Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação en Ciências da Saúde, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-06-19T15:37:41Z No. of bitstreams: 1 2013_MauricioDaherAndradeGomes.pdf: 12142815 bytes, checksum: 3455bc6f29d64874c10884881dfac5e7 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-06-20T12:39:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_MauricioDaherAndradeGomes.pdf: 12142815 bytes, checksum: 3455bc6f29d64874c10884881dfac5e7 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-06-20T12:39:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_MauricioDaherAndradeGomes.pdf: 12142815 bytes, checksum: 3455bc6f29d64874c10884881dfac5e7 (MD5) / Introdução: Em um futuro próximo, espera-se que o uso de dados genéticos individuais seja determinante para aspectos práticos da medicina como o diagnóstico e a terapêutica. Um dos maiores desafios para o surgimento desta “medicina personalizada” será a integração das informações genéticas aos determinantes clássicos do desenvolvimento de doenças e da resposta aos medicamentos. Atualmente, a realização de estudos de associação genética nas mais diversas situações clínicas é altamente pertinente e necessária. Objetivos: Comparar o risco de hipotensão arterial e as variações na resposta hemodinâmica subsequente à indução da anestesia subaracnóidea para realização de operação cesariana entre grupos de pacientes formados de acordo com a presença de variações genéticas do gene do receptor beta-2 adrenérgico; definir a frequência do polimorfismo A118G do receptor opióide-mu em uma população da região Centro-Oeste do Brasil, avaliando possíveis consequências funcionais deste polimorfismo na prevalência de tabagismo e na exposição ao tabaco. Métodos: Para avaliação de variações do gene do receptor beta-2 adrenérgico, 150 parturientes hígidas que seriam submetidas a operação cesariana eletiva foram selecionadas. Durante 30 minutos após a indução da anestesia, os seguintes desfechos foram avaliados: incidência de hipotensão arterial; dose administrada de vasopressor; variações na pressão arterial e na frequência cardíaca. As pacientes foram agrupadas de acordo com a presença do haplótipo ArgGln (composto pelos alelos Arg16 e Gln27) em homozigose, e os grupos foram comparados entre si. A frequência do polimorfismo A118G do receptor opióide-mu foi avaliada em 200 pacientes cirúrgicos do Hospital Universitário de Brasília. Estes pacientes responderam um questionário sobre dados demográficos e dados relevantes ao vício de tabaco. Resultados: No estudo do receptor beta-2 adrenérgico, as análises foram conduzidas com dados provenientes de 143 parturientes. Os grupos não apresentavam diferenças significativas em suas características basais. As pacientes que possuíam o haplótipo ArgGln em homozigose apresentaram um menor risco de hipotensão arterial após a indução da anestesia subaracnóide. Os valores pressóricos destas pacientes foram significativamente maiores ao longo do período avaliado em comparação com as pacientes que possuíam uma ou nenhuma cópia do haplótipo ArgGln (P < 0,001). Em relação a avaliação do receptor opióide-mu, uma frequência de 16% (IC 95% 12,7 - 19,9%) foi encontrada na amostra de pacientes. A prevalência de tabagismo foi semelhante quando os pacientes homozigotos para o alelo 118A foram comparados com os pacientes com uma ou duas cópias do alelo 118G. Entretanto, a exposição ao tabaco medida em maços-ano foi maior em pacientes que possuíam o alelo 118G em relação aos homozigotos 118A (28,9 ±12,5 versus 21,5 ±10,8 respectivamente, P = 0,02). Conclusões: O perfil genético em relação a haplótipos do receptor beta-2 adrenérgico parece influenciar a resposta hemodinâmica de parturientes submetidas a anestesia subaracnóidea para realização de operação cesariana. Este é o primeiro estudo a descrever a frequência do polimorfismo A118G do receptor opióide-mu em brasileiros. O polimorfismo A118G pode influenciar o comportamento de brasileiros em relação ao tabagismo. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Introduction: In the nearby future, it is expected that individual genetic data will be determinant in fundamental aspects of medical practice like diagnosis and therapy. One of the greatest challenges for the development of this “personalized medicine” will be the integration of genetic information to the classical determinants of disease development and drug response. Presently, the development of genetic association studies in diverse clinical contexts is highly relevant and necessary. Objectives: Compare the risk of arterial hypotension and the hemodynamic fluctuations after subarachnoid anesthesia induction for cesarian delivery between patients grouped according to the presence of specific genetic variations of the beta-2 adrenergic receptor; define the frequency of the A118G polymorphism of the mu-opioid receptor in a population of the Center-West region of Brazil, also evaluating possible functional consequences of this polymorphism in relation to tobacco smoking prevalence and exposure. Methods: To evaluate the effects of beta-2 adrenergic receptor variations, 150 healthy parturients scheduled to undergo elective cesarian delivery were recruited. In the 30 minutes after anesthesia induction, the following outcomes were evaluated: arterial hypotension incidence; vasopressor administered dose; arterial blood pressure and heart rate variations. Parturients were grouped according to the presence of the ArgGln haplotype (composed by the alleles Arg16 and Gln27) in homozygosity, and the groups were compared. The mu-opioid receptor A118G polymorphism was evaluated in 200 surgical patients of the Hospital Universitário de Brasília. These patients answered a survey about their demographic characteristics and factors associated to tobacco addiction. Results: In the beta-2 adrenergic receptor study, the analyses were conducted with data from 143 parturients. The baseline characteristics did not differ significantly between the groups. Patients with two copies of the ArgGln haplotype presented a lower risk of arterial hypotension after spinal anesthesia induction. The arterial pressure levels of these patients were significantly higher than the group of patients with one or no copies of the ArgGln haplotype (P < 0,001). Regarding the mu-opioid receptor evaluation, a frequency of 16% (CI 95% 12.7 - 19.9%) was observed in our patient sample. The tobacco smoking prevalence did not differ significantly when patients homozygous for the 118A allele were compared to those with one or two copies of the 118G allele. However, the tobacco exposure of smokers, measured in packs-year, was higher in patients that had the 118G allele compared to patients 118A homozygous (28.9 ±12.5 vs 21.5 ±10.8 respectively, P = 0.02). Conclusions: The genetic profile in regard to haplotypes of the beta-2 adrenergic receptor appear to influence the hemodynamic response of parturients subjected to subarachnoid anesthesia for cesarian delivery. This was the first study to describe the frequency of the mu-opioid receptor A118G polymorphism among Brazilians. The A118G polymorphism may influence the behavior of Brazilians towards the tobacco addiction.

