilisant un acide nucléique bloqué (LNA) spécifique à la mutation SQSTM1/P392L a été développée, puis la présence de cette mutation a été recherchée dans les cohortes disponibles au laboratoire et dans différents tissus. Ensuite, le développement de la signature moléculaire a utilisé les données génotypiques et biochimiques disponibles dans les cohortes du laboratoire, puis des régressions logistiques ont été effectuées afin de déterminer la combinaison de marqueurs ayant la meilleure capacité à identifier correctement les patients avec la MOP. Des mutations post-zygotiques SQSTM1/P392L étaient présentes chez 4,8% des patients pagétiques, et 1,4% des individus sains dans les populations étudiées, cette mutation post-zygotique étant restreinte à la lignée monocytaire. Deux tests moléculaires sous forme d’algorithme en deux étapes ont ensuite été proposés. D’une part, un algorithme génétique pur pourrait être utilisé : des mutations germinales dans le gène SQSTM1 devraient d’abord être recherchées, et si elles sont absentes, le score génétique basé sur la combinaison de cinq marqueurs génétiques développée dans ce projet devrait être calculé. Cet algorithme génétique avait une sensibilité égale à 83,61% et une spécificité égale à 51,03% dans les cohortes étudiées. D’autre part, un algorithme génétique et biochimique pourrait être proposé: des mutations germinales dans le gène SQSTM1 devraient d’abord être recherchées, et si elles sont absentes, le score combiné basé sur la combinaison des marqueurs génétiques et biochimiques développée dans ce projet devrait être calculé. Dans les populations étudiées, cet algorithme avait une sensibilité égale à 93,88% et une spécificité égale à 54,00%. La découverte des mutations post-zygotiques confirme l’existence d’un spectre mutationnel de SQSTM1 dans la MOP et pourrait expliquer en partie son caractère focal. Ces résultats ont par la suite permis de développer deux tests moléculaires capables de dépister la MOP de façon plus fiable que les biomarqueurs actuellement disponibles en pratique clinique. / Paget’s disease of bone (PDB) has changed in recent years, increasing the number of affected individuals who remain asymptomatic. Given the high risk of developing an osteosarcoma associated with PDB, this disease is a contraindication to the prescription of bone anabolic agents. With the incoming introduction of new bone anabolic agents indicated for osteoporosis treatment, it will be crucial to screen accurately for the presence of PDB. The objectives of this project were (1) to develop a more sensitive test to detect and assess the frequency of SQSTM1/P392L post-zygotic mutations in pagetic patients, (2) to develop a genetic test of PDB, including germinal and post-zygotic SQSTM1 mutations, (3) and to assess the diagnostic performance of this test integrated with bone biomarkers in a molecular signature of PDB. A sensitive PCR method using a locked nucleic acid (LNA) specific to the SQSTM1/P392L mutation was developed, and the presence of this mutation was investigated in the cohorts available in the laboratory, and in different tissues. Then, the development of the molecular signature used genotypic and biochemical data available in the laboratory, and logistic regressions were performed to determine the combination of markers with the best ability to correctly identify PDB patients. SQSTM1/P392L post-zygotic mutations were present in 4.8% of pagetic patients, and in 1.4% of healthy individuals in the population studied, this mutation being restricted to the monocytic lineage. Two molecular tests relying on a two steps algorithm were then developed. Firstly, a pure genetic algorithm could be proposed: a screen in the SQSTM1 gene should first be performed to search for disease-causing germinal mutations, and if negative, the genetic score based on a combination of the five SNPs developed in this study should be calculated. In the populations studied, this genetic algorithm had a sensitivity of 83.61% and a specificity of 51.03%. On the other hand, a genetic and biochemical algorithm could be used: a screen in the SQSTM1 gene should first be performed to search for disease-causing germinal mutations, and if negative, the combined score based on a combination integrating both genetic and biochemical markers developed in this study should be calculated. This genetic algorithm had a sensitivity of 83.61% and a specificity of 51.03% in the populations studied. The presence of post-zygotic mutations confirms the existence of a mutational spectrum of SQSTM1 in PDB, and may explain its focal character. These results conducted to the development of two molecular tests which predicted the PDB phenotype better than bone biomarkers already available in clinical practice.

Leishmania est un pathogène important pour la santé humaine avec plus de 350 millions de personnes à risque dans le monde. Leishmania présente des caractéristiques uniques en termes de régulation génique constituant ainsi un excellent modèle pour l’étude des mécanismes de régulation génique. Chez Leishmania ainsi que les autres Trypanosomatidae, il n’y a pas de controle au niveau de l’initiation de la transcriptin et la regulation se fait pas presque exclusivement au niveau post-transcriptionnel. Les éléments régulateurs en cis situés dans les régions 3' non-traduites (3'UTRs) des ARN messagers chez Leishmania (ARNms) sont essentiels pour la régulation de la stabilité ou la traduction des transcrits. Malgré les efforts considérables déployés pour l’identification de ces éléments régulateurs, uniquement quelques centaines ont été caractérisées chez les eucaryotes. Nous avons identifiés une nouvelle classe de rétroéléments agissant en cis, appelés SIDERs (Short Interspersed DEgenerate Retroposons) qui sont largement distribués dans le génome du parasite (>2000 copies de SIDER1 et SIDER2), situés pour la plupart dans la région 3ʹUTR. Les transcrits contenant SIDER2 le région 3ʹUTR sont dégradés par un mécanisme indépendant de la déadénylation initié par un clivage endonucléolytique au sein de la séquence signature II (SII) qui est conservée parmi SIDER2. Mon travail a consisté à déterminer les séquences nécessaires pour le clivage endonucléolytique et à identifier les trans-régulateurs jouant un rôle dans la dégradation des ARNm dépendante de SIDER2. Nous avons adopté une approche de purification d'affinité d'ARN étiquetés MS2 permettant de capturer les facteurs trans-régulateurs. Parmi ces éléments liant spécifiquement SIDER2, la Pumilio protéine PUF6 est responsable de la dégradation du transcrit rapporteur possédant la séquence SIDER2 en 3ʹUTR. De plus, l’inactivation du gène PUF6 se manifeste par une augmentation de stabilité des transcrits, suggérant un rôle de PUF6 dans la dégradation des ARNm médiée par SIDER2. Des études de mutations au sein de la séquence conservée, signature II, responsable de la régulation de la dégradation, ont permis de souligner l’importance de sites de clivages putatifs, précédemment identifiés au niveau de SIDER2. De plus, deux régions additionnelles proches de l’extrémité terminale de la séquence SIDER2 se sont révélées de jouer aussi un rôle au niveau de la déstabilisation de l’ARNm. Enfin, nous avons investigué le rôle de la traduction au niveau de la dégradation des ARNm médiée par SIDER2 et nous avons montré que la dégradation des transcrits SIDER2 est liée à une traduction active, soulignant ainsi l’importance de la machinerie de la traduction au niveau de la régulation globale des transcrits contenants des éléments SIDER2 dans le 3’UTR.. / Leishmania spp. are important human pathogens which put lives of over 350 million people at risk, worldwide. Apart from being an important human pathogen, Leishmania has unique features in terms of gene regulation, rendering it an excellent model organism to study gene regulation mechanisms. Notably, Leishmania and other trypanosomatids lack control at the level of transcription initiation and therefore most of the regulation of gene expression takes place post-transcriptionally. Cis-acting elements in 3ʹ-untranslated regions (3ʹUTRs) of Leishmania messenger RNAs (mRNAs) are central to the regulation of mRNA decay or translation efficiency. We have identified a novel class of cis-acting retroposons, termed SIDERs (Short Interspersed DEgenerate Retroposons) that are widely distributed in the parasite genome (>2000 copies of SIDER1 and SIDER2), mostly within 3ʹUTRs. Transcripts bearing SIDER2 in their 3ʹUTR are degraded via a deadenylation-independent pathway involving endonucleolytic cleavage within the conserved signature II (SII) sequence of SIDER2 elements. My research project aimed at determining the sequence requirements for endonucleolytic cleavage and identifying the trans-acting factor(s) contributing to SIDER2-mediated mRNA decay. We employed a tethering approach using the MS2 system to capture the trans-acting proteins in vivo. Amongst the proteins specifically tethered to SIDER2, the Pumilio protein PUF6 was shown to downregulate the SIDER2-harboring reporter transcript. Furthermore, inactivation of the PUF6 gene resulted in upregulation and increased transcript stability, indicating that PUF6 contributes to SIDER2-mediated decay. Mutational analysis within the conserved SII region, known to regulate decay, highlighted the importance of the previously mapped putative cleavage sites in mediating degradation of SIDER2-containing transcripts. Furthermore, two additional regions closer to the end of the SIDER2 sequence were found to contribute to mRNA destabilization. Finally, we addressed the requirement of translation for SIDER2 mediated decay and showed that degradation of SIDER2 transcripts is linked to ongoing translation, underscoring significance of the translation apparatus in global regulation of SIDER2-containing transcripts.