Establece la distribución de las frecuencias genotípica y alélicas del SNP rs17817449 en el gen FTO en diferentes subpoblaciones peruanas. Para el propósito, evalúa al SNP rs17817449 utilizando la técnica PCR-RFLP para 173 muestras de ADN genómico de las subpoblaciones de Lima ciudad (49,1 %), Huarochirí-Lima (9,8 %), Calca-Cusco (10, 4 %), y Puno (30,7 %). Las frecuencias genotípicas en la muestra global son: T/T = 87,9 %, G/T = 10,4% y G/G = 1,7 %. En las subpoblaciones los resultados son: Lima ciudad T/T = 81,2%, G/T = 16,5 % y G/G = 2,4 %; en Huarochirí-Lima T/T = 100 %; en Calca-Cusco T/T = 100 % y en Puno T/T = 90,6 %, G/T = 7,5% y G/G = 1,9 %. Las frecuencias genotípicas de la muestra global, Lima y Puno se encuentran en equilibrio Hardy – Weinberg. En la muestra total, las frecuencias de los alelos son: T = 93,1 % y G = 6,9 %. En las subpoblaciones los resultados son: Lima ciudad T = 89,4 % y G = 10,6 %; en Puno T =94,3 % y G = 5,7 %, en Huarochirí-Lima y Calca-Cusco T = 100 %. En general, no existen diferencias para el SNP rs17817449 del gen FTO en las subpoblaciones estudiadas, encontrándose una baja frecuencia de la variante G, asociada a la obesidad y masa grasa, y esto puede tener implicancias en la seguridad nutricional del país. / Tesis

Orientador: Débora Colombi / Banca: Cláudia Aparecida Rainho / Banca: Aparecida Érica Bighetti Ribas / Resumo: Para que a integridade da pele seja mantida é necessário que haja distribuição de água nas camadas epidérmica e dérmica, manutenção das propriedades de barreira da pele, além da manutenção da integridade estrutural, elasticidade e resiliência deste tecido. O objetivo deste estudo foi avaliar se o extrato de Bidens pilosa é capaz de modular a expressão dos genes AQP3, AQP9, AQP10, filagrina, involucrina, fibronectina e se este extrato é capaz de aumentar a quantidade de colágeno, elastina e GAGs. Esta avaliação foi realizada através da técnica de PCR em tempo real, utilizando culturas queratinócitos comerciais incubadas com extrato hidroglicólico de Bidens pilosa (EHBP) na concentração de 5,00 mg/ml nos tempos de 0, 3, 6 e 12 horas e em diferentes concentrações do EHBP (2,50; 5,00 e 10,00 mg/ml) para a análise de expressão dos genes da epiderme, além do p53, importante supressor tumoral. Cultura de fibroblastos foram incubados também com o extrato por 48 horas para análise do EHBP sobre a produção de colágeno, elastina e GAGs. O tratamento das culturas de queratinócitos com EHBP no tempo de 6 horas em diferentes concentrações se mostrou capaz de modular positivamente a expressão dos genes AQP3, AQP9, fibronectina e involucrina, porém não foi possível a análise da expressão gênica da AQP10 e filagrina. A expressão de p53 não foi modulada pelo tratamento com EHBP nas concentrações de 2,50 e 5,00 mg/ml, além disso, o EHBP se mostrou eficaz em aumentar a quantidade proteínas dérmicas em sobrenadante de cultura de fibroblastos. Nosso trabalho sugere que o uso do extrato hidroglicólico de Bidens pilosa pode modular positivamente a expressão dos genes relacionados à hidratação da epiderme e integridade desta camada por modular genes de expressão tardia de diferenciação de queratinócitos, e integridade, elasticidade e resiliência... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: To maintaining the integrity of the skin, it is necessary water distribution on epidermis and dermis, barrier properties of the skin maintenance, in addition to structural integrity maintenance, elasticity and tissue resilience. The aim of this study was evaluate if Bidens pilosa extract can modulate AQP3, AQP9, AQP10, filaggrin, involucrin, fibronectin expression and if this extract can improve collagen, elastin and GAGs. This evaluation was performed by real time PCR, with commercial keratinocytes incubated with hydroglycolic extract of Bidens pilosa (EHBP) at 5.0 mg/ml in times of 3, 6 e 12 hours and at different concentrations of EHBP (2.50, 5.00 and 10.00 mg/ml) to epidermal genes expression analyze, in addition to p53, a important tumor suppressor. Fibroblasts culture were also incubated with the extract for 48 hours to access the effect of EHBP on collagen, elastin and GAGs production. The culture keratinocytes treatment with EHBP with 6 hours of incubation with different concentrations of extract was capable to up-regulates AQP3, AQP9, fibronectina and involucrin gene expression, but it was not possible AQP10 and filaggrin gene expression analysis. The expression of p53 was not modulated by 2.50 and 5.00 mg/ml concentrations of EHBP, moreover, EHBP can increase dermal proteins amounts in fibroblasts culture supernatants. Our observation suggests that hydroglycolic extract of Bidens pilosa can modulate positively the expression of genes related with epidermal hydration and integrity of this layer because can modulate late expression on keratinocytes differentiation genes, and integrity, elasticity and resilience of skin by increasing amounts of dermal proteins and is unable to modulate p53 expression, suggesting absence of short-term correlation, between EHBP and cancer. Moreover, the lack of expression results to AQP10 puts in doubt the presence of this aquaglyceroporin... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Claudia Regina Bonini-Domingos / Banca: Nicola Amanda Conran Zorzetto / Banca: Maria Stella Figueiredo / Resumo: A anemia falciforme (AF) apresenta processos fisiopatológicos complexos que dificultam o tratamento e culminam no desenvolvimento de manifestações clínicas diversificadas, as quais são moduladas por marcadores genéticos, como os haplótipos da globina beta S (β S ), e bioquímicos como glicoproteínas plasmáticas detoxificadoras: haptoglobina (Hp) e a hemopexina (Hpx) que formam complexos com a Hb e grupo heme livres, respectivamente, garantindo efeitos antioxidantes e anti-inflamatórios, e a eritropoetina (Epo) que repõe os eritrócitos em resposta à hemólise, por exemplo. Desta forma, o objetivo do trabalho foi verificar, em portadores da AF, a influência do haplótipo Bantu sobre o tratamento com hidroxiuréia (HU) por meio da análise de marcadores de estresse oxidativo e eritrogênico, correlacionando-os com parâmetros hematimétricos e níveis de hemoglobina fetal (Hb F). Para isso, o grupo amostral (67 portadores da AF), foi dividido em três subgrupos: 25 (37,3%) homozigotos para o haplótipo Bantu (Bantu/Bantu), 26 (38,8%) heterozigotos para o haplótipo Bantu (Bantu/_) e 16 (23,0%) sem o haplótipo Bantu (_/_). Todos sob uso de HU há pelo menos 300 dias, sem transfusão sanguínea há 120 dias e adultos independentes do gênero. A confirmação da homozigose para Hb S e dos haplótipos β S , foi realizada por PCR-RFLP; os níveis de peroxidação lipídica (TBARS) foram avaliados por método espectrofotométrico e as glicoproteínas plasmáticas (Epo, Hp e Hpx) por ensaio imunoenzimático. Os parâmetros hematológicos foram fornecidos pelo HEMORIO. A média de Hb F no grupo amostral foi de 12,1% e não diferiu entre os subgrupos (p=0,55), porém o Bantu/_ apresentou acréscimo na média sendo o Benin o segundo haplótipo mais frequente. Os valores médios de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Sickle cell anemia (SCA) presents complex pathophysiological processes that complicate the treatment and culminate in development of diverse clinical manifestations, which are modulated by genetic markers, such as beta-S globin haplotype (β S ), and biochemical, such as plasmatic glycoproteins with action to detoxify: haptoglobin (Hp) and hemopexin (Hpx), which form complexes with free Hb and heme, respectively, providing antioxidant and anti-inflammatory effects, and erythropoietin (Epo), that restores the erythrocytes in response to hemolysis, for example. Thus, the aim of this study was to determine, in patients with SCA, the influence of Bantu haplotype in treatment with hydroxyurea (HU), by analysis of oxidative stress and erythrogenic markers, correlating them with hematological parameters and levels of fetal hemoglobin (Hb F). For this, the sample group (67 SCA patients), was divided into three subgroups: 25 (37.3%) were homozygous for the Bantu haplotypes (Bantu/Bantu), 26 (38.8%) heterozygous for the Bantu haplotype (Bantu/_) and 16 (23.0%) without the Bantu haplotype (_/_). The sample group was under use of HU for at least 300 days, without blood transfusion for 120 days and were all adults independent of the genus. The confirmation of homozygous Hb S and β S haplotypes was performed by PCR-RFLP; levels of lipid peroxidation (TBARS) were measured by the spectrophotometric method and plasmatic glycoproteins (Epo, Hp and Hpx) by enzyme immunoassay. Hematological parameters were provided by HEMORIO. The average of Hb F in the sample group was 12.1% and did not differ between the groups (p = 0.55), but the Bantu/_ showed an increase in the average, being Benin the second most frequent haplotype. The average values of Epo, Hp and Hpx did not differ between the subgroups, indicating... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Claudia Regina Bonini Domingos São José do Rio Preto - SP 2014 / Banca: Flávia Cristina Rodrigues Lisoni / Banca: Isabeth da Fonseca Estevão / Resumo: As talassemias do tipo beta são afecções genéticas frequentes na população mundial e seus portadores podem apresentar elevação nos níveis de hemoglobina A2 (Hb A2) e hemoglobina fetal (Hb F). As mutações presentes nos indivíduos podem estar associadas a diferentes haplótipos do grupamento da β-globina. Os objetivos do trabalho consistiram em investigar as frequências do polimorfismo XmnI (-158 CT) e do padrão de haplótipos da β-globina em indivíduos heterozigotos e homozigotos para a beta talassemia, relacioná-las com os níveis de Hb F, e compará-las com indivíduos sem hemoglobinopatias. Foram analisadas 150 amostras de indivíduos beta talassêmicos heterozigotos; 22 de indivíduos homozigotos e 150 de indivíduos sem hemoglobinopatias (grupo controle). Todas as amostras foram submetidas aos testes clássicos de diagnóstico de hemoglobinopatias e à análises moleculares por PCR Alelo Específico (PCR-AE) para confirmação da mutação de beta talassemia, e PCR para polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição (PCR-RFLP) para a identificação do polimorfismo XmnI e dos sítios de haplótipos da β-globina. Os testes estatísticos foram realizados com o software STATISTICA 8.0 e Haploview 4.2. Nos indivíduos beta talassêmicos heterozigotos, a mutação CD39 foi a mais frequente (62%) e nos homozigotos, a IVS-I-6 (22%). Foi observada diferença significativa nos níveis de Hb F entre os indivíduos que possuem mutações ainda não identificadas, em relação aos que possuem a mutação IVS-I-110 (p<0,05), no grupo de heterozigotos. A presença do polimorfismo XmnI foi observada em todos os grupos estudados, porém, somente para os indivíduos com talassemia beta heterozigota houve diferença estatística em relação aos níveis aumentados de Hb F (p=0,007). Nos três grupos foram observados os padrões típicos de haplótipos I, II, IV, VI, VII e IX. Para os indivíduos com beta talassemia ... / Abstract: The beta thalassemia are frequent genetic disorders and sufferers may have increased levels of hemoglobin A2 (Hb A2) and fetal hemoglobin (Hb F). The mutations present in individuals may be associated with different haplotypes of β-globin grouping. The objectives of this study consisted in investigating the frequencies of the XmnI polymorphism (-158 CT) and the pattern of the β-globin haplotypes in heterozygous and homozygous individuals for beta thalassemia, relate them to the levels of Hb F, and compare them with individuals without hemoglobinopathies. We analyzed 150 samples from heterozygous individuals with beta thalassemia, 22 homozygous and 150 individuals without hemoglobinopathies (control group). All samples were tested for classical hemoglobinopathies diagnosis and molecular analyzes Allele Specific PCR (AE-PCR) to confirm the mutation of beta thalassemia and PCR length polymorphism restriction fragment (PCR-RFLP) for identification of the polymorphism XmnI and sites of the β-globin haplotypes. Statistical tests were performed using STATISTICA 8.0 and Haploview 4.2 software. In beta thalassemia heterozygous individuals, mutation CD39 was the most common (62%) and in homozygous was the IVS-I-6 (22 %). We observed a significant difference in the levels of Hb F among the unidentified mutations and IVS-I-110 (p<0.05) in heterozygous individuals. The presence of the XmnI polymorphism was observed in all groups, but only heterozygous individuals for beta thalassemia was statistical difference in relation to increased levels of Hb F (p = 0.007). In the three groups were observed haplotype patterns I, II, IV, VI, VII and IX. For individuals heterozygous to beta thalassemia, the patterns II (24.3 %) and VII (32 %) were the most frequent, for individuals with beta thalassemia homozygous, the patterns I (29.5 %) and VII (38.6 %) and individuals without hemoglobinopathies, the patterns I (31%) and VII (28.3%). There was ... / Mestre

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000423608-Texto+Completo-0.pdf: 504079 bytes, checksum: fc36e6004509d573c3484797487fe665 (MD5) Previous issue date: 2010 / Alleles at the TPOX STR locus have different numbers of a four-nucleotide repeat motif arranged in tandem. Although tri-allelic genotypes are generally rare, the TPOX tri-allelic pattern has a higher frequency, varying widely among populations. Despite this, there are few accurate reports to disclose the nature of the TPOX third allele. In this work we present data obtained from 45 individuals belonging to the same family, in which there are cases of tri-allelic TPOX genotypes. The studied subjects were apparently healthy with a normal biological development. We noticed six tri-allelic cases in this family, and all of them were women. In this genealogy the tri-allelic cases were 8; 10; 11 probably due to three copies of the TPOX STR sequence in all cells (Type 2 tri-allelic pattern). Karyotype analysis showed no occurrence of partial 2p trisomy. It was observed that both the alleles 8 and 11 were able to segregate independently. We suggested that allele 10 is the extra allele and its insertion took place far from the main TPOX locus. This was the first study that included a pedigree analysis in order to understand the nature TPOX tri-allelic pattern. / Os alelos encontrados no lócus TPOX têm diferentes números de