Malgré les progrès récents associés à l’utilisation des nucléases d’ingénierie du génome, certaines problématiques persistent. Par exemple, l’isolement des cellules génétiquement modifiées est un travail long et parfois laborieux. De plus, la spécificité des nucléases est aussi un point souvent mal caractérisé. Cette dernière peut avoir des conséquences importantes in vitro, mais particulièrement in vivo. Le but de mon projet de maitrise était de développer des techniques permettant d’adresser ces deux problématiques. Ici, nous avons créé une cassette de sélection auto-excisable qui exploite le processus de réparation par appariement simple brin (SSA) et qui permet une isolation simple de clones modifiés sans laisser de « cicatrices » dans l’ADN. Le procédé se base sur une sélection à la puromycine, une contre sélection au ganciclovir et une excision de la cassette de résistance via l’utilisation de nucléases thermosensibles. Nous avons démontré la faisabilité de cette approche en intégrant la protéine fluorescente EGFP au locus AAVS1 et en insérant une étiquette de purification au locus EZH2. Ce locus code la protéine Enhancer of Zeste Homolog 2 (EZH2). Dans un deuxième temps, nous avons évalué la possibilité d’utiliser deux paires de nickases pour créer deux cassures simple brin (SSB) et ainsi induire indirectement une cassure double brin dans l’ADN. Cette approche permet de diminuer de façon importante la possibilité de créer des mutations à des sites non-ciblés. Nous avons déterminé que deux SSBs doivent avoir lieu sur des brins opposés et à proximité afin de stimuler la modification génique voulue. Toutefois, ces paires de nickases ont une efficacité plus faible que les nucléases clivant au même endroit. Les nouveaux outils décrits dans ce mémoire permettront éventuellement de simplifier l’ingénierie du génome en diminuant la charge de travail nécessaire à l’enrichissement des cellules modifiées génétiquement et en augmentant la spécificité des nucléases, ce qui permet de réduire les probabilités de mutations à des loci hors cible. / Despite recent advances in the use of engineered nucleases, some issues remain. For example, isolation of genetically engineered cells is a long and sometimes laborious process. Moreover, the specificity of nucleases is often poorly characterized. The latter may have important consequences in vitro, but particularly in vivo. We aimed to develop techniques for addressing these two problems. Here we have created a self-excisable selection cassette that exploits the single-strand annealing (SSA) repair process and allows for simple isolation of modified clones and scarless genome editing. The method is based on puromycin selection, ganciclovir counter-selection and excision of the resistance cassette via the use of heat-sensitive nucleases. We demonstrate the feasibility of this approach by integrating the fluorescent protein EGFP at the AAVS1 locus and by inserting a purification tag at the EZH2 locus. This locus encodes the protein Enhancer of Zeste Homolog 2 (EZH2). Secondly, we evaluated the possibility of using two pairs of nickases to create two single-strand breaks that could be repaired as a double strand break. As a proof of concept, we created two single-strand breaks at a distance of 513 bp at the CCR5 locus. When they take place on opposite strands, the latter can recreate the effect of a double-strand break, but with a lower efficiency than the nucleases cleaving at the same site. We determined that the double-strand break effect created by two single-strand breaks increases as the distance between the two single-strand breaks decreases. The new tools described here make it possible to simplify genome engineering by reducing the workload necessary for the enrichment of genetically modified cells and by increasing the specificity of the nucleases by decreasing the potential for off-target mutagenesis.

L'obesité est un problème de santé en soi et c'est aussi un facteur de risque pour de nombreux autres problèmes de santé. Outre le contrôle de l'alimentation et l'activité physique, les options pharmacologiques contre l'obésité restent limitées et de nouvelles options thérapeutiques sont nécessaires. Dans ce contexte, la génomique fonctionnelle peut identifier de nouvelles options pour gérer et étudier l'obésité. Notre groupe de recherche a identifié deux gènes liés aux deux principaux facteurs ayant un impact sur le développement de l'obésité : La diète, principalement riche en gras (HFD) et l'exercice. Ces deux gènes clés sont le trefoil factor family member 2 (Tff2) et la secreted protein acidic and rich in cysteine (SPARC). Alors que Tff2 a été identifié comme un gène induit par la HFD, SPARC a été caractérisé comme un gène induit par l'exercice. Notre groupe de recherche a également constaté que les souris Tff2 knock-out (KO) sont protégées contre l'obésité induite par la HFD. Par conséquent, ma thèse explore Tff2 et Sparc dans le contexte de l'obésité et le métabolisme énergétique. Tff2 est principalement exprimé dans le système digestif où elle a une propriété de protection des muqueuses, tandis que Sparc est plus largement distribué et s'exprime principalement lors de remodelage tissulaire dans des situations telles que les blessures et la croissance. Les parties théoriques de cette thèse décrivent diverses propriétés de Tff2 et Sparc décrites dans la littérature telles que le métabolisme et les rôles cellulaires ainsi que les implications et les applications potentielles des données que j'ai générées. Pour mes données de recherche rapportées dans cette thèse, elles sont divisées en trois publications. La première, explore des souris Tff2 KO pour expliquer leur protection contre l'obésité induite par la HFD. Les souris Tff2 KO avaient des taux plus faibles de glucose, de triglycérides et de glycérol. Leurs niveaux d'expression génique et protéique indiquent moins de stockage de graisse et une dépense énergétique accrue en améliorant l'utilisation des lipides et du glucose via la phosphorylation oxydative. Nos données mettent en évidence les voies liées à Tff2 comme potentielles cibles pour les thérapies contre l'obésité. Via une expérimentation animale, la deuxième étude vise à identifier des implications de SPARC principalement dans le muscle dans les contextes de l'exercice. Les souris ont été divisées en huit groupes en fonction de trois variables (âge, génotype et exercice). Les effets du Sparc KO sur la composition corporelle, l'adiposité et le métabolisme sont vers une réduction du tissu adipeux blanc et du poids corporel, mais avec un phénotype métabolique et fonctionnel musculaire négatif. Alors que ces effets négatifs s'aggravent avec le vieillissement, ils sont relativement améliorés par l'exercice. Nos données suggèrent aussi que les changements induits par l'exercice dans le phénotype du muscle squelettique (métabolisme, force et développement), y compris les changements induits par le lactate, dépendent de SPARC. Le troisième article à deux parties. Tout d'abord, j'explore les conséquences du Sparc KO et les compare aux effets du vieillissement. J'observe également les effets de l'exercice. Dans la deuxième partie, j'étudie les effets de la surexpression de Sparc et les compare aux avantages de l'exercice. Les mesures étaient principalement liées au poids des tissus, à l'adiposité, au métabolisme et à la force musculaire. Collectivement, ces résultats, et les données de la deuxième étude, montrent que les souris Sparc KO développe un phénotype semblable au vieillissement, tandis que la surexpression de SPARC et l'exercice génèrent des avantages similaires. Ces avantages visent à contrer à la fois le phénotype du vieillissement induit par le déficit en SPARC et à améliorer les changements liés à l'âge. Les applications potentielles de ces résultats sont de construire/optimiser des modèles d'animaux basés sur Sparc KO et, d'autre part, de développer des thérapies contre l'obésité, les troubles métaboliques ou liés à l'âge basées sur l'introduction de SPARC ou le ciblage des voies liées à SPARC pour imiter l'exercice. L'exploration de telles voies moléculaires permettrait à la fois d'élucider certains mécanismes et de développer une nouvelle génération d'options thérapeutiques pour l'obésité et les troubles métaboliques, y compris les troubles liés à l'âge. De telles approches seraient basées sur le ciblage de TFF2, SPARC ou de leurs voies connexes. / Obesity represents a challenge for health professionals. It is a health problem itself and it is also a risk factor for numerous health problems. Beside diet control and physical activity, the pharmacological options against obesity remain limited and novel therapeutic options are required. Within this context, functional genomics represents an emerging approach to identify novel options to manage and study obesity. Our research group has previously conducted functional genomics explorations to identify genes related to the two main factors impacting obesity development: Diet (mainly high fat) and exercise. Indeed, both diet, especially high-fat diet (HFD), and exercise are at the center of obesity management. Those functional genomics studies identified two key genes: Trefoil factor family member 2 (Tff2) and secreted protein acidic and rich in cysteine (SPARC). Whereas Tff2 was identified as a HFD-induced gene, SPARC was characterized as an exercise-induced gene. Following that, our research group has also found that Tff2 knock-out (KO) in mice protects them from the HFD-induced