arranjos de repetições de tetranucleotídeo dispostos em tandem. Embora os genótipos trialélicos sejam geralmente raros, as altas freqüências alélicas do genótipo TPOX variam de população para população. Apesar de uma freqüência considerável de trialelia no lócus da TPOX, existem poucos relatos precisos para identificar e/ou divulgar a natureza do alelo terceiro. Neste trabalho nós apresentamos dados obtidos de 45 indivíduos de uma mesma família, onde houve casos de trialelia no lócus TPOX. Observamos que entre os 45 indivíduos estudados todos se mostraram aparentemente saudáveis, com um desenvolvimento biológico normal. Constatamos seis casos de trialelia do TPOX nesta família, todos eles presentes em indivíduos do sexo feminino. Na genealogia estudada, o padrão tri-alélico foi devido à existência de três cópias da seqüência STR que é positiva para o anelamento com os primers desenhados para reconhecer o lócus TPOX. Identificou-se como uma trialelia do Tipo 2, a qual está presente em todas as células do indivíduo, e não em apenas um sub-grupo celular. Pela análise de cariótipo, descartou-se a ocorrência de trissomia parcial 2p. Todos os genótipos tri-alélicos foram compostos pelos alelos 8, 10 e 11. Foi observado que tanto o alelo 8 como o alelo 11 foram capazes de segregar independentemente. Nós sugerimos que o alelo 10 é o alelo extra e que sua inserção não está em desequilíbrio de ligação com o lócus da TPOX. Esse foi o primeiro estudo que incluiu uma análise de pedigree com a finalidade de entender a natureza de casos de trialelia do lócus TPOX.

Foram investigados, principalmente, polimorfismos de DNA dos genes envolvidos na síntese de proteínas relacionadas à hemostasia, como fatores de risco para a trombose venosa. Neste estudo caso-controle foram incluídos 121 pacientes caucasóides com trombose venosa profunda e 121 controles. Também foram estudados 172 indivíduos negroídes da população em geral de diversos estados brasileiros. Os pacientes foram encaminhados por profissionais da área de saúde e tiveram trombose venosa profunda nos membros inferiores, confirmada por flebografia ou ecodoppler ou que, mesmo sem esta confirmação diagnóstica, apresentavam trombose venosa de repetição ou trombose venosa profunda seguida de embolia pulmonar. Foram excluídos pacientes nos quais a trombose venosa estivesse associada a patologias tais como diabetes, câncer e anticorpos anti-fosfolipídeos. Foram investigados o fator V Leiden, o polimorfismo 20210G→A no gene da Protrombina, as deficiências de proteína C, proteína S e antitrombina III, os quais são fatores genéticos de risco bem-estabelecidos para trombose venosa. Também foram investigados os níveis dos fatores VIII e von Willebrand. Além disso, foram realizados estudos de polimorfismos de DNA dos genes do Fator VII, do Inibidor do Ativador do Plasminogênio (Pai-1), do Ativador Tissular do Plasminogênio (t-PA), da Glicoproteína IIb/IIIa (GP IIb/IIIa), do Fator II, do Fator V e da Metilenotetrahidrofolato Redutase (MTHFR). Os critérios para a seleção dos polimorfismos a serem estudados foram: evidências de alteração na síntese das respectivas proteínas e/ou relatos de associação com doenças cardiovasculares. / The work presented in this thesis investigated DNA polymorphism of genes involved in the synthesis of proteins related to haemostasis as risk factors in deep venous thrombosis (DVT) patients in the Southern Brazilian state of Rio Grande do Sul (RS). In this case-controlled study the subjects were 121 Caucasian patients with DVT from RGS and 121 controls (also from RS, but with no history of DTV) along with 172 Negroid individuals (no history of DVT) from diverse Brazilian states. The patients were referred by health-care professionals and had a history of DVT in their lower limbs, confirmed either by flebography or Doppler-ecography. Some patients did not have their diagnosis confirmed but presented repeat venous thrombosis or DVT followed by pulmonary embolism. Patients whose venous thrombosis was associated with other pathologies, such as diabetes, cancer, or anti-phospholipid antibodies were excluded. The well-established genetic risk-factors for venous thrombosis are factor V Leiden, polymorphism 20210G→A of the prothrombin gene, deficiencies of proteins C and S and antithrombin III (ATIII), all of which were investigated in the present study, along with the levels of factor VIII and von Willebrand factor. DNA polymorphism was also studied in genes relating to factors II, V and VII, plasminogen-activator inhibitor (PAI-I), tissue-plasminogen activator (t-PA), glycoprotein IIb/IIIa (GPIIb/IIIa) and methylenetetrahydrofolate-reductase (MTHFR). The criteria for selection of polymorphisms were: evidence of altered protein synthesis and/or reports of polymorphism-associated cardiovascular disease.

Foram investigados, principalmente, polimorfismos de DNA dos genes envolvidos na síntese de proteínas relacionadas à hemostasia, como fatores de risco para a trombose venosa. Neste estudo caso-controle foram incluídos 121 pacientes caucasóides com trombose venosa profunda e 121 controles. Também foram estudados 172 indivíduos negroídes da população em geral de diversos estados brasileiros. Os pacientes foram encaminhados por profissionais da área de saúde e tiveram trombose venosa profunda nos membros inferiores, confirmada por flebografia ou ecodoppler ou que, mesmo sem esta confirmação diagnóstica, apresentavam trombose venosa de repetição ou trombose venosa profunda seguida de embolia pulmonar. Foram excluídos pacientes nos quais a trombose venosa estivesse associada a patologias tais como diabetes, câncer e anticorpos anti-fosfolipídeos. Foram investigados o fator V Leiden, o polimorfismo 20210G→A no gene da Protrombina, as deficiências de proteína C, proteína S e antitrombina III, os quais são fatores genéticos de risco bem-estabelecidos para trombose venosa. Também foram investigados os níveis dos fatores VIII e von Willebrand. Além disso, foram realizados estudos de polimorfismos de DNA dos genes do Fator VII, do Inibidor do Ativador do Plasminogênio (Pai-1), do Ativador Tissular do Plasminogênio (t-PA), da Glicoproteína IIb/IIIa (GP IIb/IIIa), do Fator II, do Fator V e da Metilenotetrahidrofolato Redutase (MTHFR). Os critérios para a seleção dos polimorfismos a serem estudados foram: evidências de alteração na síntese das respectivas proteínas e/ou relatos de associação com doenças cardiovasculares. / The work presented in this thesis investigated DNA polymorphism of genes involved in the synthesis of proteins related to haemostasis as risk factors in deep venous thrombosis (DVT) patients in the Southern Brazilian state of Rio Grande do Sul (RS). In this case-controlled study the subjects were 121 Caucasian patients with DVT from RGS and 121 controls (also from RS, but with no history of DTV) along with 172 Negroid individuals (no history of DVT) from diverse Brazilian states. The patients were referred by health-care professionals and had a history of DVT in their lower limbs, confirmed either by flebography or Doppler-ecography. Some patients did not have their diagnosis confirmed but presented repeat venous thrombosis or DVT followed by pulmonary embolism. Patients whose venous thrombosis was associated with other pathologies, such as diabetes, cancer, or anti-phospholipid antibodies were excluded. The well-established genetic risk-factors for venous thrombosis are factor V Leiden, polymorphism 20210G→A of the prothrombin gene, deficiencies of proteins C and S and antithrombin III (ATIII), all of which were investigated in the present study, along with the levels of factor VIII and von Willebrand factor. DNA polymorphism was also studied in genes relating to factors II, V and VII, plasminogen-activator inhibitor (PAI-I), tissue-plasminogen activator (t-PA), glycoprotein IIb/IIIa (GPIIb/IIIa) and methylenetetrahydrofolate-reductase (MTHFR). The criteria for selection of polymorphisms were: evidence of altered protein synthesis and/or reports of polymorphism-associated cardiovascular disease.