obesity. Therefore, my thesis explores Tff2 and Sparc within the context of obesity and energy metabolism. Tff2 is mainly expressed in the digestive system where it has mucus protection property, whereas Sparc is more widely distributed and is expressed mainly during tissues remodeling in situations such as injuries and growth. The theoretical parts of this thesis describe various properties of both Tff2 and Sparc reported in the literatures such as metabolism and cellular roles as well as implications and potential applications of the data I generated. For the research parts reported in this thesis, they are divided into three publications. The first one, explores Tff2 KO-related pathways of mice at the genomic, proteinic and biochemical levels to elucidate the processes behind their protection from the HFD-induced obesity. Tff2 KO mice had lower levels of serum glucose, triglycerides and glycerol. Western blotting and Q_RT-PCR revealed that the expression levels of selected genes and proteins are toward less fat storage and increased energy expenditure by enhancing lipid and glucose utilization via oxidative phosphorylation. The data highlight Tff2-related pathways as potential targets for obesity therapies. Via an animal experiment, the second study aims to identify selected implications of SPARC mainly within the muscle in the contexts of exercise. Mice were divided into eight groups based on three variables (age, genotype and exercise): Old or young × Sparc KO or wild type × sedentary or exercise. The exercised groups were trained before all mice were sacrificed. Sparc KO effects on body composition, adiposity and metabolic patterns are toward a reduced white adipose tissue and body weight, but with a negative metabolic and functional phenotype of the skeletal muscle. Whereas such negative effects on skeletal muscle are worsened with ageing, they are relatively improved by exercise. Importantly, our data suggest that the exercise-induced changes in the skeletal muscle phenotype, in terms of increased performance (metabolic, strength and development) including lactate-induced changes, are SPARC-dependent. The third paper studies and compares both Sparc KO and Sparc overexpression in male and female mice. First, I explore the consequences of Sparc KO and compare them to the ageing phenotype. I also observe the effects of exercise. In the second part, I study the consequences of SPARC overexpression and compare them to the exercise benefits. The measurements were mainly related to tissue weights, adiposity, metabolism, and muscle strength. Collectively, these findings and data show that Sparc KO mice manifest an ageing-like phenotype, whereas SPARC overexpression and exercise generate similar benefits. These benefits are towards counteracting both SPARC deficiency-induced ageing-like phenotype as well as reversing the age-related changes. The potential applications of these findings are to build/optimize Sparc KO-based animal models of various health conditions and, on the other hand, to develop therapies based on introducing SPARC or targeting SPARC-related pathways to mimic exercise against obesity, age-related and metabolic disorders. Exploring such molecular patterns would allow both mapping some underlying mechanisms and developing a new generation of therapeutic options for obesity and metabolic disorders, including age-related disorders. Such approaches would be based on targeting TFF2, SPARC or their related pathways.

La protéine Rttl06 (Regulator of Ty Transposition) est un chaperon d'histones découvert récemment chez la levure. Ce facteur interagit avec les histones H3 et H4 et possède la faculté de déposer des nucléosome sur des molécules d'ADN. Dans notre laboratoire, le gène RTT106 fut identifié dans un crible de gènes synthétiques létaux utilisant une mutation dans le gène SPT2. De plus, des résultats obtenus dans notre laboratoire suggèrent que Rttl 06 est impliqué, tout comme SPT2 et SPT6, dans les modulations de la chromatine associée à l'élongation de la transcription. Des défauts dans cette fonction se manifeste par plusieurs phénotypes différents incluant une initiation de la transcription à partir de TATA cryptiques. Rttl06 est un chaperon d'histones suggérée de jouer un rôle dans la répression génique (± silencing ¿) par l'hétérochromatine chez S. cerevisiae. Elle interagit physiquement et fonctionnellement avec le Chromatin Assembly Factor-1 (CAF-1) qui est associé avec la déposition d'histones couplée à la replication. Nous avons utilisé diverses approches pour étudier Rtt106 de façon détaillée et lui avons identifié une fonction auparavant inconnue. Nous avons trouvé des interactions génétiques entre rtt106[delta] et des mutations dans des gènes codants pour des facteurs d'élongations, incluant Spt6, TFIIS et des membres des complexes PAF et DSIF. De plus, des analyses par immunoprecipitation de la chromatine indiquent que Rtt106 est associé spécifiquement aux régions transcrites de gènes actifs. Nos résultats ont aussi montré que Rtt106 est requis pour la répression de la transcription à partir de promoteurs cryptiques à l'intérieur d'une région codante. Cette observation suggère fortement que Rtt106 joue un rôle dans la régulation du niveau de déposition d'histone H3 couplée à la transcription. Pour finir, des résultats préliminaires suggèrent un lien entre Rtt106 et la régulation du niveau d'acétylation de la lysine 9 de l'histone H3. En somme, nos résultats indiquent un lien direct pour Rtt106 dans l'élongation de la transcription et les dynamiques de la chromatine associée avec le passage de l'ARN polymerase II.

La régulation post-transcriptionnelle joue un rôle essentiel dans le contrôle du développement des animaux et des maladies. Parmi les mécanismes de régulation posttranscriptionnelle identifiés à ce jour, les microARNs jouent un rôle central. Ils constituent une large classe de courts ARNs régulateurs qui ont été découverts chez le nématode C. elegans et ont été répertoriés chez tous les métazoaires. Les microARN sont transcrits par l'ARN polymérase II sous forme d'un long transcrit primaire et vont subir deux étapes de clivage successives pour former le microARN mature. Le microARN mature est pris en charge par une protéine Argonaute pour former un complexe effecteur, le miRISC. Les microARN s’associent avec la région 3' non traduite de leurs ARNm cibles pour réprimer leur traduction et/ou initier leur dégradation. L'orchestration dynamique de ces processus n'est pas bien comprise, mais on pense actuellement qu'elle dépend en grande partie d'un partenaire clé des Argonautes, GW182. Les cellules germinales sont la source d’ARNm maternels dont la régulation est essentielle aux premières étapes de l’embryogénèse. Le maintien de la stabilité de ces transcrits est assuré par des mécanismes posttranscriptionnels. Les microARNs sont abondants dans la lignée germinale et donc pourraient potentiellement participer à cette régulation. C’est ce qui nous amène à étudier la fonction des microARNs dans les cellules germinales. L’objectif de mon doctorat a été de comparer les mécanismes moléculaires utilisés par les microARN dans les cellules germinales et somatiques afin de mieux comprendre comment ils régulent l’expression des gènes. Grâce à une combinaison d’analyses protéomiques et de rapporteurs de l’activité des microARN in vivo, nous avons pu disséquer la composition et la fonction des miRISC germinaux et somatiques. Nous avons découvert un mécanisme de répression indépendant de GW182 qui réprime et stabilise les cibles de microARN. De façon intéressante, nous démontrons que des sites de liaison des miARN sont suffisants pour localiser un transcrit germinal à la région périnucléaire. Finalement, nous identifions GLH-1, une composante des granules P germinaux, comme étant un cofacteur de la fonction des microARN germinaux. Collectivement, mes travaux de doctorat nous ont permis de contribuer à améliorer les connaissances des mécanismes de la régulation des gènes par les microARN. / Post-transcriptional regulation plays a key role in controlling animal development and diseases. Among all post-transcriptional regulatory mechanisms identified to date, microRNAs play a central role. They constitute a large class of short non-coding RNAs that were discovered in C. elegans and have been reported in all metazoans. MicroRNAs are transcribed by RNA polymerase II as a long primary transcript that will undergo two successive cleavage steps to form the mature microRNA. The mature microRNA is the loaded onto an Argonaute protein to form an effector complex, the miRISC. MicroRNAs associate with the 3' untranslated region of their target mRNAs to repress their translation and/or initiate their degradation. The dynamic orchestration of these processes is not well understood, but at the moment is thought to be largely dependent on a key Argonaute partner, GW182. In developmental contexts such as oogenesis and early embryogenesis, the expression of maternally supplied mRNAs is tightly controlled. In oocytes, translational repression rather than irreversible mRNA decay, is preferred to accumulate and maintain a pool of maternal mRNAs whose timely expression is critical later in development. MicroRNAs are abundant in the germ line and therefore could potentially participate in this regulation. This leads us to study the function of microRNAs in germ cells. The aim of my PhD was to compare the molecular mechanisms used by microRNAs in germline and somatic cells to better understand how they regulate gene expression. Using a combination of proteomic analyzes and in vivo microRNA activity reporters, we were able to dissect the composition and function of germline and somatic miRISCs. We uncover a GW182- independent silencing mechanism used by germline miRNAs to both repress and unexpectedly stabilize their target mRNA. Interestingly, miRNA binding sites are sufficient to localize a germline reporter transcript to the perinuclear region. Finally, we identify GLH-1, a germline P granule component, as an miRISC cofactor involved in the repression of germline microRNA targets. Collectively, my doctoral work helps us gain new insights about the mechanisms used by microRNAs to regulate gene expression.