O transtorno de déficit de atenção e hiperatividade (TDAH) afeta aproximadamente de 8% a 12% das crianças em idade escolar, sendo os meninos mais afetados, em comparação às meninas. Os sintomas do TDAH reconhecidos dividem-se em dois grupos: desatenção e hiperatividade/impulsividade. A contribuição de fatores genéticos na etiologia do TDAH é fortemente sugerida pelos estudos genéticos clássicos. Atualmente, muitos genes são considerados como possíveis genes de suscetibilidade para este transtorno, principalmente genes do sistema dopaminérgico que são alvos diretos dos agentes farmacológicos. Porém, evidencia-se a grande importância do estudo de genes do sistema serotoninérgico pela extensa relação que este possui com o sistema dopaminérgico. Além disso, existem também boas razões para relacionar o sistema serotoninérgico com o TDAH, dentre as quais podemos citar a evidencia de alterações da serotonina que causam problemas comportamentais em humanos. No presente estudo foram analisados dois genes do sistema serotoninérgico (SLC6A4 e HTR2A). No gene SLC6A4 o polimorfismo estudado localiza-se no promotor, sendo uma inserção/deleção de 44pb. Já no segundo gene foram analisados dois polimorfismos. Um dos polimorfismos investigados também se localiza na região promotora do gene (-1438A>G). O outro polimorfismo investigado é uma troca de aminoácido His452Tyr localizado na região terminal da proteína receptora. A amostra foi composta por 243 crianças em idade escolar com TDAH e seus pais biológicos. O diagnóstico de TDAH está de acordo com os critérios do DSM-IV e foi inferido através do questionário semi-estruturado (K-SADS-E) bem como de avaliações clínicas com os pacientes e seus pais biológicos. A análise de risco relativo de haplótipos revelou uma ausência de associação entre o polimorfismo do gene SLC6A4 e o polimorfismo -1438 A>G no gene HTR2A (-1438 A>G) e a doença (p=0,404 para SLC6A4 e; p=0,886 para HTR2A; -1438 A>G). Entretanto, foi evidenciada associação com o polimorfismo His452Tyr no gene HTR2A e a doença. O alelo 452His foi mais freqüentemente associado ao TDAH em meninos (p=0,04). Portanto, nossos resultados sugerem uma associação do gene HTR2A (His452Tyr) dependente de gênero. Esse resultado salienta a importância do uso de amostras mais homogêneas ou o uso de fenótipos mais refinados para estudos de associação com doenças complexas, especialmente com o TDAH. / Attention deficit hyperactivity disorder (ADHD) affects approximately 5% of school age children. Boys are more affected than girls. The ADHD symptoms are divided in two groups: inattention and hyperactivity/impulsivity. Genetic factors contribution to the etiology of the ADHD is strongly supported by classic genetics studies. At present, many genes are considered as possible susceptibility genes for this disorder, mainly from the dopaminergic system because they are direct targets for pharmacologic agents. However, the importance of studying the serotoninergic genes becomes evident since it has an extensive relation with the dopaminergic system. Moreover, there are also good reasons for relating the serotoninergic system with ADHD. We could cite, for example, the evidence of serotonin modifications, which cause behavior disorders in humans. In the present study two genes of the serotoninergic system were analyzed (SLC6A4 and HTR2A). The SLC6A4 gene polymorphism studied is located in the promoter region and is defined by an insertion/deletion of 44bp. Two polymorphisms were analyzed in the second gene. One was also mapped in the promoter region, -1438 A>G. The second is a His452Tyr substitution mapped in the terminal region of the protein receptor. The present work investigated a sample of 243 ADHD school age children, as well as their biological parents. The ADHD diagnosis followed the DSM-IV classification, inferred by a semi-structured questionnaire (K-AADS-D) as well as clinical evaluations of the patients and their biological parents. The relative haplotype risk analyses revealed a lack of association between the SLC6A4 gene and the -1438A>G polymorphisms of the HTR2A (-1438 A>G) gene and the disease (p=0.404 for SLC6A4; p=0.886 for HTR2A; -1438 A>G). An association between the His452Tyr polymorphism at the HTR2A gene and ADHD was observed. The 452His allele was more frequently associated with ADHD in boys (p=0.04). Therefore, our results suggest that an association with HTR2A (His452Tyr) gene depends on gender. This result stresses the importance of homogeneous samples or refined phenotypes use for associations studies in complex diseases, such as ADHD.

A deficiência parcial ou total ou defeitos funcionais no fator VIII (FVIII) resultam na doença hereditária hemofilia A (HA), geralmente causada por mutações heterogêneas no gene do FVIII (F8). Embora mais de 1200 mutações no gene do F8 tenham sido descritas, dados sobre o espectro dessas mutações na população do Sul do Brasil são insuficientes e o estudo das mesmas possibilita uma melhor compreensão da genética molecular da doença nessa população. Além disso, ao estimar o efeito que uma mutação exerce em uma proteína, obtem-se subsídios para uma melhor avaliação de sua função, bem como das interações entre ela e estruturas afins. Os objetivos desse estudo foram identificar as mutações gênicas em pacientes com HA leve ou moderada do Rio Grande do Sul e posterior análise do papel dessas mutações na determinação da doença e presença de inibidores. Um total de 76 pacientes não-relacionados do sexo masculino, com HA leve (n=55) ou moderada (n=21) foram incluídos no estudo. Todos os 26 éxons do F8, as regiões 5’não-traduzida e 3’não-traduzida, as junções éxon-intron e a região promotora foram amplificadas por PCR e analisadas por sequenciamento direto. Foram examinados também 100 cromossomos normais de doadores de banco de sangue para excluir mudanças polimórficas como causadoras da doença. Todas as sequências do F8 dos pacientes foram comparadas com a sequência referência (NCBI: NG_005114.1), utilizando o software CodonCode Aligner implementado no Mega 5.04. As mutações encontradas foram comparadas com as do banco de dados The Haemophilia A Mutation, Structure, Test and Resource Site (HAMSTeRS) e a conservação dos aminoácidos mutados também foi verificada. A detecção de mutações em sítios de processamento