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles. / Les biodiesels, des carburants renouvelables d'origine biologique obtenus par transestérification des huiles, sont considérés comme des alternatives plus respectueuses de l'environnement en comparaison aux diesels pétroliers. Leur combustion génère moins d'émissions de monoxyde de carbone, de dioxyde de soufre et d'hydrocarbures imbrûlés que les diesels. Cependant, malgré leurs avantages, les biodiesels présentent une viscosité élevée entraînant des problèmes d'atomisation, une faible stabilité à l'oxydation, une mauvaise performance à basse température et des émissions plus importantes d'oxydes d'azote. L'objectif de ce projet de maîtrise était d'optimiser le profil lipidique de la levure oléagineuse *Yarrowia lipolytica* grâce à la biologie synthétique pour produire des biodiesels aux propriétés améliorées. Les mutants construits durant cette étude ont montré une augmentation des titres lipidiques et ont généré des profils lipidiques plus insaturés. À l'aide de modèles mathématiques basés sur la longueur et l'insaturation des lipides, les propriétés des biodiesels produits à partir de ces mutants ont été prédites, révélant des biodiesels améliorés avec une viscosité réduite et une opérabilité à des températures sous 0 °C. D'ailleurs, ce travail a abouti à l'amélioration de l'efficacité de l'édition génétique par CRISPR-Cas9 chez *Y. lipolytica* par le développement du promoteur synthétique p*TEF*(-41-406)-Kozak pour l'expression de l'endonucléase Cas9. De plus, nous avons optimisé les conditions de croissance de la levure pour une surproduction de lipides en utilisant un plan factoriel. Pour ce dernier, nous avons développé et standardisé une méthode de quantification des lipides à haut débit basée sur la fluorescence du rouge de Nil. Les essais d'optimisation ont révélé qu'un ratio C/N de 61 est optimal pour obtenir le meilleur rendement lipidique en culture. Ces travaux contribuent à faire avancer la recherche sur les biodiesels provenant des levures oléagineuses en tant que remplacement aux diesels et à l'avancement des connaissances sur les lipides microbiens. / Biodiesels are renewable fuels of biological origin obtained by transesterification of oils and are considered more environmentally-friendly alternatives to petroleum-based diesels. Their combustion generates fewer emissions of carbon monoxide, sulfur dioxide and unburned hydrocarbons than diesels. However, despite their advantages, biodiesels have a high viscosity leading to atomization problems, a poor oxidation stability, a poor low-temperature performance and higher emissions of nitrogen oxides. The aim of this project was to optimize the lipid profile of the oleaginous yeast *Yarrowia lipolytica* using synthetic biology to produce biodiesels with improved properties. The mutants constructed during this study showed an increase in lipid titers and generated more unsaturated lipid profiles. Using mathematical models based on lipid length and unsaturation, the properties of biodiesels produced from these mutants were predicted, revealing improved biodiesels with reduced viscosity and better operability at temperatures below 0°C. Moreover, this work led to the improvement of the efficiency of CRISPR-Cas9 gene editing in *Y. lipolytica* through the development of the synthetic promoter p*TEF*(-41-406)-Kozak for the expression of the Cas9 endonuclease. In addition, we optimized yeast growth conditions for lipid overproduction using a factorial design. For the latter, we developed and standardized a high-throughput lipid quantification method based on Nile Red fluorescence. Optimization trials revealed that a C/N ratio of 61 is optimal for obtaining the best lipid yield in culture. This work contributes to advance research on biodiesels from oleaginous yeasts as a replacement for diesels, and to further the knowledge of microbial lipids.

Le virus de l'immunodéficience bovine (VIB) est un rétrovirus qui partage des propriétés similaires avec les autres lentivirus, dont le virus de l'immunodéficience humaine (VIH). L'expression des gènes lentiviraux dépend des protéines régulatrices virales Tat et Rev qui interviennent, dans le cycle de réplication virale, aux niveaux transcriptionnel et post-transcriptionnel, respectivement. Les longues répétitions terminales (LTR) du génome viral fournissent, quant à elles, les signaux d'initiation, d'amplification et de terminaison de la transcription. La protéine Tat, pour exercer son activité transactivatrice, interagit avec une séquence d'ARN appelée TAR ("transactivaton response element") présente sur tous les transcrits viraux. Tat recrute le facteur positif de l'élongation de la transcription b (pTEFb) au niveau du promoteur viral des LTR pour augmenter l'efficacité de transcription de l'ARN polymérase II. La protéine nucléaire Rev est impliquée dans le transport nucléo-cytoplasmique des ARN viraux mono- et non épissés. Récemment, une protéine hybride Tat/Rev constituée de 236 acides aminés (Tat 236) a été découverte à partir de virions isolés de la rate de lapins qui avaient été infectés trois ans auparavant, suggérant une évolution temporelle du virus in vivo. L'objectif de ce travail était de déterminer si des variations génétiques et/ou fonctionnelles pouvaient se retrouver dans d'autres parties du génome du variant du VIB impliquées dans la régulation de l'expression génique virale, notamment au niveau du LTR et du gène accessoire rev du VIB. Ainsi, en utilisant la technique d'amplification en chaîne des gènes (PCR), une séquence LTR mutante (LTRm) fut mise en évidence, démontrant la présence de trois mutations aux positions 191, 250 et 271 lorsque comparée à celle du LTR pré-infection obtenue du génome des virus ayant servi à l'infection des lapins. La séquence du LTR pré-infection était 100% identique à celle du LTR sauvage (LTRs) retrouvée dans la littérature. En utilisant un test de transactivation CAT in vitro avec la protéine Tat103 comme agent transactivateur, le LTRm démontra une activité promotrice d'au moins deux fois supérieure à celle obtenue avec le LTRs. Pour tenter d'associer ces mutations au nouveau caractère phénotypique de LTRm, des mutants de restauration furent développés par PCR-mutagenèse pour revenir au phénotype LTRs. L'ensemble des résultats obtenus suggère que les mutations en positions 250 et 271 seraient impliquées dans l'activité promotrice augmentée de LTRm. Finalement, l'analyse de séquences du gène rev pré- et post- infection a montré deux mutations aux positions 48 (Val → Ile) et 76 (Pro → Leu), la dernière étant localisée dans un domaine riche en arginine. Fait intéressant, la mutation à la position 76 avait aussi été rapportée auparavant dans la portion Rev de Tat236. Les résultats obtenus suggèrent une évolution temporelle du VIB dans le cours d'infections in vivo au niveau du LTR et du gène rev, similaire à celle antérieurement décrite pour le gène tat. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : lentivirus, région du LTR, gène rev, diversité génétique

Les nombreux progrès en génie génétique ont mené au développement d’un nouveau système pour produire des molécules thérapeutiques : la moléculture végétale. L’intérêt de transformer des plantes en usine à molécules au service de l’Homme s’explique par les faibles coûts de production, la biosécurité et la capacité des plantes à synthétiser les protéines recombinantes présentant un repliement, une glycosylation et une activité appropriés. L’ablation florale constitue l’une des meilleures méthodes pour assurer le confinement génétique par stérilité mâle et femelle en plein champ. Avec objectif final de développer cette stratégie chez la luzerne (Medicago sativa), le promoteur MsMADS1 de la famille des MADS box a été isolé du génome de la luzerne et fusionné au gène rapporteur GUS et au gène codant pour la saporine, une protéine cytotoxique. Suite à la transformation génétique d’Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) à l’aide de diverses constructions, des plants transgéniques ont été générés et analysés. Des analyses d’expression transitoire ont aussi été effectuées pour évaluer l’expression du gène rapporteur GUS dans des cellules de luzerne par agro-infiltration des différentes constructions réalisées. Parallèlement, la marche génomique a été utilisée pour isoler et caractériser la séquence génomique du gène MsMADS1. La structure génomique du gène MsMADS1 semble inhabituelle avec un premier intron de plus de 1,9 kb et cette séquence ne présente pas d’homologie avec des séquences connues. Chez les plants transgéniques d’Arabidopsis, le promoteur MsMADS1 a permis l’expression de GUS de façon préférentielle dans les fleurs. Étonnamment, les constructions contenant le gène codant pour la saporine ont mené à l’obtention de plants transgéniques viables, dont le phénotype est identique aux plants sauvages d’Arabidopsis. / Progress in genetic engineering has led to the development of a new system to produce therapeutic molecules in plants: molecular pharming. The interest to transform plants into molecular factories for human purposes is explained by its lower cost, its biosecurity and the capacity of plants to synthesize recombinant proteins with appropriate folding, glycosylation and activity. Floral ablation represents one of the best ways to establish both male and female genetic confinement in open field conditions. With the final objective to develop this strategy in alfalfa (Medicago sativa), the promoter of a MADS box gene, MsMADS1, was isolated from the alfalfa genome. The genomic organisation of MsMADS1 appears to be unusual with a first intron longer than 1,9 kp without homology to any known sequence. This promoter was fused to the GUS reporter gene and a cytotoxic protein gene (saporin). Following Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) with various constructs, transgenic plants were regenerated and analysed. Transient expression was also assayed to evaluate GUS expression in alfalfa cells. Additional MsMADS1 genomic sequence was obtained by genome walking. In transgenic Arabidopsis, the MsMADS1 promoter allowed GUS expression preferentially in flowers. Surprisingly, saporin constructs resulted in the production of viable transgenic plants with a phenotype identical to wild Arabidopsis.