foi realizada pelo programa de predição de sítios de processamento (Berkeley Drosophila Genome Project) e para a análise do efeito das mutações de sentido trocado foram utilizados três preditores: PolyPhen-2 (Polymorphism Phenotyping), Site Direct Mutator (SDM) e Have yOur Protein Explained (HOPE). A localização das mutações na estrutura do FVIII foi realizada no programa PyMol e para a visualização da superfície eletrostática dos domínios A foi utilizado o programa GRASP2. Quando nenhuma mutação foi encontrada, foi executada a análise de Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA). Quanto às mutações recorrentes, a análise de haplótipos foi feita a fim de investigar se elas surgiram nessa população através de vários eventos mutacionais distintos ou através de efeito fundador. Foi identificada a mutação causadora da doença em 69 (91%) pacientes, que apresentaram 33 mutações diferentes: 27 de sentido trocado, uma pequena deleção, duas pequenas duplicações e três mudanças em sítios de processamento. Sete mutações de sentido trocado e duas em sítios de processamento não tinham sido previamente descritas no HAMSTeRS e não foram identificadas na literatura. Todas as últimas foram consideradas patogênicas; a mutação p.Val266Met, muito próxima a um sítio de ligação ao cobre, pode diminuir a interação entre os domínios A2 e A3 do FVIII; a mutação p. Met567Lys pode afetar um sítio de ligação ao fator IX; as mutações p.Arg1764Gly, p.Tyr1786Phe e p.Tyr1792Cys podem afetar a ligação ao fator IX e ao Fator von Willebrand. Nove mutações recorrentes foram encontradas, uma delas nunca descrita anteriormente (p.Tyr1786Phe). A análise de haplótipos sugere que essa mutação tenha se originado na população brasileira como um único evento em um ancestral comum. Um dos indivíduos desenvolveu inibidores. Foi feita, também, uma avaliação geral sobre o papel das mutações no F8 na formação de inibidores em pacientes graves estudados em investigação anterior, verificando-se associações significativas tanto no que se refere aos domínios em que as mutações ocorreram, quanto aos tipos de mutações encontrados. Os dados desses estudos são úteis no diagnóstico e prevenção precoce de inibidores na hemofilia A, bem como na detecção de mulheres heterozigotas na população do sul do Brasil. Espera-se oferecer um melhor manejo aos pacientes, fornecer aconselhamento genético e suporte psicológico/emocional para as famílias dos afetados. / Factor VIII (FVIII) partial or total deficiency, or functional defects, result in the hereditary disease haemophilia A (HA), generally caused by heterogeneous mutations in the FVIII gene (F8). Although more than 1200 F8 mutations have been reported, data regarding these mutations are insufficient in southern Brazilian populations and their study provides a better understanding of the molecular genetics of the disease in this population. Furthermore, after evaluating the effect that a mutation has on a protein, we can do a better assessment of its function, as well as of the interactions between the mutated protein and related structures. The objectives of this study were to identify gene mutations in patients with mild and moderate HA living in the southern Brazilian state of Rio Grande do Sul and to analyze the role of these mutations in disease determination and presence of inhibitors. A total of 76 unrelated male patients with mild (n = 55) or moderate (n = 21) HA were included in the study. All F8 26 exons, the 5 'UTR and 3' UTR, intron-exon junctions and the promoter region were amplified by PCR and analyzed by direct sequencing. We also examined 100 blood bank donors’ normal chromosomes to exlude polymorphic changes as causal to the disease. F8 patients’ sequences were compared with the reference sequence (NCBI: NG_005114.1) using the CodonCode Aligner software implemented in Mega 5.04. The mutations found were compared with those present in The Haemophilia A Mutation, Structure, Test and Resource Site (HAMSTeRS) database and the conservation of the mutated amino acids was also verified. Splice site mutations were detected using the Berkeley Drosophila Genome Project splice site prediction program, and for the analysis of missense mutation effects three predictors were used: PolyPhen-2 (Polymorphism Phenotyping), Site Direct Mutator (SDM) and Have yOur Protein Explained (HOPE). The mutations were localized in the FVIII structure by PyMOL and the FVIII A domains eletrostatic surface was visualized using GRASP2. When no mutation was found, the Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) analysis was performed. As for the recurrent mutations, haplotype analyses were conducted to investigate whether they emerged in this population through several distinct mutational events or from a founder effect. We identified the disease causing mutation in 69 (91%) patients, who showed 33 different mutations: 27 missense, one small deletion, two small duplications and three splice site changes. Seven missense and two splice site mutations had not been previously reported in HAMSTeRS and were not identified in any literature search. The latter were all considered pathogenic; p.Val266Met is located near a copper binding site and may decrease the interaction between the FVIII A2 and A3 domains; p. Met567Lys can affect a factor IX binding site; p.Arg1764Gly, p.Tyr1786Phe and p.Tyr1792Cys can affect factor IX and von Willebrand Factor binding sites. Nine recurrent mutations were found, one of them (p.Tyr1786Phe) never described before. Haplotype analysis suggests that this mutation originated in the Brazilian population as a single event in a common ancestor. One of the subjects developed inhibitors. A general evaluation was also made about the role of F8 mutations in the development of inhibitors in severe patients studied in a previous investigation, and significant associations were found both in relation to the domains where the mutations occurred, as well as in the mutations found. The data of these studies will be useful in the diagnosis and early prevention of inhibitors in haemophilia A, and in the detection of female carriers in the southern Brazilian population. We hope to offer a better monitoring to the patients, to give genetic counseling, and psychological/emotional support to the families of